Summary
Dit protocol biedt een eenvoudig te hanteren methode voor het kweken van de darmcellen van Sea komkommer Apostichopus japonicus en is compatibel met een verscheidenheid aan breed beschikbare weefselmonsters van mariene organismen, waaronder Echinodermata, slakken, en Crustacea.
Abstract
Primaire gekweekte cellen worden gebruikt in een verscheidenheid van wetenschappelijke disciplines als uitzonderlijk belangrijke instrumenten voor de functionele evaluatie van biologische stoffen of de karakterisering van specifieke biologische activiteiten. Echter, vanwege het gebrek aan universeel toepasbare celcultuur media en protocollen, zijn goed beschreven celkweek methoden voor mariene organismen nog steeds beperkt. Ondertussen belemmeren de vaak voorkomende microbiële besmetting en polytrope eigenschappen van mariene ongewervelde cellen de totstandbrenging van een effectieve celcultuur strategie voor ongewervelde mariene organismen. Hier beschrijven we een gemakkelijk te hanteren methode voor het kweken van darmcellen van zeekomkommer Apostichopus japonicus; Daarnaast bieden we een voorbeeld van in vitro apoptosis inductie en detectie in primaire gekweekte intestinale cellen. Bovendien biedt dit experiment informatie over de juiste methode voor kweekmedium en celverzameling. Het beschreven protocol is compatibel met een verscheidenheid aan breed beschikbare weefselmonsters van mariene organismen, waaronder Echinodermata, slakken, en Crustacea, en het kan voldoende cellen bieden voor meervoudige in vitro experimentele toepassingen. Deze techniek zou onderzoekers in staat stellen om de primaire celculturen efficiënt te manipuleren van ongewervelde mariene organismen en om de functionele evaluatie van gerichte biologische materialen op cellen te vergemakkelijken.
Introduction
Het kweken van cellen onder kunstmatig gecontroleerde omstandigheden, en niet in hun natuurlijke omgeving, biedt uniforme experimentele materialen voor biologische studies, vooral voor soorten die niet gemakkelijk kunnen worden gekweekt in een laboratoriumomgeving. Mariene ongewervelde dieren zijn meer dan 30% van alle diersoorten1en bieden talrijke biologische materialen voor onderzoek naar de regelgevings mechanismen van specifieke biologische processen, zoals regeneratie2,3, stress response4en aanpassing aan de milieu-adaptatie5,6.
De zeekomkommer, apostichopus japonicus, is een van de meest bestudeerde stekelhuidigen soorten die in gematigde wateren langs de Noord-Pacifische kust wonen. Het is bekend als een commercieel belangrijke soort en mariculit op grote schaal in Oost-Azië, met name in China7. Tal van wetenschappelijke vragen met betrekking tot A. japonicus, met inbegrip van de regelgevende mechanismen onderliggende intestinale regeneratie na ontbranding8 en degeneratie in aestivation9, metabole controle10,11, en immuunrespons12,13 onder thermische of pathogene spanningen, hebben de aandacht van onderzoekers aangetrokken. Echter, in vergelijking met goed bestudeerde model dieren, fundamenteel onderzoek, vooral op cellulair niveau, wordt beperkt door technische knelpunten, zoals het ontbreken van geavanceerde celcultuurmethoden.
Onderzoekers hebben veel moeite gedaan om cellijnen vast te stellen, maar ze hebben ook veel uitdagingen ondervonden en er is geen cellijn van een mariene ongewervelde opgericht, maar14. Echter, primaire celculturen van mariene ongewervelde dieren hebben gevorderd in de laatste decennia15,16, en ze hebben een kans voor experimenten op cellulair niveau geboden. Bijvoorbeeld, de regenererende intesine van A. japonicus is gebruikt als een bron van cellen voor lange-termijn celculturen die een praktische methode voor de primaire celcultuur van mariene ongewervelde dieren17. Dit protocol combineerde en geoptimaliseerde ongewervelde celcultuur benadert en ontwikkelde een breed passende primaire kweekmethode voor zeekomkommer of andere ongewervelde zeedieren.
