Summary
Dimostrata qui è un metodo efficiente ed economico per purificare, coltura e differenziare le cellule staminali della materia bianca dal cervelletto mureno postnatale.
Abstract
La maggior parte dei neuroni cerebellari derivano da due nicchie di sfiato embrionale: una nicchia di labbra trombica, che genera tutti i neuroni glutamateri eccunitori cerebellari, e una nicchia di zona ventricolare, che genera le cellule inibitorie GABAergic Purkinje, che sono neuroni che costituiscono i nuclei goneturari profondi e Bergman glia. Recentemente, è stata descritta una terza nicchia di cellule staminali che si presenta come una zona germinale secondaria dalla nicchia della zona ventricolare. Le cellule di questa nicchia sono definite dal marcatore di superficie cellulare promininin-1 e sono localizzate per lo sviluppo della materia bianca in via di sviluppo del cervelletto postnatale. Questa nicchia rappresenta lo strato molecolare nato tardivo gabAergic interneurons insieme agli astrociti cerebellari generati postinnatally. Oltre al loro ruolo di sviluppo, questa nicchia sta guadagnando importanza traslazionale per quanto riguarda il suo coinvolgimento nella neurodegenerazione e nella tumorigenesi. La biologia di queste cellule è stata difficile da decifrare a causa della mancanza di tecniche efficienti per la loro purificazione. Didimostrato qui sono metodi efficienti per purificare, coltura, e differenziare queste cellule staminali cerebellari postnatali.
Introduction
Il cervelletto è stato a lungo riconosciuto come un importante circuito neuronale che coordina il movimento volontario1. Riceve input dalle ampie fasce della neurosaxis, che include informazioni propriocettive dalla periferia, in modo da ottimizzare l'uscita del motore e coordinare il movimento. Più recentemente, è stato anche implicato nella regolazione della cognizione e delle emozioni utilizzando potenzialmente simili reti di elaborazione delle informazioni2,3,4.
Il cervelletto adulto è composto da una corteccia cerebellare esterna e materia bianca interna. Intralciati all'interno di queste strutture sono nuclei intraceri profondi. Simile al resto del sistema nervoso, lo sviluppo del cervelletto è guidato dalla proliferazione di cellule progenitrici multipotenti (cellule staminali) che migrano e si differenziano per produrre questa struttura ben organizzata. Nel primo sviluppo (E10.5–E13.5), una nicchia di stelo ventricolare intorno al quarto ventricolo in via di sviluppo genera neuroni GABAergic (cioè, cellule Purkinje, cellule Lugaro, cellule di Golgi) insieme a Bergmann glia5,6,77,8.
Più avanti nello sviluppo (settimana postnatale uno), una seconda nicchia di cellule staminali nel labbro rombico genera progenitori che esprimono MATH1 e Nestin che esprimono che danno origine a neuroni eccunetadi eccunitari9,10,11,12. Recentemente una terza nicchia di cellule staminali è statadescritta 13. Queste cellule esprimono promininin-1 (noto anche come CD133), una glicoproteina che definisce un sottoinsieme di cellule staminali nei sistemi intestinali ed ematopoietici14,15,16. La mappatura del destino in vivo mostra che queste cellule staminali generano interneuroni chiave dello strato molecolare (cioè le cellule del cesto e le cellule stellate), insieme agli astrociti, durante le prime tre settimane postnatali. In passato, è stato difficile studiare queste cellule in vitro perché i metodi precedenti hanno richiesto tecniche costose e dispendiose in termini di tempo (ad esempio, lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza [FACS]) che dipendono dalla colorazione prominin-112,13,17. Questo protocollo descrive un metodo immunomagnetico per l'isolamento di queste cellule staminali che possono quindi essere facilmente coltivate e differenziate.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati effettuati in conformità con la NiH's Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (2011) e sono stati approvati dalla Northwestern University IACUC (Protocollo IS00011368).
1. Preparazione delle soluzioni
- Preparare la soluzione di dissociazione dei tessuti realizzata con fenolo sterile rosso di Dulbecco con la salina tamponata da fosfato (DPBS) con papaina (100 U/ml), cisteina (0,2 mg/ml) e DNase (250 U/ml).
