Summary
Detta protokoll beskriver isoleringen av epitelceller från olika anatomiska regioner i människans foster membran för att bestämma deras heterogenitet och funktionella egenskaper för eventuell applicering i kliniska och fysiopatologiska modeller.
Abstract
Flera protokoll har rapporterats i litteraturen för isolering och kultur av mänskliga amniotiska epitelceller (HAEC). Emellertid, dessa förutsätter att fostervattnet epitel är ett homogent skikt. Den mänskliga Amnion kan delas in i tre anatomiska regioner: återspeglas, Placental, och navel. Varje region har olika fysiologiska roller, såsom vid sjukdomstillstånd. Här beskriver vi ett protokoll för att dissekera Human Amnion vävnad i tre sektioner och bibehålla den in vitro-. I kulturen, celler som härrör från den reflekterade Amnion visade en det morfologi, medan celler från både placenta och navel regioner var skivepitelcancer. Icke desto mindre, alla celler som erhålls har en epitelial fenotyp, påvisas genom immunodetection av E-cadherin. Därför, eftersom placenta och reflekterade regioner på plats skiljer sig i cellulära komponenter och molekylära funktioner, det kan vara nödvändigt för in vitro-studier att överväga dessa skillnader, eftersom de kan ha fysiologiska konsekvenser för användning av HAEC i biomedicinsk forskning och lovande tillämpning av dessa celler i regenerativ medicin.
Introduction
Mänskliga amniotiska epitelceller (HAEC) har sitt ursprung under de tidiga stadierna av embryonal utveckling, på cirka åtta dagar postfertilisering. De uppstår från en population av skivepitelcancer epitelial celler av epiblast som härrör från det innersta skiktet av fosterhinnan1. Således anses HAEC rester av pluripotenta celler från epiblast som har potential att differentiera till de tre bakterie lagren av embryot2. Under det senaste decenniet har olika forskargrupper utvecklat metoder för att isolera dessa celler från fosterhinnan på graviditetstiden för att karakterisera deras presumtiva pluripotens-relaterade egenskaper i en kultur modell in vitro3,4.
Följaktligen har det visat sig att HAEC har karakteristiska egenskaper hos humana pluripotenta stamceller (HPSC), såsom ytantigener SSEA-3, SSEA-4, TRA 1-60, TRA 1-81; kärnan i pluripotensen transkription faktorer OCT4, SOX2, och NANOG; och spridningen markör KI67, vilket tyder på att de är självförnyande5,6,7. Dessutom har dessa celler ifrågasatts med hjälp av differentierings protokoll för att få celler positiva för härstamnings specifika markörer av de tre bakterie lagren (ektoderm, mesoderm och endoderm)4,5,8, samt i djurmodeller av mänskliga sjukdomar. Slutligen, haec Express E-cadherin, som visar att de behåller en epitelial natur ungefär som hpsc5,9.
Bortsett från deras embryonala ursprung, haec har andra inneboende egenskaper som gör dem lämpliga för olika kliniska tillämpningar, såsom utsöndringen av antiinflammatoriska och antibakteriella molekyler10,11, tillväxtfaktorer och cytokin release12, ingen bildning av Teratomu när de transplanteras in i immunobristfällig möss i motsats till hpsc2, och immunologisk tolerans eftersom de uttrycker HLA-G, vilket minskar risken för avstötning efter transplantation13.
Tidigare rapporter har dock antagit att den mänskliga Amnion är ett homogent membran, utan att anse att det kan vara anatomiskt och fysiologiskt uppdelad i tre regioner: placentabarriären (den Amnion som täcker decidua basalis), navelsträngen (den del som omsluter navelsträngen), och reflekteras (resten av membranet inte bifogas moderkakan)14. Det har visats att placenta och reflekterade regioner i Amnion uppvisar skillnader i morfologi, mitokondriell aktivitet, detektion av reaktiva syreradikaler15, Mirna-uttryck16, och aktivering av signaleringsvägar17. Dessa resultat tyder på att den mänskliga Amnion är integrerad av en heterogen population med olika funktioner som bör övervägas för ytterligare studier som utförs i antingen in situ eller in vitro-modeller. Medan andra laboratorier har utformat protokoll för isolering av HAEC från hela membranet, har vårt laboratorium etablerat ett protokoll för att isolera, kultur och karakterisera celler från olika anatomiska regioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta protokoll godkändes av etikkommittén för Instituto Nacional de Perinatología i Mexico City (registreringsnummer 212250-21041). Alla förfaranden som utfördes i dessa studier var förenliga med de etiska normerna för Instituto Nacional de Perinatología, Helsingforsdeklarationen, och de riktlinjer som anges i hälsoministeriets officiella mexikanska standard.
