Summary
Die axtische Kultivierung auf Der Bench-Skala erleichtert die Mikroalgencharakterisierung und Produktivitätsoptimierung vor dem anschließenden Prozessskalieren. Photobioreaktoren bieten die notwendige Kontrolle für zuverlässige und reproduzierbare Mikroalgenexperimente und können angepasst werden, um Mikroalgen mit den korrosiven Gasen(CO2, SO2, NO2) aus kommunalen oder industriellen Verbrennungsemissionen sicher zu kultivieren.
Abstract
Photobioreaktoren sind beleuchtete Kultivierungssysteme für Experimente an phototrophen Mikroorganismen. Diese Systeme bieten eine sterile Umgebung für den Mikroalgenanbau mit Temperatur-, pH-Wert- und Gaszusammensetzung und Durchflussregelung. Auf der Bank-Skala sind Photobioreaktoren von Vorteil für Forscher, die Mikroalgeneigenschaften, Produktivität und Wachstumsoptimierung untersuchen. In industriellen Maßstäben können Photobioreaktoren die Produktreinheit erhalten und die Produktionseffizienz verbessern. Das Video beschreibt die Vorbereitung und Verwendung eines Photobioreaktors im Bench-Skala für den Mikroalgenanbau, einschließlich der sicheren Verwendung von korrosiven Gaseinträgen, und beschreibt relevante Biomassemessungen und Biomasseproduktivitätsberechnungen. Das Video zeigt insbesondere die Lagerung und Vorbereitung der Mikroalgenkultur für die Impfung, photobioreaktormontage und -sterilisation, Messungen der Biomassekonzentration und ein logistisches Modell für die Produktivität von Mikroalgenbiomasse mit Berechnungen einschließlich maximaler und gesamter Biomasse-Produktivitäten. Da das Interesse an Experimenten zur Kultivierung von Mikroalgen mit simulierten oder realen Abgasemissionen wächst, wird das Video außerdem die Anpassungen der Photobioreaktor-Ausrüstung abdecken, die für die Arbeit mit korrosiven Gasen erforderlich sind, und die sichere Probenahme in solche Szenarien.
Introduction
Photobioreaktoren eignen sich für kontrollierte Experimente und den Anbau von reineren Mikroalgenprodukten, als dies durch offene Teiche erreicht werden kann. Der Mikroalgenanbau in Photobioreaktoren im Bankmaßstab unterstützt die Entwicklung von Grundkenntnissen, die für die Prozessskalierung verwendet werden können. Leichte Veränderungen der Umweltbedingungen können mikrobiologische Experimente erheblich verändern und die Ergebnisse verwirren1. Ein steriler Prozess mit Temperatur-, pH- und Gasspar-Kontrolle ist vorteilhaft für die Untersuchung von Mikroalgeneigenschaften und -leistung unter unterschiedlichen Bedingungen. Darüber hinaus kann die Kontrolle der Eingangsgaskonzentrationen, der Temperatur, der Scherkraft durch Mischen und des mittleren pH-Werts verschiedene Arten unterstützen, die ansonsten schwierig zu kultivieren sind. Photobioreaktoren können als Chargenprozess mit kontinuierlicher Gaszuführung und Sparging oder als Chemostat-Durchflusssystem mit kontinuierlicher Gaszuführung und Sparging sowie in- und abwasserbasierten Nährstoffeinträgen betrieben werden. Hier zeigen wir den Chargenprozess mit kontinuierlicher Gaszuführung und Sparging.
Der Einsatz von Photobioreaktoren bewältigt mehrere Herausforderungen beim Anbau und der Produktion von Mikroalgen. Das Feld kämpft in der Regel mit Bedenken der Kontamination durch andere Mikroorganismen, einer effizienten Substratnutzung (die besonders bei DERCO2-Minderung oder Abwasserbehandlung wichtig ist)2, pH-Kontrolle, Beleuchtungsvariabilität und Biomasseproduktivität3. Photobioreaktoren ermöglichen es Forschern, eine breite Palette von Phototrophen in eng kontrollierten Batch-Systemen zu untersuchen, in denen selbst langsam wachsende Arten vor Raubtieren oder konkurrierenden Mikroorganismen geschützt sind4. Diese Chargensysteme sind auch besser geeignet, höhereCO2-Nutzungsraten und Biomasseproduktivität zu ermöglichen, da es sich um geschlossene Systeme handelt, die eher im Gleichgewicht mit den gelieferten Gasen stehen. Die Photobioreaktor-Technologie bietet auch eine pH-Kontrolle, deren Fehlen in früheren Studien eine hohe Biomasseproduktivität behindert hat5. Auf der Bankskala ist das Kontrollniveau der Photobioreaktoren für die Forscher von Vorteil. In größeren industriellen Maßstäben können Photobioreaktoren verwendet werden, um die Reinheit kommerzieller Bioprodukte aufrechtzuerhalten und die Produktionseffizienz für nutrazeutische, kosmetische, Lebens- oder Futtermittelanwendungen zu verbessern6.
Mikroalgen sind von großem Interesse für die Biosequestrierung vonCO2, da sieCO2 schnell als Biomassekohlenstoff fixieren können. Die meisten anthropogenenCO2-Quellen sind jedoch je nach Brennstoffquelle des Verbrennungsprozesses mit anderen korrosiven und toxischen Gasen oder Verunreinigungen (NOx, SOx, CO, Hg) kontaminiert. Das wachsende Interesse an einer nachhaltigen CO2-Sequestrierung hat die Entwicklung von Photobioreaktor-Technologien zur Behandlung vonCO2-reichenEmissionen, wie z. B. aus Kohlekraftwerken, ausgelöst (Tabelle 1). Leider besteht die Gefahr einer Exposition von Mensch und Umwelt gegenüber den korrosiven und toxischen Verunreinigungen während der Forschungs- und Scale-up-Prozesse. Daher ist die Beschreibung der sicheren Montage und des Betriebs von Bioreaktoren mit korrosiven Gasen notwendig und lehrreich.
