Summary
Ce protocole fournit une méthode facile à manipuler pour la culture des cellules intestinales du concombre de mer Apostichopus japonicus et est compatible avec une variété d'échantillons de tissus largement disponibles provenant d'organismes marins, y compris Echinodermata, Mollusca et Crustacea.
Abstract
Les cellules cultivées primaires sont utilisées dans une variété de disciplines scientifiques comme outils exceptionnellement importants pour l'évaluation fonctionnelle des substances biologiques ou la caractérisation d'activités biologiques spécifiques. Cependant, en raison de l'absence de médias et de protocoles de culture cellulaire universellement applicables, les méthodes de culture cellulaire bien décrites pour les organismes marins sont encore limitées. Pendant ce temps, la contamination microbienne et les propriétés polytropes des cellules d'invertébrés marins entravent davantage l'établissement d'une stratégie efficace de culture cellulaire pour les invertébrés marins. Ici, nous décrivons une méthode facile à manipuler pour cultiver les cellules intestinales du concombre de mer Apostichopus japonicus; en outre, nous fournissons un exemple d'induction et de détection in vitro d'apoptose dans les cellules intestinales cultivées primaires. En outre, cette expérience fournit des détails sur le milieu de culture approprié et la méthode de collecte cellulaire. Le protocole décrit est compatible avec une variété d'échantillons de tissus largement disponibles provenant d'organismes marins, y compris Echinodermata, Mollusca et Crustacea, et il peut fournir des cellules suffisantes pour de multiples applications expérimentales in vitro. Cette technique permettrait aux chercheurs de manipuler efficacement les cultures cellulaires primaires des invertébrés marins et de faciliter l'évaluation fonctionnelle des matériaux biologiques ciblés sur les cellules.
Introduction
La culture des cellules dans des conditions artificiellement contrôlées, et non dans leur environnement naturel, fournit des matériaux expérimentaux uniformes pour les études biologiques, en particulier pour les espèces qui ne peuvent pas être facilement cultivées dans un environnement de laboratoire. Les invertébrés marins représentent plus de 30% de toutes les espèces animales1, et ils fournissent de nombreux matériaux biologiques pour entreprendre des recherches sur les mécanismes de régulation de processus biologiques spécifiques, tels que la régénération2,3, la réponse au stress4, et l'adaptation environnementale5,6.
Le concombre de mer, Apostichopus japonicus, est l'une des espèces d'échinodermes les plus étudiées qui habitent les eaux tempérées le long de la côte du Pacifique Nord. Il est bien connu comme une espèce commercialement importante et maricultured sur une grande échelle en Asie de l'Est, en particulier en Chine7. De nombreuses questions scientifiques concernant A. japonicus, y compris les mécanismes de régulation sous-jacents à la régénération intestinale après l'éviscération8 et la dégénérescence dans l'estivation9, le contrôle métabolique10,11, et la réponse immunitaire12,13 sous des contraintes thermiques ou pathogènes, ont attiré l'attention des chercheurs. Cependant, par rapport aux animaux modèles bien étudiés, la recherche fondamentale, en particulier au niveau cellulaire, est limitée par des goulots d'étranglement techniques, tels que l'absence de méthodes avancées de culture cellulaire.
Les chercheurs ont consacré beaucoup d'efforts à l'établissement de lignées cellulaires, mais ils ont également fait face à de nombreux défis et aucune lignée cellulaire d'aucun invertébré marin n'a été établie encore14. Cependant, les cultures cellulaires primaires des invertébrés marins ont progressé au cours des dernières décennies15,16, et ils ont fourni une occasion d'expérimentation au niveau cellulaire. Par exemple, l'intesine régénératrice de A. japonicus a été utilisée comme source de cellules pour les cultures cellulaires à long terme qui ont fourni une méthode pratique pour la culture cellulaire primaire des invertébrés marins17. Ce protocole a combiné et optimisé les approches de culture cellulaire des invertébrés et a mis au point une méthode de culture primaire largement appropriée pour le concombre de mer ou d'autres invertébrés marins.
