Microalgen teelt en biomassa kwantificering in een Fotobioreactor met een tafel schaal met corrosieve rookgas

Summary

Bench-Scale, Axenische teelt vergemakkelijkt microalgal karakterisering en productiviteit optimalisatie voor verdere proces scale-up. Photobioreactoren zorgen voor de nodige controle voor betrouwbare en reproduceerbaar microalgal experimenten en kunnen worden aangepast om microalgen veilig te cultiveren met de corrosieve gassen (CO₂, dus₂, No₂) van gemeentelijke of industriële verbrandingsemissies.

Abstract

Photobioreactoren zijn verlichte teeltsystemen voor experimenten op fototrofische micro-organismen. Deze systemen bieden een steriele omgeving voor de microalgal teelt met temperatuur, pH, en gassamenstelling en debietregeling. Op tafel schaal zijn fotobioreactoren voordelig voor onderzoekers die microalgal-eigenschappen, productiviteit en groei-optimalisatie bestuderen. Bij industriële weegschalen kunnen photobioreactoren de zuiverheid van het product handhaven en de productie-efficiëntie verbeteren. De video beschrijft de voorbereiding en het gebruik van een tafelweegschaal fotobioreactor voor de microalgen teelt, inclusief het veilige gebruik van corrosieve gasingangen, en Details van relevante biomassa metingen en biomassa productiviteits berekeningen. De video illustreert specifiek de opslag van microalgen cultuur en voorbereiding voor inoculatie, fotobioreactor assemblage en sterilisatie, biomassaconcentratie metingen en een logistiek model voor de biomassa-productiviteit van de microalgen met een snelheid berekeningen inclusief maximale en algemene biomassa productiviteiten. Aangezien er steeds meer belangstelling is voor experimenten om microalgen te cultiveren met behulp van gesimuleerde of echte afvalgas emissies, zal de video de aanpassingen van de bioreactor apparatuur omvatten die nodig zijn om met corrosieve gassen te werken en om veilige bemonstering te bespreken in dergelijke scenario's.

Introduction

Photobioreactors zijn nuttig voor gecontroleerde experimenten en de teelt van zuiverder microalgal producten dan kan worden bereikt door open vijvers. Microalgal teelt in Bench-Scale photobioreactoren ondersteunt de ontwikkeling van fundamentele kennis die kan worden gebruikt voor het proces scale-up. Kleine veranderingen in de omgevingsomstandigheden kunnen microbiologische experimenten significant veranderen en de resultaten¹verstellen. Een steriel proces met temperatuur-, pH-en gassparende controle is voordelig voor het bestuderen van microalgal eigenschappen en prestaties onder gevarieerde omstandigheden. Daarnaast kan de controle over de invoer gasconcentraties, temperatuur, Afschuifkracht van mengen en medium pH verschillende soorten ondersteunen die anders een uitdaging vormen om te cultiveren. Photobioreactors kunnen worden uitgevoerd als een batchproces met continue gastoevoer en sparen, of als een chemostat flow-through-systeem met continue gastoevoer en gefiltreerde plus influent en effluent afvalwater toevoer voedingsstoffen. Hier demonstreren we het batchproces met continue gastoevoer en sparen.

Het gebruik van fotobioreactoren behandelt verschillende microalgal teelt-en productie-uitdagingen. Het veld worstelt in het algemeen met bezorgdheid over verontreiniging door andere micro-organismen, efficiënt substraat gebruik (wat vooral belangrijk is in het geval van CO₂ -mitigatie of afvalwaterzuivering)², pH-controle, verlichtings variabiliteit en biomassa-productiviteit³. Fotobioreactoren stellen onderzoekers in staat om een breed scala aan fototroph's te bestuderen in nauw gecontroleerde batch systemen, waarbij zelfs langzaam groeiende soorten worden beschermd tegen roofdieren of concurrerende micro-organismen⁴. Deze batch systemen zijn ook beter in het faciliteren van meer CO₂ -bezettingsgraad en biomassa-productiviteit, omdat ze gesloten systemen zijn die waarschijnlijker zijn in evenwicht met geleverde gassen. Photobioreactor technologie biedt ook pH-controle, waarvan het gebrek de hoge biomassa-productiviteit in eerdere studies⁵heeft belemmerd. Op tafelweegschaal, het niveau van controle aangeboden door fotobioreactoren is voordelig voor onderzoekers. Bij grotere industriële weegschalen kunnen fotobioreactoren worden gebruikt om de zuiverheid van commerciële bioproduct te handhaven en de productie-efficiëntie voor nutraceutische, cosmetische, voedsel-of voeder toepassingen te verbeteren⁶.

