大鼠复杂区域疼痛综合征I型慢性缺血后疼痛模型

Summary

此处提供了一个协议，详细说明了建立慢性缺血后疼痛（CPIP）动物模型的步骤。这是一个公认的模型，模仿人类复杂的区域疼痛综合征I型。进一步评价机械和热超敏感性，以及在CPIP大鼠模型中观察到的辣椒素引起的角感行为。

Abstract

复杂的区域疼痛综合征I型（CRPS-I）是一种神经系统疾病，在患者中引起剧烈疼痛，并且仍然是一个未解决的医疗状况。然而，CRPS-I的基本机制尚未透露。众所周知，缺血/再灌注是导致CRPS-I的主要因素之一。通过长期缺血和后肢再灌注，建立了大鼠慢性缺血后疼痛（CPIP）模型，以模仿CRPS-I。CPIP模型已成为研究CRPS-I机制的公认动物模型。该协议描述了建立CPIP大鼠模型所涉及的详细程序，包括麻醉，然后是后肢缺血/再灌注。通过测量后肢的机械和热超敏感性以及急性辣椒素注射的角质反应，进一步评价大鼠CPIP模型的特征。大鼠CPIP模型表现出几种CRPS-I样的表现，包括建立后早期后肢水肿和高血症，持续热和机械过敏，以及急性辣椒素注射增加的角质反应。这些特性使其成为进一步研究CRPS-I中涉及的机制的合适动物模型。

Introduction

复杂的区域疼痛综合征 （CRPS） 引起骨折、创伤、手术、缺血或神经损伤^1、2、3引起的复杂和慢性疼痛症状。CRPS分为2个子类别：CRPS类型I和II型（CRPS-I和CRPS-II）4。流行病学研究表明，CRPS的流行率约为1：2000^5。CRPS-I，显示没有明显的神经损伤，可能导致慢性疼痛，并极大地影响患者的生活质量。目前可用的治疗方法显示治疗效果不足。因此，CRPS-I 仍然是一个需要解决的重要且具有挑战性的临床问题。

建立模仿CRPS-I的临床前动物模型对于探索CRPS-I背后的机制至关重要。为了解决这个问题，Coderre等人设计了一个大鼠模型，将长期缺血和再灌注到后肢，以重述CRPS-I^6。据了解，缺血/再灌注损伤是CRPS-I⁷的主要原因之一。大鼠CPIP模型表现出许多CRPS-I样的症状，包括后肢水肿和高血症在模型建立后的早期阶段，其次是持续热和机械高灵敏度^6。在此模型的帮助下，建议中央疼痛敏化、外周TRPA1通道激活和活性氧物种生成等对CRPS-I^8、9、10作出贡献。我们最近成功地建立了CPIP大鼠模型，并进行了背根结核（DRGs）的RNA测序，内骨对受影响的后爪¹¹进行内脏测序。我们发现了一些潜在的机制，可能参与调解CRPS-I¹¹的疼痛过度敏感。我们进一步确定DRG神经元中的瞬态受体电位万能1（TRPV1）通道是CRPS-I¹²的机械和热超灵敏度的重要原因。

在这项研究中，我们描述了建立CPIP的老鼠模型所涉及的详细程序。通过测量机械和热超敏感性及其对急性辣椒素挑战的反应能力，我们进一步评估了大鼠CPIP模型。提出大鼠CPIP模型是进一步研究CRPS-I中相关机制的可靠动物模型。

Protocol

动物规程经浙江医科大学动物伦理委员会批准。

1. 动物

1. 从上海实验室动物中心获得雄性斯普拉格-道利（SD）大鼠（280~320克，8-10周龄）。在浙江中医药大学动物实验室动物中心饲养动物。请注意，繁殖条件应包括 12 h/ 2h 的光/暗周期，并保持温度稳定在 24°C。提供水和食物。请注意，本研究共使用了48只大鼠。有一点，在这个模型中，我们需要观察整个过程中的疼痛反应。如果应用止痛药，我们就无法成功建立疼痛模型。实验结束后，老鼠被牺牲了。

2. CPIP模型建立

1. 用苯巴比妥钠（50毫克/千克，腹内注射[i.p.]）麻醉所有大鼠（包括假鼠和CPIP模型组）。如有必要，使用高达 20 mg/kg/h 苯巴比妥 [i.p.] 维持麻醉。检查每只动物的反应，用钳子捏它的后爪或尾尖。确保大鼠在建立模型之前没有响应。在眼睛上放置兽医膏，以避免在手术过程中干燥。将麻醉大鼠放在37°C的加热垫上，进行以下操作。
2. 缺血和后爪的再灌注
   1. 一旦大鼠被麻醉，用甘油润滑右后爪和脚踝。
   2. 将内径为 7/32 英寸（5.5 毫米）的 Nitrile 70 Durometer O 型环滑入 1.5 mL Eppendorf 管的较大侧（使用前切断卡帽）。小心地将后爪插入空心的 Eppendorf 管中，直到到达底部。
   3. 逐渐将O环从管子滑到靠近踝关节的右后肢，并放置3小时。
   4. 在缺血步骤后切断 O 型环 3 小时。仔细观察大鼠，直到它恢复足够的意识，以保持胸腔。请注意，接受麻醉的大鼠在完全恢复之前，不应将其放回其他大鼠的陪伴中。

