Summary
Bu protokol deniz hıyarı Apostichopus japonicus bağırsak hücreleri kültür için kolay bir yöntem sağlar ve Echinodermata, Mollusca ve Crustacea gibi deniz organizmalarından yaygın olarak kullanılabilir doku örnekleri çeşitli ile uyumludur.
Abstract
Birincil kültür hücreleri biyolojik maddelerin fonksiyonel değerlendirilmesi veya belirli biyolojik faaliyetlerin karakterizasyonu için son derece önemli araçlar olarak bilimsel disiplinlerde çeşitli kullanılır. Ancak, evrensel olarak uygulanabilir hücre kültürü medya ve protokollerin eksikliği nedeniyle, deniz canlıları için iyi tanımlanmış hücre kültürü yöntemleri hala sınırlıdır. Bu arada, deniz omurgasız hücrelerinin yaygın olarak meydana gelen mikrobiyal kontaminasyon ve politropik özellikleri deniz omurgasızlar için etkili bir hücre kültürü stratejisinin kurulmasını engeller. Burada, deniz hıyarı Apostichopus japonicusbağırsak hücrelerini culturing için kolay bir yöntem işlemek için açıklar; ayrıca, birincil kültürbağırsak hücrelerinde in vitro apoptosis indüksiyon ve saptama bir örnek sağlar. Ayrıca, bu deneme uygun kültür orta ve hücre toplama yöntemi hakkında ayrıntılı bilgi sağlar. Açıklanan protokol, Echinodermata, Mollusca ve Crustacea gibi deniz organizmalarından alınan çeşitli yaygın doku örnekleri ile uyumludur ve birden fazla in vitro deneysel uygulama için yeterli hücre sağlayabilir. Bu teknik, araştırmacıların deniz omurgasızlarından birincil hücre kültürlerini verimli bir şekilde manipüle etmelerini ve hücreler üzerindeki hedeflenen biyolojik maddelerin işlevsel değerlendirmesini kolaylaştırmasını sağlayacaktır.
Introduction
Hücreleri doğal ortamlarında değil, yapay olarak kontrol edilen koşullarda, biyolojik çalışmalar için, özellikle de laboratuvar ortamında kolayca kültürlendirileemeyen türler için tek tip deneysel malzemeler sağlar. Deniz omurgasızlar tüm hayvan türlerinin % 30'undan fazlasını oluştururlar1, ve rejenerasyon2,3,stres tepkisi4ve çevresel adaptasyon5,6gibi belirli biyolojik süreçlerin düzenleyici mekanizmaları üzerinde araştırma üstlenmek için çok sayıda biyolojik malzeme sağlarlar.
Deniz hıyarı, Apostichopus japonicus, Kuzey Pasifik kıyıları boyunca ılıman sularda yaşayan en çok çalışılan echinoderm türlerinden biridir. Bu iyi ticari olarak önemli bir tür olarak bilinir ve Doğu Asya'da büyük bir ölçekte maricultured, ÖzellikleÇin'de 7. A. japonicusile ilgili çok sayıda bilimsel soru , evisceration sonra bağırsak rejenerasyon u yatan düzenleyici mekanizmalar dahil8 ve aestivationdejenerasyon 9, metabolik kontrol10,11, ve bağışıklık yanıtı12,13 termal veya patojenik stresaltında, araştırmacıların dikkatini çekmiştir. Ancak, iyi çalışılmış model hayvanlarile karşılaştırıldığında, temel araştırma, özellikle hücresel düzeyde, teknik darboğazları ile sınırlıdır, gelişmiş hücre kültürü yöntemlerinin eksikliği gibi.
Araştırmacılar hücre hatları oluşturmak için çok çaba ayrılmış, ama onlar da birçok zorluklarla karşı karşıya kalmıştır ve herhangi bir deniz omurgasız hiçbir hücre hattı henüz kurulmuştur14. Ancak, deniz omurgasızların birincil hücre kültürleri son yıllarda gelişmiş15,16, ve hücresel düzeyde deney için bir fırsat sağlamıştır. Örneğin, A. japonicus'un rejeneratif intesini, deniz omurgasızlarının birincil hücre kültürü için pratik bir yöntem sağlayan uzun süreli hücre kültürleri için hücre kaynağı olarak kullanılmıştır17. Bu protokol omurgasız hücre kültürü yaklaşımlarını birleştirmiş ve optimize etmiş ve deniz hıyarı veya diğer deniz omurgasızları için çok uygun bir birincil kültür yöntemi geliştirmiştir.
