Korozif Baca Gazlı Tezgah Ölçekli Fotobiyoreaktörde Mikroalg Ekimi ve Biyokütle Kantifikasyonu

Summary

Bench-scale, axenic ekimi sonraki proses ölçeklendirme önce mikroalgal karakterizasyonu ve verimlilik optimizasyonu kolaylaştırır. Fotobiyoreaktörler güvenilir ve tekrarlanabilir mikroalgal deneyler için gerekli kontrolü sağlamak ve güvenli bir şekilde aşındırıcı gazlar ile mikroalg yetiştirmek için adapte edilebilir (CO₂, SO₂, NO₂) belediye veya endüstriyel yanma emisyonları.

Abstract

Fotobiyoreaktörler fototrofik mikroorganizmalar üzerinde deneyler için aydınlatılmış yetiştirme sistemleridir. Bu sistemler sıcaklık, pH ve gaz bileşimi ve akış hızı kontrolü ile mikroalgal ekimi için steril bir ortam sağlar. Tezgah ölçeğinde, fotobiyoreaktörler mikroalgal özellikleri, verimlilik ve büyüme optimizasyonu inceleyen araştırmacılar için avantajlıdır. Endüstriyel ölçeklerde, fotobiyoreaktörler ürün saflığını koruyabilir ve üretim verimliliğini artırabilir. Video hazırlanması ve mikroalgal ekimi için bir tezgah ölçekli fotobiyoreaktör kullanımı açıklar, aşındırıcı gaz girdileri güvenli kullanımı da dahil olmak üzere, ve ayrıntıları ilgili biyokütle ölçümleri ve biyokütle verimlilik hesaplamaları. Özellikle, video mikroalgal kültür depolama ve aşılama için hazırlık göstermektedir, fotobiyoreaktör montaj ve sterilizasyon, biyokütle konsantrasyon ölçümleri, ve oranı ile mikroalgal biyokütle verimliliği için lojistik bir model maksimum ve genel biyokütle verimliliklerini içeren hesaplamalar. Ayrıca, simüle veya gerçek atık gaz emisyonları kullanarak mikroalg yetiştirmek için deneylerde artan ilgi olduğundan, video aşındırıcı gazlar ile çalışmak ve güvenli örnekleme tartışmak için gerekli fotobiyoreaktör ekipman uyarlamaları kapsayacak bu tür senaryolar.

Introduction

Fotobiyoreaktörler kontrollü deneyler ve açık göletler tarafından elde edilebilir daha saf mikroalgal ürünlerin ekimi için yararlıdır. Tezgah ölçekli fotobiyoreaktörlerde mikroalgal ekimi, proses ölçeklendirmesi için kullanılabilecek temel bilginin gelişimini destekler. Çevre koşullarında ki küçük değişiklikler mikrobiyolojik deneyleri önemli ölçüde değiştirebilir ve^sonuçları1'i şaşırtmaz. Sıcaklık, pH ve gaz sparging kontrolü ile steril bir süreç çeşitli koşullar altında mikroalgal özellikleri ve performans incelenmesi için avantajlıdır. Ayrıca, giriş gazı konsantrasyonları, sıcaklık, karıştırma dan kesme kuvveti ve orta pH üzerinde kontrol aksi takdirde yetiştirmek için zor olan çeşitli türleri destekleyebilir. Fotobiyoreaktörler sürekli gaz beslemesi ve seyrekleme ile bir toplu işlem olarak çalıştırılabilir, ya da sürekli gaz beslemeve seyrek artı etkili ve atık atık su besin girdileri ile bir chemostat akış sistemi olarak. Burada, sürekli gaz beslemeve seyrekleme ile toplu iş sürecini gösteriyoruz.

Fotobiyoreaktörlerin kullanımı çeşitli mikroalgal ekimi ve üretim zorluklarını ele almıştır. Alan genellikle diğer mikroorganizmalar tarafından kontaminasyon endişeleri ile mücadele, verimli substrat kullanımı (özellikle CO₂ azaltma veya atıksu arıtma durumunda önemlidir)², pH kontrolü, aydınlatma değişkenliği, ve biyokütle verimliliği³. Fotobiyoreaktörler araştırmacıların yakın kontrollü toplu iş sistemlerinde çok çeşitli fototrofları incelemelerine olanak sağlar, burada yavaş büyüyen türler bile yırtıcılardan veya rakip mikroorganizmalardan korunur^4. Bu toplu iş sistemleri, daha fazla CO₂ kullanım oranları ve biyokütle verimliliğini kolaylaştırmakta daha iyidir, çünkü bunlar tedarik edilen gazlarla dengede olma olasılığı daha yüksek olan kapalı sistemlerdir. Fotobiyoreaktör teknolojisi de pH kontrolü sunuyor, hangi eksikliği geçmiş çalışmalarda yüksek biyokütle verimliliği engelledi⁵. Tezgah ölçeğinde, fotobiyoreaktörler tarafından sunulan kontrol düzeyi araştırmacılar için avantajlıdır. Daha büyük endüstriyel ölçeklerde, fotobiyoreaktörler ticari biyoürün saflığını korumak ve nutraceutical, kozmetik, gıda veya yem uygulamaları için üretim verimliliğini artırmak için kullanılabilir^6.

