Summary
该协议提供了一种易于处理的方法，用于培养海参黄斑狼的肠道细胞，并与来自海洋生物（包括Echinodermata、Mollusca和甲壳类）的各种广泛可用的组织样本兼容。
Abstract
初级培养细胞在各种科学学科中使用，作为生物物质的功能评估或特定生物活动表征的特别重要的工具。然而，由于缺乏普遍适用的细胞培养基和协议，对海洋生物的细胞培养方法描述得也有限。同时，海洋无脊椎动物细胞普遍存在的微生物污染和多热带特性进一步阻碍了海洋无脊椎动物有效细胞培养策略的建立。在这里，我们描述了一种易于处理的方法，用于从海参的黄豆骨细胞培养肠道细胞;此外，我们还提供了一个在原发性培养的肠道细胞中诱导和检测体外凋亡的例子。此外，本实验还详细介绍了适当的培养培养基和细胞收集方法。所述协议与来自海洋生物（包括Echinodermata、Mollusca和甲壳类）的各种广泛可用的组织样本兼容，它可以为多种体外实验应用提供足够的细胞。这项技术将使研究人员能够有效地操作来自海洋无脊椎动物的原生细胞培养物，并促进对细胞靶向生物材料的功能评估。
Introduction
在人工控制条件下，而不是在其自然环境中培育细胞，为生物研究提供了统一的实验材料，特别是对于在实验室环境中不易培养的物种而言。海洋无脊椎动物占所有动物物种1的30%以上，它们为研究特定生物过程的调控机制提供了大量生物材料，如再生2、3、应激反应4、环境适应5、6。
海参，阿波西乔布斯黄瓜，是北太平洋沿岸温带水域中研究最多的棘皮树种之一。众所周知，它是一种具有商业重要性的物种，在东亚，特别是中国，有大规模的海水养殖。关于A.japonicus的许多科学问题，包括8号脑电化后肠道再生的调控机制和免疫性9的退化、代谢控制10、11和免疫反应12、13在热或致病压力下，都引起了研究者的注意。然而，与研究良好的模型动物相比，基础研究，特别是在细胞水平上，受到技术瓶颈的限制，如缺乏先进的细胞培养方法。
研究人员为建立细胞系付出了很大的努力，但他们也面临许多挑战，任何海洋无脊椎动物的细胞系还没有建立起来。然而，海洋无脊椎动物的主要细胞培养在过去十年中已经发展，15，16，他们提供了在细胞水平上的实验机会。例如，从A.japonicus再生的细胞素已被作为长期细胞培养的细胞来源，为海洋无脊椎动物的原性细胞培养提供了实用的方法17。该协议结合和优化了无脊椎动物细胞培养方法，并开发出了一种广泛适用于海参或其他海洋无脊椎动物的初级培养方法。
凋亡是一种由各种外源性刺激和内源性刺激触发的固有细胞自杀程序。协调凋亡对许多生物系统至关重要18，19，它一直与海参的肠道回归在9年。为了研究感兴趣的生物体的凋亡过程，已经建立了一系列方法，包括Hoechst染色和显微镜检测，并成功地应用了20个。在这里，我们在海参原生培养的肠道细胞中进行了凋亡诱导和检测，以评估原生细胞在海洋无脊椎动物生物学研究中的可用性。地马酮是常用的合成糖皮质激素21，用于诱导海参培养肠道细胞凋亡，荧光显微镜在染色细胞中成功检测到显著的Hoechst 33258信号。
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Protocol
1. 细胞培养培养培养准备
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凝液制备
- 口管液收集：在无菌条件下，解剖健康的海参（湿重85-105克），收集凝血液，并将其储存在无菌玻璃瓶中。
- 细胞切除：在50 mL离心管中将胶质液在1，700 x g下离心5分钟，并将上清液转移到新的无菌玻璃瓶中;接下来，收集海参的无细胞凝血液。
- 补充组件失活：在40~50°C水浴中孵育无菌玻璃瓶，含有海参凝血液，在40~50°C水浴中孵育20-40分钟，以获得补充成分灭活的凝液。
- 微生物去除：通过 0.22 μm 膜过滤器进行过滤，去除细菌和衣原体。接下来，通过过滤使用0.1 μm膜过滤器去除支原体和其他细颗粒，以获得凝液预处理溶液。
- 盐度调整：通过加入 20% 高浓度预消毒和过滤的 NaCl 溶液（通过预处理的凝液液稀释）或 DDW（双蒸馏水），将凝液预处理溶液的盐度调节到 30°（由盐度计测量）。将海参胶液转移到无菌瓶中，密封瓶，并将液体储存在4°C，以便进一步实验。
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莱博维茨的L-15细胞培养介质优化
- 重量 5.05 g NaCl，0.135 g KCl，0.15 g CaCl 2，0.25 g Na2SO4，0.975g MgCl2，0.25g 葡萄糖，6.25毫克牛磺酸，在 50 mL 无菌离心管中将其稀释至 40 mL 的 Leibovitz L-15 培养基中。在摇摇器上搅拌管子 1 小时，以确保盐完全溶解。