Apoptosis çeşitli eksojen ve endojen uyaranlar tarafından tetiklenen bir içsel hücre intihar programıdır. Koordine apoptosis birçok biyolojik sistemler için çok önemlidir18,19, ve aestivation sırasında deniz hıyarı bağırsak regresyonu karıştığı olmuştur9. İlgi çeken organizmalarda apoptotik süreci araştırmak için, Hoechst boyama ve mikroskopi tahlilleri de dahil olmak üzere bir dizi yöntem kurulmuş ve başarıylauygulanmıştır 20. Burada deniz omurgasızlarının biyolojik çalışmalarında birincil hücrelerin kullanılabilirliğini değerlendirmek için deniz hıyarı primer kültürlü bağırsak hücrelerinde apoptosis indüksiyonu ve tespiti gerçekleştirdik. Deksametazon, yaygın olarak kullanılan sentetik glukokortikosteroidler21,deniz hıyar kültürlü bağırsak hücrelerinde apoptoz neden olarak kullanılan, ve önemli Hoechst 33258 sinyal floresan mikroskoposkopi ile lekeli hücrelerde başarıyla tespit edildi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Hücre Kültürü Orta Hazırlık
-
Coelomik sıvı hazırlama
- Coelomik sıvı toplama: Steril koşullar altında, sağlıklı bir deniz hıyarı (85-105 g ıslak ağırlık) incelemek, coelomik sıvı toplamak ve steril bir cam şişesinde saklayın.
- Koelomik hücre çıkarılması: 50 mL santrifüj tüpteki coelomik sıvıyı 5 dk için 1.700 x g'da santrifüj edin ve supernatant'ı yeni bir steril cam şişeye aktarın; sonra, deniz hıyarı hücresiz coelomik sıvı toplamak.
- Kompleman bileşenleri inaktivasyonu: Deniz hıyarı coelomik sıvıiçeren steril cam şişeyi, kompleman bileşenleri-inaktive coelomik sıvı elde etmek için 20-40 dk boyunca 40-50 °C su banyosunda kuluçkaya yatırın.
- Mikrop kaldırma: 0,22 μm membran filtreler ilerleyerek bakteri ve klamidya kaldırın. Daha sonra, koelomik sıvı ön işlem çözümü elde etmek için 0,1 μm membran filtreleri kullanarak filtrasyon ile mikoplazma ve diğer ince partikülleri çıkarın.
- Tuzluluk ayarı: Coelomic sıvı ön arıtma solüsyonunun tuzluluğunu sterilize edilmiş ve filtrelenmiş NaCl çözeltisi (önceden işlenmiş coelomik sıvı ile seyreltilmiş) veya DDW (çift distile su) ekleyerek %30'a (salinometre ile ölçülür) ayarlayın. Deniz hıyarı coelomik sıvıyı steril bir şişeye aktarın, şişeyi kapatın ve daha fazla deney için sıvıyı 4 °C'de saklayın.
-
Leibovitz's L-15 hücre kültürü orta optimizasyon
- Tartmak 5.05 G NaCl, 0.135 g KCl, 0.15 g CaCl2, 0.25 g Na2SO4, 0.975 g MgCl2, 0.25 g glikoz, ve 6.25 mg taurin ve seyreltmek 40 mL Leibovitz's L-15 orta 50 mL steril steril tüp. Tuzların tamamen eridiğinden emin olmak için tüpü 1 saat çalkalayın.
- Daha önce hazırlanmış Leibovitz'in L-15 ortamına 2,5 mL L-glutamin (100 mg/mL) ve 500 μL VE solüsyonu (1,75 mg/L) ekleyin ve orta yı 0,22 μm membran filtreleri ile daha fazla filtreleyin.
- Taze Leibovitz'in L-15 orta ve önceden hazırlanmış 100 mL coelomic sıvı ile 500 mL toplam orta hacmi ayarlayın; sonra, NaOH çözeltisi kullanarak pH'ı 7.6'ya ayarlayın. İşlem işlemini steril bir ortamda tutun. Coelomik sıvının bileşik oranı %10-%50, A. japonicus intestinal hücre kültürü için %20 yeterlidir.