Apoptosis is een intrinsieke cel Suicide programma getriggerd door verschillende exogene en endogene stimuli. Gecoördineerde apoptosis is cruciaal voor veel biologische systemen18,19, en het is betrokken bij de intestinale regressie van zee komkommer tijdens aestivation9. Om het apoptotische proces in organismen van belang te onderzoeken, zijn een reeks methoden, waaronder Hoechst kleuring en microscopie testen, vastgesteld en met succes toegepast20. Hier, we voerden apoptosis inductie en detectie in primaire gekweekte intestinale cellen van zee komkommer om te beoordelen van de bruikbaarheid van primaire cellen in biologische studies van mariene ongewervelde dieren. Dexamethason, een van de meest gebruikte synthetische glucocorticosteroïden21, werd gebruikt voor het opwekken van Apoptosis in gekweekte darmcellen van zee komkommer, en significante Hoechst 33258 signaal werd met succes gedetecteerd in de bevlekte cellen door fluorescerende microscopie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. medium bereiding voor celkweek
-
Coelomic vloeistof voorbereiding
- Coelomic Fluid collectie: Onder steriele omstandigheden, ontleden een gezonde zeekomkommer (nat gewicht van 85-105 g), verzamel coelomic vloeistof, en bewaar het in een steriele glazen kolf.
- Coelomic celverwijdering: Centrifugeer de coelomic vloeistof in 50 mL centrifugebuizen bij 1.700 x g gedurende 5 minuten en breng het supernatant over in een nieuwe steriele glazen kolf; vervolgens, het verzamelen van de cel-vrije coelomic vloeistof van de zee komkommer.
- Complement componenten inactivatie: Inbroed de steriele glazen kolf, die de zeekomkommer coelomic vloeistof bevat, in een waterbad van 40 – 50 °C gedurende 20 – 40 minuten om complement componenten te verkrijgen-geïnactiveerde coelomic vloeistof.
- Microbe verwijdering: Verwijder bacteriën en Chlamydia door filtratie door middel van 0,22 μm membraanfilters. Verwijder vervolgens mycoplasma en andere fijne deeltjes door filtratie met behulp van 0,1 μm membraanfilters om coelomic vloeistof voorbehandelings oplossing te verkrijgen.
- Aanpassing zoutgehalte: Pas het zoutgehalte van de coelomic vloeistof voorbehandelings oplossing aan op 30‰ (gemeten met Salinometer) door toevoeging van 20% hoge concentratie voorgesteriliseerde en gefilterde NaCl-oplossing (verdund met voorbehandelde coelomic vloeistof) of DDW (dubbel gedestilleerd water). Breng de zeekomkommer coelomic Fluid over in een steriele fles, sluit de fles af en bewaar de vloeistof bij 4 °C voor verdere experimenten.
-
Leibovita's L-15 celcultuur medium optimalisatie
- Weeg 5,05 g NaCl, 0,135 g KCl, 0,15 g CaCl2, 0,25 g van na2, dus4, 0,975 g mgCl2, 0,25 g glucose, en 6,25 mg taurine en Verdun ze in 40 ml leibovito's L-15 medium in een 50 ml steriele centrifugebuis. Agitate de buis op een shaker voor 1 h om ervoor te zorgen dat de zouten volledig zijn opgelost.
- Voeg 2,5 mL L-glutamine (100 mg/mL) en 500 μL VE oplossing (1,75 mg/L) toe aan eerder voorbereide Leibovita's L-15 medium en filtreer het medium verder door middel van 0,22 μm membraanfilters.
- Stel het totale medium volume in op 500 mL met verse Leibovita's L-15 medium en met 100 mL eerder bereide coelomic vloeistof; Stel vervolgens de pH in op 7,6 met NaOH-oplossing. Houd het bedrijfsproces in een steriele omgeving. De compounding ratio van coelomic vloeistof kan 10% – 50% zijn, en 20% is voldoende voor een. japonicus darmcellen cultuur.