Microalgen zijn van groot belang voor de biosequestration van CO₂ omdat ze co₂ snel kunnen repareren als biomassa-koolstof. De meeste antropogene bronnen van CO₂ zijn echter verontreinigd met andere corrosieve en toxische gassen of verontreinigingen (geen_x, dus_x, Co, Hg), afhankelijk van de brandstofbron van het verbrandingsproces. Groeiende belangstelling voor duurzame co₂ -vastlegging heeft de ontwikkeling van bioreactor-technologieën voor de behandeling van co₂-rijke emissies, zoals die van kolen gestookte elektriciteitscentrales (tabel 1), veroorzaakt. Helaas bestaat er een inherent risico op blootstelling van mens en milieu aan de corrosieve en toxische verontreinigingen tijdens onderzoek en opschaling. Als zodanig is het beschrijven van de veilige assemblage en werking van bioreactoren met behulp van corrosieve gassen noodzakelijk en leerzaam.

Deze methode is voor het gebruik van een 2 L tafelweegschaal fotobioreactor voor de groei van microalgen onder zorgvuldig gecontroleerde experimentele omstandigheden. Het protocol beschrijft microalgal opslag, entmateriaal voorbereiding en fotobioreactor Setup en sterilisatie. Naast de basiswerking beschrijft dit werk de microalgen biomassa-metingen en de berekeningen van de biomassa-productiviteit, en de aanpassing van de apparatuur voor de microalgen teelt met corrosieve gassen. Het hieronder beschreven protocol is geschikt voor onderzoekers die meer experimentele controle willen uitoefenen, de groeiomstandigheden van microalgen moeten optimaliseren of een reeks fototrofische microben kunnen omkweken. Bij deze methode worden geen geschikte materialen beschreven voor de teelt van microben die ontvlambare gassen produceren of consumeren (bijvoorbeeld CH₄, H₂, enz.). ⁷.

Protocol

1. veilig gebruik en bemonstering van een fotobioreactor met corrosieve gassen

Opmerking: deze methode beschrijft niet de juiste procedures voor een veilige bemonstering van microalgen culturen die licht ontvlambare gassen produceren of consumeren.

1. Giftig gas beheren als een risico voor de menselijke gezondheid.
   Opmerking: volgens het Chemical Hygiene plan van de Universiteit van Iowa werkten de auteurs samen met de University Fire Safety Coordinator en de University Environmental Health & Safety Industrial Hygiene Officer om een veiligheidsprotocol te ontwikkelen voor het werken met de giftige gassen.
2. Stel een systeem voor het bewaken van toxische gassen in met sensoren voor elk van de giftige gassen die in gebruik zijn. Kalibreer de sensoren volgens de instructies van de fabrikant. Bumptest (Controleer op sensor-en alarm functionaliteit met kalibratiegassen) regelmatig, volgens de instructies van de fabrikant. Zoek de gasmonitor net buiten de dampkap.
3. Voorafgaand aan het begin van een corrosieve gasexperimenten, Informeer het personeel in de buurt van het risico-en alarmsysteem. Informeer ook de juiste lokale hulpverleners. Post borden op laboratorium ingangen die specificeren welke gevaarlijke gassen in gebruik zijn.
   1. Instrueer alle nabijgelegen medewerkers om te evacueren als giftig gas wordt gedetecteerd. Informeer laboratorium toezichthouders en noodhulppersoneel.
      Opmerking: in een stroomstoring zal de gasregelende toren de gasstroom stoppen wanneer deze stroom verliest. Echter, als de kamer Verwarming, ventilatie, en airconditioning (HVAC) systeem of rook afzuigkap naar beneden gaan zonder stroomuitval, dit zal resulteren in lekkende giftige gassen.
4. Model lering van de mogelijke geaccumuleerde concentratie van giftige gassen in de ruimte als de rook afzuigkap zou falen door gebruik te maken van de (AIHA) wiskundige Modeling spreadsheet IH MOD⁸ van de American Industrial hygiëne Association voor elk gas.
   1. Verkrijg de toevoer/afvoer van de kamer, Q, in m³ min^-1 van het bouwen van HVAC-onderhoudspersoneel of HVAC-technicus. Bereken het volume, V, van het laboratorium (L x b x H) in m³. Bereken de verontreinigings frequentie, G, van elk type giftig gas in mg min^-1, met behulp van vergelijking 1 die is aangepast aan de ideale gaswet:
      1
      waarbij P de Fractie van druk is die door het toxische gas wordt uitgeoefend bij 1 ATM (ppm gas/10⁶ ppm), Q-_gas is de debiet van het gas in L min^-1, R is de universele gasconstante (0,082057 L · ATM · mol^-1· K^-1), T is de temperatuur in K en MW is het molecuulgewicht van het gas in g mol^-1.
   2. Gebruik de waarden voor V, Qen G voor elk gas (berekend in stap 1.4.1) in het "goed gemengde kamer model met optie om het genereren en model kamer zuivering te staken" algoritme in de IH mod spreadsheet om de geaccumuleerde kamer gasconcentraties voor elk gas te berekenen over een 1440 min (24 h) simulatieperiode. Vergelijk deze waarden met de blootstellingslimieten (tabel 2)⁹.