2. Bağırsak Hücre Hazırlığı
-
Deniz hıyar bağırsak işleme
- Bir buz kutusunda sağlıklı deniz hıyarları anestezik. Kesip ön bağırsakları toplayın, sonra doku örneklerini dikey olarak kesip iç içeriğini çıkarın.
- Doku örneklerini fosfat tamponlu salin (PBS) ile iki kez yıkayın ve sulu bir etanol çözeltisi (hacim olarak %75) en fazla 2 s daldırma ile dezenfekte edin.
- Etanol çıkarmak ve 2.0 mL steril mikrosantrifüj tüpüiçine doku örneğinin yaklaşık 100 mg aktarmak için PBS doku örneklerini üç kez yıkayın.
-
Hücre koleksiyonu
- Deniz hıyar bağırsak dokusu bloğuna önceden optimize edilmiş kültür ortamının 1,5 mL'sini ekleyin ve çözelti bulutlu olana kadar steril cerrahi makasla bloğu doğrama.
NOT: İsteğe bağlı basitleştirilmiş protokol için, deniz hıyar bağırsak dokusu bloğuna önceden optimize edilmiş kültür ortamının 0,5 mL'sini ekleyin ve sterilize edilmiş cerrahi makas ile bloğu 1 mm3'ekesin. Örnekleri doğrudan kültür yemeklerine aktarın ve ardından kuluçka adımlarını takip edin. - 400 μL tripsin (%0,25) ekleyin, çözeltiyi ters çevrilerek karıştırın ve oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatırın; daha sonra çözeltiyi 100 μm hücreli süzgeç kullanarak filtreleyin.
NOT: Farklı doku örnekleri tedavi ederken hücre dağılımı için tripsin eklemek isteğe bağlıdır. Etilendimintetraasetik asit (EDTA), kültür ortamında Ca2+ ve Mg2+'dan gelen inhibitör aktiviteyi azaltmak için tripsin çözeltisinde bulunmalıdır. - Yeni bir steril 2.0 mL mikrosantrifüj tüp, santrifüj de 1.700 x g 3 dakika için filtrasyon toplamak, supernatant atmak, sonra kültür orta pelet resuspend (antibiyotik ile birlikte) ve iki kez yıkayın.
NOT: Deney başlamadan önce %2 penisilin-streptomisin çözeltisi (10.000 U/mL penisilin ve 10 mg/mL streptomisin) ve %1'i gentamisin (4 mg/mL) ile takviye edilmiş taze önceden optimize edilmiş kültür ortamı hazırlayın.
- Deniz hıyar bağırsak dokusu bloğuna önceden optimize edilmiş kültür ortamının 1,5 mL'sini ekleyin ve çözelti bulutlu olana kadar steril cerrahi makasla bloğu doğrama.
3. Hücre Kültürü
-
Kuluçka makinesi ön ayarı: Hücre kültürü için kuluçka önceden ayarlayın ve 18 ° C sıcaklık ve doymuş nem ile en az 24 saat önceden çalıştırın.
NOT: HÜCRE KÜLTÜRÜ orta özelliklerine bağlı olarak CO2'yi kuluçka makinesine yedirin; Leibovitz'in L-15'inin temel ortamını kullanırken co2'nin sağlanmasına gerek yoktur. -
İlk aşama hücre kültürü
- Mikropların büyümesini engellemek ve hücre kültürünün ilk aşamasında çoğalmayı teşvik etmek için, optimize edilmiş kültür ortamının her 500 mL'sine 10 mL penisilin-streptomisin çözeltisi (10.000 U/mL penisilin ve 10 mg/mL streptomisin) ve 0,5 mL gentamisin (40 mg/mL) ekleyin. Ayrıca, 0,6 mL insülin (10 mg/mL), 100 μL insülin benzeri büyüme faktörü (0.1 g/μL) ve 25 μL fibroblast büyüme faktörü (0.1 μg/μL) ile her 500 mL kültür ortamını tamamlayınız.
- Hücreleri 1,5 mL tüpler halinde toplayın, 200 μL'lik belirtilen ortamı kullanarak yeniden askıya alın ve 4 cm'lik tabaklara yerleştirin.
