Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

ואפופטוזיס השראה ואיתור בתרבות העיקרית של מלפפונים בתאי מעיים ים

Published: January 21, 2020 doi: 10.3791/60557

Summary

פרוטוקול זה מספק שיטה קלה לאחיזה לתרבות תאי המעיים ממלפפון המים האפוסטיקוס והיא מתאימה למגוון של דגימות רקמה בהיקף נרחב מאורגניזמים ימיים, כולל קווקדרפה, מולסקה וסרטנים.

Abstract

תאים מתורבתים ראשוניים משמשים במגוון דיסציפלינות מדעיות ככלים חשובים במיוחד להערכה פונקציונלית של חומרים ביולוגיים או אפיון של פעילויות ביולוגיות ספציפיות. עם זאת, בשל היעדר התקשורת האוניברסלית הישימה של תרבות התא ופרוטוקולים, תיאר היטב שיטות התרבות תאים עבור אורגניזמים ימיים עדיין מוגבלים. בינתיים, הזיהום הנפוץ ביותר של חיידקים ותכונות פוליטרופי של התאים החסרי חוליות ימיים עוד לעכב את הקמת האסטרטגיה האפקטיבית תרבות התא עבור חסרי חוליות ימיים. כאן, אנו מתארים שיטה קלה לטפל לתאי מעיים culturing מלפפון ים האפוסטיקוס; בנוסף, אנו מספקים דוגמה האינדוקציה ואפופטוזיס מבחנה ואיתור בתאי המעי העיקריים תרבותי. כמו-כן, ניסוי זה מספק פרטים אודות השיטה המתאימה ביותר לאוסף התרבות ולאיסוף התאים. הפרוטוקול המתואר מתאים למגוון של דגימות רקמה בהיקף נרחב מאורגניזמים ימיים, כולל קווקדרפה, מוללוסקה וסרטנים, והוא יכול לספק תאים מספיקים עבור מספר יישומים ניסיוניים בעלי מבחנה. טכניקה זו תאפשר לחוקרים לטפל ביעילות בתרבויות התאים הראשוניים מחסרי חוליות ימיים ולהקל על הערכה פונקציונלית של חומרים ביולוגיים ייעודיים על תאים.

Introduction

התאים המוגמרים בתנאים מלאכותיים, ולא בסביבתם הטבעית, מספקים חומרים ניסיוניים אחידים למחקרים ביולוגיים, במיוחד למינים שאינם יכולים להיות מתורבתים בקלות בסביבת מעבדה. בחשבון של יותר מ -30% מכלל המינים בעלי החיים הימיים,והם מספקיםחומרים ביולוגיים רבים למחקר התחייבות על מנגנוני הרגולציה של תהליכים ביולוגיים ספציפיים, כגון התחדשות2,3, לחץ התגובה4, והסתגלות סביבתית5,6.

מלפפון-ים האפוסטיקוס, הוא אחד מזני הקווצי הנלמדים ביותר הנמצאים במים ממוזגים לאורך החוף הצפוני של האוקיאנוס השקט. הוא ידוע גם כמינים חשובים מבחינה מסחרית ולחקלאות בקנה מידה גדול במזרח אסיה, בעיקר בסין7. שאלות מדעיות רבות לגבי היפנים, כולל מנגנוני הרגולציה שבבסיס התחדשות המעיים לאחר הוצאת המעיים8 וניוון בשנת9, בקרה מטבולית10,11, התגובה החיסונית12,13 תחת תרמי או פתוגניים מדגיש, משכו את תשומת לבם של חוקרים. עם זאת, בהשוואה לבעלי חיים מדגם היטב, מחקר בסיסי, בעיקר במישור הסלולר, מוגבל על-ידי צווארי בקבוק טכניים, כגון חוסר שיטות מתקדמות בתרבות התא.

החוקרים הקדישו מאמץ רב להקמת קווי תאים, אבל הם גם התמודד עם אתגרים רבים ולא קו התאים של כל חסרי חוליות ימיים הוקמה עדיין14. עם זאת, תרבויות התאים הראשוניים של חסרי חוליות ימיים מתקדמים בעשורים האחרונים15,16, והם סיפקו הזדמנות לניסויים ברמה התאית. לדוגמה, האינטסינוס הניתן ליצירה מתוך מקור הפקוניקוס נוצל כמקור תאים לתרביות תאים לטווח ארוך שסיפקו שיטה מעשית לתרבות התא הראשונית של חסרי חוליות ימיים17. פרוטוקול זה משולב ואופטימיזציה חסרי חוליות התרבות התאים מתקרב ופיתח שיטת התרבות הראשית מתאים באופן נרחב עבור מלפפון ים או חסרי חוליות ימיים אחרים.