- 将 2.5 mL L-谷氨酰胺 （100 mg/mL） 和 500 μL 的 VE 溶液 （1.75 mg/L） 加入先前制备的莱博维茨的 L-15 介质中，并通过 0.22 μm 膜过滤器进一步过滤介质。
- 使用新鲜的莱博维茨 L-15 介质和 100 mL 先前制备的曲霉液，将总介质体积调节到 500 mL;接下来，使用 NaOH 溶液将 pHH 调整为 7.6。将操作过程保持在无菌环境中。凝血液的复合比可为10%~50%，20%足以促进甲流肠细胞培养。
2. 肠道细胞制剂
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海参肠加工
- 在冰盒中麻醉健康的海参。解剖和收集前肠，然后垂直分割组织样本并去除内部内容物。
- 用磷酸盐缓冲盐水（PBS）清洗组织样品两次，然后浸入水乙醇溶液（75%体积）中消毒，时间不超过2s。
- 在PBS中清洗组织样本三次，去除乙醇，并将约100mg的组织样本转移到2.0 mL无菌微离心管中。
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单元格集合
- 将预优化培养基的1.5 mL加入海参肠道组织块，用消毒手术剪刀切碎块，直到溶液多云。
注：对于可选的简化方案，在海参肠道组织块中加入0.5 mL的预优化培养基，用消毒手术剪刀将块切成1毫米3。直接将样品转移到培养皿，然后进行孵化步骤。 - 加入400μL的胰蛋白酶（0.25%），通过反转混合溶液，并在室温下孵育5分钟;然后，使用100μm细胞过滤器过滤溶液。
注：在治疗不同的组织样本时，可添加胰蛋白酶作为细胞分散素。乙烯二甲酸（EDTA）应包含在胰蛋白酶溶液中，以减少培养基中Ca2+和Mg2+的抑制活性。 - 将滤液收集到新的无菌 2.0 mL 微离心管中，在 1，700 x g下离心 3 分钟，丢弃上清液，然后在培养基中重新悬浮颗粒（补充抗生素），然后洗涤两次。
注：在实验开始前，准备新鲜预优化培养基，辅以2%青霉素-链霉素溶液（10，000 U/mL青霉素和10毫克/mL链霉素）和1%的金霉素（4mg/mL）。
- 将预优化培养基的1.5 mL加入海参肠道组织块，用消毒手术剪刀切碎块，直到溶液多云。
3. 细胞培养
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孵化器预设：预设细胞培养的培养箱，并在温度为18°C和饱和湿度时提前运行至少24小时。
注：根据细胞培养培养基特性将CO2送入培养箱;使用莱博维茨的L-15的基本介质时，无需提供CO2。 -
第一阶段细胞培养
- 为了抑制微生物的生长，促进细胞培养的初始阶段的增殖，在每500mL的预优化培养培养基中加入10mL的青霉素-链霉素溶液（10，000 U/mL青霉素和10mg/mL链霉素）和0.5 mL的亚霉素（40mg/mL）。此外，每500 mL培养基补充0.6 mL胰岛素（10毫克/mL）、100 μL胰岛素样生长因子（0.1微克/μL）和25μL的纤维细胞生长因子（0.1微克/μL）。
- 将细胞收集到1.5 mL管中，使用200μL指示培养基重新悬浮，并将其移液至+4厘米的培养皿中。
- 在培养箱中培养细胞，并在6小时后向细胞培养皿中加入2.0 mL指示培养的培养剂，每12小时改变一半的培养基，直到达到下一阶段。
注：轻轻处理介质变化，因为细胞没有紧密地附着在盘子上。聚D-流膜涂层的菜肴可用于松散地附着在盘细胞上。
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第二阶段细胞培养
- 为了减少抗生素对培养细胞的不利影响，将培养基中指示抗生素（青霉素、链霉素和根霉素）的浓度降低一半。
注：胰岛素和生长因子的使用取决于细胞培养条件，是可选的。 - 更换细胞培养基;根据细胞密度，每两到三天进行一次介质变化。
注：每天在显微镜下观察培养的细胞，并记录生长条件。
- 为了减少抗生素对培养细胞的不利影响，将培养基中指示抗生素（青霉素、链霉素和根霉素）的浓度降低一半。
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细胞传递
注：当主细胞密度达到60%时，细胞的传递和亚培养。- 在室温下使用PBS洗涤培养细胞两次。加入200μL的胰蛋白酶溶液（0.25%）到每道菜，并手动搅拌菜，确保整个底部被覆盖。丢弃胰蛋白酶溶液，在室温下孵育细胞5分钟。