- Kültür bir kuluçka hücreleri ve 6 h sonra hücre culturing yemekleri için belirtilen orta 2.0 mL ekleyin.
NOT: Hücreler yemeklere sıkıca bağlı olmadığından orta değişimi hafifçe ele alın. Poli-D-lizin kaplı yemekler gevşek çanak hücrelerine takmak için kullanılabilir.
-
İkinci aşama hücre kültürü
- Kültürlü hücrelere antibiyotiklerin olumsuz etkilerini azaltmak için, yarı yarıya kültür orta belirtilen antibiyotik konsantrasyonu azaltmak (penisilin, streptomisin, ve gentamicin).
NOT: İnsülin kullanımı ve büyüme faktörleri hücre kültürü koşullarına bağlıdır ve isteğe bağlıdır. - Hücre kültürü ortamını değiştirin; hücre yoğunluğuna bağlı olarak her 2-3 günde bir orta değişiklikler yapar.
NOT: Kültürlü hücreleri mikroskop altında her gün gözlemleyin ve büyüme koşullarını kaydedin.
- Kültürlü hücrelere antibiyotiklerin olumsuz etkilerini azaltmak için, yarı yarıya kültür orta belirtilen antibiyotik konsantrasyonu azaltmak (penisilin, streptomisin, ve gentamicin).
-
Hücre geçişi
NOT: Birincil hücre yoğunluğu %60'a ulaştığında hücreleri geçiş ve alt kültür.- Kültür hücrelerini oda sıcaklığında PBS kullanarak iki kez yıkayın. 200 μL tripsin çözeltisi (%0.25) ekleyin her yemek için ve el ile tüm alt kaplı olmasını sağlayan çanak ajite. Tripsin çözeltisini atın ve hücreleri oda sıcaklığında 5 dk kuluçkaya yatırın.
- Hücreleri pipetleme ve yeniden sulendirme yaparak 1,0 mL taze kültür ortamı ile yıkayın. 0,5 mL hücre süspansiyonunun yeni bir tabağa aktarılması, 1,5 mL taze ortam ekleyip 18 °C'de hücreleri kuluçkaya yatırın.
NOT: Tripsin çözeltisi hücreleri sindirip ayıramayınca hücre kazıyıcılar hücre toplama için kullanılabilir (bazı hücre hatları çok yapışkandır). Ancak, her iki yöntemi de aynı anda yapmayın. - 12 saat sonra orta değiştirin ve koşulları değerlendirmek için bir mikroskop altında hücreleri gözlemleyin. Kültür daha deneysel tahliller için hücreleri.
4. A. japonicus Intestinal Hücrelerde Apoptosis İndüksiyon ve Saptanması
-
Hücre kültürü ve deksametazon tedavisi
- Daha önce tanıtılan protokolü izleyerek bağırsak hücrelerini hazırlayın ve hücreleri kuyu başına 2 x 106'lık bir hücre hacminde 12 kuyuluk bir plakaya damlayla ekleyin.
- Kültürde üç gün sonra, "ilk aşama hücre kültürü" adımlarını izleyerek, pbs ile hücreleri üç kez yıkayın ve optimize edilmiş orta (antibiyotik ve büyüme faktörleri olmadan) ile orta değiştirin.
- Deneylere başlamadan önce taze 2 μM ve 200 μM DXMS çözeltileri hazırlamak için kültür ortamında seyreltilmiş deksametazon (DXMS).
- Aynı hacimde kültür ortamıyla yetiştirilen kültürlü hücrelere farklı konsantrasyonlarda DXMS çözümleri ekleyin; kontrol (CTL), 1 μM ve 100 μM DXMS dahil olmak üzere üç deneysel grup ayarlayın.
-
Hoechst boyama
- Belirtilen süreler için (0 saat, 24 saat ve 48 saat) DXMS ile/DXMS'siz kuluçkadan sonra hücreleri Üç kez PBS ile yıkayın.
- 12 kuyulu bir tabağa her kuyubaşına 300 μL Hoechst 33258 çözeltisi ekleyin ve 18 °C'de 30 dakika boyunca kuluçkaya yatırın.
- Hoechst boyama çözeltisini çıkarın ve her kuyuya %4 paraformaldehit çözeltisinin (PBS içinde) 300 μL'lik kısmını ekleyerek hücreleri düzeltin. Hafifçe 15 dakika boyunca çalkalayın.
