Summary
هذا البروتوكول يوفر طريقه سهله للتعامل مع الثقافة الخلايا المعوية من خيار البحر ابوستيتشوكوس japonغاريس ومتوافق مع مجموعه متنوعة من العينات الانسجه المتاحة علي نطاق واسع من الكائنات البحرية بما في ذلك اشوداء الجلد ، الرخويات ، قشريات.
Abstract
وتستخدم الخلايا المستزرعة الاوليه في مجموعه متنوعة من التخصصات العلمية كاداات هامه للغاية للتقييم الوظيفي للمواد البيولوجية أو توصيف الانشطه البيولوجية المحددة. ومع ذلك ، ونظرا لعدم وجود وسائل الاعلام الثقافة الخلية المطبقة عالميا والبروتوكولات ، وصفا جيدا أساليب ثقافة الخلية للكائنات البحرية لا تزال محدوده. وفي الوقت نفسه ، فان التلوث الجرثومي والخواص المتعددة المدارات للخلايا لافقاريات البحرية التي تحدث بشكل شائع تعيق إنشاء استراتيجية فعاله لاستزراع الخلايا في لافقاريات البحرية. هنا ، ونحن وصف طريقه سهله التعامل لزراعه الخلايا المعوية من الخيار البحر ابوستيشووس جابونوكوس. بالاضافه إلى ذلك ، ونحن نقدم مثالا علي الحث في المختبر المبرمج والكشف في الخلايا المعوية المستزرعة الاوليه. وعلاوة علي ذلك ، توفر هذه التجربة تفاصيل حول أسلوب الثقافة المناسبة ومجموعه الخلايا. البروتوكول الموصوف متوافق مع مجموعه متنوعة من عينات الانسجه المتاحة علي نطاق واسع من الكائنات البحرية بما في ذلك الجلد الشحمي ، الرخويات ، قشريات ، ويمكن ان توفر خلايا كافيه للعديد من التطبيقات التجريبية في المختبر. ومن شان هذه التقنية ان تمكن الباحثين من التلاعب بكفاءة بثقافات الخلايا الاوليه من لافقاريات البحرية وتيسير التقييم الوظيفي للمواد البيولوجية المستهدفة علي الخلايا.
Introduction
وتوفر الخلايا المزروعة تحت ظروف خاضعه للسيطرة المصطنعة ، وليس في بيئتها الطبيعية ، مواد تجريبية موحده للدراسات البيولوجية ، وخاصه بالنسبة للأنواع التي لا يمكن زراعتها بسهوله في بيئة مختبريه. تمثل لافقاريات البحرية أكثر من 30% من جميع أنواع الماشية1، وتوفر العديد من المواد البيولوجية لاجراء البحوث حول أليات التنظيمية لعمليات بيولوجية محدده ، مثل التجديد2،3، الاستجابة للإجهاد4، والتكيف البيئي5،6.
خيار البحر ، Apostichopus japonغاريكوس، هو واحد من الأنواع اشوديرم الأكثر دراسة التي تسكن المياه المعتدلة علي طول ساحل شمال المحيط الهادي. ومن المعروف جيدا باسم الأنواع الهامه تجاريا والمراسي علي نطاق واسع في شرق اسيا ، وخاصه في الصين7. العديد من الاسئله العلمية المتعلقة ب. japonغاريكوس، بما في ذلك أليات التنظيمية الكامنة وراء التجدد المعوي بعد أحشاء8 وانحطاط في استيميل9، والسيطرة الايضيه10،11، واستجابه المناعي12،13 تحت الضغوط الحرارية أو المسببة للامراض ، ومع ذلك ، بالمقارنة مع الحيوانية نموذج مدروسه جيدا ، والبحوث الاساسيه ، وخاصه علي المستوي الخلوي ، محدوده بالاختناقات التقنية ، مثل عدم وجود أساليب متقدمة ثقافة الخلية.
وقد كرس الباحثون الكثير من الجهد لإنشاء خطوط خلوية ، ولكنهم واجهوا أيضا العديد من التحديات ولم يتم إنشاء اي خط خلوي من اي لافقاريات بحري حتى الآن14. ومع ذلك ، فقد تقدمت ثقافات الخلايا الاوليه من لافقاريات البحرية في العقود الاخيره15،16، وانها أتاحت فرصه لتجريب علي المستوي الخلوي. فعلي سبيل المثال ، استخدمت الخلايا المتجددة من ا. japonغاريكوس كمصدر للخلايا لثقافات الخلايا طويلة الأجل التي وفرت طريقه عمليه لثقافة الخلايا الاوليه لافقاريات البحرية17. ويجمع هذا البروتوكول والأمثل بين ثقافة الخلية لافقارياته ويطور أسلوبا للثقافة الاوليه مناسبا علي نطاق واسع لخيار البحر أو لافقاريات البحرية الأخرى.