2. voorbereiding van de intestinale cel
-
Zee komkommer darm verwerking
- Verdoving gezonde zeekomkommers in een ijsbak. Dissect en verzamelen van de voorste darmen, vervolgens sectie de weefselmonsters verticaal en verwijder de binnenste inhoud.
- Was de weefselmonsters tweemaal in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en desinfecteer ze door onderdompeling in een waterige ethanol vloeistof (75% van het volume) voor niet meer dan 2 sec.
- Was de weefselmonsters in PBS driemaal om ethanol te verwijderen en breng ongeveer 100 mg weefselmonster over in een steriele micro centrifugebuis van 2,0 mL.
-
Cell Collection
- Voeg 1,5 mL van het voorgeoptimaliseerde kweekmedium toe aan de zee komkommer darmweefsel blok en gehakt het blok met gesteriliseerde chirurgische schaar totdat de oplossing troebel is.
Opmerking: voor optioneel vereenvoudigd protocol, Voeg 0,5 mL vooraf geoptimaliseerde kweekmedium toe aan de zee komkommer intestinale weefsel blok en snijd het blok met gesteriliseerde chirurgische schaar in 1 mm3. Breng de monsters rechtstreeks over naar kweek gerechten gevolgd door daaropvolgende incuberende stappen. - Voeg 400 μL trypsine (0,25%), meng de oplossing door inversie, en incuberen het gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur; vervolgens filtert u de oplossing met een celzeef van 100 μm.
Opmerking: het is optioneel om trypsine toe te voegen voor celdispersie bij de behandeling van verschillende weefselmonsters. Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) moet in trypsine-oplossing worden opgenomen om de remmende werking van CA2 + en mg2 + in kweekmedium te verminderen. - Vang het filtraat op in een nieuwe steriele 2,0 mL micro centrifugebuis, centrifugeer bij 1.700 x g gedurende 3 minuten, gooi het supernatant weg, laat de pellet in kweekmedium (aangevuld met antibiotica) en was het tweemaal.
Opmerking: bereid vers voorgeoptimaliseerd kweekmedium, aangevuld met 2% penicillaire-streptomycine oplossing (10.000 U/mL penicillaire en 10 mg/mL streptomycine) en 1% gentamicine (4 mg/mL) vóór het begin van het experiment.
- Voeg 1,5 mL van het voorgeoptimaliseerde kweekmedium toe aan de zee komkommer darmweefsel blok en gehakt het blok met gesteriliseerde chirurgische schaar totdat de oplossing troebel is.
3. celcultuur
-
Presetting van de incubator: PRESET de incubator voor celkweek en voer deze op voorhand uit gedurende ten minste 24 uur met een temperatuur van 18 °C en een verzadigde luchtvochtigheid.
Opmerking: Voer CO2 in de incubator afhankelijk van de celkweekmedium eigenschappen; Er moet geen CO2 worden geleverd bij gebruik van het basismedium van Leibovito's L-15. -
Eerste fase celcultuur
- Voor de remming van de groei van microben en ter bevordering van de proliferatie tijdens de eerste fase van de celcultuur, voeg 10 mL penicillaire-streptomycine oplossing (10.000 U/mL penicillaire en 10 mg/mL streptomycine) en 0,5 mL gentamicine (40 mg/mL) in elke 500 mL vooraf geoptimaliseerde kweekmedium. Bovendien wordt elke kweekmedium van 500 mL aangevuld met 0,6 mL insuline (10 mg/mL), 100 μL insuline-achtige groeifactor (0,1 μg/μL) en 25 μL fibroblast-groeifactor (0,1 μg/μL).
- Verzamel de cellen in buizen van 1,5 mL, hervat ze met 200 μL aangegeven medium en pipet ze in φ 4 cm gerechten.
- Kweek de cellen in een incubator en voeg 2,0 mL aangegeven medium toe aan de celkweek gerechten na 6 h. Verander de helft van het medium om de 12 uur totdat de volgende fase is bereikt.
Opmerking: Behandel de medium verandering zachtjes, omdat de cellen niet strak aan de gerechten zijn bevestigd. Poly-D-Lysine-gecoate gerechten kunnen worden gebruikt voor losjes te hechten aan de schotel cellen.