1. förberedelser
- Bered en lösning av 1x PBS med EDTA. För att göra detta, tillsätt 500 μL av 0,5 M EDTA-beståndet i 500 mL 1x PBS för en slutlig koncentration av 0,5 mM EDTA.
- Förbered kultur mediet för HAEC. Ta 450 mL av hög glukos-DMEM, komplettera den med 5 mL natriumpyruvat (100 mM), 50 mL av värme-inaktiva foster bovint serum kvalificerat för stamceller, 5 mL av icke essentiella aminosyror (100x), 5 mL av antibiotika-antimykotisk (100x), 5 mL L-glutamin (200 mM), och 500 μL merkaptoetanol (1 000 x).
- Sterilisera behållarna för transport och bearbetning av vävnaden: en rostfri behållare med lock för att transportera hela moderkakan från Operations teatern till laboratoriet, en bricka (20 cm x 30 cm x 8 cm) för att tvätta och ta bort blod från hela moderkakan innan den dissektion av fosterhinnan, och en plast skärbräda för att separera fosterhinnan i de tre regionerna.
- Sterilisera de kirurgiska instrumenten (skalpeller, sax, tång, och klämmor), 500 mL bägare, bomull gauzes, och saltlösning.
2. erhållande av placenta vävnad
Anmärkning: foster hinnor erhölls från kvinnor vid full-term dräktig (37 − 40 veckor), under indikation på Kejsarinnans leverans, utan några bevis för aktiv arbetskraft, och inga mikrobiologiska egenskaper av infektion. De kompletta isolerings-och odlings procedurerna utfördes inom ett biosäkerhetsskåp under sterila förhållanden.
- I operationssalen, klämma navelsträngen för att förhindra blodflödet till resten av vävnaden. Samla hela moderkakan med navelsträngen fastklämd i den sterila behållaren.
- Tillsätt 500 mL saltlösning till behållaren för att återfukta moderkakan.
- Stäng behållaren och transportera vävnaden till laboratoriet vid rumstemperatur.
- Placera behållaren med moderkakan inuti biosäkerhets skåpet.
Anmärkning: om dissektion inte utförs inom 15 min för att samla moderkakan, förvara behållaren med moderkakan på is tills bearbetningen. Undvik mer än 1 h av förfluten tid mellan att få moderkakan och början av dissektion.
3. mekanisk separation per region i fosterhinnan
Anmärkning: förfarandet skall utföras i ett biosäkerhetsskåp under sterila förhållanden och vid rumstemperatur.
- Ta bort hela moderkakan från behållaren och placera den på facket med navelsträngen vänd uppåt.
- Med hjälp av en steril bomullsgasväv, rengör blodproppar från ytan av chorion-Amnion som täcker moderkakan.
- Identifiera de tre regionerna av membranet: navelsträngen Amnion kuvertering navelsträngen, placentabarriären Amnion täcker decidua basalis, och den reflekterade regionen, som är resten av Amnion som inte är knuten till moderkakan (figur 1).
- Dissekera navel regionen Amnion (figur 2A).
- Med dissekera pinpops, hålla den del av Amnion membran som täcker korsningen av moderkakan och navelsträngen.
- Med en skalpell, dissekera den region som omger sladden medan stretching för att separera den från chorion.
- Deponera den separerade vävnaden i en märkt bägare med 100 mL saltlösning.
- Dissekera placenta Amnion-regionen (figur 2b).
- Med en steril bomullsgasväv, ta bort blodproppar från ytan av chorion-Amnion som täcker moderkakan.