2. bereiding van het entmateriaal van de microalgal

1. Bereid de Scenedesmus obliquus inoculum, of andere microalgal soort geselecteerd voor de photobioreactor, vóór het begin van het experiment door het overbrengen van opslag, of cryopreserved of gekweekt op agar media.
   1. Voeg 30 − 50 mL steriel microalgen groeimedium (Triple-stikstofvet Basaal medium [3N-BBM], tabel 3) toe aan een steriele (150 − 250 ml) schud kolf met een schuim stopper.
      Opmerking: tenzij de kolf is spaard, mag slechts een vijfde van het volume van de schud fles worden ingenomen door vloeibare media.
   2. Gebruik een bioveiligheidskast om de steriliteit te behouden bij het overbrengen van cellen naar een schuine of schud kolf. Gebruik voor culturen met agar een steriele lus om microalgen van de agar-plaat of schuin naar de schud kolf te brengen. Voor cryopreserved culturen, geleidelijk ontdooien het cryopreserved monster en spoel weg de cryoprotectant volgens het gekozen protocol¹⁰, vervolgens de cellen toevoegen aan de Shake kolf.
   3. Kweekcellen in 3N-BBM bij 20 − 25 °C onder 16 h:8 h licht: donker en schudden bij 115 − 130 tpm.
   4. Volg de groei van microalgen in de loop van de tijd met behulp van optische dichtheid (OD) metingen (zoals in de paragrafen 5 en 6). Laat de microalgen zijn exponentiële groeifase bereiken (2 − 4 dagen) voordat cellen worden overgebracht naar de fotobioreactor.
      Opmerking: afhankelijk van het doel van het experiment, kunnen de cellen worden gespoeld van kweekmedium (deze studie) en/of geconcentreerd met meerdere centrifugeren stappen voorafgaand aan de inoculatie van de bioreactor.