-
Tweede fase celcultuur
- Om de nadelige effecten van antibiotica op de gekweekte cellen te verminderen, verminderen van de concentratie van geïndiceerd antibiotica (penicillair, streptomycine, en gentamicin) in het cultuurmedium door de helft.
Opmerking: het gebruik van insuline en groeifactoren is afhankelijk van de celkweek omstandigheden en is optioneel. - Het celkweekmedium vervangen; Voer middelgrote veranderingen elke twee tot drie dagen, afhankelijk van de celdichtheid.
Opmerking: observeer de gekweekte cellen dagelijks onder een microscoop en noteer de groeiomstandigheden.
- Om de nadelige effecten van antibiotica op de gekweekte cellen te verminderen, verminderen van de concentratie van geïndiceerd antibiotica (penicillair, streptomycine, en gentamicin) in het cultuurmedium door de helft.
-
Celpassaging
Opmerking: doorgang en subcultuur de cellen, wanneer de primaire celdichtheid 60% bereikt.- Was de gekweekte cellen tweemaal met PBS bij kamertemperatuur. Voeg 200 μL trypsine-oplossing (0,25%) aan elk gerecht en handmatig schudden het gerecht ervoor te zorgen dat de hele bodem is bedekt. Gooi de trypsine-oplossing weg en inbroed de cellen gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Was de cellen met 1,0 mL vers kweekmedium door pipetten en de cellen opnieuw op te schorten. Breng 0,5 mL celsuspensie over naar een nieuw schaaltje, voeg 1,5 mL vers medium toe en inincuberen de cellen bij 18 °C.
Opmerking: celscrapers kunnen worden gebruikt voor celverzameling wanneer de trypsine-oplossing niet in staat is om cellen te verteren en los te maken van de gerechten (sommige cellijnen zijn te lijm). Voer beide methoden echter niet tegelijkertijd uit. - Verander het medium na 12 uur en observeer de cellen onder een microscoop om de omstandigheden te evalueren. Kweek de cellen voor verdere experimentele testen.
4. inductie en detectie van Apoptosis in een. japonicus darmcellen
-
Celkweek en behandeling met dexamethason
- Maak de intestinale cellen na het eerder geïntroduceerde protocol en voeg de cellen druppelsgewijs toe aan een 12-put plaat bij een celvolume van 2 x 106 per put.
- Na drie dagen in cultuur, na de stappen van de "eerste fase celcultuur", was de cellen drie keer met PBS en vervang het medium door een geoptimaliseerd medium (zonder antibiotica en groeifactoren).
- Verdun dexamethason (DXMS) in kweekmedium om verse 2 μM en 200 μM DXMS-oplossingen te bereiden voordat u begint met de experimenten.
- Voeg dxms-oplossingen in verschillende concentraties toe aan gekweekte cellen die zijn geteeld met hetzelfde volume van het kweekmedium; Stel drie experimentele groepen in, waaronder Control (CTL), 1 μM en 100 μM DXMS.
-
Hoechst kleuring
- Was de cellen driemaal na incubatie met/zonder DXMS voor de aangegeven tijdsperioden (0 uur, 24 uur en 48 uur).
- Voeg 300 μL Hoechst 33258 oplossing per put toe aan een 12-put plaat en inincuberen bij 18 °C gedurende 30 min. schud de plaat zachtjes om alle cellen te bedekken die hun kleuring garanderen.
- Verwijder de Hoechst-kleurings oplossing en bevestig de cellen door aan elk goed 300 μL van een 4% Paraformaldehyde-oplossing (in PBS) toe te voegen. Zachtjes te agiteren gedurende 15 minuten.
Let op: Paraformaldehyde is matig toxisch bij aanraking van de huid of inademing, en is aangewezen als een waarschijnlijke carcinogene stof voor de mens. Bij het wegen en hanteren van Paraformaldehyde moeten chemische rook afzuigkappen, behuizingen voor geventileerde balans of andere beschermende maatregelen worden gebruikt. - Was de vaste cellen drie keer in PBS. Gooi de PBS na het wassen niet weg om de cellen bedekt te houden.