Mikroalglar CO_2'nin biyosequestrasyonu için büyük ilgi çekicidir çünkü CO_2'yi biyokütle karbonu olarak hızla düzeltebilirler. Ancak, CO₂ en antropojenik kaynakları diğer aşındırıcı ve toksik gazlar veya kirleticiler ile kontamine (NO_x, SO_x, CO, Hg), yanma işlemi yakıt kaynağına bağlı olarak. Sürdürülebilir CO_2'ye olan ilginin artması, kömüryakıtlı enerji santrallerinden elde edilenler gibi CO_2-zenginemisyonları tedavi etmek için fotobiyoreaktör teknolojilerinin geliştirilmesine yolaçmıştır (Tablo 1). Ne yazık ki, araştırma ve ölçeklendirme süreçleri sırasında aşındırıcı ve toksik kirleticilere insan ve çevresel maruz kalma doğal risk vardır. Bu nedenle, korozif gazlar kullanarak biyoreaktörlerin güvenli bir şekilde montajı ve işletilmesi nin tanımlanması gerekli ve öğreticidir.

Bu yöntem, dikkatle kontrol edilen deneysel koşullar altında mikroalgların büyümesi için 2 L tezgah ölçekli fotobiyoreaktör kullanımı içindir. Protokolde mikroalgal depolama, inokül hazırlama ve fotobiyoreaktör kurulumu ve sterilizasyonu açıklanmaktadır. Bu çalışma, temel çalışma dışında mikroalgal biyokütle ölçümlerini ve biyokütle verimlilik hesaplamalarını ve ekipmanın korozif gazlarla mikroalgal ekimi için uyarlanıncaya kadar açıklanmaktadır. Aşağıda açıklanan protokol, daha fazla deneysel kontrol uygulamak, mikroalgal büyüme koşullarını optimize etmek veya bir dizi fototrofik mikrop kültürünü eksenik olarak geliştirmek isteyen araştırmacılar için uygundur. Bu yöntem, yanıcı gazlar üreten veya tüketen mikropların yetiştirilmesi için uygun malzemeleri tanımlamaz (örneğin, CH₄, H_2,vb.) ^{7 .}

Protocol

1. Aşındırıcı gazlarla dolu bir fotobiyoreaktörün güvenli kullanımı ve numune alınması

NOT: Bu yöntem, yüksek derecede yanıcı gazlar üreten veya tüketen mikroalgal kültürlerin güvenli örneklemesi için uygun prosedürleri tanımlamaz.

1. İnsan sağlığı için bir risk olarak toksik gaz yönetmek.
   NOT: Iowa Üniversitesi'nin Kimyasal Hijyen Planı uyarınca, yazarlar toksik gazlarla çalışmak için bir güvenlik protokolü geliştirmek için Üniversite Yangın Güvenliği Koordinatörü ve Üniversite Çevre Sağlığı ve Güvenliği Endüstriyel Hijyen Görevlisi ile birlikte çalıştılar.
2. Kullanılan zehirli gazların her biri için sensörleriçeren zehirli gaz izleme sistemi kurun. Sensörleri üreticinin talimatlarına göre kalibre edin. Bump testi (kalibrasyon gazları ile sensör ve alarm işlevselliğini kontrol edin) sık sık, üretici talimatlarına göre. Gaz monitörünü duman kaputunun hemen dışında bulun.
3. Aşındırıcı gaz deneylerine başlamadan önce, yakındaki personele risk ve alarm sistemini bildirin. Ayrıca, uygun yerel acil durum müdahale ekiplerine bildirin. Laboratuvar girişlerinde hangi tehlikeli gazların kullanıldığını belirten işaretler gönderin.
   1. Zehirli gaz tespit edilirse, yakındaki tüm personele tahliye talimatı ver. Laboratuvar amirlerine ve acil durum müdahale personeline bildirin.
      NOT: Elektrik kesintisinde, gaz düzenleyici kule güç kaybettiğinde gaz akışını durdurur. Ancak, oda ısıtma, havalandırma ve klima (HVAC) sistemi veya duman başlık bir elektrik kesintisi olmadan aşağı giderse, bu toksik gaz sızıntısı neden olacaktır.
4. Duman kaputu Amerikan Endüstriyel Hijyen Derneği'nin (AIHA) matematiksel modelleme tablosu IH MOD^8'i her gaz için kullanarak başarısız olursa odadaki zehirli gazların olası birikmiş konsantrasyonunu modelle.
   1. Bina HVAC bakım personeli veya HVAC teknisyeni oda kaynağı / egzoz hava oranı, Q,m³ dk^-1 alın. Laboratuvarın (L x W x H) m^3'tekihacmini, V'yihesaplayın. İdeal gaz yasasından uyarlanmış Denklem 1 kullanarak, mg min^-1'dekiher bir zehirli gaz türünün kirletici emisyon oranını, G, hesaplamayı hesaplayın:
      (1)
      P 1 atm (ppm gaz/10⁶ ppm) de toksik gaz tarafından uygulanan basınç fraksiyonu nerede, Q_gaz L min^-1gaz akış hızı , R evrensel gaz sabiti (0.082057 L·atm·mol^-1· K^-1), K'de T sıcaklığı, MW ise g mol^-1'dekigazın molekül ağırlığıdır.
   2. IH MOD elektronik tablosunda "Üretim ve model oda tasfiyesini durdurma seçeneği ile Iyi Karışık Oda Modeli" algoritmasında her gaz için V, Qve G değerlerini (adım 1.4.1'de hesaplanır) kullanarak 1440 dk (24 saat) bir simülasyon periyodu boyunca her gaz için birikmiş oda gaz konsantrasyonlarını hesaplayın. Bu değerleri pozlama limitleri ile karşılaştırın (Tablo 2)⁹.