المبرمج هو برنامج انتحار الخلية المتاصله التي تسببها مختلف المحفزات الخارجية والمحلية. تنسيق المبرمج هو أمر حاسم بالنسبة للعديد من النظم البيولوجية18,19, وقد تورطت في الانحدار المعوي من خيار البحر اثناء الاستيميل9. للتحقيق في عمليه ابوتوتيك في الكائنات الحية من الفائدة ، وقد تم إنشاء سلسله من الطرق ، بما في ذلك تلطيخ Hoechst واختبارات المجهر ، وتطبيقها بنجاح20. هنا ، أجرينا الحث المبرمج والكشف في الخلايا المعوية المستزرعة الاوليه من خيار البحر لتقييم قابليه استخدام الخلايا الاوليه في الدراسات البيولوجية لافقاريات البحرية. وقد استخدم ديكساميثازون ، واحده من كورتيزون الاصطناعية الشائعة الاستخدام21، للحث علي المبرمج في الخلايا المعوية مثقف من خيار البحر ، وتم الكشف عن اشاره Hoechst 33258 كبيره بنجاح في الخلايا الملونة عن طريق المجهر الفلورسنت.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. خليه ثقافة الاعداد المتوسطة
-
اعداد السائل كوميوميك
- جمع السوائل كوميوميك: في ظل ظروف معقمه ، تشريح خيار البحر صحية (الوزن الرطب من 85-105 غرام) ، وجمع السائل كوميوميك ، وتخزينها في قارورة زجاجيه معقمه.
- أزاله الخلايا كوميوميك: الطرد المركزي السائل كوميوميك في أنابيب الطرد المركزي 50 mL في 1,700 x g لمده 5 دقائق ونقل ماده طافي إلى قارورة زجاجيه معقمه جديده ؛ المقبل ، وجمع السائل الخلوي خاليه من الخلايا من خيار البحر.
- تكمله المكونات التعطيل: احتضان القارورة الزجاجية المعقمة ، التي تحتوي علي السائل المائي الخيار البحر ، في 40-50 درجه مئوية حمام المياه لمده 20-40 دقيقه للحصول علي مكونات مكمله-السائل كوميوميك المعطل.
- أزاله Microbe: أزاله البكتيريا والكلاميديا عن طريق الترشيح من خلال مرشحات غشاء 0.22 μm. المقبل ، وأزاله الميكوبلازما وغيرها من الجزيئات الدقيقة عن طريق الترشيح باستخدام مرشحات غشاء 0.1 μm للحصول علي محلول المعالجة السائلة كوميوميك.
- التكيف الملوحة: ضبط ملوحة محلول المعالجة السائلة كوميوميك إلى 30‰ (تقاس بمقياس الرطوبة) عن طريق أضافه 20 ٪ تركيز عاليه تعقيمها وتصفيتها محلول كلوريد الصوديوم (المخفف بواسطة السائل كوميوميك المعالجة المسبقة) أو DDW (الماء المقطر مزدوجة). نقل السائل الخيار البحر كوميوميك إلى زجاجه معقمه ، وختم الزجاجة ، وتخزين السائل في 4 درجه مئوية لمزيد من التجارب.
-
Leibovitz ل L-15 خليه ثقافة التحسين المتوسط
- تزن 5.05 غرام من كلوريد الصوديوم ، 0.135 غرام من KCl ، 0.15 غرام من CaCl2، 0.25 g من Na2حتى4، 0.975 g من mgcl2، 0.25 g من الجلوكوز ، و 6.25 ملغ من تورين وتمييع لهم في 40 ml من leibovitz L-15 المتوسطة في 50 مل المعقمة أنبوب الطرد المركزي. اجتت الأنبوب علي شاكر لمده 1 ساعة لضمان ذوبان الأملاح تماما.
- أضافه 2.5 mL من L-الجلوتامين (100 ملغ/مل) و 500 μL من محلول VE (1.75 mg/L) في المتوسطة المعدة مسبقا Leibovitz L-15 ومزيد من تصفيه المتوسطة من خلال المرشحات غشاء 0.22 μm.
- ضبط حجم المتوسطة الاجماليه إلى 500 مل مع الطازجة Leibovitz L-15 المتوسطة ومع 100 mL من السائل كوميوميك المعدة مسبقا; المقبل ، وضبط درجه الحموضة إلى 7.6 باستخدام الحل NaOH. الحفاظ علي عمليه التشغيل في بيئة معقمه. النسبة المركبة من السائل المخروطي يمكن ان تكون 10 ٪-50 ٪ ، و 20 ٪ كافيه ل . japonغاريكوس الخلايا المعوية الثقافة.