DİkKAT: Paraformaldehit cilt teması veya inhalasyon ile orta derecede toksik, ve olası bir insan kanseriojen olarak belirlenmiştir. Paraformaldehitin tartılması ve işlenmesi sırasında kimyasal duman başlıkları, havalandırmalı denge muhafazaları veya diğer koruyucu önlemler kullanılmalıdır. - Sabit hücreleri PBS'de üç kez yıkayın. Hücreleri kapalı tutmak için yıkadıktan sonra PBS'yi atmayın.
-
Floresan mikroskopi analizi
- Cıva lamba gücü, floresan ışık gücü ve PC dahil olmak üzere floresan mikroskop donanımını açın. İşletim sistemi hesabına giriş yapın, yazılımı başlatın ve yapılandırmasını kontrol edin.
- Hazırlanan plakayı mikroskop aşamasına yerleştirin. Sahne denetleyicisini kullanarak örneği nesnel merceğin üzerine yerleştirin.
- Işık mikroskobu altında ilgi çeken hücreleri bulun, floresan mikroskobu na geçin ve parametreleri ayarı yaparak görüntüleri yakalayın.
NOT: Çekirdek DNA'sına bağlı Hoechst 33258 floresan sinyalini gözlemlemek için floresan mikroskobu sırasıyla 352 nm ve 461 nm'de uyarma ve emisyon ile yapılmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada A. japonicus'un birincil bağırsak hücre kültürünü kurduk ve hücreleri geçişyaptık. Şekil 1, farklı evrelerde yuvarlak hücreleri göstermektedir. Ve EdU boyama tahlilleri daha sonraki aşamada bu yuvarlak hücrelerin proliferatif aktivitesini ortaya çıkarmak için doğrudan kanıtlar sağlar (Şekil 2). Ayrıca protokolü biraz ayarladık, filtratedilmiş hücreler yerine kıymalı doku bloklarını kuşattık; ayrıca, bir mil hücre tipi başarıyla kültürlenebilir. Bu hücre tipi bağırsak doku blokları etrafında meydana geldi ve kültür dört gün sonra görülebilir; ancak, geçilemeyi başaramadı (Şekil 3).
Kültürlü hücreler farklı biyolojik deneysel uygulamalar için kullanılabilir. Hücreleri farklı zaman dilimleri için DXMS ile tedavi ettik ve ardından apoptotik hücre tespiti için Hoechst 33258 boyama yaptık. Şekil 4, Hoechst 33258 boyama ve floresan mikroskopi ile deniz hıyarı bağırsak hücrelerinden saptanan apoptotik sinyali göstermektedir. Şekil 5, DXMS ile uyarılma altında belirtilen süreler için apoptotik hücre oranlarını göstermektedir.
Şekil 1: Farklı evrelerde kültürlü deniz bağırsak yuvarlak hücrelerinin mikroskopisi. (A) Tohumlandıktan sonraki üçüncü gün yemeklerin dibine bağlı hücreler. (B) Yedinci gün hücre çoğalması. (C) Geçtikten sonra tabakların altına bağlı hücreler. (D) Aktivitelerini yitiren ve on pasajdan sonra ölen hücreler. "CM", hücre çoğalması sırasında oluşan hücre kütlesini gösterir. "BT", ölü hücreler tarafından bırakılan siyah yolu gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: EdU boyama tahlilleri ile tespit edilen hücre çoğalması. Hücre çoğalma tahlilleri üreticinin protokolüne göre kit(Malzeme Tablosu)kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Kültürlü deniz hıyarı bağırsak doku blokları ve hücre çoğalması mikroskopisi. (A) doku blokları (TB) kültürden sonraki ilk gün çanak alt bağlı. (B) Kültürden sonraki ikinci gün çanak dibine bağlı doku blokları ve hücreler. (C) Doku blokları ve periferik olarak meydana gelen mil hücreleri (SC) kültürden sonraki dördüncü gün. (D) kültürden sonraki yedinci günde iğ hücrelerini çoğaltır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: İndüklenen apoptozlu bağırsak yuvarlak hücrelerinin floresan mikroskobu. "NC" nükleer yoğuşma floresan sinyalini gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Hoechst-pozitif bağırsak yuvarlak hücrelerinin istatistiksel analizi. Nükleer yoğuşma floresan sinyal pozitif hücrelerinin hoechst lekeli A. japonicus bağırsak hücreleri arasında yüzde dağılımı ve deney dozu veya zaman seyri (n = 3). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kapsamlı araştırma çabaları son yıllarda hücre hatları kurmaya ayrılmış, ancak, hala deniz omurgasızlar14,22hücrelerin inuzun uzun vadeli kültür üzerinde bir ilerleme yapmak zordur. Bu rejenerasyon holotoryian dokulardan kültürlü hücrelerin uzun bir süre için canlı olduğu bildirilmiştir ve çoğalma yüksek aktivite belirli hücrelerde tespit edilebilir17,23. Ancak, normal deniz omurgasız hücreleri için, henüz pratik hücre kültürü yaklaşımı tarif edilmiştir. Burada sunulan protokol, deniz omurgasız türleri A. japonicus'tanbağırsak hücrelerinin kültüre geçirilmesi ve geçirilmesi için etkili ve kolay yorumlanabilir bir yöntem sağlar. Bu yöntem mürekkep balığı ve yengeç gibi birçok farklı deniz omurgasız organizmanın birincil hücre kültürüne kolayca adapte edilebilir.
Bir dizi önemli etken bu yordamın başarılı bir şekilde uygulanmasını etkiler. Mikrobiyal kontaminasyonun önlenmesi tüm süreç boyunca ve özellikle kültürün ilk haftasında en önemli öneme sahiptir. Su cula hayvanları genellikle solungaç, bağırsak, yüzgeç ve deri gibi dokularını kolonize çevre, çok sayıda mikroplar temas. Böylece hücre kültürü başlamadan önce doku örneklerini sterilize etmek mümkün olmayacaktır. Hücre kültürü sırasında mikrobiyal kontaminasyon riskini en aza indirmek için doku numunesi sterilizasyonu için %75 etanol daldırma esastır; ancak, tedavi süresi farklı doku tipleri için optimize edilmelidir. Ayrıca hücre kültürünün erken dönemlerinde yüksek antibiyotik konsantrasyonlarının uygulanması da mikrobiyal büyümenin inhibisyonunda önemli bir rol oynamaktadır. Ayrıca, orta formülasyon kültürlü hücrelerin çoğalmasını ve yaşam süresini belirleyen önemli bir faktördür. Deniz omurgasız hücrelerinin beslenme gereksinimleri hala bilinmediğinden, kullanılan mevcut hücre kültürü ortamı esas olarak omurgalı veya böcek hücre hatları14için tasarlanmıştır. Yeterli besin maddesi sağlamak için, deniz hıyarlarından önceden işlenmiş coelomik sıvı memeli hücre kültüründe FBS benzer kullanılabilir. Bu arada, hücre çoğalmasını kolaylaştırmak için, çeşitli memeli büyüme faktörleri de kültür orta uygulanabilir. Kuluçka sıcaklığı deniz omurgasız hücre kültürünün başarısını etkileyen bir faktör olduğundan, hedef organizmanın optimum büyüme sıcaklığı altında hücreleri kuluçka düşünülmelidir. Örneğin, A. japonicus hücre kültürünün sıcaklığı 18 °C olarak ayarlanabilir, bu da büyüme için uygundur24.
Doku ön tedavisi başarılı kültürlü ve çoğalan hücre tiplerini etkileyebilir. Çok farklı A. japonicus bağırsak hücreleri, yuvarlak veya iğ, aynı kültür prosedürü altında filtratif hücreleri veya doku blokları tohumlama elde edilebilir (Şekil 1 ve Şekil 3karşılaştırmalı veriler). Bu nedenle, belirli hücre kültürü tipi için doku pretesyon yöntemi optimize de başında yapılmalıdır; biyolojik deneysel tasarıma göre en uygun prosedüre karar verilmelidir.
Burada apoptoz indüksiyonu için DXMS tedavisi ni üç gün sonra apoptosis indüksiyonu uyguladık ve apoptotik sinyal tespiti için Hoechst boyama uyguladık. Hoechst pozitif hücrelerinin 1 μM DXMS ile 48 saat stimülasyonundan sonra başarılı bir şekilde saptanması, kültürlü hücrelere dayalı biyolojik bir deney için pratik bir örnek sağladı.