- Håll membranet på gränsen mellan moderkakan och den reflekterade regionen med dissekera pinps.
- Skär längs omkretsen av moderkakan med skalpell.
- Separera placentabarriären Amnion från chorion, är noga med att inte skära några fartyg från moderkakan.
- Placera den separerade vävnaden i en annan märkt bägare med 300 mL saltlösning.
- Separera resten av fosterhinnan som inte är knuten till moderkakan (dvs. den reflekterade delen) från chorion (figur 2C).
- Samla den reflekterade regionen i en annan märkt bägare med 300 mL saltlösning.
Anmärkning: Tillsätt saltlösning kontinuerligt under dissektion för att förhindra att vävnaden torkar ut.
- Samla den reflekterade regionen i en annan märkt bägare med 300 mL saltlösning.
4. Tvätta membranen
Anmärkning: förfarandet skall utföras i ett biosäkerhetsskåp under sterila förhållanden vid rumstemperatur.
- Kassera saltlösning av varje membran region separat.
- Tillsätt 100 mL färsk saltlösning till navel regionen.
- Tillsätt 300 mL färsk saltlösning till placenta respektive reflekterade regioner.
- Rör membranen med hjälp av dissekera pinkoppar att ta bort blod rester.
- Kassera saltlösning.
- Upprepa tvätnorna och agitation minst 3x tills membranen är genomskinliga.
- Placera och utvidga membranen på brädet för att rengöra med steril gasbinda blodproppar som inte togs bort med tvättar.
Obs: det är mycket viktigt att ta bort så många erytrocyter som möjligt, eftersom deras närvaro påverkar trypsin funktion och livskraften hos efterföljande cellkulturer.
5. enzymatisk nedbrytning av membranen från olika regioner
Anmärkning: förfarandet måste utföras inom ett biosäkerhetsskåp under sterila förhållanden.
- Skär de reflekterade och placenta regionerna i två eller tre fragment.
- Skär inte navel regionen.
- Placera fragment av varje region i Centrifugera rören. Tillsätt 20 mL 0,5% trypsin/EDTA till de reflekterade och placenta regionerna och 5 mL 0,5% trypsin/EDTA till navel regionen, respektive.
Obs: det är viktigt att skära de reflekterade och placenta regionerna i mindre bitar eftersom de måste vara helt nedsänkt i trypsin lösning. - Skaka centrifugrör lätt i 30 s. Kassera trypsin.
- Tillsätt 30 mL ny 0,5% trypsin/EDTA till de reflekterade och placenta regionerna och 15 mL nya 0,5% trypsin/EDTA till navel regionen, respektive.
- Placera rören i en rotator inuti inkubatorn.
- Inkubera med rotation (20 rpm) för 40 min vid 37 ° c.
Anmärkning: om en rör rotator inte är tillgänglig, skaka rören lätt manuellt var 10 min. - Överför trypsin/cell lösningarna från varje region till nya centrifugrör.
- Tillsätt 2x volymen av HAEC-Media förvärmda vid 37 ° c per tub för att inaktivera enzymet.
- Förvara den första matsmältningen på isen.
- Upprepa steg 5.6 − 5.8 under en andra digestionsperiod.
- För varje region, håll ena änden av Amnion Portion med dissekera pinpops, och med ett annat par klämma längs vävnaden för att ta bort rader av epitelceller som inte helt lossnar under tidigare inkubationstider.
- Samla in den andra uppslutning i en annan uppsättning av Centrifugera rör och inaktivera med 2x volymen av HAEC media.
- Kassera de smälta membranen i en behållare för biologiskt risk.
6. isolering av HAEC
Anmärkning: förfarandet måste utföras inom ett biosäkerhetsskåp under sterila förhållanden.
- Centrifugera alla rör vid 200 x g i 10 min vid 4 ° c.
- Kassera supernatanten och tillsätt 10 mL förvärmda HAEC-media (till 37 ° c) per tub och Pipettera försiktigt för att disaggregera varje pellet.
- Kombinera de cellulära suspensioner av de två digestionerna i en individuell slang för varje membran region.
- Filtrera cellulära suspensioner med hjälp av 100 μm cell silar för att ta bort den extracellulära matrix skräp och få enstaka celler.
