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Environment

Cultivo de microalgas e quantificação de biomassa em um fotobiorreator em escala de banco com gases corrosivos de flue

Published: December 19, 2019 doi: 10.3791/60566

Summary

O cultivo axenic da bancada-escala facilita a caracterização microalgal e a optimização da produtividade antes da escala subseqüente do processo-acima. Os fotobiorreatores fornecem o controle necessário para experimentos microais confiáveis e reprodutíveis e podem ser adaptados para cultivar microalgas com segurança com os gases corrosivos (CO2,SO2,NO2)das emissões de combustão municipal ou industrial.

Abstract

Fotobireatores são sistemas de cultivo iluminados para experimentos em microorganismos fototróficos. Esses sistemas fornecem um ambiente estéril para o cultivo de microalgas, com temperatura, pH e composição de gás e controle da taxa de fluxo. Em escala de bancada, os fotobireatores são vantajosos para pesquisadores que estudam propriedades microalgal, produtividade e otimização de crescimento. Em escalas industriais, fotobioreatores podem manter a pureza do produto e melhorar a eficiência da produção. O vídeo descreve a preparação e o uso de um fotobiorreator em escala de bancada para o cultivo de microalgas, incluindo o uso seguro de insumos corrosivos de gás, e detalha medições relevantes de biomassa e cálculos de produtividade de biomassa. Especificamente, o vídeo ilustra o armazenamento e a preparação da cultura microalgal para a inoculação, o conjunto e a esterilização do fotobiorreator, as medidas da concentração da biomassa, e um modelo logístico para a produtividade microalgal da biomassa com taxa cálculos, incluindo produtividademáxima e global de biomassa. Além disso, uma vez que há um interesse crescente em experimentos para cultivar microalgas usando emissões de gases de resíduos simulados ou reais, o vídeo cobrirá as adaptações de equipamentos fotobiorereatores necessárias para trabalhar com gases corrosivos e discutir amostragem segura em tais cenários.

Introduction

Fotobiorreatores são úteis para experimentos controlados e cultivo de produtos microalgal mais puros do que pode ser alcançado por lagoas abertas. O cultivo de microalgas em fotobiorreatores em escala de bancada suporta o desenvolvimento de conhecimentos fundamentais que podem ser usados para a ampliação do processo. Pequenas alterações nas condições ambientais podem alterar significativamente experimentos microbiológicos e confundir os resultados1. Um processo estéril com controle de temperatura, pH e gás sparging é vantajoso para estudar propriedades microalgas e desempenho em condições variadas. Além disso, o controle sobre as concentrações de gás de entrada, temperatura, força de cisalhamento da mistura e pH médio pode suportar diversas espécies que são de outra forma desafiadoras para cultivar. Fotobireatores podem ser executados como um processo de lote com alimentação contínua de gás e sparging, ou como um sistema de fluxo de chemostat-through com alimentação contínua de gás e sparging mais influentes e efluentes insumos de nutrientes de águas residuais. Aqui, demonstramos o processo de lote com alimentação contínua de gás e sparging.

O uso de fotobiorreatores aborda vários desafios de cultivo e produção de microalgas. O campo geralmente luta com preocupações de contaminação por outros microrganismos, utilização eficiente de substratos (o que é especialmente importante no caso de mitigação de CO2 ou tratamento de águas residuais)2,controle de pH, variabilidade de iluminação e produtividade de biomassa3. Fotobiorreatores permitem que os pesquisadores estudem uma ampla gama de fototrophs em sistemas de lote controlados de perto, onde até mesmo espécies de crescimento lento são protegidas de predadores ou microorganismos concorrentes4. Esses sistemas de lote também são melhores em facilitar maiores taxas de utilização de CO2 e produtividade de biomassa porque são sistemas fechados que são mais propensos a estar em equilíbrio com gases fornecidos. A tecnologia fotobiorreator também oferece controle de pH, a falta de que tem dificultado a alta produtividade da biomassa em estudos anteriores5. Na escala de bancada, o nível de controle oferecido pelos fotobiorreatores é vantajoso para os pesquisadores. Em escalas industriais maiores, fotobiorreatores podem ser usados para manter a pureza de bioproduto comercial e melhorar a eficiência de produção para aplicações nutracêuticos, cosméticos, alisônicos ou alimentares6.

Microalgas são de grande interesse para a biosequestration de CO2, porque eles podem corrigir rapidamente CO2 como carbono de biomassa. No entanto, a maioria das fontes antropogênicas de CO2 estão contaminadas com outros gases ou contaminantes corrosivos e tóxicos (NOx,SOx, CO, Hg), dependendo da fonte de combustível do processo de combustão. O crescente interesse no sequestro sustentável de CO2 levou ao desenvolvimento de tecnologias de fotobiorreatores para tratar as emissões ricas em CO2,como as de usinas a carvão(Tabela 1). Infelizmente, há um risco inerente de exposição humana e ambiental aos contaminantes corrosivos e tóxicos durante processos de pesquisa e ampliação. Como tal, descrever a montagem segura e operação de biorreatores usando gases corrosivos é necessário e instrutivo.

Este método é para o uso de um fotobioreator 2 L em escala de bancada para o crescimento de microalgas condições experimentais cuidadosamente controladas. O protocolo descreve o armazenamento microalgal, a preparação do inoculum, e a instalação e a esterilização do fotobiorreator. Além do funcionamento básico, este trabalho descreve medições de biomassa microalgal e cálculos de produtividade de biomassa, e adaptação do equipamento para cultivo de microalgas com gases corrosivos. O protocolo descrito abaixo é apropriado para pesquisadores que buscam exercer maior controle experimental, otimizar condições de crescimento microalgal, ou cultura axenicamente uma gama de micróbios fototróficos. Este método não descreve materiais apropriados para o cultivo de micróbios que produzem ou consomem gases inflamáveis (por exemplo, CH4,H2,etc.) 7.

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Protocol

1. Uso seguro e amostragem de um fotobiorreator esparged com gases corrosivos

NOTA: Este método não descreve os procedimentos adequados para amostragem segura de culturas microalgal que produzem ou consomem gases altamente inflamáveis.

  1. Gerenciar o gás tóxico como um risco para a saúde humana.
    NOTA: De acordo com o Plano de Higiene Química da Universidade de Iowa, os autores trabalharam com o Coordenador de Segurança contra Incêndios da Universidade e o Diretor de Higiene Industrial de Saúde Ambiental e Segurança da Universidade para desenvolver um protocolo de segurança para trabalhar com os gases tóxicos.
  2. Configure um sistema de monitoramento de gás tóxico com sensores para cada um dos gases tóxicos em uso. Calibrar os sensores de acordo com as instruções do fabricante. Teste de colisão (verifique se há funcionalidade de sensor e alarme com gases de calibração) com freqüência, de acordo com as instruções do fabricante. Localizar o monitor de gás do lado de fora do capô da fumaça.
  3. Antes de iniciar quaisquer experimentos de gás corrosivo, notifique o pessoal próximo do sistema de risco e alarme. Além disso, notificar os socorristas locais apropriados. Sinais postais nas entradas de laboratório especificando quais gases perigosos estão em uso.
    1. Instrua todo o pessoal próximo a evacuar se o gás tóxico for detectado. Notifique os supervisores de laboratório e o pessoal de resposta a emergências.
      NOTA: Em uma queda de energia, a torre reguladora de gás vai parar o fluxo de gás quando perde energia. Entretanto, se o sistema do aquecimento, da ventilação, e do condicionamento de ar do quarto (HVAC) ou a capa de fume vão para baixo sem um falho eléctrico, este conduzirá ao gás tóxico de escape.
  4. Modele a possível concentração acumulada de gases tóxicos na sala se o capô de fumaça falhar usando a planilha de modelagem matemática de modelagem matemática IH MOD8 da Associação Americana de Higiene Industrial (AIHA) para cada gás.
    1. Obter a taxa de fornecimento/exaustão da sala, Q,em m3 min-1 do pessoal de manutenção de climatização de edifícios ou técnico de Climatização. Calcule o volume, V,do laboratório (L x W x H) em m3. Calcule a taxa de emissão de contaminantes, G,de cada tipo de gás tóxico em mg min-1,usando a Equação 1 adaptada da lei ideal de gás:
      Equation 1(1)
      onde P é a fração de pressão exercida pelo gás tóxico em 1 atm (ppm gás/106 ppm), ogás Q é a taxa de fluxo do gás em L min-1, R é a constante universal do gás (0.082057 L·atm·mol-1· K-1), T é temperatura em K, e MW é o peso molecular do gás em g mol-1.
    2. Use os valores para O algoritmo V, Qe G para cada gás (calculado na etapa 1.4.1) no algoritmo "Modelo de sala bem misturada com opção de cessar a geração e o expurgo da sala de modelos" na planilha ih mod para calcular as concentrações de gás acumulado para cada gás durante um período de simulação de 1440 min (24 h). Compare esses valores com os limites de exposição(Tabela 2)9.

2. Preparação do inóculo microalgal

  1. Prepare o Scenedesmus obliquus inoculum, ou outras espécies microalgal selecionadas para o fotobioreator, antes do início do experimento, transferindo-o do armazenamento, seja criopreservado ou cultivado na mídia ágara.
    1. Adicione 30 a 50 mL de médio estéril de crescimento microalgal (meio basal de triple-nitrogen Bold [3N-BBM], Tabela 3) a um frasco estéril (150-250 mL) de agitação tampado com uma rolha de espuma.
      NOTA: A menos que o frasco é escasso, apenas um quinto do volume de frasco shake deve ser ocupado por mídia líquida.
    2. Use um armário de biossegurança para manter a esterilidade ao transferir células para uma inclinação ou agitar frasco. Para culturas no ágar, use um laço estéril para transferir microalgas de sua placa ou inclinação do ágar à garrafa da agitação. Para culturas criopreservadas, descongele gradualmente a amostra criopreservada e lave o crioprotetor de acordo com o protocolo escolhido10,em seguida, adicione as células ao frasco de tremer.
    3. Células culturais em 3N-BBM a 20-25 °C 16 h:8 h luz: escuro e tremendo em 115-130 rpm.
    4. Acompanhe o crescimento microalgal ao longo do tempo usando medições de densidade óptica (OD) (como nas seções 5 e 6). Permitir que as microalgas atinjam sua fase de crescimento exponencial (2 a 4 dias) antes de transferir as células para o fotobiorreator.
      NOTA: Dependendo do objetivo do experimento, as células podem ser enxaguadas de meio cultural (este estudo) e/ou concentradas com múltiplas etapas de centrifugação antes da inoculação do biorreator.

3. Configuração e operação de fotobioreator

  1. Use o fotobiorreator(Figura 1)para controlar a temperatura, o pH, a taxa de agitação, as taxas de fluxo de gás e as taxas de fluxo da solução de entrada.
    NOTA: O fotobiorreator pode ser usado para controlar o fluxo de até quatro soluções diferentes de entrada, comumente ácido, base, antiespuma e substrato.
    1. Prepare 100 mL cada um de 1 N NaOH e 1 N HCl e adicione cada um a um frasco da solução da entrada de 250 mL. Use contenção secundária para essas soluções.
    2. Armazenar soluções de entrada medidas em garrafas tampadas autoclaváveis equipadas com tubos de mergulho e um tubo de ventilação com um filtro de ar estéril em linha. Conecte os tubos de mergulho às quatro portas de entrada do fotobiorúmetro usando tubos autolavaficáveis e, durante a operação do fotobiorreator, submerse os tubos de mergulho nas soluções de entrada. Passe a tubulação autofálica de dimímetro dentro (ID) de 1,6 mm entre as soluções de entrada e suas portas através de bombas peristaltic separadas que podem ser controladas por taxas de fluxo selecionadas manualmente ou por feedback de sondas de pH e espuma (no caso de ácido, soluções básicas e antiespuma).
  2. Calibrar o medidor de pH fotobiorreator antes da autocllavagem.
    1. Conecte a sonda pH à torre de controle do fotobioreator, ajustando a sonda à linha de conexão e torcendo para bloquear. Use tampões de pH 4 e pH 7 para calibrar o medidor de pH. Espere até que os valores se estabilizem antes de aceitar o valor do medidor de pH.
    2. Desligue a sonda pH do cabo do medidor de pH que conecta a sonda à torre de controle.
    3. Superfície esterilizar com 70% de etanol ou autoclave a sonda com o reator. Para autoclave, tampa a ponta de prova do pH firmemente com folha de alumínio.
      NOTA: Se a sonda é autocllavada, há um risco de corrosão do interior da sonda de danos a vapor. Este método de nivelamento não garante completamente a prevenção de danos.
    4. Adicione 10 mM 4-(2-hidroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic ácido (HEPES) buffer para o meio de cultura para melhor controlar pH.
  3. Insira e parafuso fechou o dedo frio e condensador de escape na placa do fotobioreator.
  4. Insira a porta de inoculação e parafuso firmemente no lugar. Adicione um comprimento de tubulação autolavavável à seção da porta da inoculação acima da placa do photobioreactor. Antes de autocllavar o biorreator, aperte a tubulação fechada com uma braçadeira de mangueira autolavavável.
  5. Anexar tubos tampados com filtros estéreis para quaisquer portas de fotobioratores não utilizados.
  6. Anexe soluções de entrada de ácido e base para as portas de entrada de fotobioreatores através de tubos autolavaficáveis. Adicione 1,5 L de meio de cultura.
  7. Autoclave o reator e soluções de entrada associadas para 30-45 min em 121 °C de acordo com o volume de trabalho.
    NOTA: Se o meio da cultura é afetado adversamente autoclaving, adicione os meios após autoclaving circunstâncias estéreis em uma capa de fluxo laminar. O protocolo pode ser pausado aqui.
    CUIDADO: Reator será quente após a remoção do autoclave.
  8. Anexar o motor impulsoeller para o eixo impeller e aperte o encaixe.
  9. Organizar painéis de luz LED simetricamente fora do biorreator de acordo com os requisitos de iluminação.
    1. Antes da autoclivar, medir e registrar a intensidade da luz com um fotômetro. Coloque o sensor de iluminação dentro da embarcação do fotobioreator e enfrente o sensor em direção à fonte de luz.
  10. Conecte até dois cilindros de gás para fornecer as emissões simuladas de usinas a carvão(Tabela 1)às microalgas do fotobiorreator.
    NOTA: As concentrações de gás utilizadas neste estudo aproximaram as da usina da Universidade de Iowa.
    1. Monte as conexões entre o cilindro de gás, a torre reguladora de gás e o anel de esparging do fotobiorreator. Anexe reguladores apropriados capazes de 20 psi pressão de saída para os cilindros de gás. Anexar 6 mm ID tubos resistentes à farpa de mangueira de tomada reguladora e seguro com uma braçadeira de mangueira. Anexar a outra extremidade da tubulação resistente à pressão para o gás que regula a enseada de gás da torre usando uma farpa de mangueira para 6 mm haste rápida conectar montagem segura com uma braçadeira mangueira. Conecte tubos de identificação de 3,2 mm à tomada de gás da torre reguladora de gás usando outra montagem de conexão rápida de 6 mm e conecte a outra extremidade da tubulação de saída à porta de anel espargante na placa do fotobioreator.
      NOTA: Para um segundo gás de entrada, repita o passo 3.9.1, mas use uma farpa de mangueira em forma de T para consolidar as duas linhas de gás de entrada para uma única seção do tubo conectado à porta anel sparging.
    2. Defina a pressão de saída para 20 psi em cada regulador de gás e use a interface do biorreator para definir taxas experimentais de fluxo de gás.
      NOTA: Calcule e relate o volume de ar em condições padrão por volume de líquido por minuto (vvm); divida a taxa de fluxo de gás volumétrico pelo volume da cultura. Relatório em unidades de per miniute.
  11. Ao sparging com mais de um cilindro de gás, confirme a concentração fornecida de CO2 para o fotobioreactor com um sensor de CO2.
    1. Conecte um sensor de CO2 compatível com software (por exemplo, GasLab) à porta USB de um computador. Baixe o software mais recente que corresponde ao modelo de sensor CO2. Abra o software e a entrada do modelo do sensor, intervalo de tempo de medição e duração do registro de dados de medição.
    2. Coloque o sensor CO2 e o tubo de fluxo de gás combinado (antes de conectar o tubo com o biorreator) em uma embarcação de 100 a 250 mL, tampada e ventilada (externa ao biorreator).
      NOTA: Durante o experimento, as concentrações de HEADSPACE CO2 podem ser medidas a partir de um dos tubos de ventilação na placa do fotobiorreator.
    3. Inicie as medições de concentração de CO2 na interface do usuário e aguarde o equilíbrio das medições.
    4. Use a interface do usuário do fotobiorreator para ajustar as taxas de fluxo de gás de cada tanque até a taxa de fluxo total desejada (0,1 L min-1)e concentração de CO2 (12%) é alcançado.
  12. Na interface do usuário do fotobiorreator, use a função STIRR para definir a taxa de rotação do impulsor. Certifique-se de que a taxa de mistura é rápida o suficiente para o meio de cultura para assimilar as bolhas de gás escassas.
    NOTA: Certas espécies microalgal têm estruturas celulares fracas e serão danificadas ou rompidas pela força de cisalhamento elevado.

4. Adaptação do fotobioreator e configuração experimental para uso de gás tóxico

CUIDADO: Os gases corrosivos no gás flue real ou simulado são corrosivos e tóxicos. Estes gases representam um risco grave se inalados.
NOTA: Este método não descreve materiais apropriados para o cultivo seguro de micróbios que produzem ou consomem gases altamente inflamáveis (ou seja, metano, hidrogênio, etc.).

  1. Substitua os componentes de latão, plástico e tubos padrão por materiais resistentes à corrosão.
    1. Use aço inoxidável para resistir confiantemente à corrosão dos ácidos fortes formados pela reação entre NOx ou SOx e água. Substitua acessórios de conexão rápido de plástico nas enseadas de gás e tomadas na torre reguladora de gás com acessórios de conexão rápidos de aço inoxidável. Use reguladores de aço inoxidável para cilindros de gás, incluindo a farpa de mangueira de tomada, em vez de latão.
    2. Use politetrafluoroetileno (PTFE) ou acetato de vinil etípio natural (EVA) tubulação para resistir à corrosão de NOx e SOx gases (respectivamente) nas conexões entre o cilindro de gás para a torre reguladora de gás e a torre reguladora de gás para o fotobiorreator.
  2. Após a autoclagem, montar o fotobiorreator e cilindros de gás dentro de um walk-in capa de fumaça. Coloque o fotobiorreator em uma mesa dentro de contenção secundária e coloque cilindros de gás em colares de cilindro de pé livre ou um rack de cilindro.
  3. Depois de iniciar o fluxo de gás, use um detector de vazamento de líquido tipo bolha para verificar se há vazamentos de gás em todas as conexões entre os cilindros de gás e biorreator. Use uma garrafa de lavagem cheia de uma diluição 1:100 (v:v) de sabão prato: água para cobrir a conexão com um pequeno fluxo de solução de sabão.
    NOTA: Vazamentos serão indicados borbulhando nas conexões.
  4. Ao iniciar os experimentos microalgal, começar a sparging, em seguida, ajustar pH antes da inoculação (como em experimentos fotobioróticopadrão).
    NOTA: Proteger o meio de cultura durante experimentos de gás corrosivo é altamente recomendado, uma vez que os gases de entrada são fortemente ácidos.
  5. Inocular o fotobioreator aspirando o inóculo microalgal preparado em uma seringa estéril, ajustando a seringa à tubulação unida à porta da inoculação, abrindo a braçadeira de tubulação da inoculação, e deprimindo a seringa.
  6. Verifique o monitor de gás, pressões do cilindro de gás e fotobioreator duas vezes ao dia (e antes da amostragem) para níveis elevados de gás tóxico ou indicação de vazamentos.
  7. Limite a abertura da faixa da capa da fumaça a uma largura que permita que os reguladores do biorreator e do cilindro de gás sejam alcançados. Para evitar o risco de exposição à inalação, garantir que a abertura não exponha pessoal acima da região do tronco.
  8. Vire os reguladores do cilindro de gás para a posição fechada para cessar o fluxo de gás para o reator. Feche a faixa da capa de fumaça e permita que 5 min para que a capa evacue os gases corrosivos antes de provar a cultura do fotobiorreator.
  9. Amostra dentro da capa de fumaça, seja abrindo uma porta de cabeça e usando um tubo sorológico estéril ou extraindo cultura em uma seringa através da porta de inoculação/amostragem. Proteger as portas fotobioreator antes de abrir os cilindros de gás e retomar o experimento.

5. Medir a produtividade da biomassa microalgal

  1. Use uma curva de calibração para relacionar a cultura microalgal OD750 medições às concentrações secas da biomassa microalgal.
    1. Prepare vários frascos (mínimos: 4, volume mínimo de trabalho: 500 mL) frascos com meio microalgal estéril e inocular com a espécie de interesse (por exemplo, S. obliquus neste estudo).
    2. Medir a cultura OD750 até que o crescimento seja exponencial, e prontamente amostra sacrificialmente os frascos filtrando volumes conhecidos (mínimo de 100 mL) do conteúdo com uma membrana de filtro de 0,45 μm de massa conhecida. Use alumínio coberto pesar barcos ou vasos de vidro para suportar a biomassa e filtros como eles são secos.
    3. Massa a biomassa e filtros após a secagem por aproximadamente 18-24 h em um forno entre 80-100 °C. Para verificar a secagem completa, medir novamente após um adicional de 2-3 h para determinar se a massa se estabilizou.
    4. Subtraia a massa de filtro da massa combinada de biomassa e filtro para calcular a massa de biomassa.
    5. Trace a curva de calibração medida o OD750 contra a concentração de biomassa (massa de biomassa dividida pelo volume de cultura filtrada) e encaixe os dados com uma regressão linear.

6. Modelagem de produtividade de biomassa e cálculos de taxas

  1. Calcule as concentrações de biomassa do experimento a partir de medições de OD750 usando a curva de calibração de regressão linear (determinada na seção 5).
  2. Ajuste dados de crescimento microalgal do grupo da retardação à fase exponencial à estacionária com uma regressão logística (Equação 2) no software da grafeleção e das estatísticas(tabela dos materiais):
    Equation 2(2)
    onde L é o valor máximo de concentração de biomassa da curva, k é a inclinação relativa da fase exponencial (tempo-1), xo é o tempo do ponto médio da curva sigmoidal, e x é tempo.
    1. Digite manualmente a equação logística acima. Selecione ajuste uma curva com regressão não linear na aba análise no software. À esquerda dos Parâmetros: Caixa de regressão não linear, escolha Criar nova equação a nova caixa de entrega. Use a equação explícita padrão como tipo de equação, nomeie a nova função e defina a nova função como Y = L/(1+ exp (-k*(x-b)), onde b representa xo.
  3. Calcule a produtividade global da biomassa do lote de microalgas dividindo a diferença entre as concentrações de biomassa final e inicial pela diferença entre os tempos final e o ininicial.
  4. Calcule a produtividade máxima de biomassa do lote microalgal do derivado da Equação 2 (Equação 3) no ponto médio sigmoide, quando x = xo.
    Equation 3(3)

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Representative Results

Uma curva de calibração para as microalgas verdes, S. obliquus,colhida sana fase exponencial, foi estabelecida com concentrações de OD750 e biomassa seca(Figura 2). A regressão linear teve um valor R2 de 0,9996.

Uma cultura do obliquus de S. foi começada em uma garrafa de Erlenmeyer de 250 mL de uma cultura armazenada em uma placa refrigerada do ágar. A microalga foi inoculada em 3N-BBM com 10 mM HEPES buffer e sparged com 2,2% CO2 em um fotobiorreator 2 L com 1,5 L volume de trabalho (0,07 vvm) (Figura 1). O lote foi rastreado via OD750; as concentrações de biomassa foram calculadas a partir da curva de calibração e, em seguida, modeladas com uma curva logística(Figura 3). O fotobiorreator manteve a cultura em pH 6,8, 100 cm3 min-1 taxa total de fluxo de gás, contínua 280 μmol m-2 s-1 iluminação, e 27 °C. A curva logística se encaixa nos dados de concentração de biomassa do atraso para a fase exponencial e estacionária. A partir do modelo logístico, a concentração máxima de biomassa durante o lote foi de 2070 ± 20 mgL-1, a produtividade máxima da biomassa ocorreu em 4,6 dias, e a taxa de produtividade específica de biomassa foi de 1,0d-1. A produtividade máxima da biomassa, calculada a partir do derivado da curva logística no momento do crescimento máximo, foi de 532 ± 60 mg L-1 d-1.

O modelo de sala bem misturado foi usado para calcular a concentração acumulada de NO2, SO2,e CO no caso de falha de capô de fumaça para 24 h. Esses valores foram comparados aos limites de exposição(Tabela 2). Por exemplo, no cenário onde 0,05 L min-1 de 400 ppm NO2 é lançado durante um período de falha de capô de fumaça de 24 h, o modelo de sala bem misturado com insumos de G calculado = 0,0377 mg min-1,Q = 0,0001 m3 min-1, V = 100 m3, e tempo máximo para simulação = 1440 min prevê no2 acumulação de 0,54 mg m-3 (0,29 ppm), que está acima do limite de exposição crônica aceitável (Conferência Americana de Higiene Sempolítica governamental limite limite limite de valor [ ACGIH TLV]) e abaixo do limite de exposição de curto prazo (STEL).

Um ensaio preliminar promissor com gás flue simulado alcançou uma maior taxa máxima de produtividade de biomassa microalgal (690 ± 70 mg L-1 d-1) do que a de 12% de CO2 e ar ultra-zero (510 ± 40 mg L-1 d-1) (Figura 4). Antes do experimento, um monitor de gás foi calibrado com CO, NO2e SO2. O experimento simulado de gás de comlo foi realizado sem qualquer risco para o pessoal ou danos ao equipamento de gases corrosivos.

Figure 1
Figura 1: Fotobioreator bancada iluminado por luzes LED vermelhas e azuis. O fotobiorreator opera como um reator de lote 2 L com volume de trabalho de 1,5 L. O fotobiorreator é continuamente alimentado com gases através do anel sparging e aberturas de gás em excesso através de portos na placa. Adaptado com permissão de Molitor et al.5. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 2
Figura 2: Curva de calibração relativa OD750 a S. obliquus peso seco da pilha. S. obliquus a absorção da luz da cultura da pilha foi medida em 750 nm, a seguir as pilhas foram filtradas e secadas para obter medidas secas do peso da pilha. Reproduzido com permissão de Molitor et al.5. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 3
Figura 3: Dados de crescimento do S. obliquus com 2,2% de entrada de CO2 modelados com regressão logística. Os pontos de dados representam valores de biomassa calculados a partir de medições de densidade óptica. Os dados foram modelados com uma regressão logística através de um ajuste mínimo quadrados; Equation 4 onde L = 1955 mg L-1, k = 1.154d-1, e x0 = 3.317 d. R2 = 0,995. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 4
Figura 4: Crescimento modelado do oblíquo de S. em 12% CO2,com e sem componentes adicionais do gás de conduto simulado. As medições de biomassa de cada lote de microalgas foram modeladas com regressões logísticas. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Componente Por cento
H2O 12.6%
CO2 CO 2 11.6%
O2 O 2 5.8%
Co 0.048%
Então2 0.045%
2 0.022%
N 2 N2 69.9%

Tabela 1: Composição das emissões de centrais a carvão. Essas quantidades foram em média dos dados de emissões de usinas de energia da Universidade de Iowa coletados em intervalos minuciosos ao longo das 10 h.

Gás tóxico Twa Teto Stel NIOSH IDLH NIOSH REL ACGIH TLV Descrição do CDC
Co 35 ppm 200 ppm - 1.200 ppm 35 ppm 25 ppm 25 ppm Incolor, inodoro
Então2 2 ppm 2 ppm 100 ppm 100 ppm 5 ppm 5 ppm 100 ppm 100 ppm 2 ppm 2 ppm 2 ppm 2 ppm Gás incolor com um odor característico, irritante e pungente
2 3 ppm 3 ppm 5 ppm 5 ppm 1 ppm 1 ppm 13 ppm 13 ppm 1 ppm 1 ppm 0,2 ppm Líquido marrom-amarelado ou gás marrom-avermelhado (acima de 70 °F) com um odor pungente e acre

Tabela 2: Limites de exposição e descrições de gases tóxicos (CO, SO2,NO2)em gás flue. OSHA TWA: média ponderada pelo tempo (geralmente período 8 h), TETO: valor que nunca deve ser alcançado, STEL: limite de exposição de curto prazo (TWA acima de 15 min), NIOSH IDLH: perigo para a vida e saúde, NIOSH REL: limite de exposição de 15 min, ACGIH TLV: limite de exposição crônica aceitável, sem efeitos nocivos.

Composto Mm
NaNO 3 NaNO3 8,82 x 100
MgSO4·7H2O 3,04 x 10-1
Nacl 4,28 x 10-1
K 2 HPO 4 K2HPO4 4,31 x 10-1
KH 2 PO 4 KH2PO4 1,29 x 100
CaCl2·2H2O 1,70 x 10-1
ZnSO4·7H2O 3,07 x 10-2
MnCl2·4H2O 7,28 x 10-3
Moo 3 Moo3 4,93 x 10-3
CuSO4·5H2O 6,29 x 10-3
Co(NO3)2·6H2O 1,68 x 10-3
H 3 BO3 H 3BO 3 1,85 x 10-1
Edta 1,71 x 10-1
Koh 5,52 x 10-1
FeSO4·7H2O 1,79 x 10-2
H2SO4 (concentrado) 1 x 10-3 μL

Tabela 3: Composição do meio basoal (3N-BBM) do bold de nitrogênio triplo. A quantidade de nitrogênio foi triplicada a partir do meio basal original do Bold11.

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Discussion

Experimentos de fotobiororreator axenic com pH regulamentado, temperatura, taxa de fluxo de gás e concentração de gás promovem resultados significativos, eliminando a contaminação por cepas de algas não-alvo e variabilidade nas condições culturais. A cinética precisa do crescimento da cultura pura pode ser obtida mesmo na presença de gases corrosivos (CO2,SO2,NO2),que servem como nutrientes, transformando gases residuais em um produto valioso, como ração animal.

Antes de iniciar qualquer experimento microalgal, a cultura microalga escolhida deve ser retirada do armazenamento e readaptada à cultura líquida. Crescer as microalgas em fase exponencial melhora a probabilidade de que os experimentos tenham condições iniciais equivalentes e que as microalgas não estagnem em fase de atraso após a inoculação.

As curvas de calibração relativas à densidade óptica e às concentrações de biomassa são especialmente importantes durante os estudos de produtividade da biomassa. A alta produtividade da biomassa microalgal é um dos principais objetivos da indústria microalgal e, como tal, é muitas vezes um indicador do sucesso da pesquisa12. Portanto, cálculos precisos das concentrações de biomassa a partir de medições de densidade óptica devem resultar de dados específicos, precisos e precisos da curva de calibração específicos das espécies. Para evitar possíveis interferências ópticas, é importante que as medições para a curva de calibração e durante o experimento sejam feitas em soluções de fundo equivalentes. Além disso, a curva de calibração deve ser feita com medições tomadas a partir de microalgas na fase de crescimento (s) mais representativas das dos experimentos. Certas espécies microalgal podem ter diferenças dramáticas no tamanho das células durante diferentes fases de crescimento que podem alterar a densidade óptica e as concentrações de biomassa percebidas. Note-se que a produtividade da biomassa está relacionada, mas não equivalente à taxa de crescimento. A taxa de crescimento específica depende do número de células (variação na densidade celular ao longo do tempo/densidade celular) presente, e a produtividade específica da biomassa depende da massa maior de células (mudança na biomassa mg/L ao longo do tempo por biomassa mg/L)13 presentes.

Quando as concentrações de biomassa microalgal são modeladas com uma curva logística, os resultados experimentais podem ser significativamente comparados pela interpolação de concentrações de biomassa e pelo cálculo preciso das produtividades da biomassa. No entanto, deve ser tomado cuidado ao interpretar esses resultados experimentais; é inadequado comparar a produtividade global e máxima de biomassa em lote. Embora os valores máximos de produtividade da biomassa sejam úteis para comparar os resultados do lote, a produtividade geral da biomassa é enganosa sem mais informações sobre a duração do experimento e as fases de crescimento microalgal. Essas taxas mudam continuamente durante o atraso, o crescimento dos registros e as fases estacionárias.

Durante experimentos com gases corrosivos que são característicos de usinas de energia ou emissões de combustão industrial, o cuidado deve ser exercido tanto para a saúde humana quanto para a longevidade dos equipamentos. As peças padrão devem ser substituídas por materiais mais robustos, e consumíveis como tubos devem ser inspecionados e substituídos com mais freqüência para resistir à corrosão, evitar vazamentos e evitar a exposição humana. Medidas de segurança adicionais e sensibilização para os riscos são essenciais para uma operação e amostragem seguras e bem sucedidas. O método não é apropriado para gases inflamáveis porque há potencial para acumulação de gás dentro do espaço e o equipamento não é projetado para tais riscos nem adequado para adaptação segura a tais condições.

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Disclosures

Os autores não têm nada a divulgar.

Acknowledgments

Este material é baseado no trabalho apoiado pela National Science Foundation Graduate Research Fellowship Grant No. 1546595. Qualquer opinião, conclusões e conclusões ou recomendações expressas neste material são os dos autores e não refletem necessariamente as opiniões da National Science Foundation. O trabalho também foi apoiado por uma bolsa de pesquisa do Governo de Pós-Graduação e EstudanteS Profissionais da Universidade de Iowa, e pela Fundação Da Universidade de Iowa, doação de Allen S. Henry. A pesquisa foi realizada no Laboratório de Fitotecnologias W. M. Keck. Os autores gostariam de agradecer ao pessoal da usina da Universidade de Iowa, especialmente Mark Maxwell, pela experiência e apoio financeiro para os gases de conduto simulados. Os autores também gostariam de reconhecer Emily Moore por sua ajuda com amostragem e análise e Emily Greene por sua assistência e participação no vídeo do protocolo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biostat A bioreactor Sartorius Stedim 2-liter bioreactor for microbial fermentation; designed to be autoclaved; pH, temperature, gas flow rate control
Bump test NO2 gas Grainger GAS34L-112-5 Calibration gas for MultiRAE gas detector
Bump test O2, CO, LEL gas Grainger GAS44ES-301A Calibration gas for MultiRAE gas detector
Bump test SO2 gas Grainger GAS34L-175-5 Calibration gas for MultiRAE gas detector
Corrosion resistant tubing for NO2 gas Swagelok SS-XT4TA4TA4-6 PTFE Core Hose Smooth Bore X Series—Fiber Braid and 304 SS Braid Reinforcement
Corrosion resistant tubing for SO2 gas QC Supply 120325 Reinforced Braided Natural EVA Tubing - 1/4" ID
cozIR 100% CO2 meter Gas Sensing Solutions Ltd. CM-0121 at CO2meter.com CO2 meter for concentrations up to 100%
cozIR 20% CO2 meter Gas Sensing Solutions Ltd. CM-0123 at CO2meter.com CO2 meter for concentrations up to 20%
Durapore Membrane Filter, 0.45 μm Millipore Sigma HVLP04700 Hydrophilic, plain white, 47 mm diameter, 0.45 μm pore size, PVFD membrane filters
Gas cylinder regulators Praxair PRS 40221331-660 Single-stage stainless steel regulator configured for 0-15 psi outlet assembly diaphragm valve with 1/4" MNPT threads, Stainless steel to resist corrosion from NOx and SOx
Gas cylinders Praxair Ulta-zero air, high purity CO2, or custom gas composition Dependent on study objectives
Gas monitoring and leak detection system RAE Systems by Honeywell MAB3000235E020 Pumped model that detects O2, SO2, NO2, CO, and LEL
GasLab software GasLab v2.0.8.14 Software for CO2 meter measurements and data logging
Hose barb Grainger Item # 3DTN3 Used to adapt regulators to tubing, Stainless steel to resist corrosion from NOx and SOx
K30 1% CO2 meter Senseair CM-0024 at CO2meter.com CO2 meter for concentrations less than 1%
LED grow panels Roleadro HY-MD-D169-S Red & blue LED light panels
Memosens dissolved oxygen probe Endress+ Hauser COS22D-19M6/0 Autoclavable (with precautions) dissolved oxygen probe for bioreactor
Memosens pH probe Endress+ Hauser CPS71D-7TB41 Autoclavable (with precautions) pH probe for bioreactor
Oven, Isotemp 500 Series Fisher Scientific 13246516GAQ Small oven for drying
Prism GraphPad software GraphPad Software Version 7.03 or 8.0.1 Graphing software for data organization, data analysis, and publication-quality graphs
Stem to hose barb fitting Swagelok SS-4-HC-A-6MTA Stainless Steel Hose Connector, 6 mm Tube Adapter, 1/4 in. Hose ID
Tubing, dilute acid/base transfer Allied Electronics and Automation 6678441 Silicone TP Process Tubing; 1.6mm Bore Size; 3000mm Long; Food Grade
Tubing, gas transfer Allied Electronics and Automation 6678444 Silicone TP Process Tubing; 3.2mm Bore Size; 3000mm Long; Food Grade

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References

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Ciências Ambientais Edição 154 cultivo de microalgas fotobiorreator culturas axenic controle experimental produtividade da biomassa adaptação para uso corrosivo de gás
Cultivo de microalgas e quantificação de biomassa em um fotobiorreator em escala de banco com gases corrosivos de flue
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Molitor, H. R., Williard, D. E.,More

Molitor, H. R., Williard, D. E., Schnoor, J. L. Microalgae Cultivation and Biomass Quantification in a Bench-Scale Photobioreactor with Corrosive Flue Gases. J. Vis. Exp. (154), e60566, doi:10.3791/60566 (2019).

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