- 通过移液和重新悬浮细胞，用1.0 mL的新鲜培养基洗涤细胞。将0.5 mL的细胞悬浮液转移到新培养皿中，加入1.5 mL的新鲜培养基，并在18°C下孵育细胞。
注：当胰蛋白酶溶液无法从培养皿中消化和分离细胞时，细胞刮刀可用于细胞收集（有些细胞系太粘结）。但是，不要同时执行这两种方法。 - 在12小时后更换培养基，并在显微镜下观察细胞以评估条件。培养细胞进行进一步的实验测定。
4. A. 黄斑细胞的凋亡诱导和检测
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细胞培养和地塞米松治疗
- 按照先前引入的协议制备肠道细胞，并将细胞滴至12孔板中，细胞体积为每孔2 x 106。
- 培养三天后，按照"第一阶段细胞培养"的步骤，用PBS清洗细胞三次，用优化的培养基（不含抗生素和生长因子）替换培养基。
- 在开始实验之前，在培养基中稀释地塞米松（DXMS），以制备新鲜的2μM和200μM DXMS溶液。
- 将不同浓度的DXMS溶液加入具有相同培养培养量培养的培养细胞;设置三个实验组，包括控制 （CTL）、1 μM 和 100 μM DXMS。
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霍赫斯特染色
- 在指定时间段（0 小时、24 小时和 48 小时）内，用 PBS 在孵育后用 PBS 清洗三次细胞。无 DXMS。
- 将每孔300 μL的Hoechst 33258溶液加入12孔板，在18°C孵育30分钟。 轻轻搅拌板，以覆盖所有细胞，确保其染色。
- 去除Hoechst染色溶液，通过在每个井中加入300μL的4%甲醛溶液（在PBS中）来修复细胞。轻轻搅拌15分钟。
警告：甲醛通过皮肤接触或吸入具有中度毒性，被指定为可能的人类致癌物质。在称重和处理甲醛时，应使用化学烟气罩、通风平衡外壳或其他保护措施。 - 在PBS中清洗固定细胞三次。洗涤后不要丢弃 PBS 以保持细胞覆盖。
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荧光显微镜分析
- 打开荧光显微镜硬件，包括汞灯电源、荧光灯电源和 PC。登录到操作系统帐户，启动软件，并检查其配置。
- 将准备好的板放在显微镜台上。使用舞台控制器将样品置于物镜上。
- 在光学显微镜下找到感兴趣的细胞，切换到荧光显微镜，并通过调整参数来捕捉图像。
注：为了观察与核DNA结合的Hoechst 33258荧光信号，荧光显微镜应分别在约352纳米和461nm的激发和发射下进行。
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Representative Results
在这里，我们建立了A.japonicus的原发性肠道细胞培养，并传递了细胞。图1显示了不同培养阶段的圆形细胞。EdU染色测定提供了直接证据，揭示了这些圆细胞在后期的增殖活性（图2）。我们还稍微调整了协议，培养切碎的组织块，而不是过滤细胞;此外，主轴单元类型可以成功培养。这种细胞类型发生在肠道组织块周围，在培养四天后可以观察到;然而，它未能通过 （图3）。
培养的细胞可用于不同的生物实验应用。我们用DXMS对细胞进行了不同时间段的治疗，随后用Hoechst 33258染色进行凋亡细胞检测。图4显示Hoechst 33258染色和荧光显微镜从海参肠道细胞检测的诱导凋亡信号。图5显示了DXMS刺激下指示的时间段的凋亡细胞率。
图1：不同阶段培养海参肠圆细胞的显微镜。（A） 种子播种后第三天附着在盘子底部的细胞。（B） 细胞在第七天扩散.（C） 经过传损后附着在盘子底部的细胞。（D） 失去活动并在十段后死亡的细胞."CM"表示细胞质量，在细胞增殖期间发生。"BT"表示由死细胞留下的黑色轨道。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：EDU染色检测检测到的细胞增殖。细胞增殖测定是使用试剂盒（材料表）根据制造商的协议进行的.请点击此处查看此图的较大版本。
图3：培养海参肠组织块和细胞增殖的显微镜。（A） 在培养后的第一天附着在菜底的纸巾 （TB）.（B） 在培养后的第二天附着在菜底的纸巾块和细胞。（C） 组织块和外围发生主轴细胞 （SC） 在培养后的第四天.（D） 在培养后的第七天增殖主轴细胞.请点击此处查看此图的较大版本。
图4：诱导细胞凋亡的肠道圆形细胞的荧光显微镜。"NC"表示核冷凝荧光信号。请点击此处查看此图的较大版本。