3. installatie en werking van bioreactor

1. Gebruik de bioreactor (Figuur 1) om temperatuur, pH, roersnelheid, gasstroomsnelheden en debiet van de ingangs oplossing te regelen.
   Opmerking: de bioreactor kan worden gebruikt voor het regelen van de stroom van maximaal vier verschillende invoer oplossingen, gewoonlijk zuur, Base, anti schuim, en substraat.
   1. Bereid 100 mL elk van 1 N NaOH en 1 N HCl en voeg elk toe aan een 250 mL input Solution Bottle. Gebruik secundaire containment voor deze oplossingen.
   2. Sla gemeten invoer oplossingen op in autoclaveerbare afgetopte flessen met DIP-buizen en een ventilatiebuis met een steriel inline luchtfilter. Sluit de DIP-buizen aan op de vier ingangspoorten van de bioreactor met behulp van autoclaveerbare slangen en dompel de DIP-buizen tijdens de bioreactor-bewerking onder in de invoer oplossingen. Geef de 1,6 mm Inside dimeter (ID) autoclaveerbare slang tussen de ingangs oplossingen en hun poorten door afzonderlijke peristaltische pompen die kunnen worden bestuurd door handmatig geselecteerde stroomsnelheden of door feedback van pH-en schuim sondes (in het geval van zuur, basis-en antischuim oplossingen).
2. Kalibreer de fotobioreactor pH-meter vóór Autoclaveren.
   1. Verbind de pH-sonde met de fotobioreactor-besturings toren door de sonde aan de verbindingslijn te monteren en te draaien om te vergrendelen. Gebruik pH 4-en pH 7-buffers om de pH-meter te kalibreren. Wacht totdat de waarden zijn gestabiliseerd voordat de waarde van de pH-meter wordt geaccepteerd.
   2. Koppel de pH-sonde los van het pH-meter snoer dat de sonde met de controle toren verbindt.
   3. Oppervlak steriliseren met 70% ethanol of autoclaaf de sonde met de reactor. Tot autoclaaf, dop de pH-elektrode strak met aluminiumfolie.
      Opmerking: als de sonde is autoclaved, er is een risico van corrosie van de sonde interieur van stoom schade. Deze capping methode garandeert niet volledig schadepreventie.
   4. Voeg 10 mM 4-(2-hydroxyethyl) piperazine-1-ethanesulfoninezuur (HEPES) buffer toe aan het kweekmedium om de pH beter te beheersen.
3. INSERT en Screw gesloten de koude vinger en uitlaat condensor op de bioreactor Hoofdplaat.
4. Plaats de inoculatie poort en schroef stevig op zijn plaats. Voeg een lengte van autoclaveerbare slang toe aan de sectie van de inoculatie poort boven de fotobioreactor Hoofdplaat. Vóór Autoclaveren van de bioreactor, klem de slang gesloten met een autoclaveerbare slangklem.
5. Bevestig de slang met steriele filters aan alle ongebruikte fotobioreactor-poorten.
6. Bevestig zuur-en basis invoer oplossingen aan de bioreactor ingangspoorten via autoclaveerbare slangen. Voeg 1,5 L kweekmedium toe.
7. Autoclaaf de reactor en de bijbehorende input oplossingen voor 30 − 45 min bij 121 °C afhankelijk van het werkvolume.
   Opmerking: als het kweekmedium nadelig wordt beïnvloed door Autoclaveren, voeg dan de media toe na autoclaven onder steriele omstandigheden in een laminaire stroom afzuigkap. Het protocol kan hier worden onderbroken.
   Let op: de reactor zal heet zijn na het verwijderen uit autoclaaf.
8. Bevestig de waaier motor aan de waaier schacht en draai de fitting aan.
9. Regel de LED-lichtpanelen symmetrisch buiten de bioreactor volgens de verlichtingsvereisten.
   1. Meet en noteer vóór het autoclaven de lichtintensiteit met een fotometer. Plaats de verlichtingssterkte sensor in het fotobioreactor-vat en gezicht op de sensor naar de lichtbron.
10. Verbind tot twee gascilinders om de gesimuleerde kolen gestookte elektriciteitscentrales (tabel 1) aan de microalgen in de fotobioreactor te leveren.
    Opmerking: de gasconcentraties die in deze studie werden gebruikt, benade die van de University of Iowa Power plant.
    1. Monteer de verbindingen tussen de gascilinder, gasregulerende toren en fotobioreactor sparende ring. Bevestig de juiste regelventielen die 20 psi uitlaatdruk kunnen uitoefenen op de gascilinders. Bevestig 6 mm ID-drukbestendige slang aan de slang van de regulator-uitgang en bevestig deze met een slangklem. Bevestig het andere uiteinde van de drukbestendige slang aan de gas-regeling van de gasinlaat met behulp van een slangverbinding tot 6 mm stuurpen Quick Connect fitting beveiligd met een slangklem. Sluit de 3,2 mm id-slang aan op de gas-regulerende gasuitlaat met behulp van een andere 6 mm Quick Connect fitting en sluit het andere uiteinde van de Uitlaatslang aan op de sparende ring poort op de kopplaat van bioreactor.
       Opmerking: voor een tweede invoer gas, herhaal stap 3.9.1, maar gebruik een T-vormige slang Barb om de twee ingangs gasleidingen te consolideren tot een enkel deel van de buis dat is aangesloten op de sparend ring poort.
    2. Stel de uitlaatdruk in op 20 psi op elke Gasregelaar en gebruik de bioreactor-interface om experimentele gasstroomsnelheden in te stellen.
       Opmerking: Bereken en Rapporteer het volume van de lucht onder standaardomstandigheden per volume vloeistof per minuut (VVM); Verdeel de volumetrische gasstroom door het kweek volume. Rapport in eenheden per miniute.
11. Bevestig bij het sparen met meer dan één gascilinder de meegeleverde co₂ -concentratie aan de bioreactor met een co₂ -sensor.
    1. Sluit een software (bijv. GasLab) compatibele CO₂ -sensor aan op de USB-poort van een computer. Download de meest recente software die overeenkomt met het CO₂ -sensor model. Open de software en voer het sensor model, het meet tijdsinterval en de duur van de registratie van de meetgegevens in.
    2. Plaats de CO₂ -sensor en de gecombineerde gasstroom buis (voorafgaand aan het aansluiten van de buis met de bioreactor) in een 100 − 250 ml, afgedekt, geventileerd vaartuig (buiten de bioreactor).
       Opmerking: tijdens het experiment kunnen de concentraties van de headspace CO₂ worden gemeten vanaf een van de ventilatiebuizen op de Hoofdplaat van de fotobioreactor.
    3. Start de CO₂ -concentratiemetingen op de gebruikersinterface en wacht tot de metingen op een evenwichts veld worden.
    4. Gebruik de bioreactor gebruikersinterface om de gasstroomsnelheden van elke tank aan te passen tot het gewenste totale debiet (0,1 L min^-1) en co₂ -concentratie (12%) wordt bereikt.
12. Gebruik de functie stirr op de gebruikersinterface van bioreactor om de rotatiesnelheid van de waaier in te stellen. Zorg ervoor dat de mengsnelheid snel genoeg is voor het kweekmedium om de sparged gasbellen te assimileren.
    Opmerking: bepaalde microalgal soorten hebben zwakke celstructuren en zullen worden beschadigd of gescheurd door een hoge schuifkracht.