2. اعداد الخلايا المعوية
-
البحر خيار الأمعاء المعالجة
- تخدير خيار البحر الصحي في علبه ثلج. تشريح وجمع الأمعاء الاماميه ، ثم قسم عينات الانسجه عموديا وأزاله المحتويات الداخلية.
- غسل عينات الانسجه في الفوسفات مخزنه المالحة (التلفزيونية) مرتين وتطهيرها عن طريق الغمر في محلول الايثانول المائي (75 ٪ من حيث الحجم) لمده لا تزيد عن 2 ثانيه.
- غسل عينات الانسجه في الخدمات التلفزيونية ثلاث مرات لأزاله الايثانول ونقل حوالي 100 ملغ من عينه الانسجه إلى 2.0 mL أنبوب الطرد المركزي المعقمة.
-
مجموعه الخلايا
- أضف 1.5 مل من متوسط الثقافة المحسنة إلى كتله النسيج المعوي لخيار البحر وفرم الكتلة بمقص جراحي معقم حتى يصبح المحلول غائما.
ملاحظه: بالنسبة للبروتوكول المبسط الاختياري ، أضف 0.5 مل من متوسط الثقافة المحسنة مسبقا إلى كتله النسيج المعوي لخيار البحر واقطع الكتلة بمقص جراحي معقم إلى 1 مم3. نقل العينات مباشره إلى الاطباق الثقافية متبوعا بخطوات الاحتضان اللاحقة. - أضافه 400 μL من التريبسين (0.25 ٪) ، مزيج الحل عن طريق عكس ، واحتضانه لمده 5 دقائق في درجه حرارة الغرفة ؛ ثم ، تصفيه الحل باستخدام مصفاه الخلية 100 μm.
ملاحظه: انه اختياري لأضافه التريبسين لتشتت الخلايا عند معالجه عينات الانسجه المختلفة. وينبغي احتواء حمض ايثيلنديدياتيتاياستيك (أدتا) في محلول التريبسين للحد من النشاط المثبطة من Ca2 + و Mg2 + في الثقافة المتوسطة. - جمع الترشيح إلى جديد معقم 2.0 mL أنبوب الطرد المركزي ، والطرد المركزي في 1,700 x ز لمده 3 دقائق ، وتجاهل supernatant ، ثم أعاده تعليق بيليه في الثقافة المتوسطة (تستكمل مع المضادات الحيوية) ويغسل مرتين.
ملاحظه: اعداد الطازجة ثقافة ما قبل الأمثل المتوسطة تستكمل مع 2 ٪ البنسلين-ستربتوميسين الحل (10,000 U/mL البنسلين و 10 ملغ/مل ستربتومايسين) و 1 ٪ جنتاميسين (4 ملغ/مل) قبل بداية التجربة.
- أضف 1.5 مل من متوسط الثقافة المحسنة إلى كتله النسيج المعوي لخيار البحر وفرم الكتلة بمقص جراحي معقم حتى يصبح المحلول غائما.
3. ثقافة الخلية
-
حاضنه الضبط المسبق: مسبقا حاضنه للثقافة الخلية وتشغيله مقدما علي الأقل 24 ح مع درجه حرارة 18 درجه مئوية والرطوبة المشبعة.
ملاحظه: تغذيه CO2 في حاضنه اعتمادا علي خصائص ثقافة الخلية المتوسطة ؛ لا يحتاج CO2 ليتم توفيرها عند استخدام الوسيطة الاساسيه من L-15 Leibovitz. -
ثقافة خليه المرحلة الاولي
- لمنع نمو الميكروبات وتعزيز الانتشار خلال المرحلة الاوليه من ثقافة الخلية ، أضافه 10 مل من محلول البنسلين-ستربتوميسين (10,000 U/mL البنسلين و 10 ملغ/مل ستربتومايسين) و 0.5 مل من جنتاميسين (40 mg/mL) في كل 500 مل من متوسط الثقافة المحسنة مسبقا. علاوة علي ذلك, تكمله كل 500 mL الثقافة المتوسطة مع 0.6 mL من الانسولين (10 مغ/مل), 100 μL من عامل النمو الشبيهة بالانسولين (0.1 ميكروغرام/μL), و 25 μL من عامل نمو الخلايا الليفية (0.1 ميكروغرام/μL).
- جمع الخلايا في أنابيب 1.5 mL ، أعاده التعليق عليها باستخدام 200 μL من المتوسطة المشار اليها ، وماصه pipet-x لهم في الاطباق φ 4 سم.