Açıklanan protokol kullanımı kolaydır ve bir deniz omurgasız hücre kültürü kurmak için kullanılabilir. Kültürlü hücreler farklı daha fazla biyolojik deneysel uygulamalar için tutarlı genetik arka plan ile biyolojik malzeme sağlamalıdır. Ayrıca, biraz ayarlanmış protokol prosedürleri kültür sırasında başarılı bir şekilde çoğalan hücre türlerini değiştirebilir ve biyolojik deneyler için farklı hücre malzemeleri sağlayabilir. Bu nedenle, hedeflenen hayvan türlerine ve gerekli belirli hücre türlerine bağlı olarak protokoldeki belirli adımların optimizasyonu gerekli olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Yazarlar, Zhejiang Üniversitesi'nden Prof. Naiming Zhou'ya teknik tavsiyeleri ve laboratuvarının ekipmanını kullanıma hazır hale getirmeleri için teşekkür etmek isterler. Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (hibe numaraları 41876154, 41606150 ve 41406137) ve Zhejiang İl Üniversiteleri ve Araştırma Enstitüleri Için Temel Araştırma Fonları [hibe numarası 2019JZ00007) tarafından finansal olarak desteklenmiştir. ].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 μm filter | Millipore | SLVV033RS | |
| 0.22 μm filter | Millipore | SLGP033RB | |
| 0.25% Trypsin | Genom | GNM25200 | |
| 100 μm filter | Falcon | 352360 | |
| 4 cm dishes | ExCell Bio | CS016-0124 | |
| 4% paraformaldehyde solution | Sinopharm Chemical Reagent | 80096618 | in PBS |
| Benchtop Centrifuges | Beckman | Allegra X-30R | |
| BeyoClick EdU-488 kit | Beyotime | C0071S | |
| CaCl2 | Sinopharm Chemical Reagent | 10005817 | |
| Constant temperature incubator | Lucky Riptile | HN-3 | |
| Dexamethasone | Sinopharm Chemical Reagent | XW00500221 | |
| Electric thermostatic water bath | senxin17 | DK-S28 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent | 80176961 | 75% |
| Fibroblast Growth Factor(FGF) | PEPROTECH | 100-18B | |
| Fluorescent microscope | Leica DMI3000B | DMI3000B | |
| Garamycin | Sinopharm Chemical Reagent | XW14054101 | |
| Glucose | Sinopharm Chemical Reagent | 63005518 | |
| Hoechst33258 Staining solution | Beyotime | C1017 | |
| Insulin | Sinopharm Chemical Reagent | XW1106168001 | |
| Insulin like Growth Factor(IGF) | PEPROTECH | 100-11 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10016308 | |
| Leibovitz's L-15 | Genom | GNM41300 | |
| L-glutamine (100 mg/mL) | Genom | GNM-21051 | |
| MgCl2 | Sinopharm Chemical Reagent | XW77863031 | |
| Na2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10020518 | |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10019308 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent | 10019718 | |
| PBS | Solarbio | P1020 | pH7.2-7.4 |
| Penicillin-Streptomycin | Genom | GNM15140 | |
| PH meter | Bante | A120 | |
| Taurine | SIGMA | T0625 | |
| VE | Seebio | 185791 |
References
- Naganuma, T., Degnan, B. M., Horikoshi, K., Morse, D. E. Myogenesis in primary cell cultures from larvae of the abalone, Haliotis rufescens. Molecular Marine Biology and Biotechnology. 3 (3), 131-140 (1994).
- Reinardy, H. C., Emerson, C. E., Manley, J. M., Bodnar, A. G. Tissue regeneration and biomineralization in sea urchins: role of Notch signaling and presence of stem cell markers. Plos One. 10 (8), 0133860 (2015).
- Schaffer, A. A., Bazarsky, M., Levy, K., Chalifa-Caspi, V., Gat, U. A transcriptional time-course analysis of oral vs. aboral whole-body regeneration in the Sea anemone Nematostella vectensis. Bmc Genomics. 17, 718 (2016).
- Chiaramonte, M., Inguglia, L., Vazzana, M., Deidun, A., Arizza, V. Stress and immune response to bacterial LPS in the sea urchin Paracentrous lividus (Lamarck, 1816). Fish and Shellfish Immunology. 92, 384-394 (2019).