- Bered tre portioner med 90 μL trypan Blue i ett microcentrifugerör.
- Tillsätt 10 μL av varje cellsuspension per membran region i microcentrifugerören och blanda.
- Räkna cellerna med en hemocytometern under ett ljus fält Mikroskop.
7. HAECS kultur
- Utsäde haec från de tre regionerna separat med en densitet av 3 × 104 celler/cm2 med föruppvärmd haec media, kompletteras med 10 ng/ml av Human Epidermal tillväxtfaktor (EGF).
- Frö cellerna i 100 mm plattor för att bibehålla dem in vitro eller i 24 väl plattor för immunokemisk analys.
- Inkubera rätterna vid 37 ° c under normoxiska förhållanden (5% CO2) i en fuktad inkubator.
- Lägg till EGF dagligen och Byt medium var tredje dag.
Notera: cellerna kommer att bli konfluenta efter 4 − 6 dagar. - Använd cellerna för konventionell immunohistokemi, cell sortering analys, kryopreserving, RNA och protein utvinning, eller att fortsätta passagen.
8. HAEC-passagen
- Ta bort HAEC-mediet och tvätta 2x med PBS/EDTA 0,01 M lösning.
- Inkubera med en PBS/EDTA 0,01 M lösning i 15 min vid 37 ° c.
- Ta bort PBS/EDTA och tillsätt 1,5 mL 0,5% trypsin/EDTA.
- Inkubera i 5 − 8 minuter vid 37 ° c.
- Inaktivera enzymet med två volymer av HAEC-media.
- Samla den blandade lösningen och Centrifugera i 5 min vid 200 x g.
- Räkna cellerna och fortsätt med följande passager eller använda cellerna för vidare analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
HAEC isolerades från var och en av de tre anatomiska regionerna i fosterhinnan och individuellt odlade in vitro. Efter 48 h av kultur, celler med en epitelial fenotyp anslutit sig till ytan av plattan, även om medierna innehöll också cellfragment och flytande celler, som togs bort när mediet ändrades (figur 3).
Under bearbetningen av primärkulturen (passage Zero, P0) kan vissa komplikationer uppstå som kan störa den experimentella dataanalysen (figur 4): det är tillrådligt att kassera kulturerna och bearbeta ett annat membran vid identifieringen av förekomst av bakterier på grund av kontaminering av reagenser eller under isolerings processen (figur 4a). överdriven erytrocyter på grund av otillräcklig tvättning av membranen (figur 4b); bristfällig eller ingen vidhäftning av cellerna till plattorna (figur 4c); eller celler med fibroblastmorfologi (figur 4D), vilket tyder på att mänskliga amniotiska mesenkymala celler (HAMC) isolerades i stället för haec.
Haec morfologi beror på ursprunget av dessa celler: celler från den reflekterade zonen har en det morfologi och växa i en kullerstensbelagd monolayer, till skillnad från celler från placentabarriären och navel regioner, som är plattare och skivepitelcancer (figur 5). Dessa data stöder att epitelskiktet från Amnion inte är enhetligt i hela membranet. Under passager, storleken på cellerna från alla regioner ökar, men de behåller sin epitelial natur och inte förvärva en fibroblast morfologi. I själva verket visade immunofluorescens mot E-cadherin att de primära kulturerna (P0) och Subkulturerna (P1-P2) behöll sin epitelial fenotyp (figur 6), vilket tyder på att det inte finns någon förorening av en annan celltyp, såsom mesenkymala stromaceller, eller epitelial-mesenkymala övergången Dessutom visar dessa celler inga tecken på celldöd enligt TUNEL-analysen (kompletterande figur 1) men är positiva för proliferation-MARKÖREN för KI-67 (figur 6), även om våra tidigare resultat inte fann några signifikanta skillnader för denna markör mellan varje passage5.