- ثقافة الخلايا في حاضنه وأضافه 2.0 مل من المتوسطة المشار اليها في الخلية الاطباق بعد 6 ح. تغيير نصف المتوسطة كل 12 ساعة حتى تصل إلى المرحلة التالية.
ملاحظه: التعامل مع التغيير المتوسط برفق ، لأنه لا يتم إرفاق الخلايا إلى الاطباق باحكام. ويمكن استخدام الاطباق المغلفة بولي دي يسين لربط فضفاضة لخلايا الطبق.
-
ثقافة خليه المرحلة الثانية
- للحد من الآثار السلبية للمضادات الحيوية إلى الخلايا المستزرعة ، والحد من تركيز المضادات الحيوية المشار اليها (البنسلين ، ستربتومايسين ، و جنتاميسين) في الثقافة المتوسطة إلى النصف.
ملاحظه: استخدام الانسولين وعوامل النمو يعتمد علي ظروف ثقافة الخلية واختياري. - استبدلت الخلية ثقافة وسط; اجراء تغييرات متوسطه كل يومين إلى ثلاثه أيام اعتمادا علي كثافة الخلية.
ملاحظه: مراقبه الخلايا المستزرعة يوميا تحت المجهر وتسجيل ظروف النمو.
- للحد من الآثار السلبية للمضادات الحيوية إلى الخلايا المستزرعة ، والحد من تركيز المضادات الحيوية المشار اليها (البنسلين ، ستربتومايسين ، و جنتاميسين) في الثقافة المتوسطة إلى النصف.
-
تمرير الخلية
ملاحظه: المرور والثقافة الفرعية الخلايا ، عندما تصل كثافة الخلية الاساسيه 60 ٪.- اغسل الخلايا المستزرعة مرتين باستخدام الخدمات التلفزيونية في درجه حرارة الغرفة. أضافه 200 μL من محلول التريبسين (0.25%) لكل طبق ويدويا الحصول علي الطبق ضمان تغطيه القاع كله. تجاهل الحل التريبسين واحتضان الخلايا لمده 5 دقائق في درجه حرارة الغرفة.
- يغسل الخلايا مع 1.0 mL من الثقافة الطازجة المتوسطة عن طريق الأنابيب وأعاده تعليق الخلايا. نقل 0.5 mL من تعليق الخلية إلى طبق جديد ، أضافه 1.5 mL من المتوسطة الطازجة ، واحتضان الخلايا في 18 درجه مئوية.
ملاحظه: يمكن استخدام قصاصات الخلايا لتجميع الخلايا عند فشل حل التريبسين لهضم وفصل الخلايا من الاطباق (بعض خطوط الخلايا لاصقه جدا). ومع ذلك ، لا تقم باجراء كلا الأسلوبين في نفس الوقت. - تغيير المتوسطة بعد 12 ساعة ومراقبه الخلايا تحت المجهر لتقييم الظروف. ثقافة الخلايا لفحوصات تجريبية بعيده.
4. الحث المبرمج والكشف في الخلايا المعوية. japonغاريكوس
-
الخلية الثقافة والعلاج ديكساميثازون
- اعداد الخلايا المعوية بعد البروتوكول الذي تم إدخاله سابقا وأضافه الخلايا قطره إلى لوحه 12 بئر في حجم الخلية من 2 × 106 في البئر.
- بعد ثلاثه أيام في الثقافة ، وبعد خطوات من "ثقافة خليه المرحلة الاولي" ، وغسل الخلايا ثلاث مرات مع تلفزيوني واستبدال المتوسطة مع المتوسطة الأمثل (دون المضادات الحيوية وعوامل النمو).
- تمييع ديكساميثازون (DXMS) في الثقافة المتوسطة لاعداد الطازجة 2 μM و 200 μM الحلول DXMS قبل البدء في التجارب.
- أضافه حلول DXMS في تركيزات مختلفه للخلايا المستزرعة المزروعة بنفس حجم الوسط الذي يتم زراعته. تعيين ثلاث مجموعات تجريبية بما في ذلك التحكم (CTL) ، 1 μM ، و 100 μM DXMS.
-
تلوين هويشت
- اغسل الخلايا بالصورة التلفزيونية ثلاث مرات بعد الحضانة مع/بدون DXMS للفترات الزمنيه المشار اليها (0 h, 24 h, و 48 h).
- أضافه 300 μL من الحل Hoechst 33258 لكل بئر للوحه 12 بئر واحتضان في 18 درجه مئوية لمده 30 دقيقه. اجتت برفق لوحه لتغطيه جميع الخلايا ضمان تلطيخ بهم.
- أزاله الحل تلطيخ Hoechst وإصلاح الخلايا عن طريق أضافه 300 μL من محلول بارافورمالدهيد 4 ٪ (في تلفزيوني) لكل بئر. الاثاره بلطف لمده 15 دقيقه.
تحذير: بارافورمالدهيد هو سام باعتدال عن طريق ملامسه الجلد أو استنشاقه ، ويتم تعيينه كماده مسرطنه محتمله للإنسان. وينبغي استخدام أغطيه الدخان الكيميائية ، ومرفقات التوازن تنفيس ، أو غيرها من التدابير الوقائية اثناء وزنها والتعامل مع بارافورمالدهيد. - اغسل الخلايا الثابتة ثلاث مرات في الاذاعه التلفزيونية. لا تجاهل التلفزيوني بعد الغسيل للحفاظ علي الخلايا المغطية.
-
تحليل المجهر الفلورسنت
- قم بتشغيل أجهزه المجهر الفلورسنت بما في ذلك طاقة مصباح الزئبق وطاقة ضوء الفلورسنت والكمبيوتر. قم بتسجيل الدخول إلى حساب نظام التشغيل ، وتشغيل البرنامج ، والتحقق من التكوين الخاص به.
- ضع اللوحة المعدة علي مرحله المجهر. ضع العينة علي العدسة الموضوعية باستخدام وحده تحكم المرحلة.
- العثور علي خلايا الفائدة تحت المجهر الضوء ، والتحول إلى المجهر الفلورسنت ، والتقاط الصور عن طريق ضبط المعلمات.
ملاحظه: لمراقبه الاشاره الفلورية Hoechst 33258 منضما إلى نوى الحمض النووي ، وينبغي اجراء المجهر الفلوري مع الاثاره والانبعاثات في حوالي 352 نانومتر و 461 نانومتر ، علي التوالي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
هنا ، انشانا ثقافة الخلايا المعوية الاساسيه من ا. japonغاريكوس وعبور الخلايا. يظهر الشكل 1 الخلايا المستديرة في مراحل مختلفه من الخياطة. واختبارات تلطيخ ايدو توفر أدله مباشره للكشف عن النشاط التكاثري لهذه الخلايا المستديرة في مرحله لاحقه (الشكل 2). نحن أيضا تعديل قليلا البروتوكول ، وذبح كتل الانسجه المفرومة بدلا من خلايا الترشيح. وعلاوة علي ذلك ، يمكن ان يكون مثقفا نوع خليه المغزل بنجاح. حدث هذا النوع من الخلايا حول كتل الانسجه المعوية ويمكن ملاحظته بعد أربعه أيام من الثقافة. ومع ذلك ، فانه لم يتم العبور (الشكل 3).
يمكن استخدام الخلايا المستزرعة للتطبيقات التجريبية البيولوجية المختلفة. عالجنا الخلايا مع DXMS لفترات زمنيه مختلفه ، تليها Hoechst 33258 تلطيخ للكشف عن الخلايا ابوتوتيك. يشير الشكل 4 إلى الاشاره المستحثة التي تم اكتشافها من الخلايا المعوية لخيار البحر بواسطة هويشت 33258 تلطيخ والمجهر الفلوري. يوضح الشكل 5 معدلات الخلايا الخلوية للفترات الزمنيه المشار اليها تحت التحفيز مع dxms.
الشكل 1: المجهر المجهري للخلايا المستديرة المعوية لخيار البحر المستزرع في مراحل مختلفه. (ا) الخلايا الملحقة بقاع الاطباق في اليوم الثالث بعد البذر. (ب) انتشار الخلايا في اليوم السابع. (ج) الخلايا المرفقة بالجزء السفلي من الاطباق بعد المرور. (د) الخلايا التي فقدت نشاطها وتموت بعد عشر مقاطع. "CM" يشير إلى كتله الخلية ، والتي تحدث اثناء انتشار الخلايا. "BT" يشير إلى المسار الأسود ، الذي تركته الخلايا الميتة. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: انتشار الخلايا المكتشفة بواسطة اختبارات تلطيخ EdU. أجريت اختبارات انتشار الخلايا باستخدام الطقم (جدول المواد) وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: المجهر المجهري لكتل الانسجه المعوية المزروعة بخيار البحر وتكاثر الخلايا. (ا) كتل الانسجه (السل) المرفقة بأسفل الطبق في اليوم الأول بعد الثقافة. (ب) كتل الانسجه والخلايا المرفقة بأسفل الطبق في اليوم الثاني بعد الثقافة. (ج) كتل الانسجه ومحيطيا الخلايا المغزل وقعت (SC) في اليوم الرابع بعد الثقافة. (د) تكاثرت خلايا المغزل في اليوم السابع بعد الثقافة. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: المجهر الفلوري للخلايا المعوية المستديرة مع المبرمج المستحث. "NC" يشير إلى التكثيف النووي اشاره الفلورسنت. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: التحليل الإحصائي للخلايا المعوية الايجابيه للحوست. توزيع النسبة المئوية من التكثيف النووي الفلورسنت اشاره الخلايا الايجابيه بين Hoechst الملطخة الخلايا المعوية japonغاريكوس مع الجرعة أو الدورة الزمنيه للتجربة (ن = 3). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد كرست جهود بحثيه مكثفه لإنشاء خطوط خلوية في العقود الاخيره ، ومع ذلك ، لا يزال من الصعب احراز تقدم بشان الثقافة الطويلة الأجل للخلايا من لافقاريات البحرية14،22. وقد أفيد بان الخلايا المستزرعة من تجديد انسجه هولوثوريان كانت قابله للحياة لفتره طويلة من الزمن ويمكن الكشف عن النشاط العالي للانتشار في خلايا محدده17،23. ومع ذلك ، بالنسبة للخلايا لافقارياته البحرية العادية ، لم يتم حتى الآن وصف اي نهج عملي للثقافة الخلوية. البروتوكول المعروض هنا يوفر طريقه فعاله وسهله التفسير لزراعه ومرور الخلايا المعوية من الأنواع لافقاريات البحرية ا. japonغاريكوس. ويمكن تكييف هذه الطريقة بسهوله لثقافة الخلايا الاساسيه للعديد من الكائنات الحية البحرية لافقاريات المختلفة مثل الحبار وسرطان البحر.
وهناك سلسله من العوامل الرئيسية التي تؤثر علي التطبيق الناجح لهذا الاجراء. وللوقاية من التلوث الجرثومي اهميه قصوى خلال العملية برمتها ، وخاصه خلال الأسبوع الأول من الثقافة. وعاده ما تتصل الكائنات المائية بالعديد من الميكروبات من البيئة ، التي استعمرت أنسجتها ، مثل الجل والأمعاء والزعنفة والجلد. التالي ، فانه سيكون من المستحيل تعقيم عينات الانسجه قبل بدء ثقافة الخلية. للتقليل من خطر التلوث الجرثومي خلال ثقافة الخلية ، 75 ٪ الايثانول الغمر لتعقيم عينه الانسجه أمر ضروري ؛ ومع ذلك ، يجب ان يكون الأمثل وقت العلاج لأنواع مختلفه من الانسجه. وعلاوة علي ذلك ، فان تطبيق تركيزات المضادات الحيوية العالية خلال المراحل المبكرة من ثقافة الخلايا يلعب أيضا دورا هاما في تثبيط النمو الميكروبي. وعلاوة علي ذلك ، تشكل التركيبة المتوسطة عاملا رئيسيا في تحديد انتشار الخلايا المستزرعة وعمرها الافتراضي. وبما ان الاحتياجات التغذويه للخلايا لافقارياته البحرية لا تزال غير معروفه ، فان المتوسط الحالي لثقافة الخلية المستخدمة صمم أساسا لفقاري أو لخطوط الخلايا الحشرية14. لتوفير المواد الغذائية الكافية ، يمكن استخدام السائل الكوميوميك المعالج مسبقا من خيار البحر علي غرار الخلية في ثقافة خلايا الثدييات. وفي الوقت نفسه ، ولتسهيل انتشار الخلايا ، يمكن أيضا تطبيق العديد من عوامل نمو الثدييات في الوسط الثقافي. ونظرا لان درجه حرارة الحضانة عامل يؤثر علي نجاح ثقافة الخلايا البحرية لافقاريات ، ينبغي النظر في احتضان الخلايا تحت درجه حرارة النمو المثلي للكائن الحي المستهدف. علي سبيل المثال ، يمكن تعيين درجه الحرارة للثقافة الخلية ا. japonغاريكوس في 18 درجه مئوية ، والتي هي مناسبه لنموها24.
قد تؤثر معالجه الانسجه علي أنواع الخلايا المستزرعة والمنتشرة بنجاح. مختلفه جدا A. japonغاريكوس الخلايا المعوية ، جولة أو المغزل ، يمكن الحصول عليها من البذر الخلايا المرشحة أو كتل الانسجه تحت نفس الاجراء الثقافة بالبالضبط (البيانات المقارنة من الشكل 1 والشكل 3). التالي ، فان تحسين طريقه المعالجة المسبقة للانسجه لنوع الثقافة الخلوية المحددة يجب ان يتم أيضا في البداية. يجب ان يتقرر الاجراء الأمثل وفقا للتصميم التجريبي البيولوجي.
هنا ، قمنا بتطبيق العلاج DXMS للاستقراء المبرمج في الخلايا المعوية. japonغاريكوس بعد ثلاثه أيام في الثقافة ، وقامنا بتلطيخ Hoechst للكشف عن اشاره ابوتوتيك. الكشف الناجح للخلايا الايجابيه Hoechst ، بعد التحفيز 48 h بواسطة 1 μM DXMS ، قدم مثالا عمليا لتجربه بيولوجية تستند إلى الخلايا المستزرعة.
البروتوكول الموصوف سهل المعالجة ويمكن استخدامه لإنشاء ثقافة خليه لافقاريات البحرية. وينبغي ان توفر الخلايا المستزرعة المواد البيولوجية ذات الخلفية الجينية المتسقة لمختلف التطبيقات البيولوجية التجريبية. وعلاوة علي ذلك ، فان إجراءات البروتوكول المعدلة بشكل طفيف يمكن ان تغير أنواع الخلايا المنتشرة بنجاح اثناء الثقافة وتوفر مواد خلوية مختلفه للتجارب البيولوجية. لذلك ، فان الاستفادة المثلي من خطوات معينه في البروتوكول ستكون ضرورية ، اعتمادا علي الأنواع الحيوانية المستهدفة وأنواع الخلايا المحددة اللازمة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
Acknowledgments
ويود أصحاب البلاغ ان يشكروا البروفيسور ناصوب تشو من جامعه تشجيانغ علي مشورته التقنية وعلي جعل معدات مختبره متاحه للاستعمال. وقد دعم هذا العمل ماليا المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (أرقام المنح 41876154 ، 41606150 ، 41406137) وصناديق البحوث الاساسيه للجامعات ومعاهد البحوث في مقاطعه تشجيانغ [منح عدد 2019JZ00007 ].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 μm filter | Millipore | SLVV033RS | |
| 0.22 μm filter | Millipore | SLGP033RB | |
| 0.25% Trypsin | Genom | GNM25200 | |
| 100 μm filter | Falcon | 352360 | |
| 4 cm dishes | ExCell Bio | CS016-0124 | |
| 4% paraformaldehyde solution | Sinopharm Chemical Reagent | 80096618 | in PBS |
| Benchtop Centrifuges | Beckman | Allegra X-30R | |
| BeyoClick EdU-488 kit | Beyotime | C0071S | |
| CaCl2 | Sinopharm Chemical Reagent | 10005817 | |
| Constant temperature incubator | Lucky Riptile | HN-3 | |
| Dexamethasone | Sinopharm Chemical Reagent | XW00500221 | |
| Electric thermostatic water bath | senxin17 | DK-S28 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent | 80176961 | 75% |
| Fibroblast Growth Factor(FGF) | PEPROTECH | 100-18B | |
| Fluorescent microscope | Leica DMI3000B | DMI3000B | |
| Garamycin | Sinopharm Chemical Reagent | XW14054101 | |
| Glucose | Sinopharm Chemical Reagent | 63005518 | |
| Hoechst33258 Staining solution | Beyotime | C1017 | |
| Insulin | Sinopharm Chemical Reagent | XW1106168001 | |
| Insulin like Growth Factor(IGF) | PEPROTECH | 100-11 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10016308 | |
| Leibovitz's L-15 | Genom | GNM41300 | |
| L-glutamine (100 mg/mL) | Genom | GNM-21051 | |
| MgCl2 | Sinopharm Chemical Reagent | XW77863031 | |
| Na2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10020518 | |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10019308 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent | 10019718 | |
| PBS | Solarbio | P1020 | pH7.2-7.4 |
| Penicillin-Streptomycin | Genom | GNM15140 | |
| PH meter | Bante | A120 | |
| Taurine | SIGMA | T0625 | |
| VE | Seebio | 185791 |
References
- Naganuma, T., Degnan, B. M., Horikoshi, K., Morse, D. E. Myogenesis in primary cell cultures from larvae of the abalone, Haliotis rufescens. Molecular Marine Biology and Biotechnology. 3 (3), 131-140 (1994).
- Reinardy, H. C., Emerson, C. E., Manley, J. M., Bodnar, A. G. Tissue regeneration and biomineralization in sea urchins: role of Notch signaling and presence of stem cell markers. Plos One. 10 (8), 0133860 (2015).