4. aanpassen van de bioreactor en experimentele Setup voor giftig gas gebruik

Let op: de corrosieve gassen in reëel of gesimuleerd rookgas zijn corrosief en giftig. Deze gassen vormen ernstig risico bij inademing.
Opmerking: deze methode beschrijft geen geschikte materialen voor de veilige teelt van microben die licht ontvlambare gassen produceren of consumeren (d.w.z. methaan, waterstof, enz.).

1. Vervang messing, plastic en standaard slang componenten met corrosiebestendige materialen.
   1. Gebruik roestvrijstaal om op betrouwbare wijze corrosie te weerstaan aan de sterke zuren gevormd door de reactie tussen NO_x of so_x en water. Vervang plastic Quick Connect fittingen bij de gasinlaten en uitgangen op de gasregelende toren met roestvrijstalen Quick Connect fittingen. Gebruik roestvrijstalen regelventielen voor gascilinders inclusief de verbindingsslang in plaats van messing.
   2. Gebruik polytetrafluorethyleen (PTFE) of natuurlijke ethyl vinylacetaat (EVA) buizen om corrosie van NO_x en dus_x gassen (respectievelijk) te weerstaan op de verbindingen tussen de gascilinder en de gasregelende toren en de gasregelende toren naar de fotobioreactor.
2. Monteer na autoclaven de fotobioreactor en gascilinders in een inloop afzuigkap. Plaats de bioreactor op een tafel in de secundaire containment en plaats gascilinders in vrijstaande cilinder halsbanden of een cilinderrek.
3. Na het initiëren van de gasstroom, gebruik een Bubble type vloeistoflekkage detector om te controleren op gaslekken in alle verbindingen tussen de gascilinders en bioreactor. Gebruik een wasfles gevuld met een 1:100 (v:v) verdunning van afwasmiddel: water om de verbinding te bedekken met een kleine stroom zeepoplossing.
   Opmerking: lekkages worden aangegeven door te borrelen bij de aansluitingen.
4. Bij het initiëren van de microalgal experimenten, beginnen gefiltreerde dan pas pH voor de inoculatie (zoals in standaard bioreactor experimenten).
   Opmerking: het bufferen van het kweekmedium tijdens corrosieve gasexperimenten wordt sterk aanbevolen omdat de ingangs gassen sterk zuur zijn.
5. Beënt de fotobioreactor door het bereide microalgal entmateriaal in een steriele spuit te zuigen, de spuit aan te brengen op de slang die aan de inoculatie poort is bevestigd, de inoculatie slangklem te openen en de spuit te deprimerend.
6. Controleer de gasmonitor, gascilinder druk en fotobioreactor tweemaal daags (en voorafgaand aan de bemonstering) op verhoogde niveaus van giftig gas of indicatie van lekkages.
7. Beperk de schuifopening van de dampkap tot een breedte waarmee de bioreactor en de gascilinder regelventielen kunnen worden bereikt. Om blootstelling aan inademing te voorkomen, moet u ervoor zorgen dat de opening geen personeel boven het romp gebied blootstelt.
8. Draai de regelventielen van de gascilinder naar de gesloten positie om de gasstroom naar de reactor te staken. Sluit de dampkap en laat 5 minuten voor de kap de corrosieve gassen evacueren voordat de fotobioreactor cultuur wordt bemonsterd.
9. Steek het monster in de afzuigkap door een kopplaat te openen en een steriele serologische pipet of een teken cultuur in een spuit te gebruiken via de inoculatie/monsternemings poort. Beveilig de fotobioreactor poorten voordat u de gascilinders opent en het experiment hervat.