L'apoptose est un programme intrinsèque de suicide cellulaire déclenché par divers stimuli exogènes et endogènes. L'apoptose coordonnée est cruciale pour de nombreux systèmes biologiques18,19, et il a été impliqué dans la régression intestinale du concombre de mer lors de l'aestivation9. Pour étudier le processus apoptotique dans les organismes d'intérêt, une série de méthodes, y compris la coloration Hoechst et des essais de microscopie, ont été établis et appliqués avec succès20. Ici, nous avons effectué l'induction et la détection d'apoptose dans les cellules intestinales cultivées primaires du concombre de mer pour évaluer la facilité d'utilisation des cellules primaires dans les études biologiques des invertébrés marins. Dexamethasone, l'un des glucocorticostéroïdes synthétiques couramment utilisés21, a été utilisé pour induire l'apoptose dans les cellules intestinales cultivées de concombre de mer, et le signal significatif Hoechst 33258 a été détecté avec succès dans les cellules tachées par microscopie fluorescente.
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Protocol
1. Préparation moyenne de culture cellulaire
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Préparation coelomic fluide
- Collection de fluides coelomic : Dans des conditions stériles, disséquer un concombre de mer sain (poids humide de 85-105 g), recueillir du liquide coelomique et le stocker dans un flacon de verre stérile.
- Enlèvement coelomic de cellules : Centrifuger le liquide coelomique dans des tubes de centrifugeuse de 50 ml à 1 700 x g pendant 5 min et transférer le supernatant dans un nouveau flacon de verre stérile; ensuite, recueillir le liquide coelomic sans cellules du concombre de mer.
- Compléter l'inactivation des composants : Incuber le flacon de verre stérile, contenant le liquide coelomic de concombre de mer, dans un bain d'eau de 40 à 50 oC pendant 20 à 40 min pour obtenir du liquide coelomique inactivé par les composants complémentaires.
- Suppression de microbe : Enlever les bactéries et la chlamydia par filtration à travers des filtres à membrane de 0,22 m. Ensuite, retirez le mycoplasme et d'autres particules fines en les filtrationant à l'aide de filtres à membrane de 0,1 m pour obtenir une solution de prétraitement coelomic liquide.
- Ajustement de la salinité : Ajustez la salinité de la solution de prétraitement coelomic de fluide à 30 (mesurée par salinomètre) en ajoutant la solution presterilized et filtrée de 20% de presterilized et filtrée de NaCl (diluée par le fluide coelomic prétraité) ou DDW (eau distillée double). Transférer le liquide coelomique du concombre de mer dans une bouteille stérile, sceller la bouteille et entreposer le liquide à 4 oC pour d'autres expériences.
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Optimisation moyenne de la culture cellulaire L-15 de Leibovitz
- Peser 5,05 g de NaCl, 0,135 g de KCl, 0,15 g de CaCl2, 0,25 g de Na2SO4, 0,975 g de MgCl2, 0,25 g de glucose, et 6,25 mg de taurine et de les diluer dans 40 mL de Leibovitz L-15 milieu dans un 50 mL de tuberif sterile centrif. Agiter le tube sur un shaker pendant 1 h pour s'assurer que les sels se sont dissous complètement.
- Ajouter 2,5 ml de L-glutamine (100 mg/ml) et 500 l de solution VE (1,75 mg/L) dans le milieu L-15 de Leibovitz préalablement préparé et filtrer davantage le milieu à travers des filtres à membrane de 0,22 m.
- Ajuster le volume moyen total à 500 ml avec le milieu L-15 frais de Leibovitz et avec 100 ml de liquide coelomic préalablement préparé; ensuite, ajuster le pH à 7,6 à l'aide de la solution NaOH. Gardez le processus d'opération dans un environnement stérile. Le rapport composé de fluide coelomic peut être 10%-50%, et 20% est suffisant pour la culture de cellules intestinales de A. japonicus.
2. Préparation des cellules intestinales
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Traitement de l'intestin de concombre de mer
- Anesthésiez les concombres de mer sains dans une glacière. Disséquer et recueillir les intestins antérieurs, puis sectionner les échantillons de tissu verticalement et enlever le contenu intérieur.
- Laver les échantillons de tissus dans du phosphate tamponné saline (PBS) deux fois et les désinfecter par immersion dans une solution d'éthanol aqueux (75% en volume) pour pas plus de 2 s.
- Laver les échantillons de tissus dans pbS trois fois pour enlever l'éthanol et transférer environ 100 mg d'échantillon de tissu dans un tube microcentrifuge stérile de 2,0 ml.
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Collection de cellules
- Ajouter 1,5 ml du milieu de culture pré-optimisé au bloc de tissu intestinal du concombre de mer et hacher le bloc avec des ciseaux chirurgicaux stérilisés jusqu'à ce que la solution soit trouble.