אפופטוזיס היא תוכנית התאבדות התא הפנימי המופעל על ידי שונים הגירויים אנסוגני ואנדוגניים. אפופטוזיס מתואמת הוא חיוני למערכות ביולוגיות רבות18,19, וזה היה מעורב רגרסיה המעי של מלפפון ים במהלך הזמן הנכון9. כדי לחקור את תהליך האפוטוטיק באורגניזמים של עניין, סדרה של שיטות, כולל כתמים הוקוסט ומיקרוסקופיה, הוקמו והוחלו בהצלחה20. כאן, אנו מתנהל ואפופטוזיס השראה ואיתור בתאי המעי העיקרי תרבותי של מלפפון ים כדי להעריך את השימושיות של תאים ראשוניים במחקרים ביולוגיים של חסרי חוליות ימיים. Dexamethasone, אחד הנפוצים בשימוש גלוקוקורטיקוסטרואידים21, שימש כדי לגרום אפופטוזיס בתאי מעיים מתורבת מלפפון ים, ואות הופסט משמעותי 33258 התגלתה בהצלחה בתאי הכתמים על ידי מיקרוסקופ פלורסנט.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנה לתרבות התא בינונית

  1. הכנת נוזלים קומטומית
    1. אוסף הנוזלים קואוממית: בתנאים סטריליים, בנתח מלפפון ים בריא (משקל רטוב של 85-105 גרם), לאסוף נוזל קולאומית, ולאחסן אותו בבקבוקון זכוכית סטרילית.
    2. הסרת תא קואוממית: צנטריפוגה את הנוזל קולאומית ב 50 mL צנטריפוגה צינורות ב 1,700 x g עבור 5 דקות ולהעביר את supernatant לתוך הבקבוקון זכוכית סטרילית חדשה; בשלב הבא, לאסוף את נוזל קולאומית ללא תא של מלפפון הים.
    3. הפעלת רכיבים משלימים: דגירה הבקבוקון זכוכית סטרילי, המכיל את הנוזל מלפפון קואומית ים, ב 40-50 ° c באמבט מים עבור 20 – 40 דקות כדי להשיג רכיבים משלימים-נוזל קולאומית מופעל.
    4. הסרת חיידק: הסרת חיידקים וכלמידיה על ידי סינון דרך מסנני קרום 0.22 יקרומטר. הבא, להסיר mycoplasma וחלקיקים עדינים אחרים על ידי סינון באמצעות 0.1 יקרומטר מסננים קרום להשיג פתרון מראש נוזל הטיפול הקדם.
    5. כוונון מליחות: להתאים את המליחות של הפתרון הטיפול מראש הנוזל קולוממית ל 30‰ (נמדד על ידי salinometer) על ידי הוספת 20% ריכוז גבוה טרום מעוקר ומסונן פתרון (מדולל על ידי נוזל קולאומית מראש) או DDW (מים מזוקקים כפול). העבר את נוזל מלפפון קואוממית ים לתוך בקבוק סטרילי, לאטום את הבקבוק, ולאחסן את הנוזל ב 4 ° c עבור ניסויים נוספים.
  2. ליבוביץ ' של L-15 תרבות התא אופטימיזציה בינונית
    1. שוקלים 5.05 g של הנרוג, 0.135 g של KCl, 0.15 g של CaCl2, 0.25 g של Na2SO4, 0.975 g של mgcl2, 0.25 g של גלוקוז, ו 6.25 mg של טאורין ולדלל אותם ב 40 מ ל של ליבוביץ ' s-15 בינוני של לייבוביץ ' מדיום צנטריפוגה סטרילית. מתפרעים את הצינור על שייקר עבור 1 h כדי להבטיח את המלחים יש מומס לחלוטין.
    2. הוסף 2.5 mL של l-גלוטמין (100 mg/ml) ו 500 μl של פתרון VE (1.75 mg/L) לתוך הבינוני l-15 מוכן ליבוביץ ' s-בינוני ועוד לסנן את המדיום דרך מסנני ממברנה יקרומטר ב0.22.
    3. כוונן את הנפח הבינוני הכולל ל-500 mL עם מדיום לייבוביץ ' L-15 טרי עם 100 מ ל של נוזל קולאומית שהוכן בעבר; הבא, להתאים את ה-pH כדי 7.6 באמצעות NaOH פתרון. שמור את תהליך הפעולה בסביבה סטרילית. יחס הרכבה של נוזל קולוממית יכול להיות 10% – 50%, ו -20% מספיקה לתרבות של תאי מעיים .