Antalet celler som erhålls varierar beroende på region: 61,6 x 106 och 71,8 x 106 celler från de reflekterade respektive placenta regionerna och mindre än 1 x 106 per prov från navel regionen (tabell 1). Det har rapporterats med detta protokoll att placentabarriären och navelregion är mycket lika i deras uttrycks profiler, i motsats till den reflekterade och placenta regioner, särskilt i gener som deltar i ECM receptor interaktion, Focal vidhäftning, och PI3K-akt signalering väg genom RNA-SEQ6. I samförstånd, en tidigare studie rapporterade differential uttryck av mitogen-aktiverat proteinkinas och omvandla tillväxtfaktor beta vägar, samt proinflammatoriska cytokiner mellan båda regionerna17.
Även om bevisen visade att subpopulationerna från Amnion skiljer sig åt i deras morfologi och fysiologiska egenskaper, visade vi tidigare att uttrycket och närvaron av kärnan i pluripotens faktorer inte ändras i HAEC som härstammar från placenta och reflekterade regioner6. I detta sammanhang, förutom det relativt begränsade antalet celler från navel regionen, efterföljande studier bör inriktas på isolerade haec från placentabarriären och reflekteras Amnion självständigt, med tanke på de fysiologiska konsekvenserna, eftersom de olika subpopulationer inte skulle reagera lika på specifika händelser, såsom långvarig graviditet eller inflammatoriska processer under förlossningen, även om det inte finns några specifika positiva celler till de viktigaste pluripotens markörer (figur 7).
Figur 1: anatomiska regioner från fosterhinnan på sikt. Navel amniotiska membran (gul), placentabarriären fosterhinnan (vit), och reflekterat fosterhinnan (svart). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: mekanisk dissektion av fosterhinnan. A) navelregion,B)placentaregionenoch (C) reflekterad region. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: en representativ primär kultur för HAEC som härstammar från fosterhinnan. Kultur 48 h efter isolering utan (a) och med (B) en ändring av massmedia. Skalstreck = 50 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: representativa mikrografer över negativa resultat av primärkulturen i HAEC. (A) överskott av erytrocyter. Bbakterieförorening. (C) haec inte följs efter 48 h av isolering. Dprimär kultur som består av celler med fibroblastmorfologi. Skalstreck = 200 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: morfologi av HAEC från olika anatomiska regioner in vitro. Representativa mikrografer av konfluenta haec reflekteras (övre panelen), placentabarriären (mellersta panelen), och navel (nedre panelen) regioner odlade dock P0 − P2. Skalstreck 200 = μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: uttryck för E-cadherin och KI-67 i HAEC. Representativa epifluorescensmikroskopi mikroskopi bilder av E-cadherin+ och KI-67+ haec reflekteras (vänster panel) och placentabarriären (höger panel) Amnion odlade genom P0 − P2. Skalstreck = 100 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: HAEC från olika anatomiska regioner visar en pluripotens markör panel. Representativa konfokalmikroskopi bilder av dubbel immunofluorescensen Amnion för nanog med tra-1-60, OCT4 med E-cadherin, och SOX2 med ssea-4 i haec (P1) från reflekterade (övre panelen) och placentabarriären (nedre panelen) regioner. Skalstreck = 100 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| # MEMBRAN | Återspeglas | PLACENTABARRIÄREN | Navelsträngen | KOMPLETT MEMBRAN |
| 1 | 75 X 106 | 130 X 106 | 0,2 X 106 | 205,2 X 106 |
| 2 | 38,5 X 106 | 52 X 106 | 0,53 X 106 | 91,03 X 106 |
| 3 | 59 X 106 | 53 X 106 | 0,2 X 106 | 112,2 X 106 |
| 4 | 42 X 106 | 27 X 106 | 0,36 X 106 | 69,36 X 106 |
| 5 | 44,8 X 106 | 22,3 X 106 | Np | 76,1 X 106 |
| 6 | 100 X 106 | 140 X 106 | 1 X 106 | 241 X 106 |
| 7 | 72 X 106 | 78 X 106 | Np | 150 X 106 |
| Genomsnittliga | 61,6 X 106 | 71,8 X 106 | 0,45 X 106 | 133,8 X 106 |
Tabell 1: antal HAEC som isolerats per region från foster hinnor. (NP = ej bearbetad).
