Summary
يتجلى هنا هو وسيلة فعالة وفعالة من حيث التكلفة لتنقية والثقافة ، والتمييز بين الخلايا الجذعية المادة البيضاء من المخيخ الماوس بعد الولادة.
Abstract
معظم الخلايا العصبية المخيخ تنشأ من اثنين من المنافذ الجذعية الجنينية: كوة الشفاه rhombic، الذي يولد جميع الخلايا العصبية الجلوتاتيرية المنقفية المخيخ، ومكانة المنطقة البطينية، والتي تولد الخلايا GABAergic Purkinje المثبطة، والتي هي الخلايا العصبية التي تشكل نواة المخيخ العميق وبيرغمان جليا. في الآونة الأخيرة ، وصفت مكانة ثالثة للخلايا الجذعية التي تنشأ كمنطقة إنباتية ثانوية من منطقة البطين. يتم تعريف خلايا هذا المتخصصة من قبل علامة سطح الخلية prominin-1 ويتم توطينها إلى المسألة البيضاء النامية من المخيخ بعد الولادة. هذا المتخصصة حسابات للطبقة الجزيئية ولدت في وقت متأخر GABAergic interneurons جنبا إلى جنب مع الخلايا الفلكية المخيخ ولدت بعد الولادة. بالإضافة إلى دورها التنموي ، تكتسب هذه المتخصصة أهمية ترجمة فيما يتعلق بمشاركتها في التنكس العصبي وورم. كان من الصعب فك شفرة بيولوجيا هذه الخلايا بسبب عدم وجود تقنيات فعالة لتنقيتها. أظهرت هنا هي أساليب فعالة لتنقية والثقافة، والتمييز بين هذه الخلايا الجذعية المخيخ بعد الولادة.
Introduction
وقد اعترف المخيخ منذ فترة طويلة كدائرة الخلايا العصبية الرئيسية تنسيق الحركة الطوعية1. ويتلقى مدخلات من مساحات واسعة من المحور العصبي ، والذي يتضمن معلومات تنبؤية من المحيط ، وذلك لضبط إخراج المحرك وتنسيق الحركة. في الآونة الأخيرة ، كما تورط في تنظيم الإدراك والعواطف عن طريق استخدام شبكات معالجة المعلومات المماثلة2،3،4.
يتكون المخيخ البالغ من قشرة المخيخ الخارجي والمادة البيضاء الداخلية. تتخللها داخل هذه الهياكل هي نواة عميقة intracerebellar. على غرار بقية الجهاز العصبي ، يتم تحفيز تطور المخيخ بسبب انتشار الخلايا السلف متعددة القدرات (الخلايا الجذعية) التي تهاجر وتفرق لتسفر عن هذا الهيكل المنظم جيدًا. في التنمية المبكرة (E10.5 -E13.5) ، والمتخصصة الجذعية البطينية حول البطين الرابع النامية يولد الخلايا العصبية GABAergic (أي، خلايا Purkinje، خلايا لوغانو، خلايا غولجي) جنبا إلى جنب مع بيرغمان غليا5،6،7،8.
في وقت لاحق في التنمية (بعد الولادة الأسبوع الأول), مكانة الخلية الجذعية الثانية في الشفة rhombic يولد MATH1- ونستين التعبير عن السلف التي تؤدي إلى الخلايا العصبية الحبيبية مثير9,10,11,12. في الآونة الأخيرة تم وصف مكانة ثالثة للخلايا الجذعية13. هذه الخلايا التعبير عن prominin-1 (المعروف أيضا باسم CD133), غشاء تمتد الجليكوبروتين الذي يحدد مجموعة فرعية من الخلايا الجذعية في الأمعاء والنظم الهيماتوبويتيك14,,15,,16. في خريطة مصير الجسم الحي يظهر أن هذه الخلايا الجذعية تولد الطبقة الجزيئية الرئيسية interneurons (أي خلايا السلال والخلايا ستيلاتي)، جنبا إلى جنب مع الخلايا الفلكية، خلال الأسابيع الثلاثة الأولى بعد الولادة. في الماضي، كان من الصعب دراسة هذه الخلايا في المختبر لأن الأساليب السابقة قد تتطلب تقنيات مكلفة وتستغرق وقتا طويلا (أي، فرز الخلايا المنشطة فلورسينس [FACS]) التي تعتمد على prominin-1 تلطيخ12،,13،,17. يصف هذا البروتوكول طريقة تعتمد على المغناطيسية المناعية لعزل هذه الخلايا الجذعية التي يمكن بعد ذلك أن تكون مثقفة ومتمايزة بسهولة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
أجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا ً لدليل المعاهد القومية للصحة لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية (2011) وتمت الموافقة عليها من قبل جامعة نورث وسترن IACUC (بروتوكول IS00011368).