5. meten van de microalgal biomassa productiviteit

1. Gebruik een kalibratiecurve om microalgal Culture OD₇₅₀ -metingen te koppelen aan gedroogde microalgal biomassa concentraties.
   1. Bereid verschillende (minimum: 4, minimale werkvolume: 500 mL) kolven met steriel microalgal medium en inoculeren met de soorten van belang (bijv., S. obliquus in deze studie).
   2. Meet de cultuur OD₇₅₀ totdat de groei exponentieel is, en onmiddellijk de kolven monster nemen door het filteren van bekende volumes (minimum van 100 ml) van de inhoud met een 0,45 μm filtermembraan van bekende massa. Gebruik overdekte aluminium weeg boten of glazen vaten om de biomassa en filters te ondersteunen als ze worden gedroogd.
   3. Massa de biomassa en filters na drogen gedurende ongeveer 18 − 24 uur in een oven tussen 80 − 100 °C. Om de volledige droging te controleren, meet u opnieuw na 2 − 3 uur om te bepalen of de massa is gestabiliseerd.
   4. Trek de filter massa af van de gecombineerde biomassa en filter massa om de biomassa massa te berekenen.
   5. Plot de ijkcurve als gemeten OD₇₅₀ tegen de biomassaconcentratie (massa van de biomassa gedeeld door het volume van de gefilterde cultuur) en plaats de gegevens in een lineaire regressie.

6. modellering en berekening van de biomassa productiviteit

1. Bereken de biomassa concentraties van experimenten uit OD₇₅₀ -metingen met behulp van de lineaire regressie van de kalibratiecurve (bepaald in punt 5).
2. Fit batch microalgal groeigegevens van lag naar exponentiële naar stationaire fase met een logistieke regressie (vergelijking 2) in grafische en statistiek software (tabel met materialen):
   2
   waar L de maximale biomassaconcentratie waarde van de curve is, is k de relatieve helling van de exponentiële fase (tijd^-1), x_o is de tijd van het middelpunt van de sigmoïdale curve en x is tijd.
   1. Voer de logistieke vergelijking hierboven handmatig in. Selecteer een curve met niet-lineaire regressie passen op het tabblad analyse in de software. Aan de linkerkant van de parameters: niet-lineaire regressie vak, kiest u nieuwe vergelijking maken onder de nieuwe vervolgkeuzelijst. Gebruik de standaard expliciete vergelijking als vergelijkings type, noem de nieuwe functie en definieer de nieuwe functie als Y = L/(1 + exp (-k * (x-b))), waarbij b staat voor x_o.
3. Bereken de totale biomassa-productiviteit van de microalgal batch door het verschil tussen de uiteindelijke en de aanvankelijke biomassa concentraties te delen door het verschil tussen de eind-en begintijden.
4. Bereken de maximale biomassa-productiviteit van de microalgal-partij uit de afgeleide van vergelijking 2 (vergelijking 3) op het middenpunt van de sigmoid, wanneer x = x_o.
   3

Representative Results

Een ijkcurve voor de groene microalgen, S. obliquus, geoogst in de exponentiële fase, werd vastgesteld met od₇₅₀ en gedroogde biomassa concentraties (Figuur 2). De lineaire regressie had een R² -waarde van 0,9996.