- Per preparare la soluzione DNase diluire 100 mg della polvere liofilizzata di DNase I (una bottiglia) in 50 mL di H2O. Mescolare bene e filtrare la soluzione di magazzino. Preparare 10 mL di scorte aliquote. Dividere un tubo di magazzino in aliquote ad uso singolo da 0,5 mL. Conservare questi aliquots monouso a -80 gradi centigradi.
- Preparare i reagenti di separazione magnetica preparando il buffer a colonna magnetica X: 0,5% di albumina di siero bovino (BSA) e soluzione EDTA a 2 mM.
- Per preparare i media della neurosfera, utilizzare il mezzo neurobasale contenente penicillina/streptomimina con L-glutamina e integrare con 2% B27, 20 ng/mL fattore di crescita epidermica umana ricombinante (EGF), e 20 ng/mL fattore di crescita fibroblasto di base ricombinante umano (bFGF).
- Per preparare i mezzi di differenziazione, utilizzare il mezzo neurobasale e integrare con 10 ng/mL fattore di crescita differenziato fattore di crescita (PDGF-AA) o 10 ng/mL fattore inibitorio leucemia (LIF) e 2% B27.
- Utilizzare l'attacco ultra-basso 12 bene (3,5 cm2) e 6 pozze di pozzo (9,6 cm2) piastre di coltura.
2. Dissezione del cervelletto
- Anestetizza i cuccioli di topo (P3-P7) con isoflurane e decapita usando forbici chirurgiche.
- Spruzzare la testa separata dei cuccioli con 70% di etanolo.
- Trasferire ogni testa in un piatto di coltura sterile vuoto 10 cm. Separare la pelle utilizzando le forbici microdissection, quindi rimuovere il cranio eseguendo le forbici sagittal lungo la linea mediana.
- Usando #7 pinze, staccare le ossa del cranio a partire caudally dal tronco encefalico. Sollevare con attenzione il cervello utilizzando una spatola, mantenendo intatto il cervelletto, e trasferire il cervello in un piatto sterile fresco di 10,0 cm contenente 15 mL di soluzione di sale equilibrato (HBSS) ghiacciato.
- Posizionare il piatto contenente il cervello al microscopio di dissezione. Utilizzando sottili #5 pinze, rimuovere le meningi e grandi vasi sanguigni dal cervelletto e separare il cervelletto dal tronco encefalico utilizzando la spatola.
- Trasferire il cervelletto in un tubo di centrifuga di 15 mL contenente 5,0 mL di soluzione HBSS ghiacciata. Lavare il cervelletto risciacquando e decantando 3x con 5,0 mL di HBSS.
NOT: Ogni cervelletto deve essere collocato nel proprio tubo per un'ulteriore lavorazione.
3. Preparazione della sospensione cellulare
- Dopo l'ultimo risciacquo, aggiungere 5 mL di soluzione di dissociazione dei tessuti a base di papaina (sulla base del lavoro precedente13,18) che è stato preriscaldato a 37 gradi centigradi. Incubare il tessuto per 15 min a 37 gradi centigradi in un bagno d'acqua. Mescolare lentamente il contenuto invertendo il tubo su e giù 3x–5x ogni 3 min sia utilizzando un mixer dado o a mano.
- Preparare una pipetta Pasteur di ampio diametro (pipetta di vetro regolare) e di diametro stretto Pasteur (lucidata dal fuoco riscaldando su un bruciatore Bunsen) come descritto in precedenza19.
- Lavare il tessuto 3x con 5 mL di soluzione HBSS, evitando la perdita del tessuto durante la decantazione a mano.
- Rimuovere l'ultimo lavaggio HBSS e aggiungere al tessuto 5 mL di soluzione DPBS contenente 250 -L di Soluzione DNase. Dissociare il tessuto triturando 10x-15x utilizzando la pipetta Pasteur di ampio diametro. Eseguire questo passaggio delicatamente per evitare la formazione di bolle.
- Quindi incubare il liquame per ulteriori 10 min a 37 gradi centigradi nel bagno d'acqua, mescolando invertendo e raddrizzare il tubo.
- Utilizzare la pipetta Pasteur a diametro ridotto per triturare ulteriormente il liquame tissutale 10x. Se rimangono grandi pezzi di tessuto, premere i pezzi di tessuto contro il fondo del tubo con la punta del pipetta delicatamente e continuare a pipettare fino a quando le cellule raggiungono una sospensione fine.
- Incubare il tessuto a 37 gradi centigradi per altri 10 min, ripetendo le fasi di miscelazione precedenti.
4. Immunoetichettatura delle cellule staminali
- Posizionare i tubi di centrifuga sul ghiaccio e utilizzare soluzioni ghiacciate per i prossimi passi. Filtrare le cellule dissociate attraverso un colino da 40 m in un tubo di centrifuga di 50 ml. Supera il filtro con 10,0 mL di soluzione HBSS per garantire che le celle passino attraverso la rete in questa soluzione aggiuntiva.
- Trasferire le cellule filtrate in un tubo fresco di centrifuga di 15 mL e centrifugare la sospensione cellulare a 300 x g per 10 min a 4 gradi centigradi. Aspirare e scartare completamente il supernatante con attenzione utilizzando un aspiratore sottovuoto.
- Risospendere il pellet in 160 o l of magnetic column buffer. Per ottenere la sospensione a cella singola prima dell'etichettatura magnetica, passare le celle attraverso una rete di nylon di 30 m per rimuovere i grumi delle cellule, che altrimenti possono intasare la colonna.
- Aggiungere 40 l di microsfere anti-promin-1 ad ogni tubo da 15 mL, mescolare e incubare in frigorifero per 15 min in modo che l'anticorpo si leghi alle cellule prominin-1-expressing.
- Lavare le cellule aggiungendo 1,0–2,0 mL di tampone di colonna X e centrifugare a 300 x g per 10 min. Aspirate completamente il supernatante.
- Risospendere il pellet in 1,0 mL del buffer di colonna X.
NOT: Se si osservano piccoli grumi dopo la sospensione del pellet con 1,0 mL di tampone di colonna X, devono essere rimossi con attenzione utilizzando una punta della pipetta Pasteur, altrimenti questi grumi possono bloccare la colonna magnetica durante lo smistamento delle celle.
5. Preparazione delle colonne magnetiche, ordinamento delle celle e placcatura
NOT: La separazione magnetica da diverse condizioni di genotipo (malattia contro controllo) deve essere eseguita contemporaneamente, poiché qualsiasi ritardo può influenzare la morfologia della neurosfera.
- Preparare le colonne magnetiche posizionandole sul supporto magnetico esposto al campo magnetico. Risciacquare la colonna una volta con 500 l of buffer X applicando un buffer che gocciola in un tubo centrifuga da scartare.
NOT: Preparare il buffer di colonna magnetica fresco X per ogni esperimento; in caso contrario, la resa delle cellule staminali sarà bassa. - Applicare la sospensione della cella etichettata sulla colonna. Raccogliere il flusso contenente celle non etichettate che consistono principalmente di cellule misto neuronali/gliali cerebellari in tubi freschi da 15 mL (Figura 1A).
- Lavare la colonna 3x con 500 l di tampone X (ogni lavaggio dura circa 2–4 min).
NOT: La coltura mista neuronale/glialcere arricchita con neuroni granulari cerebellari può servire come un sottoprodotto utile di questa fase di purificazione. - Rimuovere la colonna dal campo magnetico e metterla in un tubo da 1,5 mL. Aggiungere 1,0 mL di mezzo di coltura (mezzo di neurosfera) alla colonna e spingere lo stantuffo nella colonna per eliminare le cellule etichettate con perline prominin-1 in un tubo di falco fresco di 1,5 mL.
- Per migliorare la purezza delle cellule etichettate prominin-1, passare le cellule eluite su una seconda colonna seguendo i passaggi da 5.1 a 5.4.
- Conta le celle con un emocitometro. La resa tipica è di 107 celle per cervelletto. Placcare le cellule su piastre di fissaggio ultra-basse (6 o 12 pozzetto, in base alla densità necessaria per gli esperimenti a valle).
6. Passaggio delle neurosfere e della differenziazione
- Placcare le cellule staminali promininin-1 con etichetta su un attacco ultra-basso a 12 pozze di pozzo nel mezzo di neurosfera media (5.000 cellule/pozzo).
- Dopo 7-10 giorni, le cellule si dividono per produrre neurosfere galleggianti a forma di palla (neurosfere primarie).