REMARQUE : Pour un protocole simplifié facultatif, ajouter 0,5 ml de milieu de culture pré-optimisé au bloc de tissu intestinal du concombre de mer et couper le bloc avec des ciseaux chirurgicaux stérilisés en 1 mm3. Transférez directement les échantillons vers des plats de culture suivis d'étapes d'incubation ultérieures. - Ajouter 400 ll de trypsine (0,25%), mélanger la solution par inversion, et l'incuber pendant 5 min à température ambiante; puis filtrer la solution à l'aide d'une passoire à cellules de 100 m.
REMARQUE : Il est facultatif d'ajouter la trypsine pour la dispersion cellulaire lors du traitement de différents échantillons de tissus. L'acide éthylediaminetetraacetic (EDTA) devrait être contenu dans la solution de trypsine pour réduire l'activité inhibitrice de Ca2 et Mg 2 dans le milieude culture. - Recueillir le filtrate dans un nouveau tube stérile de 2,0 mL de microcentrifuge, centrifugeuse à 1 700 x g pendant 3 min, jeter le supernatant, puis resuspendre le granule dans un milieu de culture (complété d'antibiotiques) et le laver deux fois.
REMARQUE : Préparer un milieu de culture frais pré-optimisé complété par une solution de pénicilline-streptomycine de 2 % (10 000 U/mL de pénicilline et 10 mg/mL de streptomycine) et 1 % de gentamicine (4 mg/mL) avant le début de l'expérience.
- Ajouter 1,5 ml du milieu de culture pré-optimisé au bloc de tissu intestinal du concombre de mer et hacher le bloc avec des ciseaux chirurgicaux stérilisés jusqu'à ce que la solution soit trouble.
3. Culture cellulaire
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Préréglage de l'incubateur : Prérégler l'incubateur pour la culture cellulaire et l'exécuter à l'avance pendant au moins 24 h avec une température de 18 oC et une humidité saturée.
REMARQUE : Nourrir le CO2 dans l'incubateur en fonction des propriétés moyennes de la culture cellulaire; aucun CO2 n'a besoin d'être fourni lors de l'utilisation du support de base du L-15 de Leibovitz. -
Culture cellulaire de première étape
- Pour inhiber la croissance des microbes et favoriser la prolifération au cours de la phase initiale de la culture cellulaire, ajouter 10 ml de solution de pénicilline-streptomycine (10 000 U/mL de pénicilline et 10 mg/mL de streptomycine) et 0,5 ml de gentamicine (40 mg/mL) dans chaque 500 mL de milieu de culture pré-optimisé. De plus, compléter chaque milieu de culture de 500 ml par 0,6 ml d'insuline (10 mg/mL), 100 l de facteur de croissance de l'insuline (0,1 g/L) et 25 l de facteur de croissance du fibroblaste (0,1 g/L).
- Recueillir les cellules dans des tubes de 1,5 ml, les suspendre à l'aide de 200 l de milieu indiqué, et les épisser dans des plats de 4 cm.
- Culture des cellules dans un incubateur et ajouter 2,0 ml de milieu indiqué à la cellule de culture des plats après 6 h. Changer la moitié du milieu toutes les 12 h jusqu'à atteindre l'étape suivante.
REMARQUE: Manipuler le changement moyen doucement, parce que les cellules ne sont pas attachés à la vaisselle étroitement. Les plats enrobés de poly-D-lysine peuvent être utilisés pour s'attacher librement aux cellules de plat.
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Culture cellulaire de deuxième étape
- Pour réduire de moitié les effets néfastes des antibiotiques sur les cellules cultivées, réduire de moitié la concentration d'antibiotiques indiqués (pénicilline, streptomycine et gentamicine).
REMARQUE : L'utilisation de l'insuline et des facteurs de croissance dépend des conditions de culture cellulaire et est facultative. - Remplacer le milieu de culture cellulaire; effectuer des changements moyens tous les deux à trois jours en fonction de la densité cellulaire.
REMARQUE : Observez les cellules cultivées quotidiennement au microscope et enregistrez les conditions de croissance.
- Pour réduire de moitié les effets néfastes des antibiotiques sur les cellules cultivées, réduire de moitié la concentration d'antibiotiques indiqués (pénicilline, streptomycine et gentamicine).
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Passaging cellulaire
REMARQUE : Passage et sous-culture des cellules, lorsque la densité cellulaire primaire atteint 60 %.- Laver les cellules cultivées deux fois à l'aide de PBS à température ambiante. Ajouter 200 ll de solution trypsine (0,25%) à chaque plat et agiter manuellement le plat en veillant à ce que le fond entier est couvert. Jeter la solution de trypsine et incuber les cellules pendant 5 min à température ambiante.