2. הכנה לתאי המעיים

  1. עיבוד המעי מלפפון ים
    1. מלפפונים הרדים ים בריאים בקופסת קרח. לנתח ולאסוף את המעיים הקדמי, ואז לחלק את דגימות הרקמה אנכית ולהסיר את התוכן הפנימי.
    2. רוחצים את דגימות הרקמה בתמיסת מלח מלוחים (PBS) פעמיים ולחטא אותם על ידי הטבילה בפתרון אתנול מימית (75% על ידי נפח) עבור לא יותר מ 2 s.
    3. לשטוף את דגימות רקמות ב-PBS שלוש פעמים כדי להסיר אתנול ולהעביר על 100 מ"ג של דגימת רקמות לתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה סטרילית של 2.0 mL.
  2. אוסף תאים
    1. הוסף 1.5 mL של בינונית התרבות טרום אופטימיזציה לחסום את מלפפון הים רקמת מעיים לחסום את הבלוק עם מספריים כירורגי מעוקר עד הפתרון מעונן.
      הערה: עבור פרוטוקול מפושטת, הוסף 0.5 mL של בינוני התרבות ממוטבת מראש לחסום מלפפון מעיים של הים וחותכים את הבלוק עם מספריים כירורגיים מעוקר לתוך 1 מ"מ3. העבירו במישרין את הדגימות למנות תרבות ואחריו שלבי הדגירה הבאים.
    2. הוסף 400 μl של טריפסין (0.25%), ערבב את הפתרון על-ידי היפוך, ומארג אותו למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר; לאחר מכן, סנן את הפתרון באמצעות מסננת תאים מבית 100 יקרומטר.
      הערה: היא אופציונלית להוסיף טריפסין לפיזור תאים בעת טיפול בדגימות רקמה שונות. את חומצת החומץ (EDTA) יש לכלול ב טריפסין פתרון כדי לצמצם את פעילות המעעכבות מ-Ca2 + ו-Mg2 + במדיום התרבותי.
    3. לאסוף את פילטרט חדש סטרילי 2.0 mL שפופרת מיקרוצנטריפוגה, צנטריפוגה ב 1,700 x g עבור 3 דקות, להיפטר supernatant, לאחר מכן להשעות את הגלולה במדיום התרבות (שיושלם עם אנטיביוטיקה) ולשטוף אותו פעמיים.
      הערה: הכינו בינונית חדשה ממוטבת לתרבות מראש שיושלם עם 2% פניצילין-סטרפטומיצין פתרון (10,000 U/mL פניצילין 10 מ"ג/mL סטרפטומיצין) ו 1% gentamicin (4 מ"ג/mL) לפני תחילת הניסוי.