-
Fluorescerende microscopie analyse
- Schakel de fluorescerende Microscoop hardware in, inclusief de Mercury Lamp Power, fluorescentielicht stroom en PC. Meld u aan bij de account van het besturingssysteem, start de software en controleer de configuratie.
- Plaats de bereide plaat op de Microscoop. Plaats het monster op de objectief lens met behulp van de stage-controller.
- Vind de cellen van belang onder de lichtmicroscoop, overschakelen naar fluorescerende microscopie, en leg de beelden door het afstemmen van de parameters.
Opmerking: om de Hoechst 33258 fluorescerende signaal gebonden aan kernen DNA te observeren, moet fluorescentiemicroscopie worden uitgevoerd met excitatie en emissie bij ongeveer 352 nm en 461 nm, respectievelijk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hier hebben we de primaire intestinale celcultuur van A. japonicus vastgesteld en de cellen door gevoerd. Figuur 1 toont ronde cellen in verschillende stadia van culturing. En de EdU-kleurings testen bieden directe bewijzen om de proliferatieve activiteit van deze ronde cellen in een later stadium te onthullen (Figuur 2). We hebben ook het protocol enigszins aangepast, het kweken van gehakte weefsel blokken in plaats van gefiltreerde cellen; Bovendien, een spil celtype kan worden gekweekt met succes. Dit celtype vond plaats rond de intestinale weefsel blokken en kon worden waargenomen na vier dagen van cultuur; het is echter niet gelukt om te worden gepasseerde (Figuur 3).
De gekweekte cellen kunnen worden gebruikt voor verschillende biologische experimentele toepassingen. We behandelden de cellen met DXMS voor verschillende periodes, gevolgd door Hoechst 33258 kleuring voor apoptotische celdetectie. Figuur 4 geeft het geïnduceerde apoptotic-signaal aan dat is gedetecteerd door de zeekomkommer darmcellen door Hoechst 33258 kleuring en fluorescerende microscopie. Figuur 5 demonstreert de apoptotische celsnelheden voor aangegeven tijdsperioden onder stimulatie met dxms.
Figuur 1: microscopie van gekweekte zee komkommer intestinale ronde cellen in verschillende stadia. A) cellen die op de derde dag nadat zij zijn geseeid, op de bodem van de gerechten zijn bevestigd. B) celproliferatie op de zevende dag. C) cellen die na het doorvoeren aan de onderzijde van de afwas zijn bevestigd. D) cellen die de activiteit hebben verloren en na tien passages sterven. "CM" geeft de celmassa aan, die optreedt tijdens celproliferatie. "BT" geeft de zwarte track aan, die achtergelaten werd door dode cellen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: celproliferatie gedetecteerd door EdU-kleurings tests. Celproliferatie assays werden uitgevoerd met behulp van de Kit (tabel van de materialen) volgens het Protocol van de fabrikant. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: microscopie van gekweekte zee komkommer intestinale weefsel blokken en celproliferatie. A) weefsel blokken (TB) die op de eerste dag na de cultuur aan de bodem van het gerecht zijn bevestigd. B) weefsel blokken en cellen die op de tweede dag na de cultuur aan de bodem van het gerecht zijn bevestigd. C) weefsel blokken en perikaal opgetreden spindel cellen (SC) op de vierde dag na de cultuur. D) uitbreidden spil cellen op de zevende dag na de cultuur. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: fluorescerende microscopie van intestinale ronde cellen met geïnduceerde apoptosis. "NC" duidt op nucleaire condensatie fluorescentie signaal. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: statistische analyse van Hoechst-positieve intestinale ronde cellen. Verdeling van het percentage van kern condensatie fluorescerende signaal-positieve cellen tussen Hoechst gekleurd A. japonicus intestinale cellen samen met de dosis of het tijdsverloop van het experiment (n = 3). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Er zijn uitgebreide onderzoeksinspanningen gewijd aan het tot stand brengen van cellijnen in de afgelopen decennia, maar het is nog steeds moeilijk om een vooruitgang te maken op lange termijn cultuur van cellen van mariene ongewervelde14,22. Er is gemeld dat gekweekte cellen van het regenereren van holothurian weefsels levensvatbaar voor een lange periode van tijd zijn en hoge activiteit van proliferatie kan worden gedetecteerd in specifieke cellen17,23. Voor de normale mariene ongewervelde cellen is er echter nog geen praktische celcultuurbenadering beschreven. Het hier gepresenteerde protocol biedt een efficiënte en gemakkelijk interpreteerbare methode voor het kweken en doorvoeren van intestinale cellen uit de mariene ongewervelde soorten A. japonicus. De methode kan gemakkelijk worden aangepast voor de primaire celcultuur van veel verschillende mariene ongewervelde organismen zoals inktvis en krab.