Kompletterande figur 1: TUNEL färgning i HAEC (passage 2) från reflekterad region och i positiva kontrollceller (HL-60 celler behandlade med camptothecin). Skalstreck = 50 μm. vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi genomförde ett nytt protokoll för att isolera HAEC från term membranen. Det skiljer sig från tidigare rapporter i att varje membran delades in i sina tre anatomiska regioner före isolering för att analysera celler från var och en.
En av de mest kritiska stegen i protokollet är tvättning av membranet för att ta bort alla blodproppar, eftersom de kan störa aktiviteten av trypsin när separera epitelceller. Underlåtenhet att genomföra detta steg på rätt sätt kan leda till att få en primär kultur med överdrivna erytrocyter och få anhängare epitelceller. Om ingen bifogad fil observeras under de första 24 − 48 h efter seedning av cellerna, rekommenderar vi att kasta kulturen. En annan kritisk punkt är inkubationstiden för den enzymatiska matsmältningen. Om inkubationstiden är för lång kan cellernas lönsamhet minska och/eller cellkulturer med mesenkymala i stället för epitelial morfologi kan erhållas (figur 4). Dessutom, om membran nedbrytning inte görs med rätt agitation, ökar sannolikheten för att få ett lågt antal celler per membran.
I detta protokoll kan vi bibehålla populationer av HAEC in vitro-utan att förlora sin epitelial fenotyp, vilket framgår av närvaron av specifika epitelceller markör E-cadherin för de flesta celler längs passager (figur 6). Men enligt vår erfarenhet kan HAEC endast utökas för tre passager (P1 − P3). Det begränsade antalet passager bör tas i beaktande för experiment som kräver långa perioder av kultur eller flera passager. Dessutom har det rapporterats att efter P3 cellerna börjar ändra sin morfologi och minska uttrycket av E-cadherin, så den långvariga kulturen kan framkalla epitelial-mesenkymala övergången (EMT)18. Nyligen, det visades att progesteron förhindrar EMT i fåramniotiska epitelceller19,20, så det skulle vara intressant att analysera effekten av olika koncentrationer av progesteron i haec kultur medium för att undvika mesenkymala fenotyp efter den tredje passagen.
I alla tidigare rapporter där HAEC isolerades, har Amnion antagits vara en enhetlig vävnad trots den eventuella heterogenitet av epitelial populationer som utgör hela membranet. I motsats till detta protokoll delar membranet i sina tre anatomiska områden för att separat isolera och kultur HAEC med tanke på de tidigare morfologiska och genuttryck rapporter som tyder på funktionella skillnader. Det är också onödigt att rena genom cell sortering för att få endast epitelial populationer, vilket påvisas genom detektion av E-cadherin markören under passager till P2.
Det har visats att isolerade HAEC från varje membran regioner har ett liknande uttryck av pluripotensen kärna, är en latent reservoar av celler med stemness. I detta sammanhang kan dessa celler användas in vitro för att studera molekylära mekanismer, såsom dynamisk lokalisering av pluripotensrelaterade transkriptionsfaktorer eller deras förmåga att förbli quiescent trots att de uttrycker cancerrelaterade gener, oavsett deras anatomiska ursprungsregion. Den framtida forskningen måste dock beakta molekylära skillnader som rapporterats (globala uttrycks gener, metabolisk aktivitet, signaleringsvägar) mellan varje region, vilket skulle få återverkningar för deras tillämpning i regenerativ medicin. Vi har tidigare rapporterat ett annat uttryck av gener involverade i PI3K/AKT och fokal adhesion signalering vägar mellan de olika foster regionerna av RNA-SEQ6. PI3K/akt reglerar självförnyelse och upprätthåller pluripotensen i hpsc, medan aktivering av fokal adhesionkinas främjar deras differentiering21,22. Således föreslår vi att karakterisera rollen av båda vägar i HAEC isolerade från olika anatomiska regioner under härstamnings-specifika differentiering protokoll. Dessutom visar flera studier skillnaderna mellan de båda regionerna när det gäller cellulära komponenter, molekylär funktion och biologiska processer. Till exempel har det regionspecifika genuttrycket och protein distributionen av aquaporiner, som är involverade i transportprocessen av intramembranös absorption, rapporterats23. En annan studie jämförde miRNome av