Summary
Denne protokollen beskriver trinnene som er tatt for å indusere KRAS lungesvulster hos mus, samt kvantifisering av dannede svulster ved ultralydavbildning. Små svulster visualiseres i tidlige tidspunkter som B-linjer. Ved senere tidspunktoppnås relative tumorvolummålinger ved hjelp av måleverktøyet i ultralydprogramvaren.
Abstract
Med ~ 1,6 millioner ofre per år, lungekreft bidrar enormt til den verdensomspennende byrden av kreft. Lungekreft er delvis drevet av genetiske endringer i onkogenes som KRAS oncogene, som utgjør ~ 25% av lungekreft tilfeller. Vanskeligheten med terapeutisk målretting KRAS-drevet lungekreft stammer delvis fra å ha dårlige modeller som kan etterligne utviklingen av sykdommen i laboratoriet. Vi beskriver en metode som tillater relativ kvantifisering av primære KRAS lungesvulster i en Cre-inducible LSL-KRAS G12D musemodell via ultralydavbildning. Denne metoden er avhengig av lysstyrke (B)-modus oppkjøp av lungeparenchyma. Svulster som opprinnelig dannes i denne modellen visualiseres som B-linjer og kan kvantifiseres ved å telle antall B-linjer som finnes i de oppkjøpte bildene. Disse ville representere det relative tumornummeret dannet på overflaten av muslungen. Etter hvert som de dannede svulstene utvikler seg med tiden, oppfattes de som dype kløfter i lungeparenchyma. Siden omkretsen av den dannede svulsten er godt definert, oppnås beregning av det relative tumorvolumet ved å måle lengden og bredden på svulsten og bruke dem i formelen som brukes til tumorkalipermålinger. Ultralydavbildning er en ikke-invasiv, rask og brukervennlig teknikk som ofte brukes til tumorkvantifiseringer hos mus. Selv om artefakter kan oppstå når du får ultralydbilder, har det vist seg at denne bildeteknikken er mer fordelaktig for tumorkvantifiseringer hos mus sammenlignet med andre bildeteknikker som computertomografi (CT) avbildning og bioluminescensavbildning (BLI). Forskere kan undersøke nye terapeutiske mål ved hjelp av denne teknikken ved å sammenligne lungetumorinitiering og progresjon mellom ulike grupper av mus.
Introduction
Som den ledende årsaken til kreftrelaterte dødsfall over hele verden, lungekreft forblir ildfast mot behandlinger, hovedsakelig på grunn av mangel på relevante prekliniske modeller som kan rekapitulere sykdommen i laboratoriet1. Rundt 25% av lungekrefttilfeller skyldes mutasjoner i KRAS oncogene2. KRAS-drevet lungekreft er ofte forbundet med dårlig prognose og lav respons på terapi, og fremhever viktigheten av videre studier i denne sykdommen2.
Vi optimaliserte en metode som tillater den relative evalueringen av lungetumorvekst i sanntid hos KRAS lungekreftinduserte immunkompetente mus. Vi bruker Lox-Stop-Lox KRAS G12D (LSL-KRAS G12D) mus der KRAS G12D onkogen kan uttrykkes av Cre lentivirale vektorer3,4. Disse vektorene er drevet av karbonanhydrase 2, slik at virusinfeksjonen kan finne sted spesielt i alveolær epitelceller5. I tillegg, for å akselerere initiering og progresjon av lungesvulster, uttrykker lentiviral konstruksjon også P53 shRNA fra en U6/H1-promotor (lentiviral konstruksjon en gang vil bli referert til som Ca2Cre-shp53)6. Den biologiske relevansen av denne metoden ligger i det naturlige løpet av lungetumorutvikling hos mus i motsetning til xenografts av ikke-ortopiske svulster hos mus. Et hinder ved hjelp av ortopisk metode overvåker lungetumorvekst uten å ofre musen. For å overvinne denne begrensningen optimaliserte vi ultralydavbildning for å tillate analyse av lungetumorprogresjon i todimensjonal (2D) modus i denne musemodellen. Initiering av svulster ved 7 uker etter infeksjon gjenspeiles som B-linjer i ultralydbilder, som kan telles, men vil ikke gjenspeile det nøyaktige antallet svulster som finnes på lungene. B-linjer er preget av laserlignende vertikale hvite linjer som oppstår fra pleural linjen i lungeparenchyma7,8. Store svulster kan visualiseres etter 18 ukers infeksjon. Det relative volumet av disse svulstene kvantifiseres av 2D-målinger gjort på ultralyd.
Denne metoden er optimal for forskere som undersøker effekten av farmakologiske legemidler på lungetumorvekst i LSL-KRAS G12D-musemodellen. I tillegg kan lungetumorprogresjon sammenlignes mellom mus med forskjellige genetiske linjer, for å undersøke viktigheten av tilstedeværelse eller fravær av visse gener/ proteiner på utviklingen av lungetumorvolum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyrestudier ble utført i samsvar med Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) fra McGill University og prosedyrer ble godkjent av Animal Welfare Committee of McGill University (dyrebrukprotokoll # 2009-5754).
1. Generasjon av CA2Cre-shp53 Lentiviral Titre
MERK: Følgende protokoll er den samme som beskrevet i Xia et al.6, med mindre modifikasjoner.
- Forberedelse av lentivirus (for 15 cm x 10 cm retter)
- På dag 1, plate sunn HEK293T celler (7,5 x 106 celler per 10 cm parabolen) med 10 ml Dulbecco modifisert Eagle medium) (DMEM), 10% føtal storfe serum (FBS), og 1% penn / strep. Kultur i en 37 °C, 5% CO2 inkubator.
- Forbered blandingen for kalsiumfosfattransfeksjon (blanding for 15 plater). Forbered rør A som inneholder 225 μg (15 μg/plate) av lentiviral vektor (Ca2Cre-shp53), 75 μg (5 μg/plate) av PsPAX2 plasmid (som inneholder HIV-1 gag og HIV-1 pol gener), 75 μg (5 μg/plate) pMD2.G plasmid (som inneholder VSV-G gen) for emballasje, en endelig konsentrasjon på 0,15 M caCl2 og fyll røret med destillert H2O opp til 3,75 ml. Forbered rør B som inneholder 3,75 ml 2x HEPES-bufret saltvann (HBS; 50 mM HEPES, pH 7,05, 280 mM NaCl, 10 mM KCl, 1,5 mM Na2HPO4·2H2O og 12 mM D-dextrose).
- Vortex rør A og legg den dropwise til rør B under kontinuerlig virvlende.
MERK: Det totale volumet vil være 7,5 ml. - Inkuber ved romtemperatur i mørket i 20-30 min.
- Omtrent 9 timer etter plating cellene, tilsett 500 μL av transfection blandingen dropwise inn i cellemediet (7,5 ml / 15 retter: 0,5 ml per tallerken).
- Virvle forsiktig hver tallerken for å blande, og inkuber alle retter ved 37 ° C, 5% CO2.
- På dag 2, 12-18 timer etter transfeksjon, erstatt mediet med 10 ml antibiotikafri redusert serummedia (Materialtabell) per 10 cm fat. Legg rettene tilbake i 37 °C, 5 % CO 2-inkubator.
- På dag 3 samler du inn mediene som inneholder lentivirus som uttrykker Ca2Cre-shp53 og filtrerer gjennom 0,45 μm filtre. Fyll opp mediet med friske antibiotikafrie reduserte serummedier.
MERK: De innsamlede mediene kan oppbevares ved 4 °C i ikke mer enn 3 dager. - På dag 4, samle, for andre gang, media som inneholder lentivirus og filtrere gjennom en 0,45 μm filter. Oppbevars ved 4 °C (i ikke mer enn 3 dager).
- Kombiner virussupernatantene fra trinn 1.1.8 og 1.1.9. Konsentrer dem gjennom sentrifugalfilterenheter (Materialtabell) ved sentrifugering ved 1372 x g i 30 min ved 4 °C. Gjenta prosessen til alle de innsamlede mediene har gått gjennom kolonnene.
MERK: Etter hver sentrifugering kan 100–200 μL konsentrert filtrate høstes. - Samle og bland de konsentrerte filtratene i et 15 ml iskaldt rør. Bland de konsentrerte lentivirusene godt og deretter aliquot (f.eks. 100 μL/ rør). Oppbevares ved -80 °C.
- Lentiviral titrering
MERK: Udødeliggjorte mus embryonale fibroblaster (MEFs) som uttrykker en loxP-flankert allele av grønt fluorescerende protein (GFP) brukes i denne protokollen for kvantifisering av viral titer. Imidlertid bør enhver cellelinje med en loxP-GFP allele være egnet for dette trinnet.- Kulturceller som uttrykker en loxP-flankert allele av GFP med DMEM, 10% FBS og 1% penn / strep ved 37 ° C, 5% CO2.
- Plate 2 x 105 celler i to 50 mm brønner av en 6-brønns plate.
MERK: Cellene i den ene brønnen vil bli brukt til lentiviral infeksjon, mens den andre vil bli brukt som en negativ kontroll. - Neste dag fyller cellene med 2 ml DMEM, 10 % FBS og 1 % penn/strep 2 t før lentiviral infeksjon.
- Tilsett 20 μL av CA2Cre-shp53 lentivirus (volumet kan variere når det trengs) i lentiviral infeksjon godt.
- Etter 3 dager i kulturen bestemmer du frekvensen av cre-induserte GFP-positive celler ved flytcytometri, som vist i figur 1. Vask celler med fosfatbufret saltvann (PBS), løsne ved trypsinisering og samle celler ved sentrifugering ved 112 x g.
- Vask cellene to ganger med PBS. Til slutt, suspendere cellene i 100 μL PBS. Bestem prosentandelen av GFP positive celler med en celleanalysator (Materialtabell).
- Beregn lentivirus smittsom/funksjonell titer ved hjelp av følgende formel:
der F er frekvensen av GFP-positive celler og beregnet ved å trekke frekvensen av GFP-positive celler etter infeksjon (Fi) fra frekvensen av GFP-positive celler (bakgrunn) før infeksjon (Fc) som vist i figur 1 (F = Fi-Fc), cn er antall belagte celler (2 x 105),V er volumet av inoculum (ml), og DF er virusfortynningsfaktoren.
MERK: Den smittsomme/funksjonelle konsentrasjonen = ~2 x 106 TU/ml.
2. Intratracheal intubasjon av lentivirus hos LSL-KRASG12D-mus
MERK: Metoden for intratracheal intubasjon ble brukt som beskrevet i den publiserte protokollen av Vandivort et al.9. I denne protokollen brukes mus LSL-KRASG12D-mus i C57BL/6-bakgrunn i alderen 6–8 uker. Et hjemmelaget arbeidsprosedyrebord brukes som beskrevet i Vandivort et al.9. Brettet er plassert foran eksperimentereren i et praktisk arbeidsområde (ca. 1 m2).
- Forbered et spirometer ved å fjerne stempelet på en 1 ml sprøyte og legge 60 μL PBS inn i sprøyten.
- Fest en 22 G kateterspiss inn i sprøyten og sett til side.
- Bedøve musene ved intraperitoneal injeksjon av en 1 μL/g mus kroppsvekt av ketamin (50 mg/ml)/xylazin (5 mg/ml)/acepromazine (1 mg/ml) cocktail. Sørg for riktig sedasjon av musen med lav respirasjonshastighet (1 pust hver 2 s).
- Aspirer 20 μL CA2Cre-shp53 lentivirus i en pipettor og sett til side.
- Plasser den bedøvede musen på arbeidsprosedyrekortet ved å hekte de øvre fortennerne i tråden på brettet.
MERK: Musens dorsum skal være flat mot plattformen. - Tape den caudale delen av thorax hulrommet til plattformen for å sikre justering av musen under prosedyren.
- Juster en gåshalsilluminator mellom 80-100% intensitet og plasser lyset 1-2 cm fra hudoverflaten.
- Fra bak plattformen, trekk tungen ut av munnhulen av musen ved hjelp av sterile tang.
- Mens du fester tungen, sett inn en depressor i munnhulen i musen og slipp deretter tungen.
- Plasser gooseneck på hovedstammen bronki for å belyse luftrøret.
MERK: Luftrøret kan være synlig gjennom respirasjonshandling, noe som forårsaker svingninger i lyset. - Når luftrøret er tydelig sett, setter du spirometeret forberedt (sprøyte med PBS og kateter) inn i trakealbanen.
- Fjern depressoren og observere økningen og fallet av PBS i sprøyten med hvert åndedrag.
MERK: Dette er en indikator på at kateteret er riktig plassert i luftrøret. - Fjern sprøyten som inneholder PBS mens du holder kateteret inne i luftrøret som forrige posisjon.
- Deponer 20 μL CA2Cre-shp53 lentivirus i midten av kateteret.
- Mens kateteret oppbevarer, injiser 300 μL luft i kateteret ved hjelp av en tom sprøyte for å sikre riktig fordeling av lentivirus i lungene.
- Hold kateteret på plass og sett spirometeret inn i kateteret igjen.
MERK: Økningen og fallet i PBS-boblen vil sikre at prosedyren er vellykket. - Fjern kateteret og tapen. Plasser dyret på et varmt og tørt sted til det er gjenopplivet.
3. Ultralydavbildning av lungesvulster hos mus
MERK: Ultralydavbildning ble utført etter 7 og 18 uker med lentiviral intubasjon ved hjelp av systemet som er oppført i Materialbordet; Imidlertid kan enhver modell brukes til analysen.
- En dag før bildebehandling, fjern pels fra brystområdet til den intuberte musen.
MERK: Musen skal bedøves i løpet av dette trinnet ved å plassere dem i et induksjonskammer på 3% isofluran e og 2L / minutt O2. - På bildedagen konfigurerer du arbeidsområdet som vist i figur 2. Slå på varmepumpen for ultralydgel og temperaturmåleren.
- Sett opp en varm 33 °C inkubator for å plassere musene i etteravbildning.
- Plasser den tredimensjonale (3D) motoren (figur 2F) på det integrerte skinnesystemet.
- Kontroller at 3D-motoren og svingermonteringssystemet er godt på plass.
- Koble til en foretrukket svinger (frekvens: 40 MHz; Figur 2E og materialtabell) for tumormålinger vinkelrett på 3D-motoren.
- Start en ny studie på ultralydprogramvaren.
- Velg Studer nettleser ( Study Browser) ( Study Browser ) ( Study Browser ) ( Study Browser ) ( Study Browser ) ( Study Browser ) ( Study Browser ) ( Study Browser ) ( Study Browser ) ( Study Browser ) (
- Velg Ny studie, et nytt vindu vil vises som gjør det mulig å legge til et studienavn i tillegg til ytterligere informasjon om studien, dvs.
- Fyll ut informasjonen i Serienavn, det vil si Animal ID, Stamme, Vekt, Fødselsdato, etc.
- Velg Ferdig, programmet endres for B-modus.
- Sett en varmelampe i en praktisk posisjon over dyreplattformen.
- Plasser musen i induksjonskammeret (3,5% isofluran).
MERK: Riktig beøvelse bekreftes av bevisstløshet av musen, og langsommere respirasjonshastighet på rundt 1 pust per 2 sekunder. - Når musen er bedøvet, endre forbindelsen av bedøvelsemaskinen som skal rettes mot dyreplattformen, redusere isoflurane til 2,5%.
- Plasser musen på dyreplattformen i decubitus ventral, med munnhulen rettet mot bedøvelsesrøret.
- Påfør smøremiddel på musens øyne.
- Plasser musen i decubitus dorsal og tape hendene og føttene godt på dyreplattformen.
- Påfør et lite lag ultralydgel på musebrystet.
- Senk anskaffelsessonden ved hjelp av høydekontrollknappen for å berøre overflaten av musebrystet. Plasser sonden slik at musens hjerte er omtrent sentrert.
- Bruk mikroknottene til å skaffe bilder av hele brystet, fra begge ekstremiteter, i tverrgående orientering ideelt sett samle 500 rammer per mus (antall rammer kan variere avhengig av personlig valg).
- Når bildebehandling er ferdig, fjern gelen fra musens bryst og plasser musen i den varme inkubatoren.
4. 2D-analyse av ultralydbilder
- Etter å ha åpnet ervervede rammer på ultralydprogramvaren, kan du skanne rammene for svulster.
- For små initierende svulster, telle antall B-linjer med jevne mellomrom hver 10 rammer for hele lengden av de 500 rammene som er anskaffet.
Derfor telles B-linjer i totalt 50 bilder, hvert bilde er atskilt med 10 bilder. B-linjer er preget av langsgående hvite rette linjer som krysser skjermen fullt ut. - For 2D-målinger av store svulster, velg det lineære verktøyet og mål bredden og lengden på svulsten som er tilstede.
- Hvis du vil beregne volumet av svulstene, bruker du følgende formel:
hvor L og W er lengden og bredden på svulsten, henholdsvis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etter å ha fått en lentiviral smittsom titer på ~ 2 x 106 TU/ml (figur 1),ble Ca2Cre-shp53 lentivirus intratracheally injisert når LSL-KRAS G12D mus nådde en passende alder (6-8 uker)9. Ultralydavbildning ble utført etter 7 ukers infeksjon ved initiering av svulster (figur 3B). Imaging ble gjort på 7 uker for å inkludere de ulike typer forløper lesjoner som oppstår i LSL-KRASG12D musemodell, alt fra hyperplasi til adenom3 som vist i figur 4A etter 8 uker med infeksjon. Imaging tidligere enn 6 uker vil ikke sikre inkludering av adenomdannende svulster i analysen3. Disse forløperlesjonene visualiseres som B-linjer i ultralyd og kan telles av øyet siden de kan identifiseres som smale bjelker av hvitt lys vertikalt som krysser skjermen og er et resultat av en sterk refleksjon av ultralydbølge (Figur 3B)10. B-linjer representerer små svulster som er på overflaten av lungene; svulster som initieres i dypere strukturer i lungene, for eksempel nær luftrøret, vil ikke bli reflektert som B-linjer. Antall svulster som initieres på pleural overflaten kan kvantifiseres ved å telle B-linjene, siden de er for små for volummålinger. Vi kjøpte 500 rammer som strekker seg over hele lungeområdet i 5 mus. B-linjer ble talt hver 10 rammer; Dermed ble de talt i totalt 50 bilder per mus som strekker seg over hele 500 rammer som er anskaffet. Scatter-plottet i figur 3D viser summen av B-linjer som telles i hver 10-avbildning (100 rammer) for 5 mus. Antall B-linjer per mus summeres deretter for å inkludere B-linjer som finnes i hele lungeområdet. Gjennomsnittlig mengde B-linjer som representerer svulster hos de fem musene var 141,6 ± 41,52 (figur 3E). Figur 3A viser et ultralydbilde ervervet av en ikke-infisert muslunge, til sammenligning.
Ifølge Jackson et al.3, 16 uker etter intubasjon inkluderer adenom samt adenokarsinom, som er tumortyper av interesse for KRAS lungekreft. For å sikre inkludering av disse typer svulster ved analyse av volummålinger via ultralyd i vår modell, så vi lungene til mus ved 18 uker etter infeksjon. For å kvantifisere volumet av de store svulstene via ultralyd, brukte vi 2D-analyse på ultralydprogramvaren. Store svulster vises som dype kløfter som forstyrrer pleural overflaten som vist på bildet av figur 3C. Når en svulst oppdages, måler vi lengden (L) og bredden (W) av svulsten, ved hjelp av måleverktøyet til ultralydprogramvaren. Når den er oppnådd, brukes L og W i den konvensjonelle formelen som brukes til beregning av tumorvolum (protokolltrinn 4.4). Vi analyserte tumorvolumet på 10 mus, som vist i figur 3F, hvor antall svulster dannet i hver mus varierte fra 5 til 26 svulster. Volumene av alle svulster dannet per mus blir deretter oppsummert for å representere tumorvolumet per mus. For denne analysen antar vi at svulstene dannet i lungene til mus er epileptiske i form, og dermed anses bredden på svulsten som vinkelrett på bildeplanet. Relativ volumkvantifisering kan gjøres når lineær størrelse på svulster når 0,3 mm (enten lengde eller bredde). Etter å ha analysert lungeparenchyma av 10 mus, var gjennomsnittlig tumorvolum oppnådd 31,8 ± 6,61 mm3 (figur 3G). Hematoksylin og Eosin (H&E) farginganalyse på lungeseksjoner bekreftet dannelsen av store svulster ved 20 uker etter infeksjon (figur 4B) og bekreftet dannelse av adenom og adenokarsinom. Det bør bemerkes at etter hvert som tumorveksten utvikler seg, kan forskjellige svulster slå seg sammen for å danne store, som vist i figur 4B. Selv om ultralydprogramvaren tillater 3D-analyse av svulster, viste denne typen analyse seg vanskelig i vår modell, hovedsakelig på grunn av den høye dynamiske bevegelsen av de primære svulstene dannet som er i samsvar med lungeglidende (bevegelse av pleural linje med respirasjon) samt hjerteslag11. Vi begrunnet at 2D-analyse ville gi konsistens i relative tumorvolummålinger, spesielt når vi sammenligner lungetumorprogresjon mellom ulike grupper av mus.
Figur 1: Flow cytometrianalyse av MEFs med en GFP LoxP-allele. Representative flow cytometri bilder som viser hyppigheten av GFP-positive MEFs som ikke er infisert (Fc) (A) og infisert (Fi) med Ca2Cre-shp53 lentivirus (B). Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Arbeidsområde av integrert jernbanesystem av ultralydavbildning. (A) X-akse mikro-knott. (B) Y-akse mikro-knott. (C) Animal plattform. (D) Høydekontrollknotten på skannehodesonden. -Transduser. (F) 3D motor. (G) Varmelampe. (H) Bedøvelserør. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Representative ultralydbilder av muselungene før og etter lungetumorinduksjon. (A) Bilde av en ikke-infisert mus lunge seksjon. Røde piler peker på ribbeina (R) og den pleurale overflaten (PS) i lungene. (B) Bilde av en mus lunge 7 uker etter tumor induksjon ved intratracheal intubasjon av lentivirus. Piler indikerer B-linjer som reflekterer små svulster på lungeoverflaten. (C) Bilde av en mus lunge seksjon 18 uker etter tumor induksjon. Blå linjer indikerer målinger av lengden (L: mm) og bredde (W: mm) av svulsten vist. (D) Scatter plott som viser B-linje kvantifisering i 10 bilder som strekker seg over 500 bilder (hvert bilde er atskilt med 10 bilder). (E) Kvantifisering av relativ tumornummer i lungene ved 7 ukers etterinduksjon. (F) Scatter plot som viser det relative volumet av de forskjellige svulstene dannet i lungene på 10 mus ved 18 uker etter infeksjon. (G) Kvantifisering av lungetumorvolum hos mus (n = 10). Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Representativ H&E-farging av LSL-KRAS G12D lungeseksjoner. (A) Lungeseksjon ved 8 ukers etterinfeksjon ved 500 μm forstørrelse. Piler peker på forløperlesjoner dannet på dette tidspunktet, som gjenspeiles som B-linjer i ultralyd. Svarte piler peker på forstørrede lesjoner ved 60 μm. (B) Lungeseksjon ved 20 ukers etterinfeksjon ved 2 mm forstørrelse. Pilspisser av samme farge viser forskjellige svulster som har fusjonert sammen. Piler viser forstørrede svulster på 60 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi viser en metode som kan vurdere lungetumorvekst i cre-inducible LSL-KRAS G12D musemodell ved ultralyd. Denne metoden kan brukes til å evaluere effekten av farmakologiske hemmere på lungetumorvekst. Den kan også brukes til å sammenligne lungetumorvekst mellom mus med forskjellig genetisk bakgrunn. Ved hjelp av denne teknikken krever ikke spesialiserte beregningsferdigheter, er det imidlertid viktig å være systematisk i antall rammer som brukes til analyse for å tillate riktig sammenligning hvis metoden brukes til å sammenligne ulike grupper av mus.
Intratracheal intubasjon av ~ 2 x 106 TU / ml Ca2Cre-shp53 i LSL-KRAS G12D mus førte til dannelsen av forløperlesjoner etter 7 ukers infeksjon. Disse vises som langsgående hvite linjer på sonografiske bilder og kalles B-linjer (Figur 3B)12. Gjennomsnittlig antall B-linjer per mus var 141,6 ± 41,52 (figur 3E). Vi valgte å visualisere initierende svulster ved 7 uker etter infeksjon siden dette tidspunktet ville omfatte ulike typer forløperlesjoner; atypisk adenomatøs hyperplasi, epitelhyperplasi og adenom3. Dannelsen av forløperlesjoner på lungene ble verifisert av H&E-farging etter 8 uker med lentiviral infeksjon (figur 4A). Etter 18 uker med viral intubasjon er svulstene store nok til å tillate 2D-volummålinger i ultralydprogramvaren (Figur 3C). Analyse av ultralydbilder ble gjort på 18-ukers tidspunkt for å inkludere kvantifisering av velutviklet adenom og adenokarsinom3. Dannelsen av disse typer svulster ble bekreftet ved 20 ukers postinfeksjon ved H&E-fargingsanalyse(figur 4B). 3D-volummålinger er også mulig av ultralydprogramvaren, men krever høy kompetanse. Titre beskrevet i denne protokollen er optimal for dannelsen av lungesvulster som kan visualiseres riktig og kvantifiseres i 2D.
Andre bildeteknikker kan også brukes til å overvåke lungetumorvekst hos mus, som CT-avbildning og BLI13. Ct-avbildning krever imidlertid å levere en strålingsdose til svulsten, noe som kan påvirke tumorveksten ved gjentatte analyser13. Videre krever det bruk av kontrastmidler for nøyaktige tumormålinger13. BLI er en viktig bildeteknikk som ofte brukes til å kvantifisere tumorspredning; Imidlertid er dens viktigste begrensning dens avhengighet av metabolske aktiviteter og tilstedeværelsen av ATP og O213. Fordelen med ultralydavbildning ligger i at den er en ikke-invasiv, ikke-bestråling, rask og rimelig teknikk for å skaffe bilder av lungeparenchyma13. Ultralyd har tidligere blitt brukt til å overvåke veksten av ortotopiske menneskelige svulster xenografted i lunge og bukspyttkjertel av mus13,14. Raes et al. har vært vellykket i langsgående overvåking veksten av en enkelt menneskelig lungesvulst implantert nær bakre diafragmisk overflate hos mus via ultralyd13. Forskjellen i LSL-KRAS G12D musemodellen har spontan utvikling av lungesvulster som kan overvåkes fra initiering til progresjon, og denne utviklingen kan sammenlignes mellom musgrupper. Det er også mange svulster som utvikles på lungen til LSL-KRAS G12D musemodell, som til slutt vokser, og kan til og med fusjonere sammen for å danne store svulster (Figur 4B). Dette oppfordret behovet for å bruke en metode som kan overvåke lungetumorinitiering og progresjon i denne musemodellen. Vi optimaliserte 2D lysstyrke (B) modusanalyse for å tillate kvantitativ vurdering av lungesvulster utviklet i denne musemodellen.
En mulig begrensning med ultralydavbildning er tilstedeværelsen av falske positiver15. Disse er sett når en svært reflekterende overflate er til stede (membran eller lever) som avbryter banen til strålen og kan skape et virtuelt objekt som etterligner et sant objekt15. Slike bilder kan være falske svulster, men kan omgås ved riktig undersøkelse; en stor svulst er vanligvis dynamisk, mens et virtuelt objekt ville være statisk.
Ultralydavbildning for LSL-KRAS-musemodellen er ideell på grunn av den ikke-invasive karakteren av denne teknikken. Metoden for analyse som brukes i laboratoriet vårt for å overvåke lungetumorprogresjon i LSL-KRAS-musemodellen er rask og brukervennlig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Dr. I. Verma for den lentivirale Ca2Cre-shp53 vektoren. Arbeidet ble støttet av midler fra Canadian Institutes of Health Research (CIHR MOP 137113) til AEK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 μm Acrodisc Syringe Filters | Pall Corporation | PN 4614 | |
| 100-mm Cell Cultre Plate | CELLSTAR | 664 160 | |
| 6-well Cell Culture Plate | CELLSTAR | 657 160 | |
| Amicon Ultra - 15 Centrifugal Filter Units | Merck Millipore Ltd. | UFC910024 | |
| BD LSR-Fortessa | BD Biosciences | 649225B 3024 | |
| CA2Cre-shp53 lentiviral vector | From Dr. I Verma Laboratory | ||
| DMEM | Multicell | 319-005-CL | |
| FBS | Multicell | 80450 | |
| LSL-KRASG12D mouse | JAX Mice | 8179 | |
| MX550S; Centre Transmit: 40 MHz | FUJIFILM VisualSonics | 51070 | |
| OptiMEM | gibco | 11058-021 | |
| Pen/strep | Multicell | 450-201-EL | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| PsPAX2 | Addgene | 12260 | |
| VEVO-3100 | FUJIFILM VisualSonics | 51072-50 |
References
- Eisenstein, M. Personalized medicine: Special treatment. Nature. 513, 8 (2014).
- Karachaliou, N., et al. KRAS mutations in lung cancer. Clinical Lung Cancer. 14 (3), 205-214 (2013).
- Jackson, E. L., et al. Analysis of lung tumor initiation and progression using conditional expression of oncogenic K-ras. Genes & Development. 15 (24), 3243-3248 (2001).
- DuPage, M., Dooley, A. L., Jacks, T. Conditional mouse lung cancer models using adenoviral or lentiviral delivery of Cre recombinase. Nature Protocol. 4 (7), 1064-1072 (2009).
- Chen, J., Lecuona, E., Briva, A., Welch, L. C., Sznajder, J. I. Carbonic anhydrase II and alveolar fluid reabsorption during hypercapnia. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 38 (1), 32-37 (2008).
- Xia, Y., et al. Reduced cell proliferation by IKK2 depletion in a mouse lung-cancer model. Nature Cell Biology. 17 (4), 532 (2015).
- Demi, L., et al. Determination of a potential quantitative measure of the state of the lung using lung ultrasound spectroscopy. Scientific Reports. 7, 12746 (2017).
- Mohanty, K., et al. Characterization of the Lung Parenchyma Using Ultrasound Multiple Scattering. Ultrasound in Medicine and Biology. 43, 993-1003 (2017).
- Vandivort, T. C., An, D., Parks, W. C. An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice. Journal of Visualized Experiments. (108), e53771 (2016).
- Saraogi, A. Lung ultrasound: Present and future. Lung India. 32 (3), 250-257 (2015).
- Gargani, L., Volpicelli, G. How I do it: lung ultrasound. Cardiovascular Ultrasound. 12, 25 (2014).
- Soldati, G., et al. On the Physical Basis of Pulmonary Sonographic Interstitial Syndrome. Journal of Ultrasound in Medicine. 35 (10), 2975 (2016).
- Raes, F., et al. High-Resolution Ultrasound and Photoacoustic Imaging of Orthotopic Lung Cancer in Mice: New Perspectives for Onco-Pharmacology. PLoS One. 11 (4), 15 (2016).
- Lakshman, M., Needles, A. Screening and quantification of the tumor microenvironment with micro-ultrasound and photoacoustic imaging. Nature Methods. 12 (4), 372 (2015).
- Chichra, A., Makaryus, M., Chaudhri, P., Narasimhan, M. Ultrasound for the Pulmonary Consultant. Clinical Medicine Insights: Circulatory Respiratory and Pulmonary Medicine. 10, 9 (2016).