3. תרבית תאים

  1. הגדרת החממה: יש לקבוע מראש את החממה לתרבות התא ולהריץ אותה מראש לפחות 24 שעות בטמפרטורה של 18 ° c ולחות רוויה.
    הערה: הזנה CO2 לתוך החממה בהתאם למאפיינים המדיום של תרבות התא; אין שיתוף2 צריך להיות מסופק בעת שימוש במדיום הבסיסי של ליבוביץ ' של L-15.
  2. תרבות תא הבמה הראשונה
    1. כדי לעכב את התפתחותם של חיידקים ולקדם את התפשטות במהלך השלב הראשוני של תרבות התא, להוסיף 10 מ ל של הפתרון פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 U/mL פניצילין 10 מ"ג/mL סטרפטומיצין) ו 0.5 mL של gentamicin (40 mg/mL) לתוך כל 500 mL של מיטוב התרבות מראש. יתר על כן, תוספת כל 500 mL בינוני בתרבות עם 0.6 מ ל של אינסולין (10 מ"ג/mL), 100 μL של מקדם הצמיחה אינסולין כמו (0.1 μg/μL), ו -25 μL של הצמיחה פיברוהפיצוץ פקטור (0.1 μg/μL).
    2. לאסוף את התאים לתוך צינורות 1.5 mL, להשעות אותם באמצעות 200 μL של בינוני מצוין, ו ללטף אותם לתוך φ 4 ס מ מנות.
    3. תרבות התאים בחממה ולהוסיף 2.0 mL של מדיום המצוין כדי מנות התא culturing לאחר 6 h. לשנות את חצי המדיום כל 12 h עד להגיע לשלב הבא.
      הערה: טפל בשינוי הבינוני בעדינות, מכיוון שהתאים אינם מחוברים לכלים הדוקים. ניתן להשתמש במנות פולי-D-ליזין מצופות לחיבור באופן רופף לתאי הכלים.
  3. תרבות תא הבמה השנייה
    1. כדי להפחית את ההשפעות השליליות של אנטיביוטיקה לתאים התרבותיים, להפחית את הריכוז של אנטיביוטיקה המצוין (פניצילין, סטרפטומיצין, ו gentamicin) ב התרבות בינונית על ידי חצי.
      הערה: השימוש באינסולין ובגורמי גדילה תלוי בתנאי תרבות התא והוא אופציונלי.
    2. החלף את המדיום של תרבות התא; לנהל שינויים בינוניים כל שנתיים עד שלושה ימים בהתאם לצפיפות התא.
      הערה: שימו לב לתאים המתורבית מדי יום מתחת למיקרוסקופ והקליטו את תנאי הגדילה.
  4. הפסיית תא
    הערה: המעבר ותת-תרבות התאים, כאשר צפיפות התא הראשית מגיעה ל-60%.
    1. שטוף את התאים המתורבתיים פעמיים באמצעות ה-PBS בטמפרטורת החדר. הוסף 200 μL של טריפסין תמיסה (0.25%) לכל מנה ומתפרעים באופן ידני את המנה המבטיחה שכל התחתון מכוסה. להשליך את התמיסה טריפסין ואת התאים הדגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    2. שטוף את התאים עם 1.0 mL של מדיום התרבות הטרייה על ידי ליטוף והשעיית התאים מחדש. העברת 0.5 mL של השעיית התא למנה חדשה, להוסיף 1.5 mL של בינוני טרי, ו מודחת התאים ב 18 ° c.
      הערה: ניתן להשתמש בתאי מגרדים לאיסוף תאים כאשר פתרון טריפסין נכשל בעיכול וניתוק תאים מהמנות (קווי תא מסוימים הם דביקים מדי). עם זאת, אל תערוך את שתי השיטות בו.
    3. לשנות את המדיום לאחר 12 h ולהתבונן בתאים תחת מיקרוסקופ כדי להעריך את התנאים. תרבות התאים עבור ניסיוני נוסף.