Een reeks belangrijke factoren is van invloed op de succesvolle toepassing van deze procedure. De preventie van microbiële besmetting is van het allergrootste belang tijdens het hele proces, en vooral tijdens de eerste week van de cultuur. Waterdieren meestal contact met talrijke microben uit de omgeving, die hun weefsels koloniseren, zoals Gill, darm, FIN, en de huid. Het is dus onmogelijk om de weefselmonsters te steriliseren vóór de initiatie van de celcultuur. Om het risico op microbiële besmetting tijdens de celkweek te minimaliseren, is 75% ethanol onderdompeling voor weefselmonster sterilisatie essentieel; de behandelingstijd moet echter worden geoptimaliseerd voor verschillende weefsel typen. Bovendien speelt de toepassing van hoge antibiotica concentraties in de vroege stadia van de celkweek ook een belangrijke rol bij de remming van de microbiële groei. Verder is de middellange formulering een belangrijke factor die de proliferatie en levensduur van gekweekte cellen bepaalt. Aangezien de voedingsbehoeften van mariene ongewervelde cellen nog onbekend zijn, is het huidige gebruikte celkweekmedium voornamelijk ontworpen voor gewervelde of insecten cellijnen14. Om voldoende voedingsstoffen te leveren, kan voorbehandelde coelomic vloeistof uit zeekomkommers worden gebruikt die vergelijkbaar is met FBS in de zoogdier celcultuur. Om de celproliferatie te vergemakkelijken, kunnen ook verschillende groeifactoren voor zoogdieren worden toegepast in kweekmedium. Aangezien de incubatietemperatuur een factor is die het succes van de mariene ongewervelde celcultuur beïnvloedt, moet worden overwogen de cellen onder de optimale groei temperatuur van het doelorganisme te bebroed. De temperatuur voor A. japonicus celcultuur kan bijvoorbeeld worden ingesteld op 18 °c, wat geschikt is voor zijn groei24.
Weefsel voorbehandeling kan invloed hebben op de succesvol gekweekte en prolifererende celtypen. Zeer verschillend A. japonicus darmcellen, rond of spindel, kunnen worden verkregen uit het zaaien van filated cellen of weefsel blokken onder exact dezelfde cultuur procedure (vergelijkende gegevens uit Figuur 1 en Figuur 3). Dus, het optimaliseren van de weefsel voorbehandelings methode voor specifieke celcultuur type moet ook worden uitgevoerd aan het begin; de optimale procedure moet worden bepaald volgens het biologisch experimentele ontwerp.
Hier, we toegepast DXMS behandeling voor apoptosis inductie in A. japonicus intestinale cellen na drie dagen in de cultuur, en we uitgevoerd Hoechst kleuring voor apoptotic signaaldetectie. Succesvolle detectie van de Hoechst-positieve cellen, na 48 h stimulatie met 1 μM DXMS, gaf een praktisch voorbeeld voor een biologisch experiment op basis van de gekweekte cellen.