2. Mikroalgal inokül hazırlanması

1. Scenedesmus obliquus inoculum veya fotobiyoreaktör için seçilen diğer mikroalgal türleri hazırlayın, denemebaşlamadan önce depolama dan aktararak, cryopreserved veya agar medya kültürlü olsun.
   1. Steril (3N-BBM, Tablo 3) 30−50 mL steril mikroalgal büyüme ortamını (üçlü azot Bold'un bazal ortası, Tablo 3)köpük durdurucu ile kaplanmış steril (150−250 mL) sallamak şişesiekleyin.
      NOT: Şişe seyrek olmadığı sürece, shake şişesi hacminin sadece beşte biri sıvı ortam tarafından işgal edilmelidir.
   2. Hücreleri eğimli bir yere aktarırken veya şişeyi sallarken steriliteyi korumak için bir biyogüvenlik kabini kullanın. Agar kültürler için, onun agar plaka veya sallamak şişesine eğimli mikroalg aktarmak için steril bir döngü kullanın. Cryopreserved kültürler için, yavaş yavaş kriyokorunmuş örnek çözülme ve seçilen protokol¹⁰göre kriyoprotektif uzak durulama, sonra sallamak şişesine hücreleri ekleyin.
   3. 3N-BBM'deki kültür hücreleri 20−25 °C'de 16 saat altında:8 saat aydınlık:karanlık ve 115−130 rpm'de sallayarak.
   4. Optik yoğunluk (OD) ölçümlerini kullanarak zaman içinde mikroalgal büyümesini takip edin (bölüm 5 ve 6'daki gibi). Mikroalgların hücreleri fotobiyoreaktöre aktarmadan önce üstel büyüme evresine (2−4 gün) ulaşmasına izin verin.
      NOT: Deneyin amacına bağlı olarak, hücreler kültür ortamı (bu çalışma) ve/veya biyoreaktörün aşılanmasından önce birden fazla santrifüj adımı ile konsantre olabilir.