Diese Methode dient für den Einsatz eines 2 L-Bench-Scale-Photobioreaktors für das Wachstum von Mikroalgen unter sorgfältig kontrollierten experimentellen Bedingungen. Das Protokoll beschreibt die Mikroalgenlagerung, inokulumische Vorbereitung und Photobioreaktor-Einrichtung und Sterilisation. Neben dem Grundbetrieb werden in dieser Arbeit Messungen der Mikroalgenbiomasse und Biomasseproduktivitätsberechnungen sowie die Anpassung der Anlagen für den Mikroalgenanbau mit korrosiven Gasen beschrieben. Das unten beschriebene Protokoll ist für Forscher geeignet, die eine größere experimentelle Kontrolle ausüben, die wachstumsbedingungen von Mikroalgen optimieren oder eine Reihe phototropher Mikroben axenisch kulturieren möchten. Dieses Verfahren beschreibt keine geeigneten Materialien für den Anbau von Mikroben, die brennbare Gase erzeugen oder verbrauchen (z. B. CH4, H2usw.) 7.
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Protocol
1. Sichere Verwendung und Probenahme eines Photobioreaktors mit korrosiven Gasen
HINWEIS: Diese Methode beschreibt keine geeigneten Verfahren für die sichere Probenahme von Mikroalgenkulturen, die leicht entzündliche Gase produzieren oder verbrauchen.
- Verwalten Sie giftiges Gas als Risiko für die menschliche Gesundheit.
HINWEIS: Gemäß dem Chemikalienhygieneplan der Universität Iowa arbeiteten die Autoren mit dem Brandschutzkoordinator der Universität und dem Beauftragten für Arbeitshygiene der Universität zusammen, um ein Sicherheitsprotokoll für die Arbeit mit den giftigen Gasen zu entwickeln. - Einrichtung eines Toxischen Gasüberwachungssystems mit Sensoren für jedes der eingesetzten toxischen Gase. Kalibrieren Sie die Sensoren gemäß herstellerspezifischen Anweisungen. Bump-Test (Prüfen auf Sensor- und Alarmfunktionalität mit Kalibriergasen) häufig, gemäß Herstelleranleitung. Suchen Sie den Gasmonitor direkt außerhalb der Dunstabzugshaube.
- Bevor Sie mit korrosiven Gasexperimenten beginnen, informieren Sie das nahegelegene Personal über das Risiko- und Alarmsystem. Informieren Sie außerdem die entsprechenden lokalen Notfallhelfer. Pfostenschilder an Laboreingängen, die angeben, welche gefährlichen Gase verwendet werden.
- Weisen Sie alle Mitarbeiter in der Nähe an, zu evakuieren, wenn giftiges Gas entdeckt wird. Benachrichtigen Sie Laborleiter und Notfallpersonal.
HINWEIS: Bei einem Stromausfall stoppt der gasregulierende Turm den Gasfluss, wenn er Strom verliert. Wenn jedoch die Raumheizung, Lüftung und Klimaanlage (HVAC) oder Die Rauchhaube ohne Stromausfall ausfällt, führt dies zu austretendem giftigem Gas.
- Weisen Sie alle Mitarbeiter in der Nähe an, zu evakuieren, wenn giftiges Gas entdeckt wird. Benachrichtigen Sie Laborleiter und Notfallpersonal.
- Modellieren Sie die mögliche akkumulierte Konzentration von toxischen Gasen im Raum, wenn die Dunstabzugshaube mit der mathematischen Modellierungstabelle IH MOD8 der American Industrial Hygiene Association (AIHA) für jedes Gas ausfallen sollte.
- Erhalten Sie die Raumzufuhr/Abluftrate, Q, in m3 min-1 vom Gebäude HVAC Wartungspersonal oder HLK-Techniker. Berechnen Sie das Volumen, V, des Labors (L x B x H) in m3. Berechnen Sie die Schadstoffemissionsrate, G, jeder Art von toxischem Gas in mg min-1, mit Gleichung 1, die dem idealen Gasgesetz angepasst ist:
(1)
wobei P der Druckanteil des toxischen Gases bei 1 atm (ppm Gas/106 ppm) ist, Q-Gas der Durchfluss des Gases in L min-1 ist, r die universelle Gaskonstante ist (0,082057 L-atm-mol-1 K-1), T ist Temperatur in K, und MW ist das Molekulargewicht des Gases in g mol-1. - Verwenden Sie die Werte für V, Qund G für jedes Gas (berechnet in Schritt 1.4.1) im Algorithmus "Well-Mixed Room Model With option to cease generation and model room purge" in der IH MOD-Tabelle, um die akkumulierten Raumgaskonzentrationen für jedes Gas über einen Simulationszeitraum von 1440 min (24 h) zu berechnen. Vergleichen Sie diese Werte mit den Expositionsgrenzwerten (Tabelle 2)9.
- Erhalten Sie die Raumzufuhr/Abluftrate, Q, in m3 min-1 vom Gebäude HVAC Wartungspersonal oder HLK-Techniker. Berechnen Sie das Volumen, V, des Labors (L x B x H) in m3. Berechnen Sie die Schadstoffemissionsrate, G, jeder Art von toxischem Gas in mg min-1, mit Gleichung 1, die dem idealen Gasgesetz angepasst ist:
(1)2. Zubereitung des Mikroalgeninokulums
- Bereiten Sie den Scenedesmus obliquus inoculum oder andere mikrogale Arten, die für den Photobioreaktor ausgewählt wurden, vor Beginn des Experiments vor, indem Sie ihn aus der Lagerung übertragen, unabhängig davon, ob sie kryokonserviert oder auf Agarmedien kultiviert sind.
- Fügen Sie 30 bis 50 ml steriles Mikroalgenwachstumsmedium (Dreifachstickstoff Bolds Basalmedium [3N-BBM], Tabelle 3)zu einem sterilen (150-250 ml) Schüttelkolben hinzu, der mit einem Schaumstopfen gekappt ist.