图5：Hoechst阳性肠圆细胞的统计分析。在Hoechst染色A.japonicus肠道细胞中核凝光荧光信号阳性细胞的百分比分布，以及实验的剂量或时间过程（n = 3）。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
在过去的几十年里，人们一直致力于建立细胞系，然而，在海洋无脊椎动物细胞的长期培养上仍然难以取得进展。据报道，从再生的荷卢图里亚组织的培养细胞在很长一段时间内是可行的，在特定的细胞17、23中可以检测到高活性的增殖。然而，对于正常的海洋无脊椎动物细胞，还没有实际的细胞培养方法被描述。这里提出的协议提供了一个有效和容易解释的方法，培养和传递肠道细胞从海洋无脊椎动物物种A.japonicus。该方法可以很容易地适应许多不同的海洋无脊椎动物，如甲鱼和螃蟹的原细胞培养。
一系列关键因素影响着本程序的成功应用。在整个过程中，特别是养殖的第一周，预防微生物污染是最重要的。水生动物通常接触环境中的大量微生物，这些微生物会殖民其组织，如刺、肠、鳍和皮肤。因此，在细胞培养启动之前，不可能对组织样本进行消毒。为了将细胞培养过程中微生物污染的风险降至最低，75%乙醇浸泡用于组织样品灭菌至关重要;然而，治疗时间应该针对不同的组织类型进行优化。此外，高抗生素浓度在细胞培养的早期阶段的应用对抑制微生物生长也起着重要的作用。此外，培养基制剂是决定培养细胞增殖和寿命的主要因素。由于海洋无脊椎动物细胞的营养需求仍不得而知，目前使用的细胞培养基主要为脊椎动物或昆虫细胞系14。为了提供足够的营养材料，海参的预处理凝血液可用于哺乳动物细胞培养中类似于FBS。同时，为了促进细胞增殖，多种哺乳动物生长因子也可应用于培养基。由于孵育温度是影响海洋无脊椎动物细胞培养成功的一个因素，因此应考虑在目标生物体的最佳生长温度下孵育细胞。例如，A. japonicus细胞培养体的温度可设置为 18°C，适合其生长24。
组织预处理可能会影响成功培养和增殖的细胞类型。在完全相同的培养程序下，可以从播种过滤细胞或组织块（图1和图3的比较数据）中获得非常不同的A.japonicus肠道细胞，圆形或主轴。因此，在开始时还应对特定细胞培养类型的组织预处理方法进行优化;最佳程序应根据生物实验设计确定。
在这里，我们应用DXMS治疗凋亡诱导在A.japonicus肠道细胞经过三天的培养后，我们进行了Hoechst染色凋亡信号检测。通过1μM DXMS成功检测了Hoechst阳性细胞，在48小时刺激后，为基于培养细胞的生物实验提供了一个实际的例子。
所述协议易于处理，可用于建立海洋无脊椎动物细胞培养。培养细胞应为不同的进一步生物实验应用提供具有一致遗传背景的生物材料。此外，稍加调整的规程程序可以改变培养过程中成功增殖的细胞类型，并为生物实验提供不同的细胞材料。因此，根据目标动物物种和所需的特定细胞类型，协议中某些步骤的优化是必要的。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢浙江大学的周宁明教授提供的技术建议和实验室设备可供使用。这项工作得到了国家自然科学基金（资助号41876154、41606150和41406137）和浙江省高校和科研院所基础研究基金的资助[批号2019JZ00007]].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 μm filter | Millipore | SLVV033RS | |
| 0.22 μm filter | Millipore | SLGP033RB | |
| 0.25% Trypsin | Genom | GNM25200 | |
| 100 μm filter | Falcon | 352360 | |
| 4 cm dishes | ExCell Bio | CS016-0124 | |
| 4% paraformaldehyde solution | Sinopharm Chemical Reagent | 80096618 | in PBS |
| Benchtop Centrifuges | Beckman | Allegra X-30R | |
| BeyoClick EdU-488 kit | Beyotime | C0071S | |
| CaCl2 | Sinopharm Chemical Reagent | 10005817 | |
| Constant temperature incubator | Lucky Riptile | HN-3 | |
| Dexamethasone | Sinopharm Chemical Reagent | XW00500221 | |