3. Fotobiyoreaktörün kurulumu ve işletilmesi

1. Sıcaklık, pH, karıştırma hızı, gaz akış hızları ve giriş çözeltisi akış hızlarını kontrol etmek için fotobiyoreaktörü(Şekil 1)kullanın.
   NOT: Fotobiyoreaktör, genellikle asit, baz, antiköpük ve substrat olmak üzere dört farklı giriş çözeltisinin akışını kontrol etmek için kullanılabilir.
   1. Her biri 1 N NaOH ve 1 N HCl olmak üzere 100 mL hazırlayın ve her birini 250 mL giriş çözüm şişesine ekleyin. Bu çözümler için ikincil çevreleme kullanın.
   2. Daldırma tüpleri ve steril sıralı hava filtresi ile bir havalandırma tüpü ile donatılmış otoklavable kapaklı şişelerde tarifeli giriş çözümleri saklayın. Otoklavlanabilir boru kullanarak dip tüplerini fotobiyoreaktörün dört giriş portuna bağlayın ve fotobiyoreaktör işlemi sırasında giriş çözümlerindeki dip tüplerini batırın. 1,6 mm iç dimetre (ID) otoklavlanabilir boruyu, giriş çözümleri ve limanları arasındaki otoklavlanabilir boruyu, elle seçilmiş akış hızları veya pH ve köpük seviyesindeki problardan gelen geri bildirimlerle kontrol edilebilen ayrı peristaltik pompalar aracılığıyla geçirin (asit durumunda, baz ve köpük önleyici çözümler).
2. Otoklavlamadan önce fotobiyoreaktör pH metresini kalibre edin.
   1. PH sondasını, sondayı bağlantı hattına takarak ve kilitlemek için bükerek fotobiyoreaktör kontrol kulesine bağlayın. pH metresini kalibre etmek için pH 4 ve pH 7 tamponlarını kullanın. pH metre değerini kabul etmeden önce değerler stabilize olana kadar bekleyin.
   2. PH sondasını, sondayı kontrol kulesine bağlayan pH metre kablosundan çıkarın.
   3. Yüzey% 70 etanol veya reaktör ile prob otoklav ile sterilize. Otoklav için, pH probu sıkıca alüminyum folyo ile kap.
      NOT: Prob otoklavlanırsa, buhar hasarı nedeniyle prob iç bölgesinin korozyon riski vardır. Bu kapama yöntemi hasar önlemeyi tamamen garanti etmez.
   4. 10 mM 4-(2-hidroksitil)piperazin-1-etanesülfonik asit (HEPES) tampon udaha iyi kontrol pH için kültür ortamına ekleyin.
3. Fotobiyoreaktör başlığına soğuk parmak ve egzoz kondansatörü yerleştirin ve vidalayın.
4. Aşılama bağlantı noktasını takın ve yerine sıkıca vidala. Fotobiyoreaktör başlığının üzerindeki aşılama portunun bölümüne bir uzunluk otoklavable boru ekleyin. Biyoreaktörü otomatikolarak otoklavlamadan önce, boruyu otoklavlanabilir bir hortum kelepçesi ile kapatın.
5. Kullanılmayan fotobiyoreaktör bağlantı noktalarına steril filtrelerle kaplı boruları takın.
6. Otoklavlanabilir boru ile fotobiyoreaktör giriş bağlantı noktalarına asit ve baz giriş çözeltileri takın. Kültür ortamının 1,5 L'sini ekleyin.
7. Reaktörü ve ilgili giriş çözümlerini çalışma hacmine göre 121 °C'de 30−45 dk için otomatik olarak tökezle.
   NOT: Kültür ortamı otoklavlamadan olumsuz etkileniyorsa, laminaakış kaputunda steril koşullar altında otoklavlama yaptıktan sonra ortamı ekleyin. Protokol burada duraklatılmış olabilir.
   DİkKAT: Reaktör otoklavdan çıkardıktan sonra sıcak olacaktır.
8. Çark motorunu çark şaftına takın ve montajı sıkın.
9. Aydınlatma gereksinimlerine göre biyoreaktör dışında simetrik LED ışık panelleri düzenleyin.
   1. Otoklavlamadan önce, ışık yoğunluğunu bir fotometre ile ölçün ve kaydedin. Illuminance sensörünü fotobiyoreaktör kabının içine yerleştirin ve sensörü ışık kaynağına doğru çevirin.
10. Simüle edilmiş kömür yakıtlı enerji santrali emisyonlarını(Tablo 1)fotobiyoreaktördeki mikroalglara sağlamak için en fazla iki gaz silindirini bağlayın.
    NOT: Bu çalışmada kullanılan gaz konsantrasyonları Iowa Üniversitesi enerji santraline yaklaşık olarak vesiya dır.
    1. Gaz silindiri, gaz düzenleme kulesi ve fotobiyoreaktör sparging halkası arasındaki bağlantıları birleştirin. Gaz silindirlerine 20 psi çıkış basıncı na sahip uygun regülatörleri takın. Regülatör çıkış hortumu dikenine 6 mm ID basınca dayanıklı boru takın ve hortum kelepçesi ile sabitle. 6 mm'ye kadar bir hortum barb kullanarak basınç geçirmez borunun diğer ucunu gaz düzenleyici kule gaz girişine takın. 3,2 mm KIMLIK boruyu 6 mm'lik başka bir hızlı bağlantı bağlantı sını kullanarak gaz düzenleyici kule gaz çıkışına bağlayın ve çıkış borunun diğer ucunu fotobiyoreaktör başlığındaki kaplama portuna bağlayın.
       NOT: İkinci bir giriş gazı için, adım 3.9.1'i tekrarlayın, ancak iki giriş gazı hattını eğimli halka bağlantı noktasına bağlı tek bir tüp bölümüne birleştirmek için T şeklinde bir hortum barb kullanın.
    2. Çıkış basıncını her gaz regülatörüne 20 psi'ye ayarlayın ve deneysel gaz akış hızlarını ayarlamak için biyoreaktör arabirimini kullanın.
       NOT: Hava hacmini standart koşullar altında, dakika sıvı hacmi başına (vvm) hesaplayın ve raporlayın; hacimsel gaz akış hızını kültür hacmine göre böl. Her miniute birimlerinde rapor.
11. Birden fazla gaz silindiri ile sparging, co₂ sensörü ile fotobiyoreaktör için verilen CO₂ konsantrasyonu teyit.
    1. Bir yazılımı (örneğin, GasLab) uyumlu bir CO₂ sensörünü bilgisayarın USB bağlantı noktasına bağlayın. CO₂ sensör modeline karşılık gelen en son yazılımı indirin. Yazılımı açın ve sensör modelini, ölçüm zaman aralığını ve ölçüm veri günlüğe kaydetme süresini girdi.
    2. CO₂ sensörünü ve kombine gaz akış tüpünü (tüpü biyoreaktöre bağlamadan önce) 100−250 mL, kapaklı, havalandırmalı bir kapta (biyoreaktörün dışında) yerleştirin.
       NOT: Deney sırasında, kafa boşluğu CO₂ konsantrasyonları fotobiyoreaktör başlığıüzerindeki havalandırma tüplerinden birinden ölçülebilir.
    3. Kullanıcı arabirimindeki CO₂ konsantrasyon ölçümlerini başlatın ve ölçümlerin dengelemesini bekleyin.
    4. İstenilen toplam akış hızına (0,1 L dk^-1)ve CO₂ konsantrasyonuna (%12) kadar her bir tanktan gelen gaz akış hızlarını ayarlamak için fotobiyoreaktör kullanıcı arabirimini kullanın elde edilir.
12. Fotobiyoreaktör kullanıcı arabiriminde, pervane dönüş hızını ayarlamak için STIRR işlevini kullanın. Karıştırma hızının, kültür ortamının seyrek gaz kabarcıklarını asimile edebilmesi için yeterince hızlı olduğundan emin olun.
    NOT: Bazı mikroalgal türlerinin zayıf hücre yapıları vardır ve yüksek kesme kuvveti tarafından hasar görür veya yırtılır.

4. Fotobiyoreaktörün uyarlanması ve zehirli gaz kullanımı için deneysel kurulum

DİkKAT: Gerçek veya simüle edilmiş baca gazlarında bulunan aşındırıcı gazlar aşındırıcı ve zehirlidir. Bu gazlar solunduğunda ciddi risk taşır.
NOT: Bu yöntem, yüksek derecede yanıcı gazlar üreten veya tüketen mikropların (metan, hidrojen vb.) güvenli bir şekilde yetiştirilmesi için uygun malzemeleri tanımlamaz.