HINWEIS: Wenn der Kolben nicht sparsam ist, sollte nur ein Fünftel des Schüttelkolbenvolumens von flüssigen Medien belegt werden. - Verwenden Sie einen Biosicherheitsschrank, um die Sterilität zu erhalten, wenn Zellen auf einen Schräg- oder Schüttelkolben übertragen werden. Für Kulturen auf Agar, verwenden Sie eine sterile Schleife, um Mikroalgen von seiner Agarplatte oder Schräglage auf den Schüttelkolben zu übertragen. Für kryokonservierte Kulturen, nach und nach auftauen Sie die kryokonservierte Probe und spülen Sie das Kryoprotektor nach dem gewählten Protokoll10,dann fügen Sie die Zellen auf den Schüttelkolben.
- Kulturzellen in 3N-BBM bei 20 bis 25 °C unter 16 h:8 h hell: dunkel und schütteln bei 115 bis 130 U/min.
- Verfolgen Sie das Mikroalgenwachstum im Laufe der Zeit mithilfe von Messungen der optischen Dichte (OD) (wie in den Abschnitten 5 und 6). Lassen Sie die Mikroalgen ihre exponentielle Wachstumsphase (2-4 Tage) erreichen, bevor Sie Zellen in den Photobioreaktor übertragen.
HINWEIS: Je nach Ziel des Experiments können die Zellen vor der Impfung des Bioreaktors von Kulturmedium (diese Studie) abgerinnen und/oder mit mehreren Zentrifugationsschritten konzentriert werden.
- Fügen Sie 30 bis 50 ml steriles Mikroalgenwachstumsmedium (Dreifachstickstoff Bolds Basalmedium [3N-BBM], Tabelle 3)zu einem sterilen (150-250 ml) Schüttelkolben hinzu, der mit einem Schaumstopfen gekappt ist.
3. Einrichtung und Betrieb des Photobioreaktors
- Verwenden Sie den Photobioreaktor (Abbildung 1), um Temperatur, pH-Wert, Rührrate, Gasdurchflussraten und Eingangslösungsdurchflussraten zu steuern.
HINWEIS: Der Photobioreaktor kann verwendet werden, um den Durchfluss von bis zu vier verschiedenen Eingangslösungen zu steuern, häufig Säure, Base, Antischaum und Substrat.- Bereiten Sie 100 ml von je 1 N NaOH und 1 N HCl vor und fügen Sie jede zu einer 250 ml Eingangslösungsflasche hinzu. Verwenden Sie für diese Lösungen sekundäres Containment.
- Bewahren Sie dosierte Eingangslösungen in autoklavierbaren Flaschen auf, die mit Tauchrohren und einem Entlüftungsrohr mit einem sterilen Inline-Luftfilter ausgestattet sind. Verbinden Sie die Tauchrohre mit autoklavierbaren Schläuchen an die vier Eingangsanschlüsse des Photobioreaktors und tauchen Sie während des Photobioreaktorbetriebs die Tauchrohre in die Eingangslösungen ein. Übergeben Sie die 1,6 mm innen dimeter (ID) autoklavierbaren Schläuche zwischen den Eingangslösungen und ihren Anschlüssen durch separate peristaltische Pumpen, die entweder durch manuell ausgewählte Durchflussraten oder durch Rückkopplung von pH- und Schaumstoff-Sonden gesteuert werden können (bei Säure, Basis und Antischaumlösungen).
- Kalibrieren Sie den pH-Meter des Photobioreaktors vor dem Autoklavieren.
- Schließen Sie die pH-Sonde an den Photobioreaktor-Kontrollturm an, indem Sie die Sonde an die Verbindungsleitung anschließen und sich verdrehen, um sie zu verriegeln. Verwenden Sie pH 4 und pH 7 Puffer, um das pH-Messgerät zu kalibrieren. Warten Sie, bis sich die Werte stabilisiert haben, bevor Sie den pH-Meterwert akzeptieren.
- Trennen Sie die pH-Sonde vom pH-Meterkabel, das die Sonde mit dem Kontrollturm verbindet.
- Oberfläche sterilisieren mit 70% Ethanol oder Autoklav die Sonde mit dem Reaktor. Um Autoklav, kappen Sie die pH-Sonde fest mit Aluminiumfolie.
HINWEIS: Wenn die Sonde autoklaviert ist, besteht die Gefahr einer Korrosion des Sondeninnenraums durch Dampfschäden. Diese Kappungsmethode garantiert keine vollständige Schadensvermeidung. - 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-Ethansulfonsäure (HEPES) Puffer zum Kulturmedium hinzufügen, um den pH-Wert besser zu kontrollieren.
- Einlegen und Schrauben geschlossen den kalten Finger und Auspuffkondensator auf der Photobioreaktor Kopfplatte.
- Setzen Sie den Impfanschluss ein und schrauben Sie fest an Ort und Stelle. Fügen Sie dem Abschnitt des Impfanschlusses oberhalb der Photobioreaktor-Kopfplatte eine Länge autoklavierbarer Schläuche hinzu. Vor dem Autoklavieren des Bioreaktors klemmen Sie den Schlauch mit einer autoklavierbaren Schlauchklemme.
- Befestigen Sie Schläuche, die mit sterilen Filtern verkappt sind, an allen nicht verwendeten Photobioreaktor-Ports.
- Befestigen Sie Säure- und Baseneingangslösungen über autoklavierbare Schläuche an die Photobioreaktor-Eingangsanschlüsse. Fügen Sie 1.5 L Kulturmedium hinzu.
- Autoklavieren Sie den Reaktor und die zugehörigen Eingangslösungen für 30-45 min bei 121 °C je nach Arbeitsvolumen.
HINWEIS: Wenn das Kulturmedium durch Autoklavieren beeinträchtigt wird, fügen Sie das Medium nach dem Autoklavieren unter sterilen Bedingungen in einer laminaren Durchflusshaube hinzu. Das Protokoll kann hier angehalten werden.
VORSICHT: Der Reaktor wird nach dem Entfernen aus dem Autoklaven heiß. - Befestigen Sie den Laufradmotor an der Laufradwelle und ziehen Sie die Armatur fest.
- Richten Sie LED-Lichtpanels symmetrisch außerhalb des Bioreaktors nach Beleuchtungsanforderungen an.