- Meng, J., Wang, T., Li, L., Zhang, G. Inducible variation in anaerobic energy metabolism reflects hypoxia tolerance across the intertidal and subtidal distribution of the Pacific oyster (Crassostrea gigas). Marine Environmental Research. 138, 135-143 (2018).
- Han, G., Zhang, S., Dong, Y. Anaerobic metabolism and thermal tolerance: The importance of opine pathways on survival of a gastropod after cardiac dysfunction. Integrative Zoology. 12 (5), 361-370 (2017).
- Zhang, X., et al. The sea cucumber genome provides insights into morphological evolution and visceral regeneration. PLoS Biology. 15 (10), 2003790 (2017).
- Sun, L., et al. iTRAQ reveals proteomic changes during intestine regeneration in the sea cucumber Apostichopus japonicus. Comparative Biochemistry and Physiology Part D: Genomics and Proteomics. 22, 39-49 (2017).
- Xu, K., et al. Cell loss by apoptosis is involved in the intestinal degeneration that occurs during aestivation in the sea cucumber Apostichopus japonicus. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 216, 25-31 (2018).
- Yang, H. S., et al. Metabolic characteristics of sea cucumber Apostichopus japonicus (Selenka) during aestivation. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 330 (2), 505-510 (2006).
- Xiang, X. W., et al. Glycolytic regulation in aestivation of the sea cucumber Apostichopus japonicus: evidence from metabolite quantification and rate-limiting enzyme analyses. Marine biology. 163 (8), 1-12 (2016).
- Jiang, L., et al. A feedback loop involving FREP and NF-kappaB regulates the immune response of sea cucumber Apostichopus japonicus. International Journal of Biological Macromolecules. 135, 113-118 (2019).
- Zhou, X., Chang, Y., Zhan, Y., Wang, X., Lin, K. Integrative mRNA-miRNA interaction analysis associate with immune response of sea cucumber Apostichopus japonicus based on transcriptome database. Fish and Shellfish Immunology. 72, 69-76 (2018).
- Cai, X., Zhang, Y. Marine invertebrate cell culture: a decade of development. Journal of Oceanography. 70 (5), 405-414 (2014).
- Maselli, V., Xu, F., Syed, N. I., Polese, G., Di Cosmo, A. A Novel Approach to Primary Cell Culture for Octopus vulgaris Neurons. Frontiers in Physiology. 9, 220 (2018).
- Pinsino, A., Alijagic, A. Sea urchin Paracentrotus lividus immune cells in culture: formulation of the appropriate harvesting and culture media and maintenance conditions. Biology Open. 8 (3), (2019).
- Odintsova, N. A., Dolmatov, I. Y., Mashanov, V. S. Regenerating holothurian tissues as a source of cells for long-term cell cultures. Marine Biology. 146 (5), 915-921 (2005).
- Rastogi, R. P., Richa, R. P., Sinha, R. P. Apoptosis: Molecular Mechanisms and Pathogenicity. Excli Journal. 8, 155-181 (2009).
- Wan, L., et al. Apoptosis, proliferation, and morphology during vein graft remodeling in rabbits. Genetics and Molecular Research. 15 (4), (2016).
- Kasibhatla, S., et al. Staining of suspension cells with hoechst 33258 to detect apoptosis. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (3), (2006).
- Mikiewicz, M., Otrocka-Domagala, I., Pazdzior-Czapula, K., Rotkiewicz, T. Influence of long-term, high-dose dexamethasone administration on proliferation and apoptosis in porcine hepatocytes. Research in Veterinary Science. 112, 141-148 (2017).
- Rinkevich, B. Cell cultures from marine invertebrates: new insights for capturing endless stemness. Marine Biotechnology. 13 (3), 345-354 (2011).
- Bello, S. A., Abreu-Irizarry, R. J., Garcia-Arraras, J. E. Primary cell cultures of regenerating holothurian tissues. Methods in Molecular Biology. 1189, 283-297 (2015).
- Yu, H., et al. Impact of water temperature on the growth and fatty acid profiles of juvenile sea cucumber Apostichopus japonicus (Selenka). Journal of Thermal Biology. 60, 155-161 (2016).