Het beschreven protocol is eenvoudig te hanteren en kan worden gebruikt om een mariene celcultuur van ongewervelde dieren tot stand te brengen. De gekweekte cellen moeten biologisch materiaal voorzien van een consistente genetische achtergrond voor verschillende verdere biologische experimentele toepassingen. Bovendien kunnen licht aangepaste protocol procedures de met succes prolifererende celtypen tijdens de cultuur veranderen en verschillende celmaterialen voor biologische experimenten bieden. Dus, de optimalisatie van bepaalde stappen in het protocol zal nodig zijn, afhankelijk van de beoogde diersoorten en de specifieke celtypen die nodig zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen Prof. Naiming Zhou van de Zhejiang University bedanken voor zijn technisch advies en voor het beschikbaar stellen van de apparatuur van zijn laboratorium voor gebruik. Dit werk werd financieel gesteund door de National Natural Science Foundation of China (subsidie nummers 41876154, 41606150 en 41406137) en de fundamentele onderzoeksfondsen voor de Zhejiang provinciale universiteiten en onderzoeksinstituten [subsidie nummer 2019JZ00007 ].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 μm filter | Millipore | SLVV033RS | |
| 0.22 μm filter | Millipore | SLGP033RB | |
| 0.25% Trypsin | Genom | GNM25200 | |
| 100 μm filter | Falcon | 352360 | |
| 4 cm dishes | ExCell Bio | CS016-0124 | |
| 4% paraformaldehyde solution | Sinopharm Chemical Reagent | 80096618 | in PBS |
| Benchtop Centrifuges | Beckman | Allegra X-30R | |
| BeyoClick EdU-488 kit | Beyotime | C0071S | |
| CaCl2 | Sinopharm Chemical Reagent | 10005817 | |
| Constant temperature incubator | Lucky Riptile | HN-3 | |
| Dexamethasone | Sinopharm Chemical Reagent | XW00500221 | |
| Electric thermostatic water bath | senxin17 | DK-S28 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent | 80176961 | 75% |
| Fibroblast Growth Factor(FGF) | PEPROTECH | 100-18B | |
| Fluorescent microscope | Leica DMI3000B | DMI3000B | |
| Garamycin | Sinopharm Chemical Reagent | XW14054101 | |
| Glucose | Sinopharm Chemical Reagent | 63005518 | |
| Hoechst33258 Staining solution | Beyotime | C1017 | |
| Insulin | Sinopharm Chemical Reagent | XW1106168001 | |
| Insulin like Growth Factor(IGF) | PEPROTECH | 100-11 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10016308 | |
| Leibovitz's L-15 | Genom | GNM41300 | |
| L-glutamine (100 mg/mL) | Genom | GNM-21051 | |
| MgCl2 | Sinopharm Chemical Reagent | XW77863031 | |
| Na2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10020518 | |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10019308 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent | 10019718 | |
| PBS | Solarbio | P1020 | pH7.2-7.4 |
| Penicillin-Streptomycin | Genom | GNM15140 | |
| PH meter | Bante | A120 | |
| Taurine | SIGMA | T0625 | |
| VE | Seebio | 185791 |
References
- Naganuma, T., Degnan, B. M., Horikoshi, K., Morse, D. E. Myogenesis in primary cell cultures from larvae of the abalone, Haliotis rufescens. Molecular Marine Biology and Biotechnology. 3 (3), 131-140 (1994).
- Reinardy, H. C., Emerson, C. E., Manley, J. M., Bodnar, A. G. Tissue regeneration and biomineralization in sea urchins: role of Notch signaling and presence of stem cell markers. Plos One. 10 (8), 0133860 (2015).
- Schaffer, A. A., Bazarsky, M., Levy, K., Chalifa-Caspi, V., Gat, U. A transcriptional time-course analysis of oral vs. aboral whole-body regeneration in the Sea anemone Nematostella vectensis. Bmc Genomics. 17, 718 (2016).
- Chiaramonte, M., Inguglia, L., Vazzana, M., Deidun, A., Arizza, V. Stress and immune response to bacterial LPS in the sea urchin Paracentrous lividus (Lamarck, 1816). Fish and Shellfish Immunology. 92, 384-394 (2019).