1- إعداد الحلول
- إعداد محلول انفصال الأنسجة المصنوعة من الفينول المعقم المحتوي على أحمر الحمراء Dulbecco في الفوسفات المخزنة مؤقتا المالحة (DPBS) مع الباباين (100 U/ ml), السيستين (0.2 ملغ / مل) وDNase (250 U/ml).
- لإعداد حل DNase تمييع 100 ملغ من مسحوق lyophilized من DNase I (زجاجة واحدة) في 50 مل من H2O. ميكس جيدا وتصفية محلول الأسهم. إعداد 10 مل الأسهم aliquots. تقسيم أنبوب واحد الأسهم إلى 0.5 مل استخدام واحد aliquots. تخزين هذه aliquots استخدام واحد في -80 درجة مئوية.
- إعداد الكواشف فصل المغناطيسي عن طريق إعداد العمود المغناطيسي عازلة X: 0.5٪ الزل في مصل البقري (BSA) و 2 mM EDTA الحل.
- لإعداد وسائل الإعلام العصبية, استخدام المتوسطة العصبية القاعدية التي تحتوي على البنسلين / العقديات مع L-الجلوتامين والملحق مع 2% B27, 20 نانوغرام / مل عامل نمو البشرة المؤتلف البشري (EGF), و 20 نانوغرام / مل الإنسان المؤتلف عامل النمو الليفي الأساسي (bFGF).
- لإعداد الوسائط التمايز, استخدام المتوسطة العصبية والملحق مع 10 نانوغرام / مل عامل نمو مشتق من الصفائح الدموية (PDGF-AA) أو 10 نانوغرام / مل عامل مثبط لسرطان الدم (LIF) و 2٪ B27.
- استخدام المرفق منخفضة جدا 12 جيدا (3.5 سم2)و 6 جيدا (9.6 سم2)لوحات الثقافة.
2. تشريح من Cerebellum
- تُسَخّر َ الجراء ُ تَوَجَعَ الفأر (P3-P7) مع الإيزوفران وقطع الرأس باستخدام المقص الجراحي.
- رش الرأس المنفصل للجراء مع الإيثانول 70٪.
- نقل كل رأس إلى طبق ثقافة معقمة فارغة 10 سم. فصل الجلد باستخدام مقص microdissection، ثم إزالة الجمجمة عن طريق تشغيل sagittal مقص على طول خط الوسط.
- باستخدام #7 ملقط، قشر قبالة عظام الجمجمة بدءا من caudally جذع الدماغ. رفع بعناية الدماغ باستخدام ملعقة، والحفاظ على المخيخ سليمة، ونقل الدماغ إلى طبق معقم جديد 10.0 سم تحتوي على 15 مل من محلول الملح المتوازن المنظّم لـ"هانكس" (HBSS).
- ضع الطبق الذي يحتوي على الدماغ تحت مجهر تشريح. باستخدام #5 الملقط غرامة، وإزالة meninges والأوعية الدموية الكبيرة من المخيخ وفصل المخيخ من جذع الدماغ باستخدام ملعقة.
- نقل المخيخ إلى أنبوب طرد مركزي 15 مل يحتوي على 5.0 مل من محلول HBSS الجليد الباردة. غسل المخيخ عن طريق الرص الرص وdecanting 3x مع 5.0 مل من HBSS.
ملاحظة: وينبغي وضع كل المخيخ في أنبوب الخاصة به لمزيد من المعالجة.
3. إعداد تعليق الخلية
- بعد الشطف الأخير ، أضف 5 مل من محلول تفكيك الأنسجة المستندة إلى الباباين (استنادًا إلى العمل السابق13،18)الذي تم تسخينه مسبقًا إلى 37 درجة مئوية. احتضان الأنسجة لمدة 15 دقيقة في 37 درجة مئوية في حمام مائي. خلط المحتوى ببطء عن طريق عكس أنبوب صعودا وهبوطا 3x-5x كل 3 دقيقة إما باستخدام خلاط الجوز أو باليد.