- Messen und erfassen Sie vor dem Autoklavieren die Lichtintensität mit einem Photometer. Platzieren Sie den Beleuchtungsstärkesensor in den Photobioreaktorbehälter und stellen Sie den Sensor zur Lichtquelle.
- Schließen Sie bis zu zwei Gasflaschen an, um die simulierten Emissionen von Kohlekraftwerken (Tabelle 1) an die Mikroalgen im Photobioreaktor zu liefern.
HINWEIS: Die in dieser Studie verwendeten Gaskonzentrationen näherten sich den des Kraftwerks der Universität von Iowa an.- Montieren Sie die Verbindungen zwischen Gasflasche, Gasregelturm und Photobioreaktor Sparging Ring. Befestigen Sie geeignete Regler, die einen Auslassdruck von 20 psi an die Gasflaschen ausüben können. Befestigen Sie 6 mm ID druckbeständige Schläuche an der Reglerauslassschlauchleiste und sichern Sie sie mit einer Schlauchklemme. Befestigen Sie das andere Ende des druckfesten Rohres mit einem Schlauchstab an einem 6 mm Stiel schnell anschlussbefestigung mit einer Schlauchklemme gesichert. Schließen Sie 3,2-mm-ID-Schläuche mit einer weiteren 6 mm Schnellanschlussbefestigung an den gasregulierenden Turmgasauslass an und verbinden Sie das andere Ende des Auslassschlauchs mit dem Sparging-Ring-Anschluss an der Photobioreaktor-Kopfplatte.
HINWEIS: Wiederholen Sie für ein zweites Eingangsgas Schritt 3.9.1, aber verwenden Sie einen T-förmigen Schlauchstab, um die beiden Eingangsgasleitungen zu einem einzigen Rohrabschnitt zu konsolidieren, der mit dem Sparging-Ring-Anschluss verbunden ist. - Stellen Sie den Ausgangsdruck auf 20 psi auf jeden Gasregler ein und verwenden Sie die Bioreaktorschnittstelle, um experimentelle Gasdurchflussraten festzulegen.
ANMERKUNG: Berechnen und melden Sie das Luftvolumen unter Standardbedingungen pro Flüssigkeitsvolumen pro Minute (vvm); dividieren Sie den volumentrumtrige Gasdurchfluss durch das Kulturvolumen. Bericht in Einheiten von pro Miniute.
- Montieren Sie die Verbindungen zwischen Gasflasche, Gasregelturm und Photobioreaktor Sparging Ring. Befestigen Sie geeignete Regler, die einen Auslassdruck von 20 psi an die Gasflaschen ausüben können. Befestigen Sie 6 mm ID druckbeständige Schläuche an der Reglerauslassschlauchleiste und sichern Sie sie mit einer Schlauchklemme. Befestigen Sie das andere Ende des druckfesten Rohres mit einem Schlauchstab an einem 6 mm Stiel schnell anschlussbefestigung mit einer Schlauchklemme gesichert. Schließen Sie 3,2-mm-ID-Schläuche mit einer weiteren 6 mm Schnellanschlussbefestigung an den gasregulierenden Turmgasauslass an und verbinden Sie das andere Ende des Auslassschlauchs mit dem Sparging-Ring-Anschluss an der Photobioreaktor-Kopfplatte.
- Bestätigen Sie beim Sparing mit mehr als einer Gasflasche die zugeführteCO2-Konzentration des Photobioreaktors mit einemCO2-Sensor.
- Schließen Sie einen Software-kompatiblenCO2-Sensor (z. B. GasLab) an den USB-Anschluss eines Computers an. Laden Sie die neueste Software herunter, die demCO2-Sensormodell entspricht. Öffnen Sie die Software und geben Sie das Sensormodell, das Messzeitintervall und die Dauer der Messdatenprotokollierung ein.
- Stellen Sie denCO2-Sensor und das kombinierte Gasdurchflussrohr (vor dem Anschluss des Rohres mit dem Bioreaktor) in ein 100 bis 250 ml, gekapseltes, belüftetes Gefäß (extern zum Bioreaktor) ein.
HINWEIS: Während des Experiments können dieCO2-Konzentrationen des Kopfraums von einem der Entlüftungsrohre auf der Photobioreaktorkopfplatte gemessen werden. - Starten Sie dieCO2-Konzentrationsmessungen auf der Benutzeroberfläche und warten Sie, bis die Messungen ausgeglichen sind.
- Verwenden Sie die Photobioreaktor-Benutzeroberfläche, um die Gasdurchflussraten von jedem Tank bis zur gewünschten Gesamtdurchflussrate (0,1 l min-1) undCO2-Konzentration (12%) einzustellen erreicht wird.
- Verwenden Sie auf der Photobioreaktor-Benutzeroberfläche die STIRR-Funktion, um die Laufradrotationsrate einzustellen. Stellen Sie sicher, dass die Mischrate schnell genug ist, damit das Kulturmedium die spärlichen Gasblasen assimiliert.
HINWEIS: Bestimmte Mikroalgenarten haben schwache Zellstrukturen und werden durch hohe Scherkraft beschädigt oder gebrochen.
4. Anpassung des Photobioreaktors und des Versuchsaufbaus für den Einsatz von Giftgas
VORSICHT: Die korrosiven Gase im realen oder simulierten Rauchgas sind ätzend und giftig. Diese Gase stellen ein ernsthaftes Risiko dar, wenn sie eingeatmet werden.
HINWEIS: Bei dieser Methode werden keine geeigneten Materialien für den sicheren Anbau von Mikroben beschrieben, die leicht entzündliche Gase (d. h. Methan, Wasserstoff usw.) erzeugen oder verbrauchen.
- Ersetzen Sie Messing-, Kunststoff- und Standardrohrkomponenten durch korrosionsbeständige Materialien.
- Verwenden Sie Edelstahl, um zuverlässig Korrosion von den starken Säuren zu widerstehen, die durch die Reaktion zwischen NOx oder SOx und Wasser gebildet werden. Ersetzen Sie Kunststoff-Schnellanschlussarmaturen an den Gasein- und -auslässen am Gasregelturm durch Schnellverbindungsarmaturen aus Edelstahl. Verwenden Sie Edelstahlregler für Gasflaschen einschließlich der Auslassschlauchleiste anstelle von Messing.
- Verwenden Sie Polytetrafluorethylen (PTFE) oder natürliche Ethylvinylacetat (EVA)-Schläuche, um Korrosion von NOx- undSO-x-Gasen (bzw.) an den Verbindungen zwischen der Gasflasche zum gasregulierenden Turm und dem gasregulierenden Turm zum Photobioreaktor zu widerstehen.
- Nach dem Autoklavieren montieren Sie den Photobioreaktor und die Gasflaschen in einer begehbaren Dunstabzugshaube. Legen Sie den Photobioreaktor auf einen Tisch in sekundäre Containment und legen Sie Gasflaschen in freistehende Zylinderhalsbänder oder ein Zylindergestell.
- Nach dem Initiieren des Gasflusses verwenden Sie einen Blasenflüssigkeitsleckdetektor, um gasaustritte in allen Verbindungen zwischen Gasflaschen und Bioreaktor zu überprüfen. Verwenden Sie eine Waschflasche gefüllt mit einer 1:100 (v:v) Verdünnung der Spülseife: Wasser, um die Verbindung mit einem kleinen Strom von Seifenlösung zu decken.
HINWEIS: Leckagen werden durch Blasen an den Verbindungen angezeigt. - Bei der Initiierung der Mikroalgenexperimente beginnen Sie mit dem Sparging und passen Sie dann den pH-Wert vor der Impfung an (wie bei Standard-Photobioreaktorexperimenten).
HINWEIS: Die Pufferung des Kulturmediums bei korrosiven Gasexperimenten wird dringend empfohlen, da die Eingangsgase stark sauer sind. - Impfen Sie den Photobioreaktor, indem Sie das vorbereitete Mikroalgen-Inokulum in eine sterile Spritze zersiedeln, die Spritze an den Schlauch an den Impfanschluss anbringen, die Impfschlauchklemme öffnen und die Spritze deprimieren.
- Überprüfen Sie den Gasmonitor, den Druck der Gasflaschen und den Photobioreaktor zweimal täglich (und vor der Probenahme) auf erhöhte Konzentrationen von giftigem Gas oder auf Hinweise auf Leckagen.
- Beschränken Sie die Öffnung der Dunstabzugshaubenöffnung auf eine Breite, die es ermöglicht, die Regler für Bioreaktor und Gasflaschen zu erreichen. Um ein Expositionsrisiko bei der Einatmung zu vermeiden, stellen Sie sicher, dass die Öffnung kein Personal über der Rumpfregion freilegt.
- Drehen Sie die Gasflaschenregler in die geschlossene Position, um den Gasstrom zum Reaktor zu stoppen. Schließen Sie die Dunstabzugshaube und lassen Sie 5 min für die Haube die korrosiven Gase evakuieren, bevor Sie die Photobioreaktorkultur abtasten.
- Probe innerhalb der Dunstabzugshaube entweder durch Öffnen eines Kopfplattenanschlusses und Verwendung einer sterilen serologischen Pipette oder Zeichnungskultur in eine Spritze durch den Impf-/Probenahmeanschluss. Sichern Sie die Photobioreaktoranschlüsse, bevor Sie die Gasflaschen öffnen und das Experiment wieder aufleben.
5. Messung der Produktivität von Mikroalgenbiomasse
- Verwenden Sie eine Kalibrierkurve, um Die Messungen der Mikroalgenkultur OD750 mit getrockneten Mikroalgenbiomassekonzentrationen in Beziehung zu setzen.
- Bereiten Sie mehrere (Minimum: 4, Mindestarbeitsvolumen: 500 ml) Kolben mit sterilem Mikroalgenmedium vor und impfen Sie mit der betreffenden Art (z. B. S. obliquus in dieser Studie).
- Messen Sie die Kultur OD750, bis das Wachstum exponentiell ist, und proben Sie die Kolben prompt aufopfernd, indem Sie bekannte Volumina (mindestens 100 ml) des Inhalts mit einer 0,45 m-Filtermembran bekannter Masse filtern. Verwenden Sie abgedeckte Aluminium-Wägeboote oder Glasgefäße, um die Biomasse und Filter beim Trocknen zu unterstützen.
- Masse der Biomasse und Filter nach dem Trocknen für ca. 18-24 h im Ofen zwischen 80 und 100 °C. Um die vollständige Trocknung zu überprüfen, messen Sie erneut nach einem zusätzlichen 2-3 h, um festzustellen, ob sich die Masse stabilisiert hat.
- Subtrahieren Sie die Filtermasse von der kombinierten Biomasse und Filtermasse, um die Biomassemasse zu berechnen.
- Zeichnen Sie die Kalibrierkurve als gemessen OD750 gegen die Biomassekonzentration (Masse der Biomasse dividiert durch das Volumen der gefilterten Kultur) und passen Sie die Daten mit einer linearen Regression an.
6. Biomasse-Produktivitätsmodellierung und Ratenberechnungen
- Berechnen Sie die Biomassekonzentrationen von Experimenten anhand von OD750-Messungen mit der linearen Regression der Kalibrierkurve (in Abschnitt 5 ermittelt).
- Anpassung von Batch-Mikroalgenwachstumsdaten von der Verzögerung auf die exponentielle zur stationären Phase mit einer logistischen Regression (Gleichung 2) in der Grafik- und Statistiksoftware (Materialtabelle):
(2)
wobei L der maximale Biomassekonzentrationswert der Kurve ist, k die relative Steilheit der Exponentialphase (Zeit-1), xo ist die Zeit des Mittelpunkts der Sigmoidalkurve und x ist die Zeit.- Geben Sie die oben genannte logistische Gleichung manuell ein. Wählen Sie Eine Kurve mit nichtlinearer Regression auf der Registerkarte Analyse in der Software anpassen aus. Wählen Sie auf der linken Seite des Felds Parameter: Nichtlineare Regression unter dem Dropdown-Feld Neue aus. Verwenden Sie die explizite Standardgleichung als Gleichungstyp, benennen Sie die neue Funktion, und definieren Sie die neue Funktion als Y = L/(1+ exp(-k*(x-b))), wobei b für xosteht.
- Berechnen Sie die Gesamtbiomasseproduktivität der Mikroalgencharge, indem Sie die Differenz zwischen der endgültigen und der anfänglichen Biomassekonzentration durch die Differenz zwischen der End- und der Anfangszeit dividieren.
- Berechnen Sie die maximale Biomasseproduktivität der Mikroalgencharge aus dem Derivat der Gleichung 2 (Gleichung 3) am Sigmoid-Mittelpunkt, wenn x = xo.
(3)
(2)
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Representative Results
Mit OD 750 und getrockneten Biomassekonzentrationen wurde eine Kalibrierkurve für die grün-mikroalgen, S. obliquus, die in der Exponentialphase geerntet wurden , mit OD750 und getrockneten Biomassekonzentrationen (Abbildung 2) erstellt. Die lineare Regression hatte einenR2-Wert von 0,9996.
Eine S. obliquus Kultur wurde in einem 250 mL Erlenmeyer Kolben aus einer Kultur auf einer gekühlten Agarplatte gespeichert begonnen. Die Mikroalga wurde in 3N-BBM mit 10 mM HEPES Puffer geimpft und mit 2,2%CO2 in einem 2 L Photobioreaktor mit 1,5 L Arbeitsvolumen (0,07 vvm) gespart (Abbildung 1). Die Charge wurde über OD750verfolgt; Die Biomassekonzentrationen wurden aus der Kalibrierkurve berechnet und dann mit einer logistischen Kurve modelliert (Abbildung 3). Der Photobioreaktor hielt die Kultur bei pH 6,8, 100 cm3 min-1 Gesamtgasdurchfluss, kontinuierlich2x m-2 s-1 Beleuchtung und 27 °C. Die logistische Kurve passt die Biomassekonzentrationsdaten von der Verzögerung auf die exponentielle zur stationären Phase an. Aus dem logistischen Modell betrug die maximale Biomassekonzentration während der Charge 2070 x 20 mg L-1, die maximale Biomasseproduktivität trat bei 4,6 Tagen auf, und die Rate der spezifischen Biomasseproduktivität betrug 1,0 d-1. Die maximale Biomasseproduktivität, berechnet aus der Ableitung der logistischen Kurve zum Zeitpunkt des maximalen Wachstums, betrug 532 x 60 mg L-1 d-1.
Das gut gemischte Raummodell wurde verwendet, um die akkumulierte Konzentration von NO2, SO2und CO im Falle eines Rauchhaubenausfalls für 24 h zu berechnen. Diese Werte wurden mit den Expositionsgrenzwerten verglichen (Tabelle 2). In dem Szenario, in dem 0,05 L min-1 von 400 ppm NO2 während einer Rauchhaube Ausfallzeit von 24 h freigegeben wird, das gut gemischte Raummodell mit Eingängen von berechneten G = 0,0377 mg min-1, Q = 0,0001 m3 min-1, V = 100 m3, und maximale Zeit für Simulation = 1440 min prognostiziert NO2 Akkumulation auf 0,54 mg m-3 (0,29 ppm), die über der akzeptablen chronischen Expositionsgrenze liegt (American Conference of Governmental Industrial Hygienists schwellenwert [ ACGIH TLV]) und unterhalb des kurzfristigen Expositionsgrenzwerts (STEL).
Eine vielversprechende Vorstudie mit simuliertem Rauchgas erreichte eine höhere maximale Mikroalgen-Biomasse-Produktivitätsrate (690 x 70 mg L-1 d-1) als die von 12%CO2 und Ultra-Null-Luft (510 x 40 mg L-1 d-1) (Abbildung 4). Vor dem Experiment wurde ein Gasmonitor mit CO, NO2und SO2kalibriert. Das simulierte Rauchgasexperiment wurde ohne Gefahr für das Personal oder ohne Beschädigung von Geräten durch korrosive Gase durchgeführt.
Abbildung 1: Bench-Top-Photobioreaktor, beleuchtet durch rote und blaue LED-Leuchten. Der Photobioreaktor arbeitet als 2 L-Batchreaktor mit 1,5 l Arbeitsvolumen. Der Photobioreaktor wird kontinuierlich mit Gasen durch den Sparring und überschüssige Gasentlüftungen durch Ports in der Kopfplatte gespeist. Angepasst mit Genehmigung von Molitor et al.5. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Kalibrierkurve, die OD750 mit dem Trockengewicht der S. obliquus-Zelle in Beziehung steht. S. obliquus Zellkultur Lichtabsorption wurde bei 750 nm gemessen, dann Zellen gefiltert und getrocknet, um Zell trockenGewicht Messungen zu erhalten. Nachdruck mit Genehmigung von Molitor et al.5. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: S. obliquus Wachstumsdaten bei 2,2%CO2-Eingang mit einer logistischen Regression modelliert. Die Datenpunkte stellen Biomassewerte dar, die aus optischen Dichtemessungen berechnet werden. Die Daten wurden mit einer logistischen Regression durch eine am wenigsten quadrierte Anpassung modelliert; 
wobei L = 1955 mg L-1, k = 1,154 d-1und x0 = 3,317 d. R2 = 0,995. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Modelliertes S. obliquus Wachstum bei 12%CO2, mit und ohne zusätzliche simulierte Rauchgaskomponenten. Die Biomassemessungen aus jeder Charge von Mikroalgen wurden mit logistischen Regressionen modelliert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Komponente | Prozent |
| H2O | 12.6% |
| CO2 | 11.6% |
| O2 | 5.8% |
| Co | 0.048% |
| SO2 | 0.045% |
| NR.2 | 0.022% |
| N2 | 69.9% |
Tabelle 1: Zusammensetzung der Emissionen von Kohlekraftwerken. Diese Mengen wurden aus den Emissionsdaten der University of Iowa für Kraftwerksemissionen gemittelt, die in Minutenabständen über einen Zeitraum von 10 h gesammelt wurden.
| Giftiges Gas | Twa | Decke | Stel | NIOSH IDLH | NIOSH REL | ACGIH TLV | CDC Beschreibung |
| Co | 35 ppm | 200 ppm | - | 1.200 ppm | 35 ppm | 25 ppm | Farblos, geruchlos |
| SO2 | 2 ppm | 100 ppm | 5 ppm | 100 ppm | 2 ppm | 2 ppm | Farbloses Gas mit charakteristischem, reizendem, stechendem Geruch |
| NR.2 | 3 ppm | 5 ppm | 1 ppm | 13 Ppm | 1 ppm | 0,2 ppm | Gelblich-braunes flüssiges oder rötlich-braunes Gas (über 70 °F) mit stechendem, scharfem Geruch |
Tabelle 2: Expositionsgrenzwerte und Beschreibungen für toxische Gase (CO, SO2, NO2) im Rauchgas. OSHA TWA: zeitgewichteter Durchschnitt (in der Regel 8 h Zeitraum), CEILING: Wert nie zu erreichen, STEL: kurzfristige Expositionsgrenze (TWA über 15 min), NIOSH IDLH: Gefahr für Leben und Gesundheit, NIOSH REL: 15 min Expositionsgrenzwert, ACGIH TLV: akzeptable chronische Expositionsgrenze, keine negativen Auswirkungen.
| Verbindung | Mm |
| NaNO3 | 8,82 x 100 |
| MgSO4bei 7H2O | 3,04 x 10-1 |
| Nacl | 4,28 x 10-1 |
| K2HPO4 | 4,31 x 10-1 |
| KH2PO4 | 1,29 x 100 |
| CaCl2bei 2H2O | 1,70 x 10-1 |
| ZnSO4bei 7H2O | 3,07 x 10-2 |
| MnCl24H2O | 7,28 x 10-3 |
| MoO3 | 4,93 x 10-3 |
| CuSO4bei 5H2O | 6,29 x 10-3 |
| Co(NO3)2€6H2O | 1,68 x 10-3 |
| H3BO3 | 1,85 x 10-1 |
| Edta | 1,71 x 10-1 |
| Koh | 5,52 x 10-1 |
| FeSO4bei 7H2O | 1,79 x 10-2 |
| H2SO4 (konzentriert) | 1 x 10-3 l |
Tabelle 3: Zusammensetzung des Basalmediums von Triple-Stickstoff Bold (3N-BBM). Die Stickstoffmenge wurde aus dem ursprünglichen Basalmedium11verdreifacht.
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Discussion
Batch-, axtische Photobioreaktorexperimente mit reguliertem pH-Wert, Temperatur, Gasdurchfluss und Gaskonzentration fördern aussagekräftige Ergebnisse, indem kontaminationsfreie Algenstämme und Variabilität unter Kulturbedingungen beseitigt werden. Genaue Reine Kulturwachstumskinetik kann auch in Gegenwart von korrosiven Gasen(CO2, SO2, NO2) gewonnen werden, die als Nährstoffe dienen und Abfallgase zu einem wertvollen Produkt wie Tierfutter machen.
Vor Beginn eines Mikroalgenexperiments sollte die gewählte Mikroalga-Kultur aus der Lagerung entnommen und an die flüssige Kultur angepasst werden. Das Wachsen der Mikroalgen in eine exponentielle Phase erhöht die Wahrscheinlichkeit, dass Experimente gleichwertige Ausgangsbedingungen haben und dass die Mikroalgen nicht in der Verzögerungsphase nach der Impfung stagnieren.
Kalibrierkurven, die die optische Dichte und Biomassekonzentrationen in Beziehung setzen, sind bei Studien zur Biomasseproduktivität besonders wichtig. Hohe Mikroalgenbiomasse Produktivität ist eines der Hauptziele der Mikroalgenindustrie und als solche ist oft ein Indikator für den Forschungserfolg12. Daher müssen genaue Berechnungen der Biomassekonzentrationen aus optischen Dichtemessungen aus artspezifischen, präzisen und genauen Kalibrierkurvendaten stammen. Um mögliche optische Interferenzen zu vermeiden, ist es wichtig, dass Messungen für die Kalibrierkurve und während des Experiments in gleichwertigen Hintergrundlösungen durchgeführt werden. Darüber hinaus sollte die Kalibrierkurve mit Messungen von Mikroalgen in den Wachstumsphasen durchgeführt werden, die am repräsentativsten für die in den Experimenten durchgeführt werden. Bestimmte Mikroalgenarten können während verschiedener Wachstumsphasen dramatische Unterschiede in der Zellgröße aufweisen, was die optische Dichte und die wahrgenommenen Biomassekonzentrationen verändern kann. Es sei darauf hingewiesen, dass die Biomasseproduktivität mit der Wachstumsrate zusammenhängt, aber nicht mit ihr entspricht. Die spezifische Wachstumsrate hängt von der Anzahl der vorhandenen Zellen (Veränderung der Zelldichte im Zeitverlauf/Zelldichte) ab, und die spezifische Biomasseproduktivität hängt von der Massenmasse der Zellen ab (Veränderung der mg/L-Biomasse im Laufe der Zeit pro mg/L Biomasse)13 vorhanden.
Wenn mikroalgale Biomassekonzentrationen mit einer logistischen Kurve modelliert werden, können experimentelle Ergebnisse sinnvoll verglichen werden, indem Biomassekonzentrationen interpoliert und Biomasse-Ieralitäten genau berechnet werden. Bei der Interpretation dieser experimentellen Ergebnisse ist jedoch Vorsicht geboten; es ist unangemessen, die Gesamt- und die maximale Produktivität von Batch-Biomasse zu vergleichen. Während maximale Biomasseproduktivitätswerte nützlich sind, um Chargenergebnisse zu vergleichen, ist die Gesamtbiomasseproduktivität irreführend, ohne weitere Informationen über die Versuchsdauer und die Mikroalgenwachstumsphasen. Diese Raten ändern sich während der Verzögerung, des Log-Wachstums und der stationären Phasen ständig.
Bei Experimenten mit korrosiven Gasen, die für Kraftwerks- oder industrielle Verbrennungsemissionen charakteristisch sind, ist sowohl auf die menschliche Gesundheit als auch auf die Langlebigkeit der Geräte Vorsicht geboten. Standardteile müssen durch robustere Materialien ersetzt werden, und Verbrauchsmaterialien wie Schläuche sollten häufiger geprüft und ersetzt werden, um Korrosion zu widerstehen, Leckagen zu verhindern und menschliche Exposition zu vermeiden. Zusätzliche Sicherheitsmaßnahmen und risikobewusstsein sind für einen sicheren und erfolgreichen Betrieb und eine Probenahme unerlässlich. Das Verfahren ist nicht für brennbare Gase geeignet, da im Kopfbereich Gasansammlungen freigesetzt werden können und die Ausrüstung weder für solche Risiken ausgelegt noch für eine sichere Anpassung an solche Bedingungen geeignet ist.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Dieses Material basiert auf Arbeiten, die vom National Science Foundation Graduate Research Fellowship unter dem Stipendium Nr. 1546595 unterstützt werden. Alle Meinungen, Erkenntnisse und Schlussfolgerungen oder Empfehlungen, die in diesem Material zum Ausdruck kommen, sind die der Autoren und spiegeln nicht unbedingt die Ansichten der National Science Foundation wider. Die Arbeit wurde auch von einem Forschungsstipendium der University of Iowa Graduate and Professional Student Government und der University of Iowa Foundation, Allen S. Henry Endowment, unterstützt. Die Forschung wurde im W. M. Keck Phytotechnologies Laboratory durchgeführt. Die Autoren danken den Mitarbeitern des Kraftwerks der University of Iowa, insbesondere Mark Maxwell, für ihre Expertise und finanzielle Unterstützung für die simulierten Rauchgase. Die Autoren möchten auch Emily Moore für ihre Unterstützung bei Sampling und Analyse und Emily Greene für ihre Unterstützung und Teilnahme am Protokollvideo würdigen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biostat A bioreactor | Sartorius Stedim | 2-liter bioreactor for microbial fermentation; designed to be autoclaved; pH, temperature, gas flow rate control | |
| Bump test NO2 gas | Grainger | GAS34L-112-5 | Calibration gas for MultiRAE gas detector |
| Bump test O2, CO, LEL gas | Grainger | GAS44ES-301A | Calibration gas for MultiRAE gas detector |
| Bump test SO2 gas | Grainger | GAS34L-175-5 | Calibration gas for MultiRAE gas detector |
| Corrosion resistant tubing for NO2 gas | Swagelok | SS-XT4TA4TA4-6 | PTFE Core Hose Smooth Bore X Series—Fiber Braid and 304 SS Braid Reinforcement |
| Corrosion resistant tubing for SO2 gas | QC Supply | 120325 | Reinforced Braided Natural EVA Tubing - 1/4" ID |
| cozIR 100% CO2 meter | Gas Sensing Solutions Ltd. | CM-0121 at CO2meter.com | CO2 meter for concentrations up to 100% |
| cozIR 20% CO2 meter | Gas Sensing Solutions Ltd. | CM-0123 at CO2meter.com | CO2 meter for concentrations up to 20% |
| Durapore Membrane Filter, 0.45 μm | Millipore Sigma | HVLP04700 | Hydrophilic, plain white, 47 mm diameter, 0.45 μm pore size, PVFD membrane filters |
| Gas cylinder regulators | Praxair | PRS 40221331-660 | Single-stage stainless steel regulator configured for 0-15 psi outlet assembly diaphragm valve with 1/4" MNPT threads, Stainless steel to resist corrosion from NOx and SOx |
| Gas cylinders | Praxair | Ulta-zero air, high purity CO2, or custom gas composition | Dependent on study objectives |
| Gas monitoring and leak detection system | RAE Systems by Honeywell | MAB3000235E020 | Pumped model that detects O2, SO2, NO2, CO, and LEL |
| GasLab software | GasLab | v2.0.8.14 | Software for CO2 meter measurements and data logging |
| Hose barb | Grainger | Item # 3DTN3 | Used to adapt regulators to tubing, Stainless steel to resist corrosion from NOx and SOx |
| K30 1% CO2 meter | Senseair | CM-0024 at CO2meter.com | CO2 meter for concentrations less than 1% |
| LED grow panels | Roleadro | HY-MD-D169-S | Red & blue LED light panels |
| Memosens dissolved oxygen probe | Endress+ Hauser | COS22D-19M6/0 | Autoclavable (with precautions) dissolved oxygen probe for bioreactor |
| Memosens pH probe | Endress+ Hauser | CPS71D-7TB41 | Autoclavable (with precautions) pH probe for bioreactor |
| Oven, Isotemp 500 Series | Fisher Scientific | 13246516GAQ | Small oven for drying |
| Prism GraphPad software | GraphPad Software | Version 7.03 or 8.0.1 | Graphing software for data organization, data analysis, and publication-quality graphs |
| Stem to hose barb fitting | Swagelok | SS-4-HC-A-6MTA | Stainless Steel Hose Connector, 6 mm Tube Adapter, 1/4 in. Hose ID |
| Tubing, dilute acid/base transfer | Allied Electronics and Automation | 6678441 | Silicone TP Process Tubing; 1.6mm Bore Size; 3000mm Long; Food Grade |
| Tubing, gas transfer | Allied Electronics and Automation | 6678444 | Silicone TP Process Tubing; 3.2mm Bore Size; 3000mm Long; Food Grade |
References
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- Tsang, Y. F. Photobioreactors: Advancements, Applications and Research. , Nova Science Publishers, Inc. Hauppauge, NY. (2017).
- Molitor, H. R., Moore, E. J., Schnoor, J. L. Maximum CO2 Utilization by Nutritious Microalgae. ACS Sustainable Chemistry & Engineering. 7 (10), 9474-9479 (2019).
- Khan, M. I., Shin, J. H., Kim, J. D. The promising future of microalgae: current status, challenges, and optimization of a sustainable and renewable industry for biofuels, feed, and other products. Microbial Cell Factories. 17 (1), 36 (2018).
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