Summary
벤치 스케일, 축 재배는 후속 공정 확장 전에 미세 조류 특성화 및 생산성 최적화를 용이하게 합니다. 광생물 반응기는 신뢰할 수 있고 재현 가능한 미세 조류 실험에 필요한 제어를 제공하며 도시 또는 산업 연소 배출에서 부식성 가스(CO2,SO2,NO2)로미세 조류를 안전하게 경작하도록 조정할 수 있습니다.
Abstract
광생물 반응기는 광영양 미생물에 대한 실험을 위한 조명 재배 시스템입니다. 이러한 시스템은 온도, pH 및 가스 조성 및 유량 제어를 통해 미세 조류 재배를 위한 멸균 환경을 제공합니다. 벤치 스케일에서 광생물 반응기는 미세 조류 특성, 생산성 및 성장 최적화를 연구하는 연구자에게 유리합니다. 산업용 스케일에서 광생물 반응기는 제품 순도를 유지하고 생산 효율성을 향상시킬 수 있습니다. 이 비디오는 부식성 가스 입력의 안전한 사용을 포함하여 미세 조류 재배를 위한 벤치 스케일 광생물반응기의 준비 및 사용과 관련 바이오매스 측정 및 바이오매스 생산성 계산에 대해 자세히 설명합니다. 구체적으로, 이 비디오는 접종, 광생물반응기 조립 및 멸균, 바이오매스 농도 측정 및 마이크로조류 바이오매스 생산성을 위한 물류 모델을 위한 미세조류 배양 저장 및 준비를 보여줍니다. 최대 및 전체 바이오 매스 생성성을 포함한 계산. 또한 시뮬레이션 또는 실제 폐가스 배출을 사용하여 미세 조류를 배양하는 실험에 대한 관심이 증가하고 있기 때문에 비디오는 부식성 가스로 작업하는 데 필요한 광생물 반응기 장비 적응을 다루고 안전한 샘플링에 대해 논의합니다. 이러한 시나리오를 참조하십시오.
Introduction
광생물 반응기는 열린 연못에 의해 달성 될 수있는 것보다 더 순수한 미세 조류 제품의 제어 실험 및 재배에 유용합니다. 벤치 규모의 광생물 반응기의 미세 조류 재배는 공정 확장에 사용될 수있는 기본 지식의 개발을 지원합니다. 환경 조건에 약간의 변화는 크게 미생물 실험을 변경하고 결과를 혼동 할 수 있습니다1. 온도, pH 및 가스 절약 제어가 있는 멸균 공정은 다양한 조건에서 미세 조류 특성 및 성능을 연구하는 데 유리합니다. 또한, 입력 가스 농도, 온도, 혼합에서 전단력 및 중간 pH에 대한 제어는 그렇지 않으면 재배하기 어려운 다양한 종을 지원할 수 있습니다. 광생물 반응기는 연속 가스 공급 및 스파징을 통한 배치 공정으로 실행되거나, 연속 가스 공급 및 스파링 플러스 유입 및 폐수 영양 입력이 있는 chemostat 흐름 통과 시스템으로 실행할 수 있습니다. 여기서, 우리는 연속 가스 공급 및 스파징과 배치 공정을 보여줍니다.
광생물 반응기의 사용은 여러 미세 조류 재배 및 생산 문제를 해결합니다. 이 분야는 일반적으로 다른 미생물에 의한 오염, 효율적인 기판 이용(CO2 완화 또는 폐수 처리의 경우 특히 중요합니다)2,pH 제어, 조명 가변성 및 바이오 매스 생산성3. Photobioreactors는 연구원이 느리게 성장하는 종조차도 포식자 또는 경쟁 미생물로부터 보호되는 밀접하게 통제 된 배치 시스템에서 광범위한 광스트로프를 연구 할 수 있게합니다4. 이러한 배치 시스템은 공급된 가스와 평형상태일 가능성이 높은 폐쇄형 시스템이므로CO2 가동률과 바이오매스 생산성을 높이는 데에도 더 좋습니다. 광생물 반응기 기술은 또한 pH 제어를 제공하며, 그 부족은 과거 연구에서 높은 바이오 매스 생산성을 저해하고있다5. 벤치 스케일에서 광생물 반응기에서 제공하는 제어 수준은 연구자에게 유리합니다. 더 큰 산업 규모에서, 광생물 반응기는 상업적인 생물 제품 순도를 유지하고 건강 기능 식품, 화장품, 식품, 또는 사료 응용 프로그램에 대한 생산 효율을 향상시키는 데 사용할 수 있습니다6.
미세조류는CO2를 바이오매스 탄소로 빠르게 해결할 수 있기 때문에CO2의 바이오스퀘스트에 큰 관심을 받고 있습니다. 그러나CO2의 대부분의 인위적 공급원은 연소 공정 연료 원에 따라 다른 부식성 및 독성 가스 또는 오염물질(NOx,SOx,CO, Hg)으로 오염됩니다. 지속 가능한CO2 격리에 대한 관심이 증가함에 따라 석탄 화력 발전소와 같은CO2배출을 처리하는 광생물 반응기 기술의 개발이 촉발되었습니다(표1). 안타깝게도 연구 및 스케일업 프로세스 중에 부식성 및 독성 오염 물질에 대한 인체 및 환경 노출위험이 내재되어 있습니다. 따라서 부식성 가스를 이용한 생물반응기의 안전한 조립 및 작동을 설명하는 것이 필요하고 유익합니다.