- Meng, J., Wang, T., Li, L., Zhang, G. Inducible variation in anaerobic energy metabolism reflects hypoxia tolerance across the intertidal and subtidal distribution of the Pacific oyster (Crassostrea gigas). Marine Environmental Research. 138, 135-143 (2018).
- Han, G., Zhang, S., Dong, Y. Anaerobic metabolism and thermal tolerance: The importance of opine pathways on survival of a gastropod after cardiac dysfunction. Integrative Zoology. 12 (5), 361-370 (2017).
- Zhang, X., et al. The sea cucumber genome provides insights into morphological evolution and visceral regeneration. PLoS Biology. 15 (10), 2003790 (2017).
- Sun, L., et al. iTRAQ reveals proteomic changes during intestine regeneration in the sea cucumber Apostichopus japonicus. Comparative Biochemistry and Physiology Part D: Genomics and Proteomics. 22, 39-49 (2017).
- Xu, K., et al. Cell loss by apoptosis is involved in the intestinal degeneration that occurs during aestivation in the sea cucumber Apostichopus japonicus. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 216, 25-31 (2018).
- Yang, H. S., et al. Metabolic characteristics of sea cucumber Apostichopus japonicus (Selenka) during aestivation. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 330 (2), 505-510 (2006).
- Xiang, X. W., et al. Glycolytic regulation in aestivation of the sea cucumber Apostichopus japonicus: evidence from metabolite quantification and rate-limiting enzyme analyses. Marine biology. 163 (8), 1-12 (2016).
- Jiang, L., et al. A feedback loop involving FREP and NF-kappaB regulates the immune response of sea cucumber Apostichopus japonicus. International Journal of Biological Macromolecules. 135, 113-118 (2019).
- Zhou, X., Chang, Y., Zhan, Y., Wang, X., Lin, K. Integrative mRNA-miRNA interaction analysis associate with immune response of sea cucumber Apostichopus japonicus based on transcriptome database. Fish and Shellfish Immunology. 72, 69-76 (2018).
- Cai, X., Zhang, Y. Marine invertebrate cell culture: a decade of development. Journal of Oceanography. 70 (5), 405-414 (2014).
- Maselli, V., Xu, F., Syed, N. I., Polese, G., Di Cosmo, A. A Novel Approach to Primary Cell Culture for Octopus vulgaris Neurons. Frontiers in Physiology. 9, 220 (2018).
- Pinsino, A., Alijagic, A. Sea urchin Paracentrotus lividus immune cells in culture: formulation of the appropriate harvesting and culture media and maintenance conditions. Biology Open. 8 (3), (2019).
- Odintsova, N. A., Dolmatov, I. Y., Mashanov, V. S. Regenerating holothurian tissues as a source of cells for long-term cell cultures. Marine Biology. 146 (5), 915-921 (2005).
- Rastogi, R. P., Richa, R. P., Sinha, R. P. Apoptosis: Molecular Mechanisms and Pathogenicity. Excli Journal. 8, 155-181 (2009).
- Wan, L., et al. Apoptosis, proliferation, and morphology during vein graft remodeling in rabbits. Genetics and Molecular Research. 15 (4), (2016).
- Kasibhatla, S., et al. Staining of suspension cells with hoechst 33258 to detect apoptosis. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (3), (2006).
- Mikiewicz, M., Otrocka-Domagala, I., Pazdzior-Czapula, K., Rotkiewicz, T. Influence of long-term, high-dose dexamethasone administration on proliferation and apoptosis in porcine hepatocytes. Research in Veterinary Science. 112, 141-148 (2017).
- Rinkevich, B. Cell cultures from marine invertebrates: new insights for capturing endless stemness. Marine Biotechnology. 13 (3), 345-354 (2011).
- Bello, S. A., Abreu-Irizarry, R. J., Garcia-Arraras, J. E. Primary cell cultures of regenerating holothurian tissues. Methods in Molecular Biology. 1189, 283-297 (2015).
- Yu, H., et al. Impact of water temperature on the growth and fatty acid profiles of juvenile sea cucumber Apostichopus japonicus (Selenka). Journal of Thermal Biology. 60, 155-161 (2016).