| Electric thermostatic water bath | senxin17 | DK-S28 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent | 80176961 | 75% |
| Fibroblast Growth Factor(FGF) | PEPROTECH | 100-18B | |
| Fluorescent microscope | Leica DMI3000B | DMI3000B | |
| Garamycin | Sinopharm Chemical Reagent | XW14054101 | |
| Glucose | Sinopharm Chemical Reagent | 63005518 | |
| Hoechst33258 Staining solution | Beyotime | C1017 | |
| Insulin | Sinopharm Chemical Reagent | XW1106168001 | |
| Insulin like Growth Factor(IGF) | PEPROTECH | 100-11 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10016308 | |
| Leibovitz's L-15 | Genom | GNM41300 | |
| L-glutamine (100 mg/mL) | Genom | GNM-21051 | |
| MgCl2 | Sinopharm Chemical Reagent | XW77863031 | |
| Na2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10020518 | |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10019308 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent | 10019718 | |
| PBS | Solarbio | P1020 | pH7.2-7.4 |
| Penicillin-Streptomycin | Genom | GNM15140 | |
| PH meter | Bante | A120 | |
| Taurine | SIGMA | T0625 | |
| VE | Seebio | 185791 |
References
- Naganuma, T., Degnan, B. M., Horikoshi, K., Morse, D. E. Myogenesis in primary cell cultures from larvae of the abalone, Haliotis rufescens. Molecular Marine Biology and Biotechnology. 3 (3), 131-140 (1994).
- Reinardy, H. C., Emerson, C. E., Manley, J. M., Bodnar, A. G. Tissue regeneration and biomineralization in sea urchins: role of Notch signaling and presence of stem cell markers. Plos One. 10 (8), 0133860 (2015).
- Schaffer, A. A., Bazarsky, M., Levy, K., Chalifa-Caspi, V., Gat, U. A transcriptional time-course analysis of oral vs. aboral whole-body regeneration in the Sea anemone Nematostella vectensis. Bmc Genomics. 17, 718 (2016).
- Chiaramonte, M., Inguglia, L., Vazzana, M., Deidun, A., Arizza, V. Stress and immune response to bacterial LPS in the sea urchin Paracentrous lividus (Lamarck, 1816). Fish and Shellfish Immunology. 92, 384-394 (2019).