3. 规范行为测试

1. 将大鼠放在一个透明的Plexiglas室中，这个房间位于网状地板上。在任何行为测试之前，将大鼠活动0.5小时。
2. 机械过敏症
   1. 在测试中使用 von Frey 灯丝（0.4、0.6、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、15.0 和 26.0 g 灯丝）。从中间灯丝 （4.0 g） 开始测试。垂直地将灯丝涂在后爪的中间平面上。稍微施加适当的力，将灯丝弯曲长达 5 s。突然收回后爪对刺激的反应被认为是一种尖利行为。在 -3、-2、-1 天每隔一天进行机械异位测试，直到第 13 天。
   2. 应用上下测试方法来测试阈值。应用迪克森方法计算50%爪提取阈值（PWT）13，14，15。
3. 热超阿尔基西亚
   1. 使用哈格里夫斯的方法检查热超热性。直接将灯泡（50 W）发射的光束对准后爪，以测量爪子提取延迟 （PWL）。将 20 s 设置为截止阈值，以避免加热造成过度伤害。
   2. 每个后爪以 5 分钟间隔重复每个测试 3 倍。以这三个测试的平均数作为每只大鼠^的PWL16。在 -3、-2、-1 天每隔一天进行热超节性测试，直到第 13 天。
4. 辣椒素诱发急性角化行为
   1. 使用二甲基硫酸盐（DMSO）制备辣椒素原料溶液（200 mM），并在无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）中进一步稀释至1：1000，用于后爪注射。PBS 中的最终 DMSO 浓度为 0.1%（仅在 PBS 中车辆包含 0.1% DMSO）。使用连接到 1 mL 注射器的 30 G 针头，以 50 μL 的体积将辣椒素或车辆注射到后爪（内平面内注射）。
   2. 记录注射后10分钟的电感行为（即舔、咬或退缩注射的爪子），然后像前面描述17、18、19那样进行量化。
5. 动爪水肿评价：通过测量爪径的增加来评估后爪水肿。使用数字卡钳测量，并计算基基值与在不同时间点观察到的测试值之间的差异。在模型建立后，评估 15 分钟、24 小时、48 小时和 72 h 的爪子厚度变化。

Representative Results

在脚踝上放置O环后，叶侧后爪皮肤出现青紫，指示组织缺氧（图1A）。切割O环后，叶侧后爪开始充满血液，并表现出强健的肿胀，这显示了高血症的强烈迹象（图1A）。爪子肿胀逐渐减少，并在缺血/再灌注程序后恢复正常的48小时（与Sidak的双向ANOVA，即位测试，图1B）。所有这些迹象都符合以前的研究^6，12。

然后，使用冯·弗雷头发测试测量机械过敏症。与假组相比，CPIP组的后爪在模型建立后1天表现出明显的机械性全侧。益西侧后爪的机械性异位肌一直持续到观察时间范围的13天（双向ANOVA与Sidak的后点测试，图1C）。CPIP组的反向后爪也表现出类似于益边后爪的机械超节，持续13天（双向ANOVA与Sidak后测试，图1D）。

然后，使用哈格里夫斯测试测量热超节。与假组大鼠相比，CPIP大鼠的双边后爪表现出显著减少的戒断延迟，以回应有害的热刺激，这是热增节症的标志（与假组大鼠相比（双向ANOVA与Sidak后特级测试，图1E，F）。这一观察结果与先前的研究^11、12一致。益西侧后爪的热超节一直持续到观测时间范围结束，而反向后爪的热超节持续7天（与西达克的双向ANOVA，即点后测试，图1E，F）。上述结果表明，CPIP大鼠产生强健和持久的机械和热超敏性，与先前的观测^{结果11，12}一致。

CRPS患者在²⁰日对辣椒素引起的疼痛表现出明显增加的反应。然后，研究CPIP大鼠模型是否可以重述这一现象。在CPIP大鼠的角性行为被观察到响应植物内辣椒素（TRPV1激动剂）注射到ipsi侧后爪。首先，对注射车辆时大鼠的感知反应进行了测试。假组对车辆喷射表现出轻微的轻微反应，而 CPIP 组表现出比假组高得多的响应（带有 Sidak 的单向 ANOVA，即点后测试，图 2）。此外，辣椒素注射导致在假组强健的角性反应（图2）。更重要的是，CPIP大鼠对辣椒素注射的反应明显高于假组（图2）。这些数据表明，CPIP大鼠对辣椒素表现出更强的抗性反应，这是一种模仿CRPS-I的人类患者的现象。