4. ואפופטוזיס השראה וזיהוי בתאי מעיים של הפקוניקוס

  1. תרבית תאים וטיפול דקאמת1
    1. הכן תאי מעיים בעקבות הפרוטוקול שהוצג קודם לכן והוסף את התאים המדרוכים לצלחת של 12-היטב בנפח תא של 2 x 106 לכל טוב.
    2. לאחר שלושה ימים בתרבות, בעקבות השלבים של "תרבות תא הבמה הראשונה", לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS ולהחליף את המדיום עם בינונית אופטימיזציה (ללא אנטיביוטיקה וגורמי צמיחה).
    3. לדלל dexamethone (DXMS) בתווך התרבות כדי להכין טרי 2 μM ו-200 μM הפתרונות DXMS לפני תחילת הניסויים.
    4. הוסף פתרונות DXMS בריכוזים שונים לתאים מתורבתים גדל עם אותו נפח של בינונית culturing; הגדיר שלוש קבוצות נסיוניות כולל בקרה (CTL), 1 μM ו-100 μM DXMS.
  2. צביעת הופסט
    1. שטוף את התאים עם PBS שלוש פעמים לאחר הדגירה עם/ללא DXMS עבור תקופות הזמן המצוין (0 h, 24 h, ו 48 h).
    2. הוסף 300 μL של Hoechst 33258 פתרון לכל טוב לצלחת 12-באר ו דגירה ב 18 ° c עבור 30 דקות. בעדינות מתפרעים את הצלחת לכסות את כל התאים להבטיח את ההכתמים שלהם.
    3. הסר את הפתרון כתמים ולתקן את התאים על ידי הוספת 300 μL של 4% הפתרון פאראפורמלדהיד (ב PBS) לכל טוב. . מתפרעים בעדינות במשך 15 דקות
      זהירות: פאראפורמלדהיד הוא רעיל בינוני על ידי מגע העור או אינהלציה, והוא מיועד כנראה מסרטן אנושי סביר. מנדפים כימיים, מארזים במאזן פרקו, או אמצעי הגנה אחרים יש להשתמש במהלך שקילה וטיפול של פאראפורמלדהיד.
    4. שטוף את התאים הקבועים שלוש פעמים ב-PBS. אל תמחק את ה-PBS לאחר כביסה כדי לשמור על תאים מכוסים.
  3. אנליזה מיקרוסקופית פלורסנט
    1. הפעל את חומרת מיקרוסקופ הפלורסנט כולל כוח המנורה הכספית, כוח הפלורסנט, והמחשב. היכנס לחשבון מערכת ההפעלה, הפעל את התוכנה ובדוק את תצורתה.
    2. הניחו את הצלחת המוכנה על מיקרוסקופ הבמה. הצב את המדגם מעל העדשה האובייקטיבית באמצעות בקר הבמה.
    3. מצא את תאי העניין מתחת למיקרוסקופ האור, עבור למיקרוסקופ פלורסנט, ולכוד את התמונות על-ידי כוונון הפרמטרים.
      הערה: כדי להתבונן באות פלורסנט 33258 מאוגד ל-DNA גרעינים, מיקרוסקופ ניאון צריך להתבצע עם עירור ופליטה ב כ 352 ננומטר ו 461 nm, בהתאמה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כאן, הקמנו את התרבות הראשית של תאי המעי . איור 1 מראה תאים עגולים בשלבים שונים של culturing. ו-EdU מכתים לספק ראיות ישירות כדי לחשוף את הפעילות ההתרבות של התאים העגולים האלה בשלב מאוחר יותר (איור 2). אנחנו גם קצת להתאים את הפרוטוקול, culturing בלוקים הרקמה הקצוצה במקום תאים filtrated; יתרה מזאת, סוג תא ציר עשוי להיות מתורבת בהצלחה. סוג תא זה התרחש סביב בלוקים רקמת המעיים יכול להיות נצפתה לאחר ארבעה ימים של תרבות; עם זאת, הוא לא הצליח להיות מיושן (איור 3).

ניתן להשתמש בתאים מתורבתים ליישומים ניסיוניים שונים. התייחסו לתאים עם DXMS עבור תקופות זמן שונות, ואחריו Hoechst 33258 כתמים לזיהוי תא האפוטוטית. איור 4 מציין את אות האפוטוטיק המושרה שזוהה מתאי מעיים של מלפפון ים על ידי הואכסט 33258 ומיקרוסקופ פלורסנט. איור 5 מדגים את שיעורי התאים האפוטוטיים לפרקי זמן מסומנים בגירוי באמצעות dxms.

Figure 1
איור 1: מיקרוסקופ של מלפפונים בעלי מעיים ים עגולים בשלבים שונים. (א) תאים המחוברים לתחתית הכלים ביום השלישי לאחר הזריעה. (ב) הפצת תאים ביום השביעי. (ג) תאים המחוברים לתחתית הכלים לאחר הפסיית. (ד) תאים שאיבדו פעילות ומתים לאחר עשרה מעברים. "ס"מ "מציין מסת תא, המתרחשת במהלך הפצת תאים. "BT" מציין את המסלול השחור, אשר הושאר על ידי תאים מתים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: הפצת תאים שאותרו על-ידי EdU כתמים מספר. הפצת התאים בוצעה באמצעות הערכה (טבלת חומרים) לפי פרוטוקול היצרן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: מיקרוסקופיה של בלוקי רקמת מעיים ימיים והפצת תאים. (א) רקמת בלוקים (TB) המצורפת לתחתית התבשיל ביום הראשון לאחר התרבות. (ב) בלוקי רקמה ותאים המחוברים לתחתית הקערה ביום השני לאחר התרבות. (ג) בלוקי רקמה ומעניינת התרחשו בתאי ציר (SC) ביום הרביעי לאחר התרבות. (ד) מתרבים כדוריות הציר ביום השביעי לאחר התרבות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: מיקרוסקופ פלורסנט של תאים עגולים המעי עם אפופטוזיס המושרה. המילה "NC" מצביעה על. אות פלורסנט של עיבוי גרעיני אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: ניתוח סטטיסטי לתאי מעיים בעלי המעי החיובי. התפלגות אחוזי הפיזור הגרעיני של האות הפלורסצנט-תאים חיוביים בקרב הופסט מוכתם בתאי מעיים ביחד עם המינון או קורס הזמן של הניסוי (n = 3). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מאמצי מחקר נרחבים הקדישו להקמת קווי תאים בעשורים האחרונים, עם זאת, עדיין קשה לבצע התקדמות בתרבות ארוכת טווח של תאים מחסרי חוליות ימיים14,22. דווח כי תאים מתורבתים מליצור מתחדשות רקמות הולותאנית היו קיימא לתקופה ארוכה של זמן ופעילות גבוהה של התפשטות ניתן לזהות תאים ספציפיים17,23. עם זאת, עבור תאים רגילים חסרי חוליות ימיים, יש עדיין לא מעשית גישה לתרבות התא תוארה. הפרוטוקול המוצג כאן מספק שיטה יעילה ובעלת שולחן מתרגם עבור culturing והפסנת תאי מעיים מהזן החסרי חוליות ימיים A. יפנית. השיטה יכולה להיות מותאמת בקלות עבור תרבות התא העיקרי של אורגניזמים ימיים שונים רבים חסרי חוליות כגון דיונון וסרטן.