Een S. obliquus cultuur werd gestart in een erlenmeyer kolf van 250 ml uit een op een gekoelde agar plaat opgeslagen cultuur. De microalga werd inocculeerd in 3n-BBM met 10 mm Hepes buffer en sparged met 2,2% Co₂ in een 2 L bioreactor met 1,5 L werkvolume (0,07 VVM) (Figuur 1). De batch werd bijgehouden via OD₇₅₀; de biomassa concentraties werden berekend op basis van de ijkcurve en gemodelleerd met een logistieke curve (Figuur 3). De bioreactor handhaafde de cultuur bij pH 6,8, 100 cm³ min^-1 totale gasstroom, continue 280 μmol m^-2 s^-1 verlichting en 27 °c. De logistieke curve past biomassaconcentratie gegevens van lag tot exponentiële tot stationaire fase. Uit het logistieke model was de maximale biomassaconcentratie tijdens de batch 2070 ± 20 mg L^-1, de maximale biomassa productiviteit vond plaats op 4,6 dag, en de snelheid van de specifieke biomassa-productiviteit was 1,0 d^-1. De maximale biomassa-productiviteit, berekend op basis van de afgeleide van de logistieke curve ten tijde van de maximale groei, bedroeg 532 ± 60 mg L^-1 d^-1.

Het goed gemengde kamermodel werd gebruikt om de geaccumuleerde concentratie van NO₂te berekenen, dus₂, en co in het geval van rook afzuigkap voor 24 uur. Deze waarden werden vergeleken met de blootstellingslimieten (tabel 2). Bijvoorbeeld, in het scenario waar 0,05 L min^-1 van 400 ppm nr₂ wordt vrijgegeven tijdens een storing van de rook afzuigkap periode van 24 uur, het goed gemengde kamermodel met ingangen van berekende G = 0,0377 mg min^-1, Q = 0,0001 m³ min^-1, V = 100 m³, en maximale tijd voor simulatie = 1440 min voorspelt geen₂ accumulatie tot 0,54 mg m^-3 (0,29 ppm), die boven de aanvaardbare chronische blootstellingslimiet ligt (Amerikaanse conferentie van gouvernementele industriële hygienisten drempelwaarde [ ACGIH TLV]) en onder de kortdurende blootstellingslimiet (STEL).

Een veelbelovend voorbereidend proces met gesimuleerd rookgas bereikte een groter maximum aan biomassa van de microalgal (690 ± 70 mg L^-1 d^-1) dan dat van 12%_{CO 2} en ultra-Zero Air (510 ± 40 mg l^-1 d^-1) (Figuur 4). Voorafgaand aan het experiment werd een gasmonitor gekalibreerd met CO, NO₂, en zo₂. Het gesimuleerde rookgas experiment werd uitgevoerd zonder enig risico voor personeel of schade aan apparatuur van corrosieve gassen.

Figuur 1: bioreactor op tafelblad verlicht door rode en blauwe ledlampjes. De bioreactor werkt als een 2 L batch reactor met 1,5 L werkvolume. De bioreactor wordt continu gevoed met gassen door de sparend ring en overtollige gas openingen door de poorten in de hoofdplaat. Aangepast met toestemming van Molitor et al.⁵. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 2: ijkcurve met betrekking tot OD₇₅₀ naar S. obliquus cel drooggewicht. S. obliquus celcultuurlicht absorptie werd gemeten bij 750 nm, vervolgens werden cellen gefilterd en gedroogd om cel-droge gewichts metingen te verkrijgen. Herdrukt met toestemming van Molitor et al.⁵. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 3: S. obliquus groeigegevens bij 2,2% Co₂ input gemodelleerd met een logistieke regressie. De gegevenspunten vertegenwoordigen de biomassa waarden zoals berekend op basis van optische dichtheidsmetingen. De gegevens zijn gemodelleerd met een logistieke regressie door middel van een kleinste kwadraten pasvorm; waarbij l = 1955 mg l^-1, k = 1,154 d^-1, en x₀ = 3,317 d. R² = 0,995. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 4: gemodelleerde S. obliquus groei bij 12% co₂, met en zonder extra gesimuleerde rookgas componenten. De biomassa metingen van elke partij microalgen werden gemodelleerd met logistieke regressies. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Component	Procent
H2O	12,6%
CO2	11,6%
O2	5,8%
Co	0,048%
SO2	0,045%
NO2	0,022%
N2	69,9%

Tabel 1: samenstelling van de emissies van kolencentrales. Deze hoeveelheden werden gemiddeld van de emissiegegevens van de University of Iowa Power plant verzameld met minuten tussenpozen over de spanwijdte van 10 uur.