1. Pirinç, plastik ve standart boru bileşenlerini korozyona dayanıklı malzemelerle değiştirin.
   1. NO_x veya SO_x ile su arasındaki reaksiyonun oluşturduğu güçlü asitlerden kaynaklanan korozyona güvenilir bir şekilde karşı koymak için paslanmaz çelik kullanın. Gaz düzenleyici kuledeki gaz giriş ve çıkışlarında plastik hızlı bağlantı bağlantı bağlantılarını paslanmaz çelik hızlı bağlantı parçalarıyla değiştirin. Pirinç yerine çıkış hortumu barb dahil olmak üzere gaz silindirleri için paslanmaz çelik regülatörleri kullanın.
   2. Gaz silindiri ile gaz düzenleyici kule arasındaki bağlantılarda NO_x ve SO_x gazlarından (sırasıyla) gelen korozyona karşı direnç sağlamak için politetrafloroetilen (PTFE) veya doğal etil vinil asetat (EVA) borularını kullanın.
2. Otoklavlamadan sonra, fotobiyoreaktör ve gaz silindirlerini duman kaputunun içinde birleştirin. Fotobiyorerererererererererererererererererererererererereyi ikincil çevrelemenin içine yerleştirin ve gaz silindirlerini serbest duran silindir yakalarına veya silindir rafına yerleştirin.
3. Gaz akışını başlattıktan sonra, gaz silindirleri ve biyoreaktör arasındaki tüm bağlantılarda gaz sızıntıları kontrol etmek için bir kabarcık tipi sıvı sızıntı dedektörü kullanın. Bir yıkama şişesi 1:100 (v:v) bulaşık sabunu seyreltme ile dolu kullanın: sabun çözeltisi küçük bir akışı ile bağlantıyı kapsayacak şekilde su.
   NOT: Sızıntılar bağlantılarda köpürerek belirtilir.
4. Mikroalgal deneyleri başlatırken, aşılamadan önce (standart fotobiyoreaktör deneylerinde olduğu gibi) pH'ı ayarlamadan sonra sparging yapmaya başlayın.
   NOT: Aşındırıcı gaz deneyleri sırasında kültür ortamının tamponlanması, giriş gazları kuvvetle asidik olduğundan şiddetle tavsiye edilir.
5. Hazırlanan mikroalgal inoculumu steril bir şırınga haline getirerek, şırıngayı aşılama noktasına bağlı boruya takarak, aşılama boru kelepçesini açarak ve şırıngayı bastırarak fotobiyoreaktörü aşıla.
6. Gaz monitörünü, gaz silindir basınçlarını ve fotobiyoreaktörü günde iki kez (ve numune almadan önce) yüksek düzeyde zehirli gaz veya sızıntı göstergesi için kontrol edin.
7. Duman kaputu açıklığını biyoreaktör ve gaz silindir regülatörlerine ulaşılmasını sağlayan bir genişlikle sınırlandırın. Teneffüs emülsine riskini önlemek için, açıklığın personeli gövde bölgesinin üzerinde maruz bırakmadığından emin olun.
8. Gaz silindir regülatörlerini reaktöre gaz akışını durdurmak için kapalı konuma getirin. Duman kaputu kuşağını kapatın ve fotobiyoreaktör kültürünü örneklemeden önce kaputun aşındırıcı gazları boşaltmasına 5 dakika izin verin.
9. Bir başlık portu açarak ve steril bir serolojik pipet kullanarak veya aşılama/örnekleme portu aracılığıyla şırıngaya kültür çizerek duman kaputu içinde örnek alın. Gaz silindirlerini açıp deneye devam edilmeden önce fotobiyoreaktör bağlantı noktalarını emniyete ala.

5. Mikroalgal biyokütle verimliliğinin ölçülmesi

1. Kurutulmuş mikroalgal biyokütle konsantrasyonları için mikroalgal kültür OD₇₅₀ ölçümleri ilişkilendirmek için bir kalibrasyon eğrisi kullanın.
   1. Birkaç (minimum: 4, minimum çalışma hacmi: 500 mL) steril mikroalgal orta ve ilgi türleri ile inoculate (örneğin, Bu çalışmada S obliquus) ile şişeleri hazırlayın.
   2. Büyüme üssel olana kadar kültür OD_750'yi ölçün ve bilinen kütleye sahip 0,45 μm filtre membranıyla içeriğin bilinen hacimlerini (en az 100 mL) filtreleyerek şişeleri derhal örnekleyin. Onlar kurutulur gibi biyokütle ve filtreler desteklemek için kapalı alüminyum tartmak tekneler veya cam kaplar kullanın.
   3. Biyokütleyi ve filtreleri 80−100 °C arasındaki bir fırında yaklaşık 18−24 saat kuruduktan sonra toplayın. Tam kurutmayı doğrulamak için, kütlenin stabilize olup olmadığını belirlemek için ek bir 2−3 saat sonra tekrar ölçün.
   4. Biyokütle kütlesini hesaplamak için filtre kütlesini kombine biyokütleden ve filtre kütlesinden çıkarın.
   5. Kalibrasyon eğrisini biyokütle konsantrasyonu (filtreli kültürün hacmine bölünen biyokütle kütlesi) karşı ölçülen OD₇₅₀ olarak çizin ve verileri doğrusal bir regresyonla sığdırın.