סדרה של גורמים מרכזיים משפיעים על היישום המוצלח של הליך זה. מניעת זיהום חיידקים היא בעלת חשיבות רבה ביותר במהלך התהליך כולו, ובעיקר במהלך השבוע הראשון של התרבות. בעלי חיים ימיים בדרך כלל ליצור קשר עם חיידקים רבים מהסביבה, אשר ליישב את הרקמות שלהם, כגון זימים, המעי, סנפיר, ועור. לכן, זה יהיה בלתי אפשרי לעקר את דגימות הרקמה לפני החניכה של תרבות התא. כדי למזער את הסיכון של זיהום חיידקים במהלך התרבות התאית, 75% האתנול טבילה לדגימת רקמת עיקור הוא חיוני; עם זאת, זמן הטיפול צריך להיות ממוטב עבור סוגי רקמות שונים. יתר על כן, היישום של ריכוזי אנטיביוטיקה גבוהה במהלך השלבים המוקדמים של תרבות התא גם ממלא תפקיד חשוב בעיכוב של גידול חיידקים. יתר על כן, ניסוח בינוני הוא גורם מרכזי הקובע את התפשטות ותוחלת החיים של תאים מתורבתים. מאז הדרישות התזונתיות של תאי חסרי חוליות ימיים עדיין לא ידוע, המדיום הנוכחי בתרבות התא בשימוש תוכנן בעיקר עבור בעלי חוליות או תא חרקים שורות14. כדי לספק חומרים תזונתיים מספיקים, נוזל קולאומית מטופל מפני מלפפונים מהים יכול לשמש בדומה ל-FBS בתרבות התא של היונקים. בינתיים, כדי להקל על תפוצת התאים, ניתן ליישם גם מספר גורמי גדילה במדיום התרבותי. מאז הטמפרטורה הדגירה היא גורם להשפיע על ההצלחה של התרבות הימית חסרי חוליות התאים, בתאי דגירה תחת טמפרטורת הצמיחה האופטימלית של האורגניזם היעד צריך להיחשב. לדוגמה, ניתן להגדיר את הטמפרטורה עבור תרבות התא של הפקוניקוס ב- 18 ° c, המתאימה לצמיחתה24.

טיפול מקדים ברקמות עלול להשפיע על סוגי תאים בהצלחה תרבותי ומתרבים. מאוד שונה תאי מעיים , עגול או ציר, ניתן להשיג מתוך זריעת תאים filtrated או בלוקים רקמות תחת הליך בדיוק באותה התרבות (נתונים השוואתי מתוך איור 1 ואיור 3). לפיכך, אופטימיזציה של שיטת הטיפול ברקמה המוקדמת לסוג התרבות הסלולרית צריכה להתבצע גם בהתחלה; את ההליך האופטימלי יש להחליט בהתאם לתכנון הניסיוני הביולוגי.

כאן, התחלנו את הטיפול DXMS בתאי מעיים לאחר שלושה ימים בתרבות, ואנו ביצעו הופסט כתמים עבור זיהוי אותות האות. גילוי מוצלח של תאים חיוביים הופסט, אחרי 48 h גירוי על ידי 1 μM DXMS, סיפק דוגמה מעשית לניסוי ביולוגי המבוסס על תאים מתורבתים.