Microarrays, visar regionspecifika uttryck för miR-145 och miR-143, den senare att kunna posttranskriptionellt reglera prostaglandin-endoperoxidas syntas 2 under särskilda förhållanden såsom arbete på termin16. Dessutom, placentabarriären regionen uppvisar högre mitokondriell andning men lägre reaktiva syre arter upptäckt jämfört med reflekterad vävnad15. Dissekera Amnion i reflekterade och placenta regioner uppmuntras att isolera HAEC och analysera deras egendomliga egenskaper separat, såsom frisättning av tillväxtfaktorer och cytokiner, deras låga immunogenicitet, produktion av extracellulär matris, effekten av deras konditionerade medium i samodling med andra celltyper, och nya funktioner såsom deras förmåga att upprätthålla HPSC linjer som en matar skikt24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vår forskning stöddes av bidrag från Instituto Nacional de Perinatología de México (21041 och 21081) och CONACYT (a1-S-8450 och 252756). Vi tackar Jessica González Norris och Lidia Yuriria Paredes Vivas för teknisk support.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Culture reagents | |||
| 2-Mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 21985023 | 55 mM |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 15240062 | 100X |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 12430054 | Supplemented with high glucose and HEPES |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific/Ambion | AM9260G | 0.5 M |
| Embryonic stem-cell FBS, qualified | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 10439024 | |
| Non-Essential Amino Acids | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 11140050 | 100X |
| Paraformaldehyde | any brand | ||
| Phosphate-Buffered Saline | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 10010023 | 1X |
| Saline solution (sodium chloride 0.9%) | any brand | ||
| Sodium Pyruvate | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 11360070 | 100 mM |
| Trypsin/EDTA 0.05% | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 25300054 | |
| Disposable material | |||
| 100 µm Cell Strainer | Corning/Falcon | 352360 | |
| 100 mm TC-Treated Culture Dish | Corning | 430167 | |
| 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3526 | |
| 6-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3516 | |
| Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube | any brand | with conical bottom | |
| Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 µl, 200 µl and 10 µl. | |||
| Sterile cotton gauzes | |||
| Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL | any brand | ||
| Sterile surgical gloves | any brand | ||
| Equipment | |||
| Biological safety cabinet | |||
| Centrifuge | |||
| Micropipettes | |||
| Motorized Pipet Filler/Dispenser | |||
| Sterile beakers of 500 mL | |||
| Sterile plastic cutting board | |||
| Sterile scalpels, scissors, forceps, clamps | |||
| Sterile stainless steel container | |||
| Sterile tray | |||
| Tube Rotator | MaCSmix | ||
| Antibodies and Kits | Antibody ID | ||
| Anti-E-cadherin | BD Biosciences | 610181 | RRID:AB_3975 |
| Anti-KI67 | Santa Cruz | 23900 | RRID:AB_627859) |
| Anti-NANOG | Peprotech | 500-P236 | RRID:AB_1268274 |
| Anti-OCT4 | Abcam | ab19857 | RRID:AB_44517 |
| Anti-SOX2 | Millipore | AB5603 | RRID:AB_2286686 |
| Anti-SSEA-4 | Cell Signaling | 4755 | RRID:AB_1264259 |
| Anti-TRA-1-60 | Cell Signaling | 4746 | RRID:AB_2119059 |
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11029 | RRID:AB_2534088 |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-11036 | RRID:AB_10563566 |
| Tunel Assay Kit | Abcam | 66110 |
References
- Shahbazi, M. N., et al. Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues. Nature Cell Biology. 18 (6), 700-708 (2016).
- Garcia-Lopez, G., et al. Human amniotic epithelium (HAE) as a possible source of stem cells (SC). Gaceta Medica de Mexico. 151 (1), 66-74 (2015).
- Gramignoli, R., Srinivasan, R. C., Kannisto, K., Strom, S. C. Isolation of Human Amnion Epithelial Cells According to Current Good Manufacturing Procedures. Current Protocols in Stem Cell Biology. 37, (2016).
- Murphy, S., et al. Amnion epithelial cell isolation and characterization for clinical use. Current Protocols in Stem Cell Biology. , Chapter 1, Unit 1E 6 (2010).