- Laver les cellules avec 1,0 ml de milieu de culture frais par pipetting et resuspendre les cellules. Transférer 0,5 ml de suspension cellulaire dans un nouveau plat, ajouter 1,5 ml de milieu frais et incuber les cellules à 18 oC.
REMARQUE : Les grattoirs cellulaires peuvent être utilisés pour la collecte cellulaire lorsque la solution de trypsine ne digère pas et ne détache pas les cellules de la vaisselle (certaines lignées cellulaires sont trop adhésives). Cependant, ne conduisez pas les deux méthodes simultanément. - Changer le milieu après 12 h et observer les cellules au microscope pour évaluer les conditions. Culture des cellules pour d'autres essais expérimentaux.
4. Induction et détection d'apoptose dans les cellules intestinales de A. japonicus
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Culture cellulaire et traitement de la dexaméthasone
- Préparer les cellules intestinales suivant le protocole précédemment introduit et ajouter les cellules goutte à une plaque de 12 puits à un volume cellulaire de 2 x 106 par puits.
- Après trois jours de culture, suivant les étapes de la « culture cellulaire de première étape », lavez les cellules trois fois avec du PBS et remplacez le milieu par un milieu optimisé (sans antibiotiques et facteurs de croissance).
- Diluer la dexaméthasone (DXMS) dans le milieu de culture pour préparer des solutions diluées fraîches de 2 et 200 M DXMS avant de commencer les expériences.
- Ajouter des solutions DXMS en différentes concentrations aux cellules cultivées cultivées avec le même volume de milieu de culture; trois groupes expérimentaux, dont le contrôle (CTL), 1 M et 100 M DXMS.
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Coloration Hoechst
- Laver les cellules avec du PBS trois fois après l'incubation avec/sans DXMS pour les périodes indiquées (0 h, 24 h et 48 h).
- Ajouter 300 oL de solution Hoechst 33258 par puits à une plaque de 12 puits et incuber à 18 oC pendant 30 min. Agiter doucement la plaque pour couvrir toutes les cellules assurant leur coloration.
- Retirez la solution de coloration Hoechst et fixez les cellules en ajoutant 300 L d'une solution de paraformaldéhyde de 4 % (en PBS) à chaque puits. Agiter doucement pendant 15 min.
MISE EN GARDE: Le paraformaldéhyde est modérément toxique par contact cutané ou par inhalation, et il est désigné comme cancérogène probable pour l'homme. Les hottes chimiques de fumée, les enceintes d'équilibre ventilées, ou d'autres mesures protectrices devraient être employées pendant le poids et la manipulation du paraformaldéhyde. - Laver les cellules fixes trois fois en PBS. Ne jetez pas le PBS après le lavage pour garder les cellules couvertes.
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Analyse de microscopie fluorescente
- Allumez le matériel fluorescent de microscope comprenant la puissance de lampe de mercure, la puissance fluorescente de lumière, et le PC. Connectez-vous au compte du système d'exploitation, lancez le logiciel et vérifiez sa configuration.
- Placer la plaque préparée sur la scène du microscope. Placez l'échantillon au-dessus de l'objectif à l'aide du contrôleur d'étape.
- Trouvez les cellules d'intérêt sous le microscope léger, passez à la microscopie fluorescente et capturez les images en parant les paramètres.
REMARQUE : Pour observer le signal fluorescent Hoechst 33258 lié à l'ADN des noyaux, la microscopie à fluorescence doit être effectuée avec excitation et émission à environ 352 nm et 461 nm, respectivement.
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Representative Results
Ici, nous avons établi la culture intestinale primaire de cellules de A. japonicus et avons passages les cellules. La figure 1 montre les cellules rondes à différents stades de la culture. Et les tests de coloration EdU fournissent des preuves directes pour révéler l'activité proliférante de ces cellules rondes à un stade ultérieur (Figure 2). Nous avons également légèrement ajusté le protocole, crepandant des blocs de tissu hachés au lieu des cellules filtrated ; en outre, un type de cellule de fuseau pourrait être cultivé avec succès. Ce type de cellule s'est produit autour des blocs de tissu intestinal et pourrait être observé après quatre jours de culture ; toutefois, il n'a pas été adopté (figure 3).