Giftig gas	Twa	Plafond	STEL	NIOSH IDLH	NIOSH REL	ACGIH TLV	CDC beschrijving
Co	35 ppm	200 ppm	-	1.200 ppm	35 ppm	25 ppm	Kleurloos, geurloos
SO2	2 ppm	100 ppm	5 ppm	100 ppm	2 ppm	2 ppm	Kleurloos gas met een karakteristieke, irriterende, penetrante geur
NO2	3 ppm	5 ppm	1 ppm	13 ppm	1 ppm	0,2 ppm	Geel-bruine vloeistof of rood bruin gas (boven 70 °f) met een penetrante, bijtend-geur

Tabel 2: blootstellingslimieten en-beschrijvingen voor giftige gassen (Co, dus₂, nr.₂) in rookgas. OSHA TWA: tijd gewogen gemiddelde (meestal 8 h periode), plafond: waarde nooit te bereiken, STEL: kortdurende blootstellingslimiet (TWA meer dan 15 min), NIOSH IDLH: gevaar voor leven en gezondheid, NIOSH REL: 15 min blootstellingslimiet, ACGIH TLV: acceptabele chronische blootstellingslimiet, geen nadelige effecten.

Samengestelde	Mm
NaNO3	8,82 x 100
MgSO4· 7h2O	3,04 x 10-1
Nacl	4,28 x 10-1
K2HPO4	4,31 x 10-1
KH2po4	1,29 x 100
CaCl2· 2H2O	1,70 x 10-1
ZnSO4· 7h2O	3,07 x 10-2
MnCl2· 4h2O	7,28 x 10-3
MoO3	4,93 x 10-3
CuSO4· 5H2O	6,29 x 10-3
Co (nr.3)2· 6h2O	1,68 x 10-3
H3Bo3	1,85 x 10-1
Edta	1,71 x 10-1
Koh	5,52 x 10-1
FeSO4· 7h2O	1,79 x 10-2
H2dus4 (geconcentreerd)	1 x 10-3 μL

Tabel 3: samenstelling van Triple-stikstofvet Basaal medium (3N-BBM). De hoeveelheid stikstof is verdrievoudigd uit de oorspronkelijke vet basale medium¹¹.

Discussion

Batch, Axenische bioreactor experimenten met gereguleerde pH, temperatuur, gasstroom en gasconcentratie bevorderen zinvolle resultaten door het elimineren van verontreiniging door niet-doelwit algen stammen en variabiliteit in cultuuromstandigheden. Nauwkeurige pure cultuur groei kinetiek kan ook worden verkregen in de aanwezigheid van corrosieve gassen (CO₂, dus₂, No₂), die als voedingsstoffen dienen, waardoor afvalgassen worden omgezet in een waardevol product zoals diervoeders.

Voorafgaand aan het begin van een microalgal-experiment, moet de gekozen microalga-cultuur uit de opslag worden gehaald en naar de vloeibare cultuur worden bijgesteld. Het kweken van de microalgen in exponentiële fase verbetert de waarschijnlijkheid dat experimenten gelijkwaardige initiële omstandigheden hebben en dat de microalgen niet stagneren in de lag-fase na de inoculatie.

Kalibratie curves met betrekking tot optische dichtheid en biomassa concentraties zijn vooral belangrijk tijdens studies naar de productiviteit van biomassa. De hoge biomassa productiviteit van microalgen is een van de belangrijkste doelstellingen van de microalgen industrie en is als zodanig vaak een indicator van het succes van het onderzoek¹². Daarom moeten nauwkeurige berekeningen van de biomassa concentraties van optische dichtheidsmetingen voortvloeien uit soortspecifieke, nauwkeