Summary
Este protocolo descreve as medidas tomadas para induzir tumores pulmonares KRAS em camundongos, bem como a quantificação de tumores formados por ultrassom. Pequenos tumores são visualizados nos primeiros tempos como linhas B. Em momentos posteriores, as medidas relativas do volume tumoral são alcançadas pela ferramenta de medição no software de ultrassom.
Abstract
Com ~1,6 milhão de vítimas por ano, o câncer de pulmão contribui tremendamente para a carga mundial do câncer. O câncer de pulmão é parcialmente impulsionado por alterações genéticas em oncogenes como o oncogene KRAS, que constitui ~25% dos casos de câncer de pulmão. A dificuldade em mirar terapêuticamente o câncer de pulmão orientado pelo KRAS em parte decorre de ter modelos ruins que podem imitar a progressão da doença em laboratório. Descrevemos um método que permite a quantificação relativa dos tumores pulmonares KRAS primários em um modelo de rato LSL-KRAS G12D cre-induável através de imagens de ultrassom. Este método depende da aquisição do modo de brilho (B) do parenchyma pulmonar. Os tumores que são inicialmente formados neste modelo são visualizados como linhas B e podem ser quantificados contando o número de linhas B presentes nas imagens adquiridas. Estes representariam o número relativo do tumor formado na superfície do pulmão do rato. À medida que os tumores formados se desenvolvem com o tempo, eles são percebidos como fendas profundas dentro do parenchyma pulmonar. Uma vez que a circunferência do tumor formado é bem definida, calcular o volume relativo do tumor é alcançado medindo o comprimento e largura do tumor e aplicando-os na fórmula utilizada para medições de caliper tumoral. A imagem de ultrassom é uma técnica não invasiva, rápida e fácil de usar que é frequentemente usada para quantificações tumorais em camundongos. Embora os artefatos possam aparecer ao obter imagens de ultrassom, mostrou-se que essa técnica de imagem é mais vantajosa para quantificações tumorais em camundongos em comparação com outras técnicas de imagem, como imagens de tomografia computadorizada (TC) e imagem de bioluminescência (BLI). Os pesquisadores podem investigar novos alvos terapêuticos usando essa técnica comparando a iniciação do tumor pulmonar e a progressão entre diferentes grupos de camundongos.
Introduction
Como a principal causa de mortes relacionadas ao câncer em todo o mundo, o câncer de pulmão permanece refratário aos tratamentos, principalmente pela falta de modelos pré-clínicos relevantes que possam recapitular a doença no laboratório1. Cerca de 25% dos casos de câncer de pulmão são devido a mutações no oncogene KRAS2. O câncer de pulmão orientado por KRAS está frequentemente associado ao mau prognóstico e baixa resposta à terapia, destacando a importância de estudos adicionais nesta doença2.
Otimizamos um método que permite a avaliação relativa do crescimento do tumor pulmonar em tempo real em camundongos imunes induzidos pelo câncer de pulmão do KRAS. Usamos ratos Lox-Stop-Lox KRAS G12D (LSL-KRAS G12D) nos quais o oncogene KRAS G12D pode ser expresso pelos vetores cre lentiviral3,4. Esses vetores são impulsionados pela anidrise carbônica 2, permitindo que a infecção viral ocorra especificamente nas células epiteliais aveolar5. Além disso, para acelerar a iniciação e progressão de tumores pulmonares, a construção lentiviral também expressa P53 shRNA de um promotor U6/H1 (a construção lentiviral aqui será referida como Ca2Cre-shp53)6. A relevância biológica desse método está no curso natural do desenvolvimento de tumores pulmonares em camundongos em oposição a xenôenxetos de tumores não ortotópicos em camundongos. Um obstáculo usando o método ortotópico é monitorar o crescimento do tumor pulmonar sem sacrificar o camundongo. Para superar essa limitação, otimizamos a ultrassom para permitir a análise da progressão do tumor pulmonar no modo bidimensional (2D) neste modelo de camundongo. A imitência de tumores a 7 semanas após a infecção se reflete como linhas B em imagens de ultrassom, que podem ser contadas, mas não refletirão o número exato de tumores presentes no pulmão. As linhas B são caracterizadas por linhas brancas verticais semelhantes a laser decorrentes da linha pleural na parenchymapulmonar 7,8. Tumores grandes podem ser visualizados após 18 semanas de infecção. O volume relativo desses tumores é quantificado por medidas 2D feitas no ultrassom.
Este método é ótimo para pesquisadores que investigam o efeito de drogas farmacológicas no crescimento do tumor pulmonar no modelo de camundongos LSL-KRAS G12D. Além disso, a progressão do tumor pulmonar pode ser comparada entre camundongos com diferentes linhagens genéticas, para examinar a importância da presença ou ausência de certos genes/proteínas no desenvolvimento do volume de tumores pulmonares.
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Protocol
Os estudos em animais foram realizados de acordo com o Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade McGill e os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Bem-Estar Animal da Universidade McGill (protocolo de uso animal nº 2009-5754).
1. Geração de CA2Cre-shp53 Titre Lentiviral
NOTA: O seguinte protocolo é o mesmo descrito em Xia et al.6,com pequenas modificações.
- Preparação do lentivírus (para pratos de 15 cm x 10 cm)
- No dia 1, as células HEK293T saudáveis (7,5 x 106 células por prato de 10 cm) com 10 mL do meio eagle modificado de Dulbecco) (DMEM), 10% de soro bovino fetal (FBS) e 1% de caneta/estrep. Cultura em uma incubadora de 37 °C, 5% CO2.
- Prepare a mistura para transfecção de cálcio-fosfato (mistura para 15 pratos). Prepare tubo A contendo 225 μg (15 μg/placa) do vetor lentiviral (Ca2Cre-shp53), 75 μg (5 μg/placa) de plasmídeo PsPAX2 (contendo mordaça HIV-1 e genes HIV-1 pol), 75 μg (5 μg/placa) de pMD2.G plasmid (contendo gene VSV-G) para embalagem, embalagem, plasmídeo pMD2.G (contendo gene VSV-G) para embalagem, embalagem, plasmídeo pMD2.G (contendo gene VSV-G) para embalagem, embalagem, uma concentração final de 0,15 M de CaCl2 e encha o tubo com H2O destilado até 3,75 mL. Prepare o tubo B contendo 3,75 mL de salino tampão de 2x HEPES (HBS; 50 mM HEPES, pH 7.05, 280 mM NaCl, 10 mM KCl, 1,5 mM Na2HPO4·2H2O e 12 mM D-dextrose).
- Tubo de vórtice A e adicioná-lo em sentido de gota para tubo B vórtice contínua.
NOTA: O volume total será de 7,5 mL. - Incubar à temperatura ambiente no escuro por 20-30 min.
- Aproximadamente 9 h após o revestimento das células, adicione 500 μL da mistura de transfecção em sentido para o meio celular (7,5 mL/15 pratos: 0,5 mL por prato).
- Gire suavemente cada prato para misturar, e incubar todos os pratos a 37 °C, 5% CO2.
- No dia 2, 12-18 h após a transfecção, substitua a mídia por 10 mL de mídia de soro reduzido soro(Tabela de Materiais)sem antibióticos por prato de 10 cm. Coloque os pratos de volta na incubadora 37 °C, 5% CO2.
- No dia 3, colete a mídia contendo lentivírus expressando Ca2Cre-shp53 e filtrar através de filtros de 0,45 μm. Reponha a mídia com novos meios de comunicação de soro reduzidos sem antibióticos.
NOTA: Os meios arrecadados podem ser mantidos a 4 °C por no mais de 3 dias. - No dia 4, colete, pela segunda vez, a mídia contendo o lentivírus e o filtro através de um filtro de 0,45 μm. Mantenha-se a 4 °C (por no mais de 3 dias).
- Combine os supernatantes do vírus das etapas 1.1.8 e 1.1.9. Concentre-os através de unidades de filtro centrífugas (Tabela de Materiais) por centrifuging a 1.372 x g por 30 min a 4 °C. Repita o processo até que todos os meios de comunicação coletados passem pelas colunas.
NOTA: Após cada centrífuga, 100-200 μL de filtragem concentrada podem ser colhidos. - Colete e misture os filtrados concentrados em um tubo gelado de 15 mL. Misture bem as lentivírus concentradas e, em seguida, aliquot (por exemplo, 100 μL/tubo). Loja a -80 °C.
- Titulação lentiviral
NOTA: Fibroblastos embrionários de camundongos imortalizados (MEFs) expressando uma alelo ladeada de proteína fluorescente verde (GFP) são usados neste protocolo para a quantificação do titer viral. No entanto, qualquer linha celular com um loxP-GFP allele deve ser adequada para esta etapa.- Células culturais expressando um loxP-lacrado de GFP com DMEM, 10% FBS e 1% caneta/estreptococo a 37 °C, 5% CO2.
- Placa 2 x 105 células em dois poços de 50 mm de uma placa de 6 poços.
NOTA: As células de um poço serão usadas para infecção lentiviral, enquanto a do outro será usada como controle negativo. - No dia seguinte, reponha as células com 2 mL de DMEM, 10% FBS e 1% de caneta/estreptococos 2 h antes da infecção lentiviral.
- Adicione 20 μL do micivírus CA2Cre-shp53 (o volume pode variar quando necessário) no poço da infecção lentiviral.
- Após 3 dias na cultura, determine a frequência das células GFP-positivas induzidas pelo Cre por citometria de fluxo, como mostrado na Figura 1. Lave células com soro lona -pbs tampão de fosfato (PBS), desapegue-se por trippsinização e colete células por centrífuga em 112 x g.
- Lave as células duas vezes com PBS. Por fim, suspenda as células em 100 μL de PBS. Determine o percentual de células gfp positivas por um analisador de células (Tabela de Materiais).
- Calcule o titer infeccioso/funcional do lentivírus usando a seguinte fórmula:
onde F é a frequência de células GFP-positivas e calculada subtraindo a frequência de células GFP -positivas após a infecção (Fi) a partir da frequência de células gfp-positivas (fundo) antes da infecção (Fc) como mostrado na Figura 1 (F = Fi-Fc), cn é o número de células emplacadas (2 x 105),V é o volume do inoculum (mL), e DF é o fator de diluição do vírus.
NOTA: A concentração infecciosa/funcional = ~2 x 106 TU/mL.
2. Intubação Intratracal de Lentivírus em camundongos LSL-KRASG12D
NOTA: O método de intubação intratracal foi utilizado conforme descrito no protocolo publicado por Vandivort et al.9. Neste protocolo, camundongos camundongos LSL-KRASG12D em fundo C57BL/6 são usados aos 6 e 8 semanas de idade. Um quadro de procedimentos de trabalho caseiro é usado como descrito em Vandivort et al.9. A placa está posicionada na frente do experimentador em um espaço de trabalho conveniente (aproximadamente 1 m2).
- Prepare um espipirômetro removendo o êmbolo de uma seringa de 1 mL e carregando 60 μL de PBS na seringa.
- Coloque uma ponta de cateter de 22 G na seringa e reserve.
- Anestesiados os camundongos por injeção intraperitoneal de um coquetel de 1 μL/g de peso corporal do camundongo de cetamina (50 mg/mL)/xiylazine (5 mg/mL)/acepromazina (1 mg/mL). Certifique-se adequada do camundongo por uma baixa taxa respiratória (1 hálito a cada 2 s).
- Aspirar 20 μL de lentivírus CA2Cre-shp53 em um pipettor e reserve.
- Posicione o mouse sedado na placa de procedimento de trabalho, fisando seus incisivos superiores no fio da placa.
NOTA: O dorsum do mouse deve ser plano contra a plataforma. - Afina a parte caudal da cavidade torácica à plataforma para garantir o alinhamento do mouse durante o procedimento.
- Ajuste um iluminador de pescoço de ganso entre 80-100% de intensidade e coloque a luz de 1-2 cm da superfície da pele.
- De trás da plataforma, tire a língua da cavidade oral do mouse usando fórceps estéreis.
- Ao proteger a língua, insira um depressor na cavidade oral do rato e solte a língua.
- Posicione o pescoço de ganso no brônquio de haste principal para iluminar a traqueia.
NOTA: A traqueia pode ser visível através da ação de respiração, causando flutuação da luz. - Quando a traqueia é claramente vista, insira o espirômetro preparado (seringa com PBS e cateter) no caminho traqueal.
- Retire o depressor e observe o aumento e queda de PBS na seringa a cada respiração.
NOTA: Este é um indicador de que o cateter está devidamente posicionado na traqueia. - Remova a seringa contendo PBS mantendo o cateter dentro da traqueia como a posição anterior.
- Deposite o lentivírus CA2Cre-shp53 de 20 μL no centro do cateter.
- Mantendo o cateter no lugar, injete 300 μL de ar no cateter usando uma seringa vazia para garantir a distribuição adequada do lentivírus nos pulmões.
- Mantenha o cateter no lugar e reinsira o espirômetro no cateter.
NOTA: A elevação e queda da bolha pbs garantirá que o procedimento seja bem sucedido. - Remova o cateter e a fita. Coloque o animal em um lugar quente e seco até que ele seja revivido.
3. Ultrassom de Tumores Pulmonares em Camundongos
NOTA: A ultrassom foi realizada após 7 e 18 semanas de intubação lentiviral utilizando o sistema listado em Tabela de Materiais; no entanto, qualquer modelo pode ser usado para a análise.
- Um dia antes da imagem, remova a pele da área torácica do rato entubado.
NOTA: O mouse deve ser sedado durante esta etapa colocando-os em uma câmara de indução de 3% isoflurane e 2L/minuto O2. - No dia da imagem, configure o espaço de trabalho como mostrado na Figura 2. Ligue a bomba de aquecimento para gel de ultrassom e o monitor de temperatura.
- Configure uma incubadora quente de 33 °C para colocar os ratos em pós-imagem.
- Coloque o motor tridimensional (3D)(Figura 2F)no sistema ferroviário integrado.
- Certifique-se de que o motor 3D e o sistema de montagem transdutor estejam firmemente no lugar.
- Conecte um transdutor preferido (frequência: 40 MHz; Figura 2E e Tabela de Materiais) para medições tumorais perpendiculares para o motor 3D.
- Inicie um novo estudo sobre o software de ultrassom.
- Selecione O Navegador de Estudoe selecione novo na parte inferior da tela.
- Selecione Novo Estudo, uma nova janela aparecerá que permite a adição de um Nome de Estudo, além de mais informações sobre o estudo, ou seja, data de estudo, nome de pesquisador, etc.
- Preencha as informações em Nome da Série, ou seja, Animal ID, Strain, Peso, Data de Nascimento, etc.
- Select Done, o programa mudará para o modo B.
- Coloque uma lâmpada de aquecimento em uma posição conveniente acima da plataforma animal.
- Coloque o rato na câmara de indução (3,5% isoflurane).
NOTA: A anestesia adequada é confirmada pela inconsciência do camundongo e uma taxa respiratória mais lenta de cerca de 1 respiração por 2 segundos. - Quando o mouse está sedado, mude a conexão da máquina anestéstica para ser direcionada para a plataforma animal, reduza o isoflurano para 2,5%.
- Coloque o mouse na plataforma animal em ventral decubitus, com sua cavidade oral direcionada para o tubo de anestésicos.
- Aplique lubrificante nos olhos do rato.
- Coloque o mouse em dorsal dedecubíto e afina as mãos e os pés firmemente na plataforma animal.
- Aplique uma pequena camada de gel de ultrassom no peito do rato.
- Abaixe a sonda de aquisição usando o botão de controle de altura para tocar na superfície do peito do rato. Posicione a sonda de tal forma que o coração do rato é aproximadamente centrado.
- Use os microbotões para adquirir imagens de todo o peito, de ambas as extremidades, na orientação transversa idealmente reunindo 500 quadros por mouse (número de quadros pode variar dependendo da escolha pessoal).
- Uma vez feito a imagem, remova o gel do peito do mouse e coloque o mouse na incubadora quente.
Análise 2D de Imagens de Ultrassom
- Depois de abrir quadros adquiridos no software de ultrassom, escaneie os quadros para tumores.
- Para pequenos tumores iniciantes, conte o número de linhas B periodicamente a cada 10 quadros para o comprimento total dos 500 quadros adquiridos.
Portanto, as linhas B são contadas em um total de 50 imagens, cada imagem é separada por 10 quadros. As linhas B são caracterizadas por linhas retas brancas longitudinal que atravessam totalmente a tela. - Para medições 2D de tumores grandes, selecione a ferramenta linear e meça a largura e o comprimento do tumor presentes.
- Para calcular o volume dos tumores, use a seguinte fórmula:
onde L e W são o comprimento e largura do tumor, respectivamente.
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Representative Results
Depois de obter um díter infeccioso lentiviral de ~2 x 106 TU/mL (Figura 1),o lentivírus Ca2Cre-shp53 foi injetado intratrachealmente quando os ratos LSL-KRAS G12D atingiram uma idade apropriada (6-8 semanas)9. A ultrassonografia foi realizada após 7 semanas de infecção após o início dos tumores (Figura 3B). A imagem foi feita em 7 semanas para incluir os vários tipos de lesões precursoras que ocorrem no modelo de camundongoL-KRASG12D, que vão da hiperplasia ao adenoma3, como mostrado na Figura 4A após 8 semanas de infecção. A imagem antes de 6 semanas não garantirá a inclusão de tumores formadores de adenoma na análise3. Essas lesões precursoras são visualizadas como linhas B no ultrassom e podem ser contadas pelo olho, pois podem ser identificadas como feixes estreitos de luz branca atravessando verticalmente a tela e são resultado de um forte reflexo da onda de ultrassom (Figura 3B)10. Linhas B representam pequenos tumores que estão na superfície dos pulmões; tumores iniciados em estruturas mais profundas do pulmão, como perto da traqueia, não serão refletidos como linhas B. O número de tumores iniciados na superfície pleural pode ser quantificado contando as linhas B, uma vez que são muito pequenos para medições de volume. Adquirimos 500 quadros abrangendo toda a área pulmonar em 5 ratos. As linhas B eram contadas a cada 10 quadros; assim, foram contadas em um total de 50 imagens por rato que abrangem os 500 quadros adquiridos. O enredo de dispersão na Figura 3D mostra a soma das linhas B contadas em cada 10 imagens (100 quadros) para 5 ratos. O número de linhas B por mouse é então resumido para incluir linhas B presentes na área pulmonar completa. A quantidade média de linhas B representando tumores nos cinco camundongos foi de 141,6 ± 41,52 (Figura 3E). Figura 3A mostra uma imagem de ultrassom adquirida de um pulmão de rato não infectado, para comparação.
De acordo com Jackson et al.3, 16 semanas após a entubação inclui adenoma, bem como adenocarcinoma, que são tipos de tumores de interesse no câncer de pulmão KRAS. Para garantir a inclusão desses tipos de tumores ao analisar as medidas de volume via ultrassom em nosso modelo, imagens dos pulmões de camundongos com 18 semanas após a infecção. Para quantificar o volume dos grandes tumores via ultrassom, utilizou-se análise sem dP no software de ultrassom. Tumores grandes aparecem como fendas profundas interrompendo a superfície pleural como mostrado na imagem da Figura 3C. Quando um tumor é detectado, medimos o comprimento (L) e a largura (W) do tumor, utilizando a ferramenta de medição do software de ultrassom. Uma vez obtidos, L e W são aplicados na fórmula convencional usada para calcular o volume tumoral (etapa 4.4 do protocolo). Analisamos o volume tumoral de 10 camundongos, como mostrado na Figura 3F,onde o número de tumores formados em cada camundongo variou de 5 a 26 tumores. Os volumes de todos os tumores formados por camundongo são resumidos para representar o volume tumoral por camundongo. Para esta análise, assumimos que os tumores formados nos pulmões dos camundongos estão epilépticos em forma, portanto a largura do tumor é considerada como perpendicular ao plano de imagem. A quantificação relativa do volume pode ser feita quando o tamanho linear dos tumores atinge 0,3 mm (comprimento ou largura). Após analisar o parenchyma pulmonar de 10 camundongos, o volume médio de tumores obtidofoi de 31,8 ± 6,61 mm3 (Figura 3G). A análise de coloração de hematoxilina e eosina (H&E) em seções pulmonares confirmou a formação de tumores grandes em 20 semanas após a infecção (Figura 4B) e a formação confirmada de adenoma e adenocarcinoma. Deve-se notar que à medida que o crescimento do tumor progride, diferentes tumores podem se fundir para formar grandes, como mostra a Figura 4B. Embora o software de ultrassom permita a análise 3D de tumores, esse tipo de análise se mostrou difícil em nosso modelo, principalmente devido ao alto movimento dinâmico dos tumores primários formados que é consistente com o deslizamento pulmonar (movimento da linha pleural com respiração) bem como batidas cardíacas11. Nós argumentamos que a análise 2D forneceria consistência em medidas relativas do volume tumoral, especialmente quando comparamos a progressão do tumor pulmonar entre diferentes grupos de camundongos.
Figura 1: Análise de citometria de fluxo de MEFs com um GFP LoxP-ale. Imagens representativas de citometria de fluxo mostrando frequência de MEFs gfp-positivo que não estão infectados (Fc)(A)e infectados (Fi) com o lentivírus Ca2Cre-shp53(B). Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 2: Espaço de trabalho do sistema ferroviário integrado de ultrassom. (A)micro-botão de eixo X. (B)micro-botão do eixo Y. (C) Plataforma animal. (D) Botão de controle de altura da sonda de cabeça de varredura. (E)Transdutor. (F)motor 3D. (G)Lâmpada de aquecimento. (H)tubo de anestésicos. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 3: Imagens representativas de ultrassom de pulmões de camundongos antes e depois da indução do tumor pulmonar. (A)Imagem de uma seção pulmonar de rato não infectado. As setas vermelhas apontam para costelas (R) e a superfície pleural (PS) do pulmão. (B) Imagem de um pulmão de camundongos 7 semanas após a indução do tumor por intubação intratracal de lentivírus. Setas indicam linhas B refletindo pequenos tumores na superfície pulmonar. (C) Imagem de uma seção pulmonar de rato 18 semanas após a indução do tumor. Linhas azuis indicam medições do comprimento (L: mm) e largura (W: mm) do tumor mostrado. (D) Traçar dispersão mostrando quantificação da linha B em 10 imagens que abrangem 500 quadros (cada imagem é separada por 10 quadros). (E)Quantificação do número relativo de tumor escaneamento nos pulmões a 7 semanas após a indução. (F) Estique de dispersão mostrando o volume relativo dos diferentes tumores formados nos pulmões de 10 camundongos com 18 semanas após a infecção. (G) Quantificação do volume de tumor pulmonar em camundongos (n = 10). Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 4: A coloração representativa h&E das seções pulmonares LSL-KRAS G12D. (A) Seção pulmonar a 8 semanas após a infecção em 500 μm de ampliação. As setas apontam para lesões precursoras formadas neste ponto de tempo, que são refletidas como linhas B no ultrassom. As flechas pretas apontam para lesões ampliadas a 60 μm.(B) Seção pulmonar a 20 semanas após a infecção em ampliação de 2 mm. Pontas de flecha da mesma cor mostram tumores diferentes que se fundiram. As setas mostram tumores ampliados a 60 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Demonstramos um método que pode avaliar o crescimento do tumor pulmonar no modelo de camundongos LSL-KRAS G12D cre-indutor por ultrassom. Este método pode ser usado para avaliar o efeito dos inibidores farmacológicos no crescimento do tumor pulmonar. Também pode ser usado para comparar o crescimento do tumor pulmonar entre camundongos de diferentes origens genéticas. O uso dessa técnica não requer habilidades computacionais especializadas, no entanto, é importante ser sistemático no número de quadros utilizados para análise para permitir a comparação adequada se o método for usado para comparar diferentes grupos de camundongos.
A intubação intratracal de ~2 x 106 TU/mL Ca2Cre-shp53 em camundongos LSL-KRAS G12D levou à formação de lesões precursoras após 7 semanas de infecção. Estas aparecem como linhas brancas longitudinal em imagens sonográficas e são chamadas de linhas B (Figura 3B)12. O número médio de linhas B por mouse foi de 141,6 ± 41,52 (Figura 3E). Optamos por visualizar tumores iniciadores a 7 semanas após a infecção, uma vez que esse ponto de tempo incluiria vários tipos de lesões precursoras; hiperplasia adenomatosaatípica, hiperplasia epitelial e adenoma3. A formação de lesões precursoras no pulmão foi verificada pela coloração de H&E após 8 semanas de infecção lentiviral (Figura 4A). Após 18 semanas de intubação viral, os tumores são grandes o suficiente para permitir medições de volume 2D no software de ultrassom (Figura 3C). A análise das imagens de ultrassom foi feita no ponto de tempo de 18 semanas, a fim de incluir a quantificação de adenoma bem desenvolvido e adenocarcinoma3. A formação desses tipos de tumores foi confirmada em 20 semanas após a infecção pela análise de coloração de H&E (Figura 4B). As medições de volume 3D também são possíveis pelo software de ultrassom, mas requerem alto nível de experiência. O titre descrito neste protocolo é ideal para a formação de tumores pulmonares que podem ser devidamente visualizados e quantificados em 2D.
Outras técnicas de imagem também podem ser usadas para monitorar o crescimento do tumor pulmonar em camundongos, como a imagem de tomografia computadora e o BLI13. No entanto, a imagem de tomografia computadoré requer o parto de uma dose de radiação ao tumor, o que pode afetar o crescimento do tumor em relação a ensaios repetidos13. Além disso, requer o uso de agentes de contraste para medições tumorais precisas13. O BLI é uma técnica de imagem importante que muitas vezes é usada para quantificar a proliferação do tumor; no entanto, sua principal limitação é sua dependência das atividades metabólicas e a presença de ATP e O213. A vantagem da imagem de ultrassom reside em ser uma técnica não invasiva, não irradiada, rápida e barata para adquirir imagens do parenchyma pulmonar13. O ultrassom já foi usado anteriormente para monitorar o crescimento de tumores humanos ortotópicos xenoenxertos no pulmão e pâncreas de camundongos13,14. Raes et al. foram bem sucedidos no monitoramento longitudinalmente do crescimento de um único tumor pulmonar humano implantado perto da superfície diafragmia posterior em camundongos via ultrassom13. A diferença no modelo de camundongol-KRAS G12D é ter desenvolvimento espontâneo de tumores pulmonares que podem ser monitorados desde a iniciação até a progressão e esse desenvolvimento pode ser comparado entre grupos de camundongos. Além disso, há inúmeros tumores sendo desenvolvidos no pulmão do modelo de camundongoL-KRAS G12D, que eventualmente crescem, e podem até se fundir para formar grandes tumores(Figura 4B). Isso instou a necessidade de usar um método que possa monitorar a iniciação e a progressão do tumor pulmonar neste modelo de camundongos. Otimizamos a análise do modo de brilho 2D (B) para permitir a avaliação quantitativa dos tumores pulmonares desenvolvidos neste modelo de camundongos.
Uma possível limitação com a imagem de ultrassom é a presença de falsos positivos15. Estes são vistos quando uma superfície altamente reflexiva está presente (diafragma ou fígado) que interrompe a trajetória do feixe e pode criar um objeto virtual imitando um objeto verdadeiro15. Tais imagens podem ser tumores falsos, mas podem ser contornadas no exame adequado; um tumor grande é geralmente dinâmico, enquanto um objeto virtual seria estático.
A imagem de ultrassom para o modelo de mouse LSL-KRAS é ideal devido à natureza não invasiva desta técnica. O método de análise usado em nosso laboratório para monitorar a progressão do tumor pulmonar no modelo de mouse LSL-KRAS é rápido e amigável ao usuário.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos ao Dr. I. Verma pelo vetor lentiviral Ca2Cre-shp53. O trabalho foi apoiado por fundos dos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (CIHR MOP 137113) para a AEK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 μm Acrodisc Syringe Filters | Pall Corporation | PN 4614 | |
| 100-mm Cell Cultre Plate | CELLSTAR | 664 160 | |
| 6-well Cell Culture Plate | CELLSTAR | 657 160 | |
| Amicon Ultra - 15 Centrifugal Filter Units | Merck Millipore Ltd. | UFC910024 | |
| BD LSR-Fortessa | BD Biosciences | 649225B 3024 | |
| CA2Cre-shp53 lentiviral vector | From Dr. I Verma Laboratory | ||
| DMEM | Multicell | 319-005-CL | |
| FBS | Multicell | 80450 | |
| LSL-KRASG12D mouse | JAX Mice | 8179 | |
| MX550S; Centre Transmit: 40 MHz | FUJIFILM VisualSonics | 51070 | |
| OptiMEM | gibco | 11058-021 | |
| Pen/strep | Multicell | 450-201-EL | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| PsPAX2 | Addgene | 12260 | |
| VEVO-3100 | FUJIFILM VisualSonics | 51072-50 |
References
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