Les cellules cultivées peuvent être utilisées pour différentes applications expérimentales biologiques. Nous avons traité les cellules avec DXMS pour différentes périodes de temps, suivies de la coloration de Hoechst 33258 pour la détection de cellules apoptotic. La figure 4 indique le signal apoptotique induit détecté à partir de cellules intestinales de concombre de mer par la coloration Hoechst 33258 et la microscopie fluorescente. La figure 5 montre les taux de cellules apoptotiques pour les périodes indiquées sous stimulation avec DXMS.
Figure 1 : Microscopie de cellules rondes intestinales de concombre de mer cultivées à différents stades. (A) Cellules attachées au fond de la vaisselle le troisième jour après avoir été enseissées. (B) Prolifération cellulaire le septième jour. (C) Cellules attachées au fond de la vaisselle après le passage. (D) Cellules qui ont perdu de l'activité et meurent après dix passages. "CM" indique la masse cellulaire, qui se produit pendant la prolifération cellulaire. "BT" indique la piste noire, qui a été laissée par des cellules mortes. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Prolifération cellulaire détectée par les tests de coloration EdU. Les tests de prolifération cellulaire ont été effectués à l'aide du kit (Table of Materials) selon le protocole du fabricant. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Microscopie des blocs de tissu intestinal de concombre de mer cultivés et prolifération cellulaire. (A) blocs de tissu (TB) attachés au fond du plat le premier jour après la culture. (B) Blocs de tissus et cellules fixées au fond du plat le deuxième jour après la culture. (C) Blocs de tissu et cellules de fuseau périphériquement produites (SC) le quatrième jour après culture. (D) cellules de fuseau proliférées le septième jour après la culture. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Microscopie fluorescente des cellules rondes intestinales avec apoptose induite. "NC" indique le signal fluorescent de condensation nucléaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Analyse statistique des cellules rondes intestinales Hoechst-positives. Répartition du pourcentage de cellules signal-positives fluorescentes de condensation nucléaire parmi les cellules intestinales teintées de Hoechst A. japonicus avec la dose ou le cours du temps de l'expérience (n - 3). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Des efforts de recherche approfondis ont été consacrés à l'établissement de lignées cellulaires au cours des dernières décennies, cependant, il est encore difficile de faire des progrès sur la culture à long terme des cellules des invertébrés marins14,22. Il a été rapporté que les cellules cultivées des tissus holothuriens régénérants étaient viables pendant une longue période de temps et l'activité élevée de la prolifération peut être détectée dans les cellules spécifiques17,23. Cependant, pour les cellules d'invertébrés marins normales, il n'y a pas encore d'approche pratique de culture cellulaire a été décrite. Le protocole présenté ici fournit une méthode efficace et facilement interprétable pour la culture et la passage des cellules intestinales de l'espèce d'invertébrés marins A. japonicus. La méthode peut être facilement adaptée à la culture cellulaire primaire de nombreux organismes invertébrés marins tels que la seiche et le crabe.
Une série de facteurs clés influent sur l'application réussie de cette procédure. La prévention de la contamination microbienne est d'une importance primordiale pendant l'ensemble du processus, et en particulier pendant la première semaine de culture. Les animaux aquatiques contactent habituellement de nombreux microbes de l'environnement, qui colonisent leurs tissus, tels que les branchies, l'intestin, les nageoires et la peau. Ainsi, il sera impossible de stériliser les échantillons de tissus avant l'initiation de la culture cellulaire. Pour minimiser le risque de contamination microbienne pendant la culture cellulaire, une immersion de 75 % d'éthanol pour la stérilisation des échantillons de tissus est essentielle; cependant, le temps de traitement devrait être optimisé pour différents types de tissu. En outre, l'application de fortes concentrations d'antibiotiques pendant les premiers stades de la culture cellulaire joue également un rôle important dans l'inhibition de la croissance microbienne. En outre, la formulation moyenne est un facteur majeur déterminant la prolifération et la durée de vie des cellules cultivées. Étant donné que les besoins nutritionnels des cellules d'invertébrés marins sont encore inconnus, le milieu actuel de culture cellulaire utilisé a été principalement conçu pour les lignées de vertébrés ou d'insectes14. Pour fournir suffisamment de matériaux nutritionnels, le liquide coelomic prétraité des concombres de mer peut être utilisé de la même façon que le FBS dans la culture cellulaire des mammifères. Pendant ce temps, pour faciliter la prolifération cellulaire, plusieurs facteurs de croissance des mammifères peuvent également être appliqués dans le milieu de culture. Étant donné que la température d'incubation est un facteur ayant un impact sur le succès de la culture des cellules d'invertébrés marins, les cellules d'incubation sous la température de croissance optimale de l'organisme cible devraient être prises en considération. Par exemple, la température de la culture cellulaire A. japonicus peut être fixée à 18 oC, ce qui convient à sa croissance24.