- إعداد قطر واسع (ماصة الزجاج العادية) وضيق قطر هابستر pipette (النار مصقول عن طريق التدفئة على موقد بونسن) كما هو موضح سابقا19.
- غسل الأنسجة 3x مع 5 مل من محلول HBSS، وتجنب فقدان الأنسجة أثناء التفكيك باليد.
- إزالة غسل HBSS الماضي وإضافة 5 مل من محلول DPBS التي تحتوي على 250 ميكرولتر من محلول DNase إلى الأنسجة. فصل الأنسجة عن طريق التواز 10x-15x باستخدام ماصة باستور ذات القطر العريض. تنفيذ هذه الخطوة بلطف لتجنب تشكيل فقاعات.
- ثم احتضان الطين لمدة 10 دقيقة إضافية في 37 درجة مئوية في حمام الماء، والاختلاط عن طريق عكس واستقامة الأنبوب.
- استخدام انخفاض قطر بستر ماصة لمزيد من triturate الطين الأنسجة 10x. إذا بقيت قطع كبيرة من الأنسجة، اضغط على قطع الأنسجة مقابل الجزء السفلي من الأنبوب مع غيض من ماصة بلطف ومواصلة الأنابيب حتى تصل الخلايا إلى تعليق غرامة.
- احتضان الأنسجة في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة إضافية، وتكرار خطوات الخلط السابقة.
4. وضع العلامات المناعية للخلايا الجذعية
- ضع أنابيب الطرد المركزي على الجليد واستخدم حلول الجليد البارد ة للخطوات التالية. سلالة الخلايا المنفصلة من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر في أنبوب طرد مركزي 50 مل. قم بقم بفلتر مع 10.0 مل من محلول HBSS لضمان مرور الخلايا عبر الشبكة في هذا الحل الإضافي.
- نقل الخلايا المصفاة إلى أنبوب طرد مركزي جديد 15 مل والطرد المركزي تعليق الخلية في 300 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية. تستنشق وتجاهل supernatant تماما عن طريق بعناية باستخدام aspirator فراغ.
- إعادة تعليق بيليه في 160 ميكرولتر من المخزن المؤقت العمود المغناطيسي. للحصول على تعليق خلية واحدة قبل وضع العلامات المغناطيسية، تمرير الخلايا من خلال شبكة النايلون 30 ميكرومتر لإزالة كتل الخلية، والتي يمكن أن تسد العمود خلاف ذلك.
- إضافة 40 ميكرولتر من الميكروبات المضادة للبرومينين-1 إلى كل أنبوب 15 مل، مزيج، واحتضان في ثلاجة لمدة 15 دقيقة من أجل الأجسام المضادة لربط الخلايا برومينين-1-التعبير.
- اغسل الخلايا بإضافة 1.0-2.0 مل من العمود العازل X والطرد المركزي عند 300 × ز لمدة 10 دقيقة.
- إعادة تعليق بيليه في 1.0 مل من العمود المؤقت X.
ملاحظة: إذا شوهدت كتل صغيرة بعد إعادة تعليق بيليه مع 1.0 مل من العمود المؤقت X ، فيجب إزالتها بعناية باستخدام طرف من ماصة باستور ، وإلا يمكن لهذه الكتل منع العمود المغناطيسي أثناء فرز الخلايا.
5. إعداد العمود المغناطيسي، فرز الخلايا، والطلاء
ملاحظة: يجب إجراء الانفصال المغناطيسي عن حالات النمط الجيني المختلفة (المرض مقابل السيطرة) في نفس الوقت ، لأن أي تأخير قد يؤثر على مورفولوجيا الغلاف العصبي.
- إعداد الأعمدة المغناطيسية عن طريق وضعها على موقف المغناطيسي يتعرض للمجال المغناطيسي. شطف العمود مرة واحدة مع 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت X عن طريق تطبيق المخزن المؤقت الذي يقطر في أنبوب الطرد المركزي ليتم التخلص منها.