6. Biyokütle verimlilik modelleme ve oran hesaplamaları

1. Kalibrasyon eğrisi lineer regresyonu kullanarak OD₇₅₀ ölçümlerinden deney biyokütle konsantrasyonlarını hesaplayın (bölüm 5'te belirlenir).
2. Grafik ve istatistik yazılımında(Tablo Malzemeler)bir lojistik regresyon (Denklem 2) ile lag'den üstel faza kadar mikroalgal büyüme verilerini sığdırın:
   (2)
   L eğrisinin maksimum biyokütle konsantrasyon değeri olduğu yerde, k üstel fazın göreceli dikliğidir (zaman^-1), x_o sigmoidal eğrinin orta noktasının zamanıdır ve x zamandır.
   1. Yukarıdaki lojistik denklemi el ile girin. Yazılımdaki Çözüm sekmesinde doğrusal olmayan regresyon içeren bir eğri sığdır'ı seçin. Parametrelerin solunda: Doğrusal Olmayan Regresyon kutusu, Yeni açılır kutusunun altında yeni denklem oluştur'u seçin. Varsayılan açık denklemi denklem türü olarak kullanın, yeni işlevi adlandırın ve yeni işlevi b'nin x_o'yu temsil ettiği Y = L/(1+ exp(-k*(x-b)) olarak tanımlayın.
3. Son ve ilk biyokütle konsantrasyonları arasındaki farkı son ve ilk zamanlar arasındaki farka bölerek mikroalgal toplu iş genel biyokütle verimliliğini hesaplayın.
4. X = x_o.
   (3)

Representative Results

Yeşil mikroalglar için kalibrasyon eğrisi, S. obliquus, üstel fazda hasat, OD₇₅₀ ve kurutulmuş biyokütle konsantrasyonları ile kurulmuştur(Şekil 2). Doğrusal regresyon 0.9996 R² değerine sahipti.

250 mL Erlenmeyer şişesinde soğutulmuş agar tabağı üzerinde saklanan bir kültürden s. obliquus kültürü başlamıştır. Mikroalga 10 mM HEPES tampon ile 3N-BBM aşılanmış ve 1.5 L çalışma hacmi (0.07 vvm) ile 2 L fotobiyoreaktör% 2.2 CO₂ ile seyrek (Şekil 1). Toplu iş OD₇₅₀üzerinden izlendi; biyokütle konsantrasyonları kalibrasyon eğrisinden hesaplandı ve daha sonra lojistik eğri ile modellendi (Şekil 3). Fotobiyoreaktör pH 6.8, 100 cm³ dk^-1 toplam gaz akış hızı, sürekli 280 μmol m^-2 s^-1 aydınlatma ve 27 °C'de kültürünü korumuştur. Lojistik eğri, gecikmeden üstel evreye ve sabit faza biyokütle konsantrasyon verilerine uygundur. Lojistik modelden, parti sırasında maksimum biyokütle konsantrasyonu 2070 ± 20 mg L^-1, maksimum biyokütle verimliliği 4.6 gün meydana geldi ve spesifik biyokütle verimlilik oranı 1.0 d^-1idi. Maksimum büyüme sırasında lojistik eğrinin türevinden hesaplanan maksimum biyokütle verimliliği 532 ± 60 mg L^-1 d^-1idi.

Iyi karışık oda modeli_NO2 birikmiş konsantrasyonu hesaplamak için kullanılmıştır , SO₂, ve CO 24 saat için duman kaput yetmezliği durumunda. Bu değerler maruz kalma limitleri ile karşılaştırıldı (Tablo 2). Örneğin, 0,05 L dk^-1 400 ppm NO₂ bir duman kaput arıza süresi sırasında serbest bırakılır senaryoda 24 saat, hesaplanan G = 0.0377 mg min^-1, Q = 0.0001 m³ dk^-1, V = 100 m³ve simülasyon için maksimum süre = 1440 dk kabul edilebilir kronik maruzkalma sınırının üzerinde olan 0.54 mg m^-3 (0.29 ppm) no₂ birikimini tahmin eder , kabul edilebilir kronik maruzkalma limitinin üzerinde dir (Amerikan Konferansı Hükümet Hijyen Sanayicileri eşik değeri [ ACGIH TLV]) ve kısa süreli maruz kalma sınırının (STEL) altında.

Simüle baca gazı ile umut verici bir ön deneme, maksimum mikroalgal biyokütle verimlilik oranının (690 ± 70 mg L^-1 d^-1)%12'den fazla co₂ ve ultra sıfır hava (510 ± 40 mg L^-1 d^-1)(Şekil 4)elde etti. Deneyden önce, bir gaz monitörü CO, NO₂ve SO₂ile kalibre edildi. Simüle edilen baca gazı deneyi personel için herhangi bir risk veya aşındırıcı gazlardan kaynaklanan ekipmana zarar vermeden gerçekleştirilmiştir.

Şekil 1: Kırmızı ve mavi LED ışıklarla aydınlatılan tezgah üstü fotobiyoreaktör. Fotobiyoreaktör 1,5 L çalışma hacmi ile 2 L toplu reaktör olarak çalışır. Fotobiyoreaktör sürekli headplate portları aracılığıyla sparging halkası ve aşırı gaz delikleri ile gazlar ile beslenir. Molitor ve ark.^5'inizniyle uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: OD₇₅₀ ile S. obliquus hücre kuru ağırlığını ilişkilendiren kalibrasyon eğrisi. S. obliquus hücre kültürü ışık emilimi 750 nm ölçüldü, daha sonra hücreler filtrelendi ve hücre kuru ağırlık ölçümleri elde etmek için kurutuldu. Molitor ve ark.^5'inizniyle yeniden basılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: S. %2.2 CO₂ girdide obliquus büyüme verileri lojistik regresyon ile modellenmiştir. Veri noktaları optik yoğunluk ölçümlerinden hesaplanan biyokütle değerlerini temsil eder. Veriler, en az kareler uygun bir lojistik regresyon ile modellenmiştir; nerede L = 1955 mg L^-1, k = 1.154 d^-1, ve x₀ = 3.317 d. R² = 0.995. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Modellenmiş S. obliquus büyüme 12% CO₂, ve ek simüle baca gazı bileşenleri olmadan. Her bir mikroalg parçasının biyokütle ölçümleri lojistik gerilemelerle modellenmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Bileşen	Yüzde
H2O	12.6%
CO2	11.6%
O2	5.8%
Co	0.048%
YANI2	0.045%
NO2	0.022%
N2	69.9%