Le prétraitement tissulaire peut avoir un impact sur les types de cellules cultivées et proliférantes avec succès. Des cellules intestinales A. japonicus très différentes, rondes ou fuseuses, peuvent être obtenues à partir de cellules filtrées d'ensemencement ou de blocs de tissu selon exactement la même procédure de culture (données comparatives de la figure 1 et de la figure 3). Ainsi, l'optimisation de la méthode de prétraitement des tissus pour un type spécifique de culture cellulaire devrait également être effectuée au début; la procédure optimale doit être décidée en fonction de la conception expérimentale biologique.
Ici, nous avons appliqué le traitement de DXMS pour l'induction d'apoptosis dans les cellules intestinales de A. japonicus après trois jours dans la culture, et nous avons effectué la coloration de Hoechst pour la détection de signal apoptotic. La détection réussie des cellules positives de Hoechst, après la stimulation de 48 h par 1 DXMS de M, a fourni un exemple pratique pour une expérience biologique basée sur les cellules cultivées.
Le protocole décrit est facile à manipuler et peut être utilisé pour établir une culture des cellules d'invertébrés marins. Les cellules cultivées devraient fournir du matériel biologique avec un bagage génétique cohérent pour différentes autres applications expérimentales biologiques. En outre, les procédures de protocole légèrement ajustées peuvent changer les types de cellules proliférant avec succès pendant la culture et fournir différents matériaux cellulaires pour des expériences biologiques. Ainsi, l'optimisation de certaines étapes du protocole sera nécessaire, en fonction des espèces animales ciblées et des types de cellules spécifiques nécessaires.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Les auteurs souhaitent remercier le professeur Naiming Zhou de l'Université du Zhejiang pour ses conseils techniques et pour avoir mis à la disposition de l'équipement de son laboratoire une utilisation. Ce travail a été soutenu financièrement par la National Natural Science Foundation of China (numéros de subvention 41876154, 41606150 et 41406137) et les Fonds de recherche fondamentale pour les universités provinciales et les instituts de recherche du Zhejiang [numéro de subvention 2019JZ00007 ].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 μm filter | Millipore | SLVV033RS | |
| 0.22 μm filter | Millipore | SLGP033RB | |
| 0.25% Trypsin | Genom | GNM25200 | |
| 100 μm filter | Falcon | 352360 | |
| 4 cm dishes | ExCell Bio | CS016-0124 | |
| 4% paraformaldehyde solution | Sinopharm Chemical Reagent | 80096618 | in PBS |
| Benchtop Centrifuges | Beckman | Allegra X-30R | |
| BeyoClick EdU-488 kit | Beyotime | C0071S | |
| CaCl2 | Sinopharm Chemical Reagent | 10005817 | |
| Constant temperature incubator | Lucky Riptile | HN-3 | |
| Dexamethasone | Sinopharm Chemical Reagent | XW00500221 | |
| Electric thermostatic water bath | senxin17 | DK-S28 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent | 80176961 | 75% |
| Fibroblast Growth Factor(FGF) | PEPROTECH | 100-18B | |
| Fluorescent microscope | Leica DMI3000B | DMI3000B | |
| Garamycin | Sinopharm Chemical Reagent | XW14054101 | |
| Glucose | Sinopharm Chemical Reagent | 63005518 | |
| Hoechst33258 Staining solution | Beyotime | C1017 | |
| Insulin | Sinopharm Chemical Reagent | XW1106168001 | |
| Insulin like Growth Factor(IGF) | PEPROTECH | 100-11 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10016308 | |
| Leibovitz's L-15 | Genom | GNM41300 | |
| L-glutamine (100 mg/mL) | Genom | GNM-21051 | |
| MgCl2 | Sinopharm Chemical Reagent | XW77863031 | |
| Na2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10020518 | |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10019308 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent | 10019718 | |
| PBS | Solarbio | P1020 | pH7.2-7.4 |
| Penicillin-Streptomycin | Genom | GNM15140 | |
| PH meter | Bante | A120 | |
| Taurine | SIGMA | T0625 | |
| VE | Seebio | 185791 |
References
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