ملاحظة: إعداد العمود المغناطيسي الجديد المؤقت X لكل تجربة؛ إذا لم يكن كذلك ، ثم العائد من الخلايا الجذعية ستكون منخفضة. - تطبيق تعليق الخلية المسمى على العمود. جمع flowthrough تحتوي على الخلايا غير المسمى التي تتكون أساسا من خلايا المخيخ العصبية / الدبقية المختلطة في أنابيب جديدة 15 مل(الشكل 1A).
- اغسل العمود 3x بـ 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت X (كل غسل يستغرق حوالي 2-4 دقيقة).
ملاحظة: يمكن أن تكون الخلايا العصبية المخيبل / الثقافة المختلطة جليال المخصب مع الخلايا العصبية الحبيبية المخيخ بمثابة منتج ثانوي مفيد لهذه الخطوة تنقية. - قم بإزالة العمود من المجال المغناطيسي وضعه في أنبوب 1.5 مل. إضافة 1.0 مل من الثقافة المتوسطة (المتوسطة الغلاف العصبي) إلى العمود ودفع المكبس في العمود لطرد الخلايا الموسومة مع حبات prominin-1 في أنبوب جديد 1.5 مل الصقر.
- لتعزيز نقاء الخلايا المسماة prominin-1، مرر الخلايا المصممة على عمود ثانٍ باتباع الخطوات 5.1-5.4.
- عد الخلايا مع مقياس الهيموكيتومتر. العائد النموذجي هو 107 خلايا لكل مخيخ. قم بصف الخلايا على لوحات مرفق منخفضة للغاية (6 أو 12 بئرًا ، استنادًا إلى الكثافة المطلوبة لتجارب المصب).
6. تمرير من المجالات العصبية والتمايز
- لوحة الخلايا الجذعية prominin-1 المسمى على مرفق منخفض للغاية 12 لوحات جيدا في المتوسطة الغلاف العصبي (5000 خلية / جيدا).
- بعد 7-10 أيام، تنقسم الخلايا لتسفر عن كرات على شكل كرات الخلايا العصبية العائمة (الخلايا العصبية الأولية).
ملاحظة: في هذه التجربة، يتم إنشاء المجالات العصبية الثانوية التي تتوسع في الأرقام لمزيد من الاستخدام. لا تستخدم مجموعات الخلايا العصبية الأولية في هذه التجارب، لأنها قد تحتوي على خلايا ملوثة ليس لها خصائص الخلايا الجذعية ويمكن أن تتجمع مع الخلايا العصبية. - للتمرير، قم بنقل المجالات العصبية الأساسية مع الوسائط الثقافية باستخدام نصائح ماصة 1.0 مل إلى أنبوب طرد مركزي معقم بـ 15 مل. بيليه الاعصاب عن طريق الطرد المركزي في 300 × ز لمدة 5 دقيقة والتخلص من supernatant.
- إعادة تعليق بيليه في 5 مل من وسائل الإعلام الانفصام الأنسجة التي تحتوي على الباباين أو 0.05% محلول التربسين. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
- طرد مركزي تعليق الخلية في 300 × ز لمدة 5 دقيقة. إعادة تعليق الخلايا في 5 مل من المتوسطة الغلاف العصبي وفصلها الخلايا ميكانيكيا باستخدام ماصة باستور بلاستيكية والأنابيب ببطء صعودا وهبوطا 10x.
- لوحة الخلايا (مرة أخرى) في وسائل الإعلام العصبيكما هو موضح سابقا. بعد 7-10 أيام في الثقافة، يجب إثراء اللوحة بعالم الأعصاب الثانوي.
ملاحظة: ويمكن تمرير هذه الثقافات تصل إلى 8x مع كفاءة جيدة، وبعد ذلك حجم الغلاف العصبي يميل إلى أن يكون أصغر وموحية من انخفاض في الانتشار. - عد الخلايا على مقياس الهيموكيتومتر ولوحة العدد الأمثل للتجارب المستقبلية على لوحات المغلفة بولي-د-ليسين (6 أو 12 بئر).
- للتمييز بين الخلايا الجذعية، جمع الخلايا العصبية من الممر الثاني إلى الثامن عن طريق الطرد المركزي كما هو موضح سابقا، إلا إضافة المتوسطة التمايز إلى بيليه.
ملاحظة: بعد 7 أيام في المختبر، والخلايا الجذعية التفريق في الخلايا العصبية، والخلايا الفلكية، وoligodendrocytes، كما يتضح من تلطيخ مع علامة الخلايا العصبية α-III توبولين، علامة الخلايا الفلكية GFAP، وصانع oligodendrocyte O4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
شكلت الخلايا الجذعية المخيخية الإيجابية من برومينين-1 بعد الولادة الخلايا العصبية في الغلاف العصبي المتوسط الغني بعوامل النمو (EGF و bFGF). كانت هذه الخلايا العصبية إيجابية لبلتينين-1-تلطيخ، علامة تستخدم للعزل، وأيضا كوصمة عار لعلامات الخلايا الجذعية الأخرى مثل نيستين وGFAP13 (الشكل 1). تم الحفاظ على تعبير علامة الخلايا الجذعية في جميع أنحاء الثقافة ولمدة تصل إلى ما لا يقل عن ثمانية ممرات20. عند انسحاب عوامل النمو وفي وجود LIF و PDGF-AA (وهي العوامل التي تدعم التمايز العصبي والكلي21،22)، والآثار العصبية المتمايزة في الأنساب العصبية وجلية(الشكل 2).
الشكل 1: عزل الخلايا الجذعية البرومينين-1 عن المخيخ بعد الولادة. (أ)تم عزل الخلايا الجذعية المخيخة باستخدام حبات برومينين-1 المغناطيسية المناعية. اللوحة العلوية: شكلت الخلايا الجذعية النقية (المرتبطة بالعمود) الخلايا العصبية ذات الانتشار الواسع وخصائص التجديد الذاتي. لم تتمكن الخلايا غير المنضمة إلى العمود (flowthrough) من تشكيل الخلايا العصبية. بدلا من ذلك، أصبحت خلايا الخلايا العصبية / الدبقية المختلطة (α-III tubulin/GFAP). أسفل اللوحة: الخلايا العصبية التي تشكلت من الخلايا prominin-1+ التعبير عن علامات الخلايا الجذعية الخاصة: نيتين، برومينين-1، وGFAP. (ب)الخلايا في flowthrough السلبية الملطخة لعلامات الخلايا الجذعية prominin-1 وعشين وإيجابية لعلامة الخلايا العصبية α-III توبولين. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تمايز التّيبّاجين-1 النّاسيّات العصبيّة الإيجابية. في وجود عوامل التمايز (PDGF-AA أو LIF)، الخلايا العصبية الإيجابية البرومينين 1 المتباينة إلى الخلايا العصبية (α-III tubulin)، الخلايا الفلكية (GFAP)، وoligodendrocytes (O4). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الخلايا الجذعية الركرياتين-1-التعبير عن المخيخ يقيم في المادة البيضاء المحتملة خلال الأسابيع 3 الأولى من الحياة بعد الولادة. يتم التحكم في انتشارها بإحكام من قبل مسار القنفذ الصوتي الذي تدعمه خلايا Purkinje17. هذه الخلايا الجذعية / السلف تسهم في لاحق ولدت GABAergic interneurons تسمى خلايا السلة والخلايا ستيلاتي. هذه الخلايا العصبية الموجودة في الطبقة الجزيئية، حيث أنها مشبك على خلايا Purkinje ونحت تضاريس الكمبيوتر ووظيفة عبر تثبيط GABAergic13،17،23. إلى جانب تشكيل interneurons, هذا السكان الخلايا الجذعية يولد أيضا جميع الخلايا الفلكية المخيخ المستمدة بعد الولادة17,,24.
يصف هذا البروتوكول طريقة سهلة وفعالة من حيث التكلفة لتنقية الخلايا الجذعية prominin-1/CD133 من المخيخ الماوس بعد الولادة. يجب أن تكون الخلايا الجذعية مثقفة في لوحات المرفقات منخفضة للغاية. قد يؤدي استزراع هذه الخلايا الجذعية في الصفائح العادية إلى تعلق الخلايا العصبية على السطح ويؤدي إلى انخفاض انتشار الخلايا الجذعية والتمايز. هنا، يتوافق العائد من 200-300 من الخلايا العصبية لكل 5000 خلية مع عائد الخلايا الجذعية حوالي 1 × 107 خلايا من المخيخ الواحد. وهذا يماثل ما وُصف لاستراتيجية تستند إلى نظام مراقبة الأصول الميدانية يزيد تكلفة الاستراتيجية عن 10 x. وعلاوة على ذلك، تتطلب معدات القوات المسلحة الكونغولية إعدادا مكلفا وموظفين مدربين تدريبا عاليا، وهي غير متاحة بسهولة.
هذه الخلايا الجذعية تكتسب أيضا أهمية متزايدة في الترجمة في البحوث على السرطان وكذلك العصبية النمائية والاضطرابات العصبية25,26,27. انتشار غير المنضبط لهذه الخلايا الجذعية في الحياة المبكرة يؤدي إلى ورم الأرومية النخاعية28, في حين أن البحوث من مختبرنا الخاص تشير إلى أن انتشارها غير طبيعي والتمايز يمكن أن تسهم في الضمور المخيخ في وقت لاحق في مرض الأمراض الوراثية السنعور ة الرنح من نوع 120. وستكون هذه البروتوكولات الجديدة ذات قيمة لدراسة هذه الخلايا وتوفير نظرة جديدة على أدوارها في الصحة والمرض. قد تؤدي هذه الطرق أيضًا إلى تقدم في العلاجات التجديدية بعد السكتة الدماغية أو الصدمة وغيرها من الإهانات للدماغ التي من شأنها أن تبرر تجديد الأعصاب. ومن المتصور أن هذه التقنيات يمكن تعميمها لاستخراج الخلايا الجذعية برومينين-1-التعبير من الأنسجة الأخرى، مثل الأمعاء ونخاع العظام، حيث يتم التعبير عنها أيضا15،29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولم يُعلن عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نشكر أعضاء مختبر أوبال على اقتراحاتهم. تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة المنح 1RO1 NS062051 و 1RO1NS08251 (أوبال P)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05%Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | 0.05% |
| 2% B27 | Gibco; Thermo Fisher Scientific | 17504001 | |
| 2 mM EDTA solution | Corning | 46-034-CI | |
| Anti- Prominin-1 microbeads | Miltenyi Biote | 130-092-333 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A9418 | |
| Column MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Culture plates ultra - low attachment | Corning | 3473 | |
| Cysteine | Sigma | C7880 | |
| DNase | Sigma | D4513-1VL | 250 U/ml |
| Dulbecco’s Phosphate Buffer Saline | Thermo Fisher Scientific | 14040141 | |
| Hank's balanced salt solution-HBSS | Gibco | 14025-092 | |
| Human recombinant Basic Fibroblast Growth Factor | Promega | G507A | 20 ng/mL |
| Human recombinant Epidermal Growth Factor | Promega | G502A | 20 ng/mL |
| Leukemia Inhibitory Factor | Sigma | L5158 | |
| l-glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Microscopy | Lieca TCS SP5 confocal microscopes | ||
| MiniMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| Mouse anti-Prominin-1 | Affymetrix eBioscience | 14-1331 | 1 in 100 |
| Nestin | Abcam | ab27952 | 1 in 200 |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher | 25030081 | |
| O4 | Millopore | MAB345 | |
| Papain | Worthington | LS003126 | (100 U/mL) |
| Platelet- Derived Growth Factor | Sigma | H8291 | 10 ng/mL |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P6407 | |
| Rabbit anti-tubulin, b-III | Sigma | T2200 | 1 in 500 |
| Rabit anti-GFAP | Dako | Z0334 | 1 in 500 |
| Separation columns-MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Sterile cell strainer | Fisher Scientific | 22363547 | 40 μm |
References
- Glickstein, M., Strata, P., Voogd, J. Cerebellum: history. Neuroscience. 162, 549-559 (2009).
- Carta, I., Chen, C. H., Schott, A. L., Dorizan, S., Khodakhah, K. Cerebellar modulation of the reward circuitry and social behavior. Science. 363, (2019).
- Sathyanesan, A., et al. Emerging connections between cerebellar development, behaviour and complex brain disorders. Nature Reviews Neuroscience. 20, 298-313 (2019).
- Wagner, M. J., Kim, T. H., Savall, J., Schnitzer, M. J., Luo, L. Cerebellar granule cells encode the expectation of reward. Nature. 544, 96-100 (2017).
- Araujo, A. P. B., Carpi-Santos, R., Gomes, F. C. A. The Role of Astrocytes in the Development of the Cerebellum. Cerebellum. , (2019).
- Seto, Y., et al. Temporal identity transition from Purkinje cell progenitors to GABAergic interneuron progenitors in the cerebellum. Nature Communication. 5, 3337 (2014).
- Marzban, H., et al. Cellular commitment in the developing cerebellum. Frontiers in Cell Neurosciences. 8, 450 (2014).
- Koziol, L. F., et al. Consensus paper: the cerebellum's role in movement and cognition. Cerebellum. 13, London, England. 151-177 (2014).
- Ben-Arie, N., et al. Math1 is essential for genesis of cerebellar granule neurons. Nature. 390, 169-172 (1997).
- Machold, R., Fishell, G. Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors. Neuron. 48, 17-24 (2005).
- Wang, V. Y., Rose, M. F., Zoghbi, H. Y. Math1 expression redefines the rhombic lip derivatives and reveals novel lineages within the brainstem and cerebellum. Neuron. 48, 31-43 (2005).
- Li, P., et al. A population of Nestin-expressing progenitors in the cerebellum exhibits increased tumorigenicity. Nature Neurosciences. 16, 1737-1744 (2013).
- Lee, A., et al. Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum. Nature Neurosciences. 8, 723-729 (2005).
- Toren, A., et al. CD133-positive hematopoietic stem cell "stemness" genes contain many genes mutated or abnormally expressed in leukemia. Stem Cells. 23, 1142-1153 (2005).
- Zhu, L., et al. Prominin 1 marks intestinal stem cells that are susceptible to neoplastic transformation. Nature. 457, 603-607 (2009).
- Man, S. M., et al. Critical Role for the DNA Sensor AIM2 in Stem Cell Proliferation and Cancer. Cell. 162, 45-58 (2015).
- Fleming, J. T., et al. The Purkinje neuron acts as a central regulator of spatially and functionally distinct cerebellar precursors. Developmental Cell. 27, 278-292 (2013).
- Panchision, D. M., et al. Optimized flow cytometric analysis of central nervous system tissue reveals novel functional relationships among cells expressing CD133, CD15, and CD24. Stem Cells. 25, 1560-1570 (2007).
- Beaudoin, G. M., et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nature Protocols. 7, 1741-1754 (2012).
- Edamakanti, C. R., Do, J., Didonna, A., Martina, M., Opal, P. Mutant ataxin1 disrupts cerebellar development in spinocerebellar ataxia type 1. Journal of Clinical Investigation. 128, 2252-2265 (2018).
- Erlandsson, A., Enarsson, M., Forsberg-Nilsson, K. Immature neurons from CNS stem cells proliferate in response to platelet-derived growth factor. Journal of Neurosciences. 21, 3483-3491 (2001).
- Galli, R., Pagano, S. F., Gritti, A., Vescovi, A. L. Regulation of neuronal differentiation in human CNS stem cell progeny by leukemia inhibitory factor. Developmental Neurosciences. 22, 86-95 (2000).
- Silbereis, J., Cheng, E., Ganat, Y. M., Ment, L. R., Vaccarino, F. M. Precursors with Glial Fibrillary Acidic Protein Promoter Activity Transiently Generate GABA Interneurons in the Postnatal Cerebellum. Stem Cells. 27, 1152-1163 (2009).
- Parmigiani, E., et al. Heterogeneity and Bipotency of Astroglial-Like Cerebellar Progenitors along the Interneuron and Glial Lineages. Journal of Neurosciences. 35, 7388-7402 (2015).
- Wojcinski, A., et al. Cerebellar granule cell replenishment postinjury by adaptive reprogramming of Nestin(+) progenitors. Nature Neurosciences. 20, 1361-1370 (2017).
- Yang, Z., Joyner, A. L. YAP1 is involved in replenishment of granule cell precursors following injury to the neonatal cerebellum. Developmental Biology. 1606 (19), 30207 (2019).
- Wang, S. S., Kloth, A. D., Badura, A. The cerebellum, sensitive periods, and autism. Neuron. 83, 518-532 (2014).
- Eberhart, C. G. Three down and one to go: modeling medulloblastoma subgroups. Cancer Cell. 21, 137-138 (2012).
- Takahashi, M., et al. CD133 is a positive marker for a distinct class of primitive human cord blood-derived CD34-negative hematopoietic stem cells. Leukemia. 28, 1308-1315 (2014).