- Garcia-Castro, I. L., et al. Markers of Pluripotency in Human Amniotic Epithelial Cells and Their Differentiation to Progenitor of Cortical Neurons. PLoS One. 10 (12), 0146082 (2015).
- Garcia-Lopez, G., et al. Pluripotency markers in tissue and cultivated cells in vitro of different regions of human amniotic epithelium. Experimental Cell Research. 375 (1), 31-41 (2019).
- Yang, P. J., et al. Biological characterization of human amniotic epithelial cells in a serum-free system and their safety evaluation. Acta Pharmacological Sinica. 39 (8), 1305-1316 (2018).
- Zou, G., et al. MicroRNA32 silences WWP2 expression to maintain the pluripotency of human amniotic epithelial stem cells and beta isletlike cell differentiation. International Journal of Molecular Medicine. 41 (4), 1983-1991 (2018).
- Avila-Gonzalez, D., et al. Capturing the ephemeral human pluripotent state. Developmental Dynamics. 245 (7), 762-773 (2016).
- Niknejad, H., et al. Properties of the amniotic membrane for potential use in tissue engineering. European Cells & Materials. 15, 88-99 (2008).
- Miki, T. Stem cell characteristics and the therapeutic potential of amniotic epithelial cells. American Journal of Reproductive Immunology. 80 (4), 13003 (2018).
- Wu, Q., et al. Comparison of the proliferation, migration and angiogenic properties of human amniotic epithelial and mesenchymal stem cells and their effects on endothelial cells. International Journal of Molecular Medicine. 39 (4), 918-926 (2017).
- Hammer, A., et al. Amnion epithelial cells, in contrast to trophoblast cells, express all classical HLA class I molecules together with HLA-G. American Journal of Reproductive Immunology. 37 (2), 161-171 (1997).
- Benirschke, K., et al. Anatomy and Pathology of the Placental Membranes. Pathology of the Human Placenta. , Springer. 268-318 (1995).
- Banerjee, A., et al. Different metabolic activity in placental and reflected regions of the human amniotic membrane. Placenta. 36 (11), 1329-1332 (2015).
- Kim, S. Y., et al. miR-143 regulation of prostaglandin-endoperoxidase synthase 2 in the amnion: implications for human parturition at term. PLoS One. 6 (9), 24131 (2011).
- Han, Y. M., et al. Region-specific gene expression profiling: novel evidence for biological heterogeneity of the human amnion. Biology of Reproduction. 79 (5), 954-961 (2008).
- Alcaraz, A., et al. Autocrine TGF-beta induces epithelial to mesenchymal transition in human amniotic epithelial cells. Cell Transplantation. 22 (8), 1351-1367 (2013).
- Canciello, A., et al. Progesterone prevents epithelial-mesenchymal transition of ovine amniotic epithelial cells and enhances their immunomodulatory properties. Scientific Reports. 7 (1), 3761 (2017).
- Canciello, A., Greco, L., Russo, V., Barboni, B. Amniotic Epithelial Cell Culture. Methods in Molecular Biology. 1817, 67-78 (2018).
- Singh, A. M., et al. Signaling network crosstalk in human pluripotent cells: a Smad2/3-regulated switch that controls the balance between self-renewal and differentiation. Cell Stem Cell. 10 (3), 312-326 (2012).
- Villa-Diaz, L. G., Kim, J. K., Laperle, A., Palecek, S. P., Krebsbach, P. H. Inhibition of Focal Adhesion Kinase Signaling by Integrin alpha6beta1 Supports Human Pluripotent Stem Cell Self-Renewal. Stem Cells. 34 (7), 1753-1764 (2016).
- Bednar, A. D., Beardall, M. K., Brace, R. A., Cheung, C. Y. Differential expression and regional distribution of aquaporins in amnion of normal and gestational diabetic pregnancies. Physiological Reports. 3 (3), 12320 (2015).
- Avila-Gonzalez, D., et al. Human amniotic epithelial cells as feeder layer to derive and maintain human embryonic stem cells from poor-quality embryos. Stem Cell Research. 15 (2), 322-324 (2015).