Tablo 1: Kömürle çalışan enerji santrali emisyonlarının bileşimi. Bu miktarlar Iowa Üniversitesi enerji santrali emisyon verilerinden 10 saat boyunca dakika aralıklarla toplanan ortalama edildi.

Zehirli gaz	Twa	Tavan	Stel	NIOSH IDLH	NIOSH REL	ACGIH TLV	CDC Açıklama
Co	Dakikada 35 sayfa	Dakikada 200	-	1.200 sayfa	Dakikada 35 sayfa	Dakikada 25	Renksiz, kokusuz
YANI2	2 sayfa	Dakikada 100	5 sayfa	Dakikada 100	2 sayfa	2 sayfa	Karakteristik, tahriş edici, keskin kokulu renksiz gaz
NO2	Dakikada 3 sayfa	5 sayfa	1 sayfa	Dakikada 13 sayfa	1 sayfa	dakikada 0,2	Sarımsı-kahverengi sıvı veya kırmızımsı-kahverengi gaz (70 °F'nin üzerinde) keskin, acrid kokusu ile

Tablo 2: Baca gazıtoksik gazlar (CO, SO₂, NO₂₎için maruz kalma limitleri ve açıklamaları. OSHA TWA: zaman ağırlıklı ortalama (genellikle 8 saatlik periyot), TAVAN: değere asla ulaşılmamalı, STEL: kısa süreli maruz kalma limiti (15 dk'nın üzerinde TWA), NIOSH IDLH: yaşam ve sağlık için tehlike, NIOSH REL: 15 dk maruz kalma sınırı, ACGIH TLV: kabul edilebilir kronik maruzkalma sınırı, kötü etkileri yok.

Bileşik	Mm
NaNO3	8,82 x 100
MgSO4·7H2O	3,04 x 10-1
Nacl	4,28 x 10-1
K2HPO4	4,31 x 10-1
KH2PO4	1,29 x 100
CaCl2·2H2O	1,70 x 10-1
ZnSO4·7H2O	3,07 x 10-2
MnCl2·4H2O	7,28 x 10-3
MoO3	4,93 x 10-3
CuSO4·5H2O	6,29 x 10-3
Co(NO3)2·6H2O	1,68 x 10-3
H3BO3	1,85 x 10-1
Edta	1,71 x 10-1
Koh	5,52 x 10-1
FeSO4·7H2O	1,79 x 10-2
H2SO4 (konsantre)	1 x 10-3 μL

Tablo 3: Üçlü azot Bold'un bazal ortamının (3N-BBM) bileşimi. Azot miktarı orijinal Bold'un bazal orta^11'denüçe katlandı.

Discussion

Toplu, düzenlenmiş pH, sıcaklık, gaz akış hızı ve gaz konsantrasyonu ile axenic fotobiyoreaktör deneyleri, kültür koşullarında hedef olmayan alg suşları ve değişkenlik tarafından kontaminasyonu ortadan kaldırarak anlamlı sonuçlar doğurur. Doğru saf kültür büyüme kinetik aşındırıcı gazların varlığında bile elde edilebilir (CO₂, SO₂, NO₂), hangi besin olarak hizmet, hayvan yemi gibi değerli bir ürün haline atık gazlar dönüm.

Herhangi bir mikroalgal deneye başlamadan önce, seçilen mikroalg kültürü depodan alınmalı ve sıvı kültüre yeniden uyarlanmalıdır. Mikroalgların üstel faza doğru büyütülmesi, deneylerin eşdeğer başlangıç koşullarına sahip olma ve mikroalgların aşılama dan sonra gecikme evresinde durgunlaşmama olasılığını artırır.

Biyokütle verimliliği çalışmaları sırasında optik yoğunluk ve biyokütle konsantrasyonlarını ilişkilendiren kalibrasyon eğrileri özellikle önemlidir. Yüksek mikroalgal biyokütle verimliliği mikroalgal endüstrisinin temel hedeflerinden biridir ve, bu nedenle, genellikle araştırma başarısının bir göstergesidir¹². Bu nedenle, optik yoğunluk ölçümlerinden elde edilen biyokütle konsantrasyonlarının doğru hesaplamaları türe özgü, hassas ve doğru kalibrasyon eğrisi verilerinden kaynaklanmalıdır. Olası optik parazitleri önlemek için, kalibrasyon eğrisi için ölçümlerin ve deney sırasında eşdeğer arka plan çözümlerinde yapılması önemlidir. Ayrıca, kalibrasyon eğrisi, mikroalglardan alınan ölçümlerle yapılmalıdır. Bazı mikroalgal türlerinin farklı büyüme evrelerinde hücre boyutunda dramatik farklılıklar olabilir ve bu da optik yoğunluğu ve algılanan biyokütle konsantrasyonlarını değiştirebilir. Bu biyokütle verimliliği ile ilgili olduğu unutulmamalıdır, ama eşdeğer değil, büyüme hızı. Özgül büyüme hızı mevcut hücre sayısına (zaman/hücre yoğunluğundaki hücre yoğunluğundaki değişim) ve spesifik biyokütle verimliliği hücrelerin toplu kütlesine (mg/L biyokütle başına zaman içinde mg/L biyokütledeki değişim) bağlıdır¹³ mevcut.