이 방법은 신중하게 제어된 실험 조건 하에서 미세조류의 성장을 위한 2L 벤치 스케일 광생물반응기를 사용하기 위한 것이다. 이 프로토콜은 미세 조류 저장, 접종 준비 및 광생물 반응기 설정 및 살균을 설명합니다. 이 작업은 기본 작동 외에도 미세 조류 바이오매스 측정 및 바이오매스 생산성 계산, 부식성 가스로 미세 조류 재배를 위한 장비의 적응에 대해 설명합니다. 아래에 설명된 프로토콜은 더 큰 실험 적 제어를 발휘하고자하는 연구자, 미세 조류 성장 조건을 최적화, 또는 광영양 미생물의 범위를 축하 배양하고자하는 연구자에게 적합합니다. 이 방법은 인화성 가스를 생산하거나 소비하는 미생물의 재배에 적합한 물질을 설명하지 않습니다 (예 : CH4,H2등) 7.
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Protocol
1. 부식성 가스가 절약된 광생물 반응기의 안전한 사용 및 샘플링
참고: 이 방법은 고인화성 가스를 생산하거나 소비하는 미세 조류 배양물의 안전한 샘플링을 위한 적절한 절차를 설명하지 않습니다.
- 인간의 건강에 대한 위험으로 독성 가스를 관리합니다.
참고: 아이오와 대학의 화학 위생 계획에 따라 저자는 대학 화재 안전 코디네이터 및 대학 환경 보건 및 안전 산업 위생 책임자와 협력하여 독성 가스 작업을 위한 안전 프로토콜을 개발했습니다. - 사용 중 각 유독 가스에 대한 센서가 있는 유독 가스 모니터링 시스템을 설정합니다. 제조업체 지침에 따라 센서를 교정합니다. 제조업체의 지침에 따라 범프 테스트(교정 가스가 있는 센서 및 경보 기능 확인)를 자주 확인합니다. 연기 후드 바로 바깥쪽에 가스 모니터를 찾습니다.
- 부식성 가스 실험을 시작하기 전에 인근 직원에게 위험 및 경보 시스템을 알려주십시오. 또한 해당 지역 응급 구조대에 알립니다. 실험실 입구에 어떤 유해 가스가 사용 중이니 지정표지판을 게시합니다.
- 유독가스가 검출되면 인근 의 모든 직원에게 대피하도록 지시하십시오. 실험실 관리자 및 비상 대응 담당자에게 알립니다.
참고: 정전 시 가스 조절 타워는 정전 시 가스 흐름을 중지합니다. 그러나 실내 난방, 환기 및 공조(HVAC) 시스템 또는 연기 후드가 정전 없이 다운되면 유독 가스가 누출됩니다.
- 유독가스가 검출되면 인근 의 모든 직원에게 대피하도록 지시하십시오. 실험실 관리자 및 비상 대응 담당자에게 알립니다.
- 연기 후드가 미국 산업 위생 협회 (AIHA) 수학 모델링 스프레드 시트 IH MOD8각 가스를 사용하지 못하는 경우 실내에서 유독 가스의 가능한 축적 농도를 모델링합니다.
- 건물 HVAC 유지 보수 인력 또는 HVAC 기술자로부터 m3 분-1의 실내 공급 / 배기 공기 속도 Q를얻습니다. m3에서실험실 (L x W x H)의 볼륨, V를계산합니다. 이상적인 가스 법칙에서 적응된 방정식 1을 사용하여 mg min-1의각 유형의 독성 가스의 오염 물질 배출 속도 G를계산합니다.
(1)
P가 1 atm(ppm gas/106 ppm)에서 유독 가스에 의해 가해지는 압력의 분율이 있는 경우, Q가스는 L min-1의가스의 유량이며, R은 범용 가스 상수(0.082057 L·몰-1· K-1), T는 K의 온도이고 MW는 gmol-1의가스 분자량입니다. - IH MOD 스프레드시트의 "잘 혼합된 룸 모델"에서 각 가스에 대한 V, Q및 G(1.4.1단계에서 계산)에 대한 값을 사용하여 시뮬레이션 기간 동안 각 가스에 대한 누적 실내 가스 농도를 계산합니다. 이러한 값을 노출 한계와 비교합니다(표2)9.
- 건물 HVAC 유지 보수 인력 또는 HVAC 기술자로부터 m3 분-1의 실내 공급 / 배기 공기 속도 Q를얻습니다. m3에서실험실 (L x W x H)의 볼륨, V를계산합니다. 이상적인 가스 법칙에서 적응된 방정식 1을 사용하여 mg min-1의각 유형의 독성 가스의 오염 물질 배출 속도 G를계산합니다.
(1)2. 미세 조류 접종의 준비
- 한천 배지상에서 저온 보존 또는 배양 여부에 관계없이 저장에서 이송하여 실험을 시작하기 전에 광생물반응기용으로 선택된 장면데스무스 경사침 구형 또는 기타 미세 조류 종을 준비한다.
- 30-50 mL의 멸균 미세 조류 성장 매체 (삼중 질소 Bold의 기초 매체 [3N-BBM], 표 3)를멸균 (150-250 mL)에 거품 스토퍼로 덮인 쉐이크 플라스크에 추가하십시오.
참고: 플라스크가 아껴두지 않는 한, 쉐이크 플라스크 볼륨의 1/5만 액체 매체에 의해 점유되어야 합니다. - 세포를 경사로 옮기거나 흔들플라스크로 옮길 때 생체 안전 성 캐비닛을 사용하여 멸균을 유지하십시오. 한천의 배양의 경우 멸균 루프를 사용하여 한천 접시에서 미세 조류를 옮기거나 흔들플라스크로 기울어지세요. 저온 보존 배양을 위해, 냉동 보존 된 샘플을 서서히 해동하고 선택한 프로토콜(10)에따라 냉동 보호제를 헹구고 쉐이크 플라스크에 세포를 추가하십시오.
- 20-25°C에서 3N-BBM에서 배양 세포는 16 h:8 hh 에서 빛:어둡고 115-130 rpm에서 흔들어.
- 광학 밀도(OD) 측정(섹션 5 및 6에서와 같이)을 사용하여 시간이 지남에 따라 미세 조류 성장을 추적합니다. 미세조류가 세포를 광생물반응기로 옮기기 전에 지수 성장 단계(2−4일)에 도달할 수 있도록 하십시오.
참고: 실험의 목표에 따라, 세포는 생물 반응기의 접종 전에 여러 원심 분리 단계로 배양 배지 (이 연구) 및 / 또는 농축 될 수있다.
- 30-50 mL의 멸균 미세 조류 성장 매체 (삼중 질소 Bold의 기초 매체 [3N-BBM], 표 3)를멸균 (150-250 mL)에 거품 스토퍼로 덮인 쉐이크 플라스크에 추가하십시오.
3. 광생물반응기 설치 및 운영
- 광생물반응기(그림1)를사용하여 온도, pH, 교반 속도, 가스 유량 및 입력 용액 유량을 제어합니다.
참고: 광생물반응기는 최대 4개의 상이한 입력 용액, 일반적으로 산, 염기, 항폼 및 기판의 흐름을 제어하는 데 사용될 수 있습니다.- 각각 1N NaOH 및 1 N HCl각각 100 mL을 준비하고 250 mL 입력 솔루션 병에 각각 추가합니다. 이러한 솔루션에 보조 제약을 사용합니다.
- 딥 튜브와 멸균 인라인 에어 필터가 장착된 통풍관이 장착된 자동 변제식 병에 계량 입력 솔루션을 보관하십시오. 자동 변조 튜브를 사용하여 딥 튜브를 포토바이오리액터의 4개의 입력 포트에 연결하고, 광생물 반응기 작동 중에 입력 솔루션에 딥 튜브를 잠수합니다. 수동으로 선택한 유량 또는 pH 및 폼 레벨 프로브의 피드백에 의해 제어될 수 있는 별도의 연동 펌프를 통해 입력 솔루션과 포트 사이에 1.6mm 내부 디미터(ID) 자동 세척식 튜브를 전달합니다(산의 경우, 베이스, 및 안티폼 솔루션).
- 오토클레이브 전에 광생물 반응기 pH 미터를 보정하십시오.
- pH 프로브를 연결 라인에 끼우고 비틀어 고정하여 광생물 반응기 컨트롤 타워에 연결합니다. pH 4 및 pH 7 버퍼를 사용하여 pH 측정기를 교정합니다. pH 미터 값을 수락하기 전에 값이 안정화될 때까지 기다립니다.
- 프로브를 컨트롤 타워에 연결하는 pH 미터 코드에서 pH 프로브를 분리합니다.
- 70% 에탄올 또는 반응기프로브로 프로브를 오토클레이브하여 표면 멸균. 오토클레이브를 위해 pH 프로브를 알루미늄 호일로 단단히 고정합니다.
참고: 프로브가 오토클레이브된 경우 스팀 손상으로 인해 프로브 내부가 부식될 위험이 있습니다. 이 캡핑 방법은 손상 방지를 완전히 보장하지는 않습니다. - pH를 더 잘 조절하기 위해 배양 배지에 10 mM4-(2-하이드록세틸) 피페라진-1-에탄술포닉산(HEPES) 완충제를 첨가한다.
- 삽입 및 나사는 광생물 반응기 헤드 플레이트에 차가운 손가락과 배기 콘덴서를 닫았다.
- 접종 포트를 삽입하고 나사를 제자리에 단단히 고정시다. 광생물 반응기 헤드 플레이트 위의 접종 포트 섹션에 오토클레이브 튜브의 길이를 추가합니다. 바이오리액터를 오토클레이브하기 전에 오토클레이브 식 호스 클램프로 튜브를 닫아 고정하십시오.
- 사용하지 않은 광생물 반응기 포트에 멸균 필터로 덮인 튜브를 부착하십시오.
- 오토클레이브 튜브를 통해 광생물 반응기 입력 포트에 산 및 기본 입력 솔루션을 부착합니다. 배양 배지 1.5L를 추가합니다.
- 작동 량에 따라 121 °C에서 30-45 분 동안 반응기 및 관련 입력 솔루션을 오토클레이브하십시오.
참고: 배양 배지가 오토클레이브에 의해 부정적인 영향을 받는 경우, 층류 후드의 멸균 조건하에서 오토클레이브 후 매질을 추가합니다. 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.
주의: 오토클레이브에서 제거한 후 반응기가 뜨거워집니다. - 임펠러 모터를 임펠러 샤프트에 부착하고 피팅을 조입니다.
- 조명 요구 사항에 따라 생물 반응기 외부에 대칭으로 LED 조명 패널을 배치합니다.
- 오토클레이브에 앞서 광도계로 빛의 강도를 측정하고 기록합니다. 광생물 반응기 용기 내부에 조도 센서를 놓고 센서를 광원을 향하게 합니다.
- 최대 2개의 가스 실린더를 연결하여 광생물반응기내의 미세조류에 모의 석탄화력발전소배출량(표 1)을공급합니다.
참고: 이 연구에 사용된 가스 농도는 아이오와 대학교 발전소의 가스 농도와 거의 다 되었습니다.- 가스 실린더, 가스 조절 타워 및 광생물 반응기 스파징 링 사이의 연결을 조립합니다. 가스 실린더에 20psi 출구 압력을 가할 수 있는 적절한 레귤레이터를 부착합니다. 레귤레이터 호스 바브에 6mm ID 내압 튜브를 부착하고 호스 클램프로 고정하십시오. 호스 클램프로 고정 된 6mm 스템 빠른 연결 피팅에 호스 바브를 사용하여 가스 조절 타워 가스 입구에 압력 저항 튜브의 다른 쪽 끝을 부착합니다. 3.2mm ID 튜브를 다른 6mm 퀵 커넥트 피팅을 사용하여 가스 조절 타워 가스 배출구에 연결하고 출구 튜브의 다른 쪽 끝을 광생물 반응기 헤드플레이트의 스파징 링 포트에 연결합니다.
참고: 두 번째 입력 가스의 경우 3.9.1 단계를 반복하지만 T 자형 호스 바브를 사용하여 두 입력 가스 라인을 스퍼징 링 포트에 연결된 튜브의 단일 섹션으로 통합합니다. - 각 가스 레귤레이터에서 배출 압력을 20psi로 설정하고 생물 반응기 인터페이스를 사용하여 실험 용 가스 유량을 설정합니다.
참고: 분당 액체(vvm)당 표준 조건하에서 공기의 부피를 계산하고 보고합니다. 체적 위류량을 배양량으로 나눕니다. 미니 단위 단위로 보고합니다.
- 가스 실린더, 가스 조절 타워 및 광생물 반응기 스파징 링 사이의 연결을 조립합니다. 가스 실린더에 20psi 출구 압력을 가할 수 있는 적절한 레귤레이터를 부착합니다. 레귤레이터 호스 바브에 6mm ID 내압 튜브를 부착하고 호스 클램프로 고정하십시오. 호스 클램프로 고정 된 6mm 스템 빠른 연결 피팅에 호스 바브를 사용하여 가스 조절 타워 가스 입구에 압력 저항 튜브의 다른 쪽 끝을 부착합니다. 3.2mm ID 튜브를 다른 6mm 퀵 커넥트 피팅을 사용하여 가스 조절 타워 가스 배출구에 연결하고 출구 튜브의 다른 쪽 끝을 광생물 반응기 헤드플레이트의 스파징 링 포트에 연결합니다.
- 하나 이상의 가스 실린더를 스파징할 때,CO2 센서를 사용하여 광생물반응기에 제공된CO2 농도를 확인합니다.
- 소프트웨어(예: GasLab)와 호환되는CO2 센서를 컴퓨터의 USB 포트에 연결합니다. CO2 센서 모델에 해당하는 최신 소프트웨어를 다운로드합니다. 소프트웨어를 열고 센서 모델, 측정 시간 간격 및 측정 데이터 로깅 기간을 입력합니다.
- CO2 센서와 결합 된 가스 흐름 튜브 (생물 반응기와 튜브를 연결하기 전에)를 100-250 mL에 놓고 뚜껑을 덮고 환기 용기 (생물 반응기 외부)에 놓습니다.
참고: 실험 동안, 헤드스페이스CO2 농도는 광생물반응기 헤드플레이트상에 있는 환기튜브 중 하나에서 측정될 수 있다. - 사용자 인터페이스에서CO2 농도 측정을 시작하고 측정이 평형화될 때까지 기다립니다.
- 광생물 반응기 사용자 인터페이스를 사용하여 원하는 총 유량(0.1 Lmin-1)및CO2 농도(12%)까지 각 탱크의 가스 유량을 조정합니다. 달성됩니다.
- 광생물 반응기 사용자 인터페이스에서 STIRR 함수를 사용하여 임펠러 회전 속도를 설정합니다. 배양 배지가 희소가스 기포를 동화시킬 수 있을 만큼 혼합 속도가 충분히 빠른지 확인한다.
참고 : 특정 미세 조류 종은 약한 세포 구조를 가지고 있으며 높은 전단력에 의해 손상되거나 파열됩니다.
4. 유독 가스 사용을 위한 광생물 반응기 및 실험 설정 조정
주의: 실제 또는 시뮬레이션된 연도 가스의 부식성 가스는 부식성 및 독성입니다. 이러한 가스는 흡입하면 심각한 위험을 초래합니다.
참고: 이 방법은 인화성이 높은 가스(예: 메탄, 수소 등)를 생성하거나 소비하는 미생물의 안전한 재배를 위한 적절한 물질을 설명하지 않습니다.
- 황동, 플라스틱 및 표준 튜브 부품을 부식 방지 재료로 교체하십시오.
- NOx 또는 SOx와 물 사이의 반응에 의해 형성된 강한 산의 부식에 확실하게 저항하기 위해 스테인레스 스틸을 사용합니다. 가스 조절 타워의 가스 입구 및 출구의 플라스틱 퀵 커넥트 피팅을 스테인리스 스틸 퀵 커넥트 피팅으로 교체합니다. 황동대신 출구 호스 바브를 포함한 가스 실린더에 스테인리스 스틸 레귤레이터를 사용합니다.
- 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 또는 천연 에틸 비닐 아세테이트(EVA) 튜브를 사용하여 가스 실린더와 가스 조절 타워사이의 연결에 NOx 및 SOx 가스(각각)의 부식에 저항하고 광생물 반응기로 가스 조절 타워를 사용합니다.
- 오토클레이브 후, 광생물 반응기 및 가스 실린더를 워크인 연기 후드 내에 조립합니다. 포토바이오리액터를 보조 격납기 내부의 테이블에 놓고 가스 실린더를 독립된 실린더 칼라 또는 실린더 랙에 놓습니다.
- 기포형 액체 누출 검출기를 사용하여 기포 실린더와 생물 반응기 사이의 모든 연결에서 가스 누출을 확인하십시오. 1:100(v:v) 접시 비누 희석물로 채워진 세척병을 사용하여 소량의 비누 용액과의 연결을 덮으세요.
참고: 누수는 연결에서 버블링으로 표시됩니다. - 미세 조류 실험을 시작할 때, 예방 접종 전에 pH를 조정한 다음 (표준 광생물 반응기 실험에서와 같이) 스파징을 시작합니다.
참고: 부식성 가스 실험 중에 배양 배지를 버퍼링하는 것은 입력 가스가 강한 산성이므로 매우 권장됩니다. - 준비된 미세 조류 접종을 멸균 주사기로 흡입하고, 접종 포트에 부착된 튜브에 주사기를 끼우고, 접종 튜브 클램프를 열고, 주사기를 우울하게 하여 광생물반응기를 접종합니다.
- 가스 모니터, 가스 실린더 압력 및 광생물 반응기(샘플링 전)에 독성 가스의 높은 수준이나 누출 표시가 있는지 확인하십시오.
- 바이오리액터 및 가스 실린더 레귤레이터에 도달할 수 있도록 연기 후드 새시 개구부를 폭으로 제한합니다. 흡입 노출 위험을 방지하려면 개구부가 몸통 부위 위에 인력을 노출시키지 않도록 하십시오.
- 가스 실린더 레귤레이터를 닫힌 위치로 돌려 반응기로의 가스 흐름을 중단합니다. 연기 후드 새시를 닫고 광생물 반응기 배양물을 샘플링하기 전에 후드가 부식성 가스를 배출할 수 있도록 5분 동안 허용합니다.
- 헤드 플레이트 포트를 열고 멸균 혈청 학적 파이펫을 사용하거나 접종 / 샘플링 포트를 통해 주사기로 배양을 그리는 방식으로 연기 후드 내에서 샘플링하십시오. 가스 실린더를 열고 실험을 재개하기 전에 광생물 반응기 포트를 고정하십시오.
5. 미세 조류 바이오 매스 생산성 측정
- 캘리브레이션 곡선을 사용하여 미세 조류 배양 OD750 측정을 건조된 미세 조류 바이오매스 농도와 관련시킵니다.
- 여러 가지 (최소 : 4, 최소 작업 량 : 500 mL) 멸균 미세 조류 배지로 플라스크를 준비하고 관심종 (예 : 이 연구에서 S. 경사)을 접종하십시오.
- 성장이 기하급수적으로 증가할 때까지 배양 OD750을 측정하고, 공지된 질량의 0.45 μm 필터 멤브레인으로 내용물의 알려진 부피(최소 100 mL)를 필터링하여 플라스크를 즉시 샘플링합니다. 덮여 알루미늄 계량 보트 또는 유리 용기를 사용하여 건조 시 바이오 매스와 필터를 지지하십시오.
- 80-100 °C 사이의 오븐에서 약 18-24 시간 동안 건조 한 후 바이오 매스와 필터를 질량. 완전한 건조를 확인하려면 질량이 안정화되었는지 확인하기 위해 추가로 2−3 시간 후에 다시 측정하십시오.
- 결합된 바이오매스와 필터 질량에서 필터 질량을 빼서 바이오매스 질량을 계산합니다.
- 바이오매스 농도(여과된 배양의 부피로 나눈 바이오매스 질량)에 대해 측정된 OD750으로 캘리브레이션 곡선을 플롯하고 선형 회귀로 데이터를 맞춥니다.
6. 바이오매스 생산성 모델링 및 속도 계산
- 교정 곡선 선형 회귀를 사용하여 OD750 측정에서 실험 바이오매스 농도를 계산합니다(섹션 5에서 결정).
- 그래프 및 통계소프트웨어(재료 표)에서로지스틱 회귀(수학식 2)를 사용하여 지연에서 지수에서 고정 상까지의 배치 미세 조류 성장 데이터를 맞춥니다.
(2)
여기서 L은 곡선의 최대 바이오매스 농도 값인데, k는 지수 단계(시간-1)의상대적인 가파도이며, xo는 시그모이드 곡선의 중간점의 시간이며 x는 시간입니다.- 위의 물류 방정식을 수동으로 입력합니다. 소프트웨어의 분석 탭에서 비선형 회귀가 있는 곡선 맞춤을 선택합니다. 매개변수 왼쪽: 비선형 회귀 상자에서 새 드롭다운 상자 아래에 새 방정식 만들기를 선택합니다. 기본 명시적 방정식을 수식 문자로 사용하고 새 함수의 이름을 지정하고 새 함수를 Y = L/(1+ exp(1+ exp(x-b)))으로 정의하고 b가 xo를나타냅니다.
- 최종 및 초기 바이오매스 농도 간의 차이를 최종 및 초기 시간 의 차이로 나누어 미세 조류 배치의 전체 바이오매스 생산성을 계산합니다.
- sigmoid 중간점에서 수학식 2(수학식 3)의 미분으로부터 미세조류 배치의 최대 바이오매스 생산성을 계산합니다(x=x o.)
(3)
(2)
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Representative Results
지수상에서 수확된 녹색 미세조류, S. 경사에대한 캘리브레이션 곡선은 OD750 및 건조 바이오매스 농도로 확립되었다(그림2). 선형 회귀는R2 값이 0.9996입니다.
S. 경사 배양은 냉장 한천 접시에 저장된 배양물로부터 250 mL Erlenmeyer 플라스크에서 시작되었다. 미세조류는 10 mM HEPES 완충액으로 3N-BBM에서 접종하고 1.5 L 작동 량 (0.07 vvm)으로 2 L 광생물 반응기에서 2.2 %CO2로 아껴졌습니다(그림 1). 배치는 OD750을통해 추적되었다; 바이오매스 농도는 교정 곡선으로부터 계산한 다음 물류 곡선으로 모델링하였다(그림3). 광생물반응기는 pH 6.8, 100 cm3 분-1 총 가스 유량, 연속 280 μmolm-2 s-1 조명 및 27°C에서 배양을 유지했다. 물류 곡선은 지연에서 지수, 고정상까지 바이오매스 농도 데이터를 적합하게 합니다. 물류 모델에서, 배치 동안의 최대 바이오매스 농도는 2070±20 mgL-1,최대 바이오매스 생산성은 4.6일, 특정 바이오매스 생산성의 비율은 1.0d-1이었다. 최대 성장시 물류 곡선의 유도체로부터 산출된 최대 바이오매스 생산성은 532±60 mgL-1-1이었다.
잘 혼합된 룸 모델은 24시간 동안 연기 후드 고장의 경우NO2,SO2및 CO의 축적 된 농도를 계산하는 데 사용되었다. 이러한 값은 노출 한계와 비교하였다(표2). 예를 들어, 400 ppmNO2의 0.05 L min-1이 24h의 연기 후드 고장 기간 동안 방출되는 시나리오에서, 계산된 G = 0.0377 mg min-1,Q = 0.0001 m3 min-1,V = 100 m3,및 시뮬레이션에 대한 최대 시간 = 1440 분의 입력이 있는 잘 혼합 된 방 모델은 허용 가능한 만성 노출 한계 (미국 정부 산업 임계값 값)를 초과하는 0.54 mg m-3 (0.29 ppm)에NO 2 축적을 예측합니다 . ACGIH TLV]) 및 단기 노출 한계(STEL) 미만입니다.
시뮬레이션 된 연도 가스를 가진 유망한 예비 시험은 12 %CO2 및 초제로 공기 (510 ± 40 mg L-1 -1)보다더 큰 최대 미세 조류 바이오 매스 생산성 속도 (690 ± 70 mg L-1 d-1)를달성했습니다(그림 4). 실험에 앞서 가스 모니터를 CO, NO2및 SO2로보정했습니다. 시뮬레이션 된 연도 가스 실험은 부식성 가스로 인한 장비의 인력 또는 손상에 대한 위험없이 수행되었습니다.
그림 1: 빨간색과 파란색 LED 조명으로 조명된 벤치탑 포토바이오리액터. 광생물 반응기는 1.5L 작업량을 가진 2L 배치 반응기로 작동합니다. 광생물 반응기는 헤드 플레이트의 포트를 통해 스파징 링과 과잉 가스 통풍구를 통해 지속적으로 가스로 공급됩니다. 몰리터 외5. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: OD750과 S. 경사 셀 건조 중량을 연관하는 캘리브레이션 곡선. S. 비스듬한 세포 배양 광 흡수는 750 nm에서 측정한 다음, 세포를 여과하고 건조하여 세포 건기 측정을 얻었다. 몰리터 외5. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 로지스틱 회귀로 모델링된 2.2%CO2 입력에서의 S. 경사 성장 데이터. 데이터 포인트는 광학 밀도 측정에서 계산된 바이오매스 값을 나타냅니다. 데이터는 최소 제곱 피팅을 통한 로지스틱 회귀로 모델링되었습니다. 
여기서 L = 1955 mg L-1, k = 1.154 d-1,및 x0 = 3.317 d. R2 = 0.995. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 추가 시뮬레이션된 연도 가스 구성 요소와 관계없이 12%CO2에서모델링된 S. 경사 성장. 미세 조류의 각 배치에서 바이오 매스 측정물류 회귀로 모델링되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 구성 요소 | 백분율 |
| H2O | 12.6% |
| CO2 | 11.6% |
| O2 | 5.8% |
| 공동 | 0.048% |
| SO2 | 0.045% |
| NO2 | 0.022% |
| N2 | 69.9% |
표 1: 석탄화력발전소 배출량의 구성. 이 수량은 아이오와 대학 발전소 배기가스 배출 데이터에서 10시간 동안 분 간격으로 수집된 평균값입니다.
| 유독 가스 | Twa | 천장 | 스텔 ("스텔 주) | 니오쉬 IDLH | 니오쉬 렐 | ACGIH TLV | CDC 설명 |
| 공동 | 35 ppm | 200 ppm | - | 1,200 ppm | 35 ppm | 25 ppm | 무색, 무취 |
| SO2 | 2 ppm | 100 ppm | 5 ppm | 100 ppm | 2 ppm | 2 ppm | 특징적이고 자극적이며 매운 냄새가 나는 무색 가스 |
| NO2 | 3 ppm | 5 ppm | 1 ppm | 13 ppm | 1 ppm | 0.2 ppm | 황갈색 액체 또는 적갈색 가스(70°F 이상)와 매운 냄새가 납니다. |
표 2: 연도 가스의 독성 가스(CO, SO2,NO2)에대한 노출 제한 및 설명. OSHA TWA: 시간 가중 평균 (일반적으로 8 시간 기간), 천장 : 값에 도달 할 수 없습니다, STEL : 단기 노출 제한 (15 분 이상 TWA), NIOSH IDLH : 생명과 건강에 위험, NIOSH REL : 15 분 노출 제한, ACGIH TLV : 허용 만성 노출 제한, 아픈 영향없음.
| 화합물 | M m |
| 나노3 | 8.82 x 100 |
| MgSO4·7H2O | 3.04 x 10-1 |
| Nacl | 4.28 x 10-1 |
| K2HPO4 | 4.31 x 10-1 |
| KH2PO4 | 1.29 x 100 |
| CaCl2·2H2O | 1.70 x 10-1 |
| ZnSO4·7H2O | 3.07 x 10-2 |
| MnCl2·4H2O | 7.28 x 10-3 |
| MoO3 | 4.93 x 10-3 |
| CuSO4·5H2O | 6.29 x 10-3 |
| 공동 (NO3)2·6H2O | 1.68 x 10-3 |
| H3BO3 | 1.85 x 10-1 |
| Edta | 1.71 x 10-1 |
| 코 | 5.52 x 10-1 |
| FeSO4·7H2O | 1.79 x 10-2 |
| H2SO4 (농축) | 1 x 10-3 μL |
표 3: 삼중 질소 Bold의 기저 배지 (3N-BBM)의 조성. 질소의 양은 원래 Bold의 기저 매체11에서세 배로 되었습니다.
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Discussion
배치, 축사 광생물반응기 규제 pH, 온도, 가스 유량 및 가스 농도를 가진 실험은 비표적 조류 균주에 의한 오염과 배양 조건의 가변성을 제거하여 의미 있는 결과를 촉진합니다. 정확한 순수 배양 성장 역학은 영양분으로 작용하여 폐가스를 동물 사료와 같은 귀중한 제품으로 바꾸는 부식성 가스(CO2,SO2,NO2)가있는경우에도 얻을 수 있습니다.
어떤 미세 조류 실험을 시작 하기 전에, 선택한 미세 조류 배양 저장에서 가져와 액체 배양에 다시 적응 한다. 미세조류를 지수 단계로 성장하면 실험이 동등한 초기 조건을 가지며 접종 후 지연 단계에서 미세 조류가 정체되지 않을 확률이 향상됩니다.
광학 밀도 및 바이오매스 농도와 관련된 교정 곡선은 바이오매스 생산성 을 연구하는 동안 특히 중요합니다. 높은 미세 조류 바이오 매스 생산성은 미세 조류 산업의 주요 목표 중 하나이며, 이와 같이, 종종 연구 성공의 지표입니다12. 따라서 광학 밀도 측정에서 바이오매스 농도를 정확하게 계산하는 것은 종별, 정밀하고 정확한 교정 곡선 데이터에서 비롯되어야 합니다. 잠재적인 광학 간섭을 방지하려면 교정 곡선과 실험 중에 동등한 배경 솔루션으로 측정해야 합니다. 추가적으로, 캘리브레이션 곡선은 성장 단계에서 미세조류로부터 취해진 측정으로 이루어져야 한다(들) 실험에서 가장 대표적인. 특정 미세 조류 종은 광학 밀도 및 인식 된 바이오 매스 농도를 변경할 수있는 다른 성장 단계 동안 세포 크기에 극적인 차이가있을 수 있습니다. 바이오매스 생산성은 성장률과 관련이 있지만 동등하지는 않다는 점에 유의해야 합니다. 특이적 성장속도는 존재하는 세포 수(시간대비 세포 밀도의 변화/세포 밀도의 변화)에 따라 달라지며, 특정 바이오매스 생산성은 세포의 대량 질량(mg/L 바이오매스당 시간당 mg/L 바이오매스의 변화)에 따라 달라지다13.
미세 조류 바이오매스 농도를 물류 곡선으로 모델링하면 바이오매스 농도를 보간하고 바이오매스 생성량을 정확하게 계산하여 실험 결과를 의미 있게 비교할 수 있습니다. 그러나 이러한 실험 결과를 해석할 때는 주의를 기울여야 합니다. 전체 및 최대 배치 바이오매스 생산성을 비교하는 것은 부적절합니다. 최대 바이오매스 생산성 값은 배치 결과를 비교하는 데 유용하지만, 실험 기간 및 미세 조류 성장 단계에 대한 추가 정보 없이 는 전반적인 바이오매스 생산성이 오해의 소지가 있습니다. 이러한 속도는 지연, 로그 증가 및 고정 단계 동안 지속적으로 변경됩니다.
발전소 또는 산업용 연소 배출의 특징인 부식성 가스를 실험하는 동안 인간의 건강과 장비 수명을 위해 주의를 기울여야 합니다. 표준 부품은 보다 견고한 재료로 교체해야 하며, 부식에 저항하고 누출을 방지하며 사람의 노출을 방지하기 위해 튜브와 같은 소모품을 더 자주 검사하고 교체해야 합니다. 안전하고 성공적인 운영 및 샘플링에는 추가적인 안전 조치와 위험 인식이 필수적입니다. 이 방법은 헤드스페이스 내에 가스가 축적될 가능성이 있으며 장비가 이러한 위험을 위해 설계되지 않았으며 이러한 조건에 안전하게 적응하기에 적합하지 않기 때문에 인화성 가스에 적합하지 않습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 자료는 그랜트 번호 1546595에서 국립 과학 재단 대학원 연구 펠로우십에 의해 지원 되는 작업을 기반으로 합니다. 이 자료에 표현 된 의견, 결과 및 결론 이나 권고는 저자의 의견이며 반드시 국립 과학 재단의 견해를 반영하지 는 않습니다. 이 작품은 또한 아이오와 대학 대학원 및 전문 학생 정부 연구 보조금, 아이오와 재단, 앨런 S. 헨리 엔다우먼트의 대학에 의해 지원되었다. 연구는 W. M. Keck Phytotechnologies 실험실에서 실시되었습니다. 저자는 아이오와 대학 발전소 직원, 특히 마크 맥스웰(Mark Maxwell)에게 시뮬레이션된 연도 가스에 대한 전문 지식과 재정적 지원에 감사를 표하고 싶습니다. 저자는 또한 샘플링 및 분석에 대한 그녀의 도움에 대한 에밀리 무어와 그녀의 도움과 프로토콜 비디오에 참여 에밀리 그린을 인정하고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biostat A bioreactor | Sartorius Stedim | 2-liter bioreactor for microbial fermentation; designed to be autoclaved; pH, temperature, gas flow rate control | |
| Bump test NO2 gas | Grainger | GAS34L-112-5 | Calibration gas for MultiRAE gas detector |
| Bump test O2, CO, LEL gas | Grainger | GAS44ES-301A | Calibration gas for MultiRAE gas detector |
| Bump test SO2 gas | Grainger | GAS34L-175-5 | Calibration gas for MultiRAE gas detector |
| Corrosion resistant tubing for NO2 gas | Swagelok | SS-XT4TA4TA4-6 | PTFE Core Hose Smooth Bore X Series—Fiber Braid and 304 SS Braid Reinforcement |
| Corrosion resistant tubing for SO2 gas | QC Supply | 120325 | Reinforced Braided Natural EVA Tubing - 1/4" ID |
| cozIR 100% CO2 meter | Gas Sensing Solutions Ltd. | CM-0121 at CO2meter.com | CO2 meter for concentrations up to 100% |
| cozIR 20% CO2 meter | Gas Sensing Solutions Ltd. | CM-0123 at CO2meter.com | CO2 meter for concentrations up to 20% |
| Durapore Membrane Filter, 0.45 μm | Millipore Sigma | HVLP04700 | Hydrophilic, plain white, 47 mm diameter, 0.45 μm pore size, PVFD membrane filters |
| Gas cylinder regulators | Praxair | PRS 40221331-660 | Single-stage stainless steel regulator configured for 0-15 psi outlet assembly diaphragm valve with 1/4" MNPT threads, Stainless steel to resist corrosion from NOx and SOx |
| Gas cylinders | Praxair | Ulta-zero air, high purity CO2, or custom gas composition | Dependent on study objectives |
| Gas monitoring and leak detection system | RAE Systems by Honeywell | MAB3000235E020 | Pumped model that detects O2, SO2, NO2, CO, and LEL |
| GasLab software | GasLab | v2.0.8.14 | Software for CO2 meter measurements and data logging |
| Hose barb | Grainger | Item # 3DTN3 | Used to adapt regulators to tubing, Stainless steel to resist corrosion from NOx and SOx |
| K30 1% CO2 meter | Senseair | CM-0024 at CO2meter.com | CO2 meter for concentrations less than 1% |
| LED grow panels | Roleadro | HY-MD-D169-S | Red & blue LED light panels |
| Memosens dissolved oxygen probe | Endress+ Hauser | COS22D-19M6/0 | Autoclavable (with precautions) dissolved oxygen probe for bioreactor |
| Memosens pH probe | Endress+ Hauser | CPS71D-7TB41 | Autoclavable (with precautions) pH probe for bioreactor |
| Oven, Isotemp 500 Series | Fisher Scientific | 13246516GAQ | Small oven for drying |
| Prism GraphPad software | GraphPad Software | Version 7.03 or 8.0.1 | Graphing software for data organization, data analysis, and publication-quality graphs |
| Stem to hose barb fitting | Swagelok | SS-4-HC-A-6MTA | Stainless Steel Hose Connector, 6 mm Tube Adapter, 1/4 in. Hose ID |
| Tubing, dilute acid/base transfer | Allied Electronics and Automation | 6678441 | Silicone TP Process Tubing; 1.6mm Bore Size; 3000mm Long; Food Grade |
| Tubing, gas transfer | Allied Electronics and Automation | 6678444 | Silicone TP Process Tubing; 3.2mm Bore Size; 3000mm Long; Food Grade |
References
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