NOT: In questo esperimento, le neurosfere secondarie che si espandono in numero vengono generate per un ulteriore uso. Le popolazioni della neurosfera primaria non sono utilizzate per questi esperimenti, poiché possono contenere cellule contaminanti che non hanno proprietà delle cellule staminali e possono raggrupparsi insieme alle neurosfere. - Per passare, trasferire le neurosfere primarie insieme ai mezzi di coltura utilizzando punte pipette da 1,0 mL in un tubo di centrifuga sterile da 15 mL. Pellet le neurosfere per centrifugazione a 300 x g per 5 min e scartare il supernatante.
- Risospendere il pellet in 5 mL di mezzi di dissociazione tissutale che contiene la soluzione di papaina o 0,05% trypsin. Incubare a 37 gradi centigradi per 10 min.
- Centrifugare la sospensione cellulare a 300 x g per 5 min. Risospendere le cellule in 5 mL di mezzo di neurosfera e dissociare le cellule meccanicamente utilizzando una pipetta Pasteur plastica e lentamente pipetting su e giù 10x.
- Piastrare le cellule (di nuovo) nei media della neurosfera come descritto in precedenza. Dopo 7-10 giorni di coltura, la piastra deve essere arricchita con neurosfere secondarie.
NOT: Queste colture possono essere passaggi fino a 8 volte con una buona efficienza, dopo di che le dimensioni della neurosfera tendono ad essere più piccole e suggestive di una diminuzione della proliferazione. - Contare le cellule sull'emocitometro e placcare il numero ottimale per esperimenti futuri su piastre rivestite poli-D-lysina (6 o 12 pozzi).
- Per differenziare le cellule staminali, raccogliere le neurosfere dal secondo all'ottavo passaggio per centrifugazione come descritto in precedenza, ad eccezione di aggiungere il mezzo di differenziazione al pellet.
NOT: Dopo 7 giorni in vitro, le cellule staminali si differenziano in neuroni, astrociti e oligodendrociti, come dimostrato dalla colorazione con il marcatore neuronale tubulina z-III, marcatore astrocitico GFAP e oligodendrociti produttore O4.
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Representative Results
Le cellule staminali del cerebellare postnatale promininininale-1 formato hanno formato neurosfere in neurosfera media ricca di fattori di crescita (EGF e bFGF). Queste neurosfere erano positive per la colorazione promininin-1, il marcatore utilizzato per l'isolamento, e anche come macchia per altri marcatori di cellule staminali come Nestin e GFAP13 (Figura 1). L'espressione del marcatore della cellula staminale è stata mantenuta per tutta la coltura e per almeno otto passaggi20. Al ritiro dei fattori di crescita e in presenza di LIF e PDGF-AA (che sono fattori che supportano la differenziazione neuronale e gliale21,22), le neurosfere differenziate in linee neuronali e gliali (Figura 2).
Figura 1: Isolamento delle cellule staminali della promininin-1 dal cervelletto postnatale. (A) Le cellule staminali cerebellari sono state isolate utilizzando perle immunomagnetiche prominin-1. Pannello superiore: Le cellule staminali purificate (con colonne) hanno formato neurosfere con ampie proprietà di proliferazione e auto-rinnovamento. Le cellule non legate alla colonna (fluttuosa) non erano in grado di formare neurosfere; invece, sono diventate cellule miste neuronali/gliali cerebellari (tubulina z-III/GFAP). Pannello inferiore: le neurosfere formate da prominin-1- cellule che esprimono marcatori specifici delle cellule staminali: Nestin, prominin-1 e GFAP. (B) Cellule nel flusso negative macchiate per i marcatori delle cellule staminali prominin-1 e nestin e positive per la tubulina del marcatore neuronale z-III. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Differenziazione delle neurosfere positive promininin-1. In presenza di fattori di differenziazione (PDGF-AA o LIF), le neurosfere prominin-1-positive si differenziano in neuroni (tubulina z-III), astrociti (GFAP) e oligodendrociti (O4). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Le cellule staminali cerebellari che esprimono promininina-1 risiedono nella futura materia bianca durante le prime 3 settimane di vita postnatale. La loro proliferazione è strettamente controllata dalla via del riccio sonico supportata dalle cellule Purkinje17. Queste cellule staminali/progenitori contribuiscono agli interneuroni GABAergici nati più tardi chiamati cellule del pancia e delle cellule stellate. Questi interneuroni risiedono nello strato molecolare, dove si sinsisizzano sulle cellule Purkinje e scolpiscono la topografia e la funzione del PC tramite l'inibizione GABAergic13,17,23. Oltre a formare interneuroni, questa popolazione di cellule staminali genera anche tutti gli astrociti cerebellari di origine postnata17,24.
Questo protocollo descrive un metodo semplice ed economico per purificare le cellule staminali del prominin-1/CD133 dal cervelletto del topo postnatale. Le cellule staminali devono essere coltivate in piastre di fissaggio ultra-basse. Coltivare queste cellule staminali in placche normali può causare l'attaccamento delle neurosfere alla superficie e portare a una bassa proliferazione e differenziazione delle cellule staminali. Qui, la resa di 200-300 neurosfere per 5.000 cellule corrisponde a una resa di cellule staminali di circa 1 x 107 cellule da un singolo cervelletto. Questo è paragonabile a quello che è stato descritto per una strategia basata su FACS che è 10 volte più costoso. Inoltre, le apparecchiature FACS richiedono un costoso allestimento e personale altamente qualificato e non sono prontamente disponibili.
Queste cellule staminali stanno anche acquistando un crescente significato traslazionale nella ricerca sul cancro così come i disturbi neurodegenerativi e di neurosviluppo25,26,27. La proliferazione incontrollata di queste cellule staminali all'inizio della vita porta al medulloblastoma28, mentre la ricerca del nostro laboratorio suggerisce che la loro proliferazione anormale e differenziazione può contribuire alla successiva degenerazione cerebellare nella malattia genetica spinocerebellar atassia di tipo 120. Questi nuovi protocolli saranno preziosi per studiare queste cellule e forniranno nuove informazioni sui loro ruoli nella salute e nella malattia. Questi metodi possono anche portare a progressi nelle terapie rigenerative dopo ictus o trauma e altri insulti al cervello che garantirebbero la neurorigenerazione. È concepibile che queste tecniche possano essere generalizzate per estrarre cellule staminali che esprimono prominin-1 da altri tessuti, come l'intestino e il midollo osseo, dove sono anche espresse15,29.
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Disclosures
Non vengono dichiarati conflitti di interesse.
Acknowledgments
Ringraziamo i membri del laboratorio Opal per i loro suggerimenti. Questo lavoro è stato supportato da NIH sovvenzioni 1RO1 NS062051 e 1RO1NS08251 (Opal P)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05%Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | 0.05% |
| 2% B27 | Gibco; Thermo Fisher Scientific | 17504001 | |
| 2 mM EDTA solution | Corning | 46-034-CI | |
| Anti- Prominin-1 microbeads | Miltenyi Biote | 130-092-333 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A9418 | |
| Column MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Culture plates ultra - low attachment | Corning | 3473 | |
| Cysteine | Sigma | C7880 | |
| DNase | Sigma | D4513-1VL | 250 U/ml |
| Dulbecco’s Phosphate Buffer Saline | Thermo Fisher Scientific | 14040141 | |
| Hank's balanced salt solution-HBSS | Gibco | 14025-092 | |
| Human recombinant Basic Fibroblast Growth Factor | Promega | G507A | 20 ng/mL |
| Human recombinant Epidermal Growth Factor | Promega | G502A | 20 ng/mL |
| Leukemia Inhibitory Factor | Sigma | L5158 | |
| l-glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Microscopy | Lieca TCS SP5 confocal microscopes | ||
| MiniMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| Mouse anti-Prominin-1 | Affymetrix eBioscience | 14-1331 | 1 in 100 |
| Nestin | Abcam | ab27952 | 1 in 200 |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher | 25030081 | |
| O4 | Millopore | MAB345 | |
| Papain | Worthington | LS003126 | (100 U/mL) |
| Platelet- Derived Growth Factor | Sigma | H8291 | 10 ng/mL |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P6407 | |
| Rabbit anti-tubulin, b-III | Sigma | T2200 | 1 in 500 |
| Rabit anti-GFAP | Dako | Z0334 | 1 in 500 |
| Separation columns-MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Sterile cell strainer | Fisher Scientific | 22363547 | 40 μm |
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