Summary
ここで実証されているのが、白物質幹細胞を出生後マウス小脳から精製、培養、分化するための効率的で費用対効果の高い方法です。
Abstract
ほとんどの小脳ニューロンは、すべての小脳興奮性グルタミン酸ニューロンを生成する菱唇ニッチと、深部小脳核を構成するニューロンである抑制性GABAergic Purkinje細胞を生成する心室領域ニッチの2つの胚性幹細胞ニッチから生じる。近年、第3の幹細胞ニッチは、心室領域ニッチから二次的な発芽領域として生じると述べられてきた。このニッチの細胞は、細胞表面マーカープロミニニン-1によって定義され、出生後小脳の開発白色物質に局在する。このニッチは、出生後に生成された小脳アストロサイトと共に後期生まれた分子層GABAergicインターニューロンを占めています。彼らの発達の役割に加えて、このニッチは神経変性および腫瘍形成への関与に関して翻訳的重要性を得ている。これらの細胞の生物学は、その精製のための効率的な技術の欠如のために解読することが困難であった。ここで実証されているのは、これらの出生後小脳幹細胞を精製、培養、および分化するための効率的な方法です。
Introduction
小脳は、自主的な動きを調整する主要な神経回路として長い間認識されてきた1.それは、運動出力を微調整し、運動を調整するように、周囲からのプロプリオセプティブ情報を含む神経軸の広いスワッシュからの入力を受け取る。最近では、同様の情報処理ネットワーク,2、3、43を使用する可能性を有して認知や感情の調節にも関与している2。4
成体小脳は、外側の小脳皮質と内白物質で構成される。これらの構造内に散在する深いイントレースレクラ核である。神経系の他の部分と同様に、小脳の発達は、このよく組織化された構造を生み出すために移行し、分化する多能性前駆細胞(幹細胞)の増殖によって駆動される。初期の開発(E10.5-E13.5)では、第4心室の周りの心室幹ニッチ,は、ベルクマングリア,5、6、7、86と共にGABAergicニューロン(すなわち、プルキンジェ細胞、ルガロ細胞、ゴルジ5細胞)を生成する。7
開発の後半(出生後第1週)において、菱唇の第2の幹細胞ニッチは、励起性顆粒ニューロン99、10、11、1210,11,12を生じさせるMATH1およびNestin発現前駆体を生成する。最近第三の幹細胞ニッチは13を説明した。これらの細胞は、プロミニン-1(CD133とも呼ばれる)を発現し、腸内および造血系14、15、16,15,16における幹細胞のサブセットを定義する膜スパン糖タンパク質である。生体内運命マッピングは、これらの幹細胞が出生後の最初の3週間の間に、アストロサイトと共に主要な分子層インターニューロン(すなわち、バスケット細胞および星状細胞)を生成することを示している。従来、これらの細胞をインビトロで研究することは困難であった従来の方法では、プロミニン-1染色12、13、17,13,17に依存する高価で時間のかかる技術(すなわち、蛍光活性化細胞選別[FACS])が必要であった。このプロトコルは、これらの幹細胞を容易に培養し、分化することができるこれらの幹細胞の単離のための免疫磁気ベースの方法を記述する。
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Protocol
すべての動物実験は、NIHの実験用動物のケアと使用ガイド(2011)に従って行われ、ノースウェスタン大学IACUC(プロトコルIS00011368)によって承認されました。
1. ソリューションの準備
- 無菌フェノール赤含有ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)をパパイン(100 U/ml)、システイン(0.2mg/ml)、DNase(250 U/ml)で作られた組織解離液を調製します。
- DNase溶液を調製するために、DNase Iの凍結乾燥粉末(1本)を50mLのH2Oで100mg希釈して調製し、ストック溶液を濾過する。10 mLストックアリコートを準備します。1つのストックチューブを0.5 mLの単一使用アリコートに分割します。これらの単一使用アリコートを-80 °Cに保存してください。
- 磁気カラムバッファーX:0.5%のウシ血清アルブミン(BSA)および2 mM EDTA溶液を調製して、磁気分離試薬を調製します。
- 神経圏培地を調製するには、ペニシリン/ストレプトマイシンを含む神経基底培地をL-グルタミンと共に使用し、2%B27、20 ng/mLヒト組換え表皮成長因子(EGF)、および20ng/mLヒト組換え塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)を添加する。
- 分化培地を調製するには、神経基底培地を使用し、10 ng/mL分化因子血小板由来成長因子(PDGF-AA)または10ng/mL白血病阻害因子(LIF)および2%B27を添加する。
- 超低添付ファイル12ウェル(3.5cm2)と6ウェル(9.6 cm2)の培養プレートを使用してください。
2. 小脳の解剖
- イオブルランでマウスの子犬(P3-P7)を麻酔し、手術用ハサミを使用して首を切る。
- 分離した子犬の頭部に70%エタノールをスプレーします。
- 空の無菌10センチ培養皿に各ヘッドを転送します。マイクロディセクセを使用して皮膚を分離し、その後、正中線に沿ってはさみを矢状に動かして頭蓋骨を取り除きます。
- 鉗子#7使用して、頭蓋骨の骨を脳幹から突き出して剥がします。慎重にヘラを使用して脳を持ち上げ、小脳をそのままにし、15 mLの氷冷ハンクスバランスソルト溶液(HBSS)溶液を含む新鮮な無菌10.0cm皿に脳を移します。
- 脳を含む皿を解剖顕微鏡の下に置きます。微細な#5鉗子を使用して、小脳から髄液と大きな血管を取り除き、へらを使用して脳幹から小脳を分離する。
- 5.0 mLの氷冷HBSS溶液を含む15 mL遠心分離管に小脳を移します。5.0 mLのHBSSで3倍の洗浄とデカンスを行い、小脳を洗浄します。
注:各小脳は、さらなる処理のために独自のチューブに配置する必要があります。
3. 細胞懸濁液調製
- 最後のすすめの後、37°Cに予め温めた5 mLのパパインベースの組織解離液(前の作業13、18,18に基づく)を加える。37°Cで15分間、水浴中に組織をインキュベートします。3分ごとに3x-5倍のチューブを上下に反転させ、3分ごとに、または手でゆっくりと内容を混ぜます。
- 広径(通常のガラスピペット)と狭径パスツールピペット(ブンゼンバーナーで加熱して火を磨く)を用意する(19.
- 5 mLのHBSS溶液で組織3xを洗浄し、手でデカンスしながら組織の損失を防ぐ。
- 最後のHBSS洗浄を取り除き、250 μLのDNase溶液を含むDPBS溶液を5 mL加えます。広径パスツールピペットを使用して10x-15xを三つ引きすることにより、組織を解約します。気泡の形成を避けるために、このステップを穏やかに実行します。
- その後、スラリーを水浴中の37°Cでさらに10分間インキュベートし、チューブを反転してまっすぐにして混合します。
- 還元された直径のパスツールピペットを使用して、組織スラリーを10倍にしてさらにトリチュレートします。大きな組織が残っている場合は、ピペットの先端を持つチューブの底に組織片をそっと押し付け、細胞が微細な懸濁液に達するまでピペットを続けます。
- 37°Cで組織をさらに10分間インキュベートし、前の混合工程を繰り返します。
4. 幹細胞の免疫標識
- 遠心分離管を氷の上に置き、次のステップには氷冷溶液を使用します。解約した細胞を40μmの細胞ストレーナーを通して50 mL遠心分離チューブにひずみます。10.0 mLのHBSSソリューションでフィルターを上にして、この追加ソリューションでセルがメッシュを通過するようにします。
- 濾過した細胞を新鮮な15 mL遠心チューブに移し、4°Cで10分間300 x gの細胞懸濁液を遠心分離します。吸気し、真空吸引器を用いて上清を完全に捨てます。
- ペレットを160 μLの磁気カラムバッファに再懸濁します。磁気ラベリングの前に単細胞懸濁液を得るために、30 μmのナイロンメッシュを通して細胞を通して細胞の塊を取り除き、それ以外の場合はカラムを詰まらせることができます。
- 各15 mLチューブに40 μLの抗プロミニリン-1マイクロビーズを加え、混合し、15分間冷蔵庫でインキュベートし、抗体をプロミニン-1発現細胞に結合させます。
- 100 x gで1.0~2.0mLのカラムバッファーXと遠心分離機を10分間加えて細胞を洗浄し、上清を完全に吸引します。
- ペレットをカラムバッファXの1.0 mLに再懸濁します。
注:カラムバッファXの1.0 mLでペレットを再懸濁した後に小さな塊が見られる場合、それらはパスツールピペットの先端を使用して慎重に除去されるべきであり、そうでなければこれらの塊は細胞のソート中に磁気カラムをブロックすることができる。
5. 磁気カラムの準備、細胞のソート、およびめっき
注:遅延が神経圏形態に影響を与える可能性があるため、異なる遺伝子型条件(疾患対コントロール)からの磁気分離を同時に行う必要があります。
- 磁界に露出した磁気スタンドに置いて、磁気カラムを準備します。500 μL のバッファー X でカラムを 1 回リンスし、投げる遠心分離管に滴下するバッファーを塗布します。
注:実験ごとに新鮮な磁気カラムバッファXを準備します。そうでなければ、幹細胞の収率は低くなります。 - ラベル付きセルサスペンションを列に適用します。主に小脳神経/グリア混合細胞からなる標識されていない細胞を含むフロースルーを、新鮮な15 mLチューブに集める(図1A)。
- 500 μLのバッファー X でカラム 3x を洗います(各洗浄は約 2 ~ 4 分かかります)。
注:小脳顆粒性ニューロンを富化した小脳神経/グリア混合培養は、この精製ステップの有用な副産物として役立つ可能性がある。 - 磁界からカラムを取り外し、1.5 mLチューブに入れる。1.0 mLの培養培地(神経球培地)をカラムに加え、プランジャーをカラムに押し込み、プロミニン-1ビーズでタグ付けされた細胞を新鮮な1.5mLのハヤブサチューブに洗い流します。
- プロミニン1標識細胞の純度を高めるには、手順5.1~5.4の後の2列目に溶出した細胞を渡します。
- ヘモサイトメーターで細胞を数えます。典型的な収量は小脳あたり107細胞である。細胞を超低い取り付けプレート(下流の実験に必要な密度に基づいて6または12ウェル)にプレートします。
6. 神経球の通過と分化
- プロミニン1標識幹細胞を神経球培地(5,000細胞/ウェル)の超低添付着12ウェルプレートにプレートします。
- 7~10日後、細胞は分裂してボール状の浮遊神経球(一次神経球)を生み出す。
注:本実験では、数が増える二次神経球が生成され、さらに使用されます。原発性神経球集団は、幹細胞特性を持たない汚染細胞を含み、神経球と一緒に凝集する可能性があるため、これらの実験には使用されません。 - 通過する場合、1.0 mLピペットチップを使用して15 mLの無菌遠心分離管に一次神経球を培養します。5分間300xgで遠心分離により神経球をペレット化 gし、上清を捨てる。
- パパインまたは0.05%トリプシン溶液を含む組織解離培地の5 mLにペレットを再懸濁します。37°Cで10分間インキュベートします。
- 5分間、300 x gで細胞懸濁液を遠心分離し、5 mLの神経圏培地で細胞を再懸濁し、プラスチック製のパスツールピペットを使用して細胞を機械的に解約し、ゆっくりと上下10倍のピペットを作ります。
- 先に述べたように、神経球培地に細胞を(再び)プレートします。培養で7〜10日後、プレートは二次神経球で濃縮されるべきである。
注:これらの培養物は、効率がよい8倍まで継代することができ、その後、神経球のサイズは小さく、増殖の減少を示唆する傾向がある。 - 血球計上の細胞を数え、ポリD-リジンコーティングされたプレート(6または12ウェル)の将来の実験に最適な数をプレートします。
- 幹細胞を分化するために、先に述べたように遠心分離によって第2から第8の通路から神経球を採取するが、ペレットに分化媒体を加える以外。
注:7日間のインビトロの後、幹細胞はニューロン、アストロサイト、およびオリゴデンドロサイトに分化し、ニューロンマーカーβ-III管状管状、アストロサイトマーカーGFAP、およびオリゴデンドロサイトメーカーO4で染色することによって示されるように。
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Representative Results
プロミニン-1陽性出生後小脳幹細胞は、成長因子が豊富な神経圏培地(EGFおよびbFGF)において神経球を形成した。これらの神経球は、プロミニン1染色に陽性であり、単離に使用されるマーカー、およびネスチンおよびGFAP13などの他の幹細胞マーカーの染色剤としてもあった(図1)。幹細胞マーカー発現は培養中、および少なくとも8節20まで維持した。成長因子の離脱時およびLIFおよびPDGF-AA(神経およびグリア分化を支持する因子である21,22)の21存在下で、神経球は神経およびグリア系統に分化した(図2)。
図1:出生後小脳からのプロミニン-1幹細胞の分離(A)小脳幹細胞を免疫磁気プロミニン-1ビーズを用いて単離した。トップパネル:精製幹細胞(カラム結合)は、広範な増殖および自己再生特性を有する神経球を形成した。カラムに結合していない細胞(フロースルー)は神経球を形成することができなかった。代わりに、小脳神経/グリア混合細胞(β-IIIチューブリン/GFAP)になりました。下部パネル:幹細胞特異的マーカーを発現するプロミニン-1+細胞から形成された神経球:ネスチン、プロミニン-1、およびGFAP。(B)フロースルー中の細胞は、幹細胞マーカープロミニン-1およびヌチンおよび陽性の神経マーカーβ-III管状に対して陰性に染色された。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2: プロミニン-1陽性神経球の分化分化因子(PDGF-AAまたはLIF)の存在下で、プロミニン-1陽性神経球はニューロン(β-III管状)、アストロサイト(GFAP)、およびオリゴデンドロサイト(O4)に分化した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
プロミニン1発現小脳幹細胞は、出生後の最初の3週間の間に将来の白質に存在する。彼らの増殖は、Purkinje細胞17によってサポートされるソニックヘッジホッグ経路によって厳密に制御される。これらの幹細胞/前駆細胞は、バスケット細胞および星状細胞と呼ばれる後生まれのGABAergicインターニューロンに寄与する。これらのインターニューロンは分子層に存在し、そこでそれらはプルキンジェ細胞上にシナプスし、GABAergic阻害13、17、23,17,23を介してPCの地形および機能を彫刻する。インターニューロンの形成に加えて、この幹細胞集団はまた、すべての出生後由来小脳アストロサイト17、24,24を生成する。
このプロトコルは、出生後マウス小脳からプロミニン1/CD133幹細胞を精製するための簡単で費用対効果の高い方法を記述する。幹細胞は超低い付着プレートで培養されなければならない。これらの幹細胞を正常なプレートに培養すると、神経球が表面に付着し、低い幹細胞増殖と分化を引き起こす可能性があります。ここでは、5,000細胞当たり200~300個の神経球の収量は、1つの小脳から約1 x107細胞の幹細胞収量に相当する。これは、10 倍のコストがかかる FACS ベースの戦略で説明されているのと同程度です。さらに、FACS機器は高価なセットアップと高度な訓練を受けた人員を必要とし、容易に入手できません。
これらの幹細胞は、がんの研究、ならびに神経発達および神経変性疾患25、26、2726,27の研究において翻訳25的意義を高めている。初期の生命におけるこれらの幹細胞の制御不能な増殖は髄芽腫28につながり、我々自身の研究室からの研究は、その異常な増殖および分化が遺伝性疾患脊髄小脳失調症の後の小脳変性に寄与し得ることを示唆している。これらの新しいプロトコルは、これらの細胞を研究し、健康と病気における彼らの役割に関する新しい洞察を提供するために貴重です。これらの方法はまた、脳卒中や外傷後の再生療法の進歩や神経再生を保証する脳への他の侮辱につながる可能性があります。これらの技術は、腸や骨髄などの他の組織からプロミニン1発現幹細胞を抽出するために一般化することができ、そこでも15,29,29を発現させることが考えられる。
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Disclosures
利益相反は宣言されていません。
Acknowledgments
私たちは、彼らの提案のためのオパールラボのメンバーに感謝します.この作業は、NIH助成金1RO1 NS062051と1RO1NS08251(オパールP)によってサポートされました
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05%Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | 0.05% |
| 2% B27 | Gibco; Thermo Fisher Scientific | 17504001 | |
| 2 mM EDTA solution | Corning | 46-034-CI | |
| Anti- Prominin-1 microbeads | Miltenyi Biote | 130-092-333 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A9418 | |
| Column MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Culture plates ultra - low attachment | Corning | 3473 | |
| Cysteine | Sigma | C7880 | |
| DNase | Sigma | D4513-1VL | 250 U/ml |
| Dulbecco’s Phosphate Buffer Saline | Thermo Fisher Scientific | 14040141 | |
| Hank's balanced salt solution-HBSS | Gibco | 14025-092 | |
| Human recombinant Basic Fibroblast Growth Factor | Promega | G507A | 20 ng/mL |
| Human recombinant Epidermal Growth Factor | Promega | G502A | 20 ng/mL |
| Leukemia Inhibitory Factor | Sigma | L5158 | |
| l-glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Microscopy | Lieca TCS SP5 confocal microscopes | ||
| MiniMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| Mouse anti-Prominin-1 | Affymetrix eBioscience | 14-1331 | 1 in 100 |
| Nestin | Abcam | ab27952 | 1 in 200 |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher | 25030081 | |
| O4 | Millopore | MAB345 | |
| Papain | Worthington | LS003126 | (100 U/mL) |
| Platelet- Derived Growth Factor | Sigma | H8291 | 10 ng/mL |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P6407 | |
| Rabbit anti-tubulin, b-III | Sigma | T2200 | 1 in 500 |
| Rabit anti-GFAP | Dako | Z0334 | 1 in 500 |
| Separation columns-MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Sterile cell strainer | Fisher Scientific | 22363547 | 40 μm |
References
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