הפרוטוקול המתואר הוא קל לטפל והוא יכול לשמש להקמת תרבות תא חסרי חוליות ימיים. התאים המתורבתות צריכים לספק חומר ביולוגי עם רקע גנטי עקבי ליישומים שונים של ניסויים ביולוגיים. יתר על כן, פרוצדורות פרוטוקול מותאמות מעט יכול לשנות את סוגי התאים מתרבים בהצלחה במהלך התרבות ולספק חומרים סלולריים שונים עבור ניסויים ביולוגיים. כך, האופטימיזציה של צעדים מסוימים בפרוטוקול יהיה צורך, בהתאם למין בעלי החיים ממוקד ואת סוגי התא הספציפיים הדרושים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

המחברים רוצים להודות לפרופ ' נאנג'לי ז'או מאוניברסיטת ג'ה-ג'יאנג לעצתו הטכנית ולהכנת ציוד המעבדה שלו הזמין לשימוש. עבודה זו הייתה נתמכת כספית על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (הענקת מספרים 41876154, 41606150, ו 41406137) ואת קרנות המחקר הבסיסי עבור אוניברסיטאות מחוזי ג'ה-ג'יאנג ומכוני מחקר [גרנט מספר 2019JZ00007 ].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1 μm filter Millipore SLVV033RS
0.22 μm filter Millipore SLGP033RB
0.25% Trypsin Genom GNM25200
100 μm filter Falcon 352360
4 cm dishes ExCell Bio CS016-0124
4% paraformaldehyde solution Sinopharm Chemical Reagent 80096618 in PBS
Benchtop Centrifuges Beckman Allegra X-30R
BeyoClick EdU-488 kit Beyotime C0071S
CaCl2 Sinopharm Chemical Reagent 10005817
Constant temperature incubator Lucky Riptile HN-3
Dexamethasone Sinopharm Chemical Reagent XW00500221
Electric thermostatic water bath senxin17 DK-S28
Ethanol Sinopharm Chemical Reagent 80176961 75%
Fibroblast Growth Factor(FGF) PEPROTECH 100-18B
Fluorescent microscope Leica DMI3000B DMI3000B
Garamycin Sinopharm Chemical Reagent XW14054101
Glucose Sinopharm Chemical Reagent 63005518
Hoechst33258 Staining solution Beyotime C1017
Insulin Sinopharm Chemical Reagent XW1106168001
Insulin like Growth Factor(IGF) PEPROTECH 100-11
KCl Sinopharm Chemical Reagent 10016308
Leibovitz's L-15 Genom GNM41300
L-glutamine (100 mg/mL) Genom GNM-21051
MgCl2 Sinopharm Chemical Reagent XW77863031
Na2SO4 Sinopharm Chemical Reagent 10020518
NaCl Sinopharm Chemical Reagent 10019308
NaOH Sinopharm Chemical Reagent 10019718
PBS Solarbio P1020 pH7.2-7.4
Penicillin-Streptomycin Genom GNM15140
PH meter Bante A120
Taurine SIGMA T0625
VE Seebio 185791