Mikroalgal biyokütle konsantrasyonları lojistik bir eğri ile modellendiğinde, biyokütle konsantrasyonları enterpolasyon ve doğru biyokütle verimlilikleri hesaplayarak deneysel sonuçlar anlamlı karşılaştırılabilir. Ancak, bu deneysel sonuçlar yorumlanırken dikkatli olunmalıdır; genel ve maksimum toplu biyokütle verimliliğini karşılaştırmak uygun değildir. Maksimum biyokütle verimlilik değerleri toplu sonuçları karşılaştırmak için yararlı olmakla birlikte, genel biyokütle verimliliği deney süresi ve mikroal büyüme aşamaları hakkında daha fazla bilgi olmadan yanıltıcıdır. Bu oranlar gecikme, günlük büyümesi ve sabit aşamalar sırasında sürekli olarak değişir.

Enerji santrali veya endüstriyel yanma emisyonlarının karakteristik özelliği olan aşındırıcı gazlarla yapılan deneylerde, hem insan sağlığı hem de ekipman ın uzun ömürlü olması için dikkatli olunmalıdır. Standart parçalar daha sağlam malzemelerle değiştirilmeli ve korozyona karşı koymak, sızıntıları önlemek ve insan maruziyetini önlemek için boru gibi sarf malzemeleri daha sık kontrol edilmeli ve değiştirilmelidir. Güvenli ve başarılı bir şekilde çalışma ve örnekleme için ekstra güvenlik önlemleri ve risk farkındalığı esastır. Bu yöntem yanıcı gazlar için uygun değildir, çünkü kafa boşluğuiçinde gaz birikimi potansiyeli vardır ve ekipman ne bu tür riskler için tasarlanmıştır ne de bu koşullara güvenli adaptasyon için uygundur.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biostat A bioreactor	Sartorius Stedim		2-liter bioreactor for microbial fermentation; designed to be autoclaved; pH, temperature, gas flow rate control
Bump test NO2 gas	Grainger	GAS34L-112-5	Calibration gas for MultiRAE gas detector
Bump test O2, CO, LEL gas	Grainger	GAS44ES-301A	Calibration gas for MultiRAE gas detector
Bump test SO2 gas	Grainger	GAS34L-175-5	Calibration gas for MultiRAE gas detector
Corrosion resistant tubing for NO2 gas	Swagelok	SS-XT4TA4TA4-6	PTFE Core Hose Smooth Bore X Series—Fiber Braid and 304 SS Braid Reinforcement
Corrosion resistant tubing for SO2 gas	QC Supply	120325	Reinforced Braided Natural EVA Tubing - 1/4" ID
cozIR 100% CO2 meter	Gas Sensing Solutions Ltd.	CM-0121 at CO2meter.com	CO2 meter for concentrations up to 100%
cozIR 20% CO2 meter	Gas Sensing Solutions Ltd.	CM-0123 at CO2meter.com	CO2 meter for concentrations up to 20%
Durapore Membrane Filter, 0.45 μm	Millipore Sigma	HVLP04700	Hydrophilic, plain white, 47 mm diameter, 0.45 μm pore size, PVFD membrane filters
Gas cylinder regulators	Praxair	PRS 40221331-660	Single-stage stainless steel regulator configured for 0-15 psi outlet assembly diaphragm valve with 1/4" MNPT threads, Stainless steel to resist corrosion from NOx and SOx
Gas cylinders	Praxair	Ulta-zero air, high purity CO2, or custom gas composition	Dependent on study objectives
Gas monitoring and leak detection system	RAE Systems by Honeywell	MAB3000235E020	Pumped model that detects O2, SO2, NO2, CO, and LEL
GasLab software	GasLab	v2.0.8.14	Software for CO2 meter measurements and data logging
Hose barb	Grainger	Item # 3DTN3	Used to adapt regulators to tubing, Stainless steel to resist corrosion from NOx and SOx
K30 1% CO2 meter	Senseair	CM-0024 at CO2meter.com	CO2 meter for concentrations less than 1%
LED grow panels	Roleadro	HY-MD-D169-S	Red & blue LED light panels
Memosens dissolved oxygen probe	Endress+ Hauser	COS22D-19M6/0	Autoclavable (with precautions) dissolved oxygen probe for bioreactor
Memosens pH probe	Endress+ Hauser	CPS71D-7TB41	Autoclavable (with precautions) pH probe for bioreactor
Oven, Isotemp 500 Series	Fisher Scientific	13246516GAQ	Small oven for drying
Prism GraphPad software	GraphPad Software	Version 7.03 or 8.0.1	Graphing software for data organization, data analysis, and publication-quality graphs
Stem to hose barb fitting	Swagelok	SS-4-HC-A-6MTA	Stainless Steel Hose Connector, 6 mm Tube Adapter, 1/4 in. Hose ID
Tubing, dilute acid/base transfer	Allied Electronics and Automation	6678441	Silicone TP Process Tubing; 1.6mm Bore Size; 3000mm Long; Food Grade
Tubing, gas transfer	Allied Electronics and Automation	6678444	Silicone TP Process Tubing; 3.2mm Bore Size; 3000mm Long; Food Grade