- Meng, J., Wang, T., Li, L., Zhang, G. Inducible variation in anaerobic energy metabolism reflects hypoxia tolerance across the intertidal and subtidal distribution of the Pacific oyster (Crassostrea gigas). Marine Environmental Research. 138, 135-143 (2018).
- Han, G., Zhang, S., Dong, Y. Anaerobic metabolism and thermal tolerance: The importance of opine pathways on survival of a gastropod after cardiac dysfunction. Integrative Zoology. 12 (5), 361-370 (2017).
- Zhang, X., et al. The sea cucumber genome provides insights into morphological evolution and visceral regeneration. PLoS Biology. 15 (10), 2003790 (2017).
- Sun, L., et al. iTRAQ reveals proteomic changes during intestine regeneration in the sea cucumber Apostichopus japonicus. Comparative Biochemistry and Physiology Part D: Genomics and Proteomics. 22, 39-49 (2017).
- Xu, K., et al. Cell loss by apoptosis is involved in the intestinal degeneration that occurs during aestivation in the sea cucumber Apostichopus japonicus. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 216, 25-31 (2018).
- Yang, H. S., et al. Metabolic characteristics of sea cucumber Apostichopus japonicus (Selenka) during aestivation. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 330 (2), 505-510 (2006).
- Xiang, X. W., et al. Glycolytic regulation in aestivation of the sea cucumber Apostichopus japonicus: evidence from metabolite quantification and rate-limiting enzyme analyses. Marine biology. 163 (8), 1-12 (2016).
- Jiang, L., et al. A feedback loop involving FREP and NF-kappaB regulates the immune response of sea cucumber Apostichopus japonicus. International Journal of Biological Macromolecules. 135, 113-118 (2019).
- Zhou, X., Chang, Y., Zhan, Y., Wang, X., Lin, K. Integrative mRNA-miRNA interaction analysis associate with immune response of sea cucumber Apostichopus japonicus based on transcriptome database. Fish and Shellfish Immunology. 72, 69-76 (2018).
- Cai, X., Zhang, Y. Marine invertebrate cell culture: a decade of development. Journal of Oceanography. 70 (5), 405-414 (2014).
- Maselli, V., Xu, F., Syed, N. I., Polese, G., Di Cosmo, A. A Novel Approach to Primary Cell Culture for Octopus vulgaris Neurons. Frontiers in Physiology. 9, 220 (2018).
- Pinsino, A., Alijagic, A. Sea urchin Paracentrotus lividus immune cells in culture: formulation of the appropriate harvesting and culture media and maintenance conditions. Biology Open. 8 (3), (2019).
- Odintsova, N. A., Dolmatov, I. Y., Mashanov, V. S. Regenerating holothurian tissues as a source of cells for long-term cell cultures. Marine Biology. 146 (5), 915-921 (2005).
- Rastogi, R. P., Richa, R. P., Sinha, R. P. Apoptosis: Molecular Mechanisms and Pathogenicity. Excli Journal. 8, 155-181 (2009).
- Wan, L., et al. Apoptosis, proliferation, and morphology during vein graft remodeling in rabbits. Genetics and Molecular Research. 15 (4), (2016).
- Kasibhatla, S., et al. Staining of suspension cells with hoechst 33258 to detect apoptosis. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (3), (2006).
- Mikiewicz, M., Otrocka-Domagala, I., Pazdzior-Czapula, K., Rotkiewicz, T. Influence of long-term, high-dose dexamethasone administration on proliferation and apoptosis in porcine hepatocytes. Research in Veterinary Science. 112, 141-148 (2017).
- Rinkevich, B. Cell cultures from marine invertebrates: new insights for capturing endless stemness. Marine Biotechnology. 13 (3), 345-354 (2011).
- Bello, S. A., Abreu-Irizarry, R. J., Garcia-Arraras, J. E. Primary cell cultures of regenerating holothurian tissues. Methods in Molecular Biology. 1189, 283-297 (2015).
- Yu, H., et al. Impact of water temperature on the growth and fatty acid profiles of juvenile sea cucumber Apostichopus japonicus (Selenka). Journal of Thermal Biology. 60, 155-161 (2016).