图1：CPIP大鼠模型显示双后肢的热和机械疼痛过度敏感。（A） 在不同时间点（缺血期间，再灌注后10分钟，7天后）拍摄的典型图像。（B） CPIP 和假组的后爪厚度测量。（C，D） 50% 爪子提取阈值 （50% PWT， 机械超脂指数） 的益边 （C） 和反向 （D） 后爪的大鼠.（E，F）爪子戒断延迟（PWL，热超节指数）的益边（E）和反向（F）后爪大鼠（n = 8大鼠每组，\p <0.01）。结果表示为均值 = SEM（双向 ANOVA 后跟 Sidak 的特次测试）。请点击此处查看此图的较大版本。

图2：CPIP大鼠在将辣椒素注射到叶西侧后爪中时，表现出与假大鼠相比更多的角性行为。大鼠在车辆后10分钟内（PBS，普天间0.1%DMSO）或辣椒素（50μL体积为10 nmol，普天间）注射（n = 每组8只大鼠，μp <0.01）后计算了大鼠舔、咬或退缩的累积时间。结果表示为均值 = SEM（单向方差分析后，Sidak 后特次测试）。请点击此处查看此图的较大版本。

Discussion

该协议描述了通过在大鼠后肢应用缺血/再灌注来建立大鼠CPIP模型的详细方法。它涉及评估后肢外观，水肿，机械/热过敏性，和急性角质行为，以回应辣椒素注射。

肢体缺血/再灌注是导致CRPS-I在人类患者¹²的常见因素。该协议描述了如何建立大鼠CPIP模型，这是一个常用的动物模型来概括人类CRPS-I^6。在麻醉下，在大鼠的后肢诱导了缺血，在麻醉下用紧的O环在脚踝上涂了3小时。O 型环已移除，并发生重新灌注。模型建立后，CPIP模型大鼠在后肢出现早期高血症和水肿。该模型还显示神经病痛行为，包括持续的机械/热过敏。这些症状都模仿人类CRPS-I ²¹的典型特征。

CRPS患者表现出明显增加的反应，在受影响的四肢的辣椒素引起的疼痛^20。然而，目前还不清楚CPIP模型动物是否表现出类似的反应。因此，在这项研究中，对CPIP大鼠的角性行为进行了检查，以响应将辣椒素注射到叶侧后爪中。结果发现，与假大鼠相比，CPIP模型大鼠对辣椒素注射的角性反应明显较高。据我们所知，这是CPIP模型大鼠首次报告这种现象。

在以前的研究中，TRPV1通道表达被证明在叶侧后爪组织和DRG神经元中向上调节，这些神经元对后爪¹²进行内侧分析。此外，还发现脊髓胶质细胞在CPIP模型大鼠中被激活，导致中央疼痛敏感和疼痛感知和传递^9，12。因此，在CPIP模型大鼠中，对辣椒素注射的增角性行为可能同时涉及外周和中枢疼痛敏化。未来的研究是必要的，以测试辣椒素注射是否导致增强反应的逆后爪的CPIP模型大鼠，以及。在这里进行的测试中，我们没有观察到CPIP模型大鼠的自切除术。这与经过坐骨切片的老鼠形成对比，它们除了慢性疼痛过度敏感性^22、23外，通常还发展为自体切除术。此外，CRPS-I患者或CPIP模式动物没有转诊疼痛反应报告。

模型中的关键步骤之一是在整个过程中保持麻醉。在这项研究中，麻醉是由苯巴比妥钠（50毫克/千克）的腹内注射引起的。这种剂量经常用于许多涉及大鼠麻醉的研究，包括与CPIP大鼠模型建立^9，12，24的研究。此外，麻醉应通过20毫克/千克/小时（i.p.）苯巴比妥钠在必要时保持，以保证成功实施程序^12，24。

在Coderre等人建立的初始CPIP模型中，当后^{爪尽可能地}放入注射器的桶中时，O-ring实际上从3厘米³注射器的外侧滑落（切成两半）。在这里，在我们的研究中，我们对此方法做了一些小的修改。我们使用1.5 mL Eppendorf管（事先切断卡帽），而不是注射器，因为这种材料更容易接近，正好适合大鼠后爪的直径。O 型环可以很方便地放置在大鼠的脚踝部分，这种经过修改的方法无需受伤，便于建立模型。

目前，CPIP大鼠模型完全建立在雄鼠的基础上，包括我们目前的研究^25。然而，应该指出，根据流行病学分析^26、27，女性CRPS-I的发病率比男性患者更频繁。这进一步支持了发现，女性动物表现出更多的疼痛反应比雄性动物，当CPIP成立^28。因此，今后有必要在雄性动物和雌性动物中建立CPIP模型。这对研究该模型的转化意义具有重要意义。

最后，这里介绍了建立大鼠CPIP模型的方法。该CPIP大鼠模型概括了人类CRPS-I的许多临床特征，其性质可使其成为研究CRPS-I的合适动物模型。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 ml Eppendorf tube	Eppendorf	22431021
DMSO	Sigma-Aldrich	D1435
Capsaicin	APEXBIO	A3278
Digital caliper	Meinaite	NA
O-ring	O-Rings West	Nitrile 70 Durometer	7/32 in. internal diameter
Plantar Test Apparatus	UGO Basile, Italy	37370
von Frey filaments	UGO Basile, Italy	NC12775