- Schaffer, A. A., Bazarsky, M., Levy, K., Chalifa-Caspi, V., Gat, U. A transcriptional time-course analysis of oral vs. aboral whole-body regeneration in the Sea anemone Nematostella vectensis. Bmc Genomics. 17, 718 (2016).
- Chiaramonte, M., Inguglia, L., Vazzana, M., Deidun, A., Arizza, V. Stress and immune response to bacterial LPS in the sea urchin Paracentrous lividus (Lamarck, 1816). Fish and Shellfish Immunology. 92, 384-394 (2019).
- Meng, J., Wang, T., Li, L., Zhang, G. Inducible variation in anaerobic energy metabolism reflects hypoxia tolerance across the intertidal and subtidal distribution of the Pacific oyster (Crassostrea gigas). Marine Environmental Research. 138, 135-143 (2018).
- Han, G., Zhang, S., Dong, Y. Anaerobic metabolism and thermal tolerance: The importance of opine pathways on survival of a gastropod after cardiac dysfunction. Integrative Zoology. 12 (5), 361-370 (2017).
- Zhang, X., et al. The sea cucumber genome provides insights into morphological evolution and visceral regeneration. PLoS Biology. 15 (10), 2003790 (2017).
- Sun, L., et al. iTRAQ reveals proteomic changes during intestine regeneration in the sea cucumber Apostichopus japonicus. Comparative Biochemistry and Physiology Part D: Genomics and Proteomics. 22, 39-49 (2017).
- Xu, K., et al. Cell loss by apoptosis is involved in the intestinal degeneration that occurs during aestivation in the sea cucumber Apostichopus japonicus. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 216, 25-31 (2018).
- Yang, H. S., et al. Metabolic characteristics of sea cucumber Apostichopus japonicus (Selenka) during aestivation. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 330 (2), 505-510 (2006).
- Xiang, X. W., et al. Glycolytic regulation in aestivation of the sea cucumber Apostichopus japonicus: evidence from metabolite quantification and rate-limiting enzyme analyses. Marine biology. 163 (8), 1-12 (2016).
- Jiang, L., et al. A feedback loop involving FREP and NF-kappaB regulates the immune response of sea cucumber Apostichopus japonicus. International Journal of Biological Macromolecules. 135, 113-118 (2019).
- Zhou, X., Chang, Y., Zhan, Y., Wang, X., Lin, K. Integrative mRNA-miRNA interaction analysis associate with immune response of sea cucumber Apostichopus japonicus based on transcriptome database. Fish and Shellfish Immunology. 72, 69-76 (2018).
- Cai, X., Zhang, Y. Marine invertebrate cell culture: a decade of development. Journal of Oceanography. 70 (5), 405-414 (2014).
- Maselli, V., Xu, F., Syed, N. I., Polese, G., Di Cosmo, A. A Novel Approach to Primary Cell Culture for Octopus vulgaris Neurons. Frontiers in Physiology. 9, 220 (2018).
- Pinsino, A., Alijagic, A. Sea urchin Paracentrotus lividus immune cells in culture: formulation of the appropriate harvesting and culture media and maintenance conditions. Biology Open. 8 (3), (2019).
- Odintsova, N. A., Dolmatov, I. Y., Mashanov, V. S. Regenerating holothurian tissues as a source of cells for long-term cell cultures. Marine Biology. 146 (5), 915-921 (2005).
- Rastogi, R. P., Richa, R. P., Sinha, R. P. Apoptosis: Molecular Mechanisms and Pathogenicity. Excli Journal. 8, 155-181 (2009).
- Wan, L., et al. Apoptosis, proliferation, and morphology during vein graft remodeling in rabbits. Genetics and Molecular Research. 15 (4), (2016).
- Kasibhatla, S., et al. Staining of suspension cells with hoechst 33258 to detect apoptosis. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (3), (2006).
- Mikiewicz, M., Otrocka-Domagala, I., Pazdzior-Czapula, K., Rotkiewicz, T. Influence of long-term, high-dose dexamethasone administration on proliferation and apoptosis in porcine hepatocytes. Research in Veterinary Science. 112, 141-148 (2017).
- Rinkevich, B. Cell cultures from marine invertebrates: new insights for capturing endless stemness. Marine Biotechnology. 13 (3), 345-354 (2011).
- Bello, S. A., Abreu-Irizarry, R. J., Garcia-Arraras, J. E. Primary cell cultures of regenerating holothurian tissues. Methods in Molecular Biology. 1189, 283-297 (2015).
- Yu, H., et al. Impact of water temperature on the growth and fatty acid profiles of juvenile sea cucumber Apostichopus japonicus (Selenka). Journal of Thermal Biology. 60, 155-161 (2016).