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Naganuma, T., Degnan, B. M., Horikoshi, K., Morse, D. E. Myogenesis in primary cell cultures from larvae of the abalone, Haliotis rufescens. Molecular Marine Biology and Biotechnology. 3 (3), 131-140 (1994).
  2. Reinardy, H. C., Emerson, C. E., Manley, J. M., Bodnar, A. G. Tissue regeneration and biomineralization in sea urchins: role of Notch signaling and presence of stem cell markers. Plos One. 10 (8), 0133860 (2015).
  3. Schaffer, A. A., Bazarsky, M., Levy, K., Chalifa-Caspi, V., Gat, U. A transcriptional time-course analysis of oral vs. aboral whole-body regeneration in the Sea anemone Nematostella vectensis. Bmc Genomics. 17, 718 (2016).
  4. Chiaramonte, M., Inguglia, L., Vazzana, M., Deidun, A., Arizza, V. Stress and immune response to bacterial LPS in the sea urchin Paracentrous lividus (Lamarck, 1816). Fish and Shellfish Immunology. 92, 384-394 (2019).
  5. Meng, J., Wang, T., Li, L., Zhang, G. Inducible variation in anaerobic energy metabolism reflects hypoxia tolerance across the intertidal and subtidal distribution of the Pacific oyster (Crassostrea gigas). Marine Environmental Research. 138, 135-143 (2018).
  6. Han, G., Zhang, S., Dong, Y. Anaerobic metabolism and thermal tolerance: The importance of opine pathways on survival of a gastropod after cardiac dysfunction. Integrative Zoology. 12 (5), 361-370 (2017).
  7. Zhang, X., et al. The sea cucumber genome provides insights into morphological evolution and visceral regeneration. PLoS Biology. 15 (10), 2003790 (2017).
  8. Sun, L., et al. iTRAQ reveals proteomic changes during intestine regeneration in the sea cucumber Apostichopus japonicus. Comparative Biochemistry and Physiology Part D: Genomics and Proteomics. 22, 39-49 (2017).
  9. Xu, K., et al. Cell loss by apoptosis is involved in the intestinal degeneration that occurs during aestivation in the sea cucumber Apostichopus japonicus. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 216, 25-31 (2018).
  10. Yang, H. S., et al. Metabolic characteristics of sea cucumber Apostichopus japonicus (Selenka) during aestivation. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 330 (2), 505-510 (2006).
  11. Xiang, X. W., et al. Glycolytic regulation in aestivation of the sea cucumber Apostichopus japonicus: evidence from metabolite quantification and rate-limiting enzyme analyses. Marine biology. 163 (8), 1-12 (2016).
  12. Jiang, L., et al. A feedback loop involving FREP and NF-kappaB regulates the immune response of sea cucumber Apostichopus japonicus. International Journal of Biological Macromolecules. 135, 113-118 (2019).
  13. Zhou, X., Chang, Y., Zhan, Y., Wang, X., Lin, K. Integrative mRNA-miRNA interaction analysis associate with immune response of sea cucumber Apostichopus japonicus based on transcriptome database. Fish and Shellfish Immunology. 72, 69-76 (2018).
  14. Cai, X., Zhang, Y. Marine invertebrate cell culture: a decade of development. Journal of Oceanography. 70 (5), 405-414 (2014).
  15. Maselli, V., Xu, F., Syed, N. I., Polese, G., Di Cosmo, A. A Novel Approach to Primary Cell Culture for Octopus vulgaris Neurons. Frontiers in Physiology. 9, 220 (2018).
  16. Pinsino, A., Alijagic, A. Sea urchin Paracentrotus lividus immune cells in culture: formulation of the appropriate harvesting and culture media and maintenance conditions. Biology Open. 8 (3), (2019).
  17. Odintsova, N. A., Dolmatov, I. Y., Mashanov, V. S. Regenerating holothurian tissues as a source of cells for long-term cell cultures. Marine Biology. 146 (5), 915-921 (2005).
  18. Rastogi, R. P., Richa, R. P., Sinha, R. P. Apoptosis: Molecular Mechanisms and Pathogenicity. Excli Journal. 8, 155-181 (2009).
  19. Wan, L., et al. Apoptosis, proliferation, and morphology during vein graft remodeling in rabbits. Genetics and Molecular Research. 15 (4), (2016).
  20. Kasibhatla, S., et al. Staining of suspension cells with hoechst 33258 to detect apoptosis. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (3), (2006).
  21. Mikiewicz, M., Otrocka-Domagala, I., Pazdzior-Czapula, K., Rotkiewicz, T. Influence of long-term, high-dose dexamethasone administration on proliferation and apoptosis in porcine hepatocytes. Research in Veterinary Science. 112, 141-148 (2017).
  22. Rinkevich, B. Cell cultures from marine invertebrates: new insights for capturing endless stemness. Marine Biotechnology. 13 (3), 345-354 (2011).
  23. Bello, S. A., Abreu-Irizarry, R. J., Garcia-Arraras, J. E. Primary cell cultures of regenerating holothurian tissues. Methods in Molecular Biology. 1189, 283-297 (2015).
  24. Yu, H., et al. Impact of water temperature on the growth and fatty acid profiles of juvenile sea cucumber Apostichopus japonicus (Selenka). Journal of Thermal Biology. 60, 155-161 (2016).

Tags

ביולוגיה סוגיה 155 מלפפון ים תרבות ראשית מדיום תרבות התא תאי מעיים אפופטוזיס ים חסרי חוליות ימית תרבות
ואפופטוזיס השראה ואיתור בתרבות העיקרית של מלפפונים בתאי מעיים ים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, T., Chen, X., Xu, K., Zhang,More

Wang, T., Chen, X., Xu, K., Zhang, B., Huang, D., Yang, J. Apoptosis Induction and Detection in a Primary Culture of Sea Cucumber Intestinal Cells. J. Vis. Exp. (155), e60557, doi:10.3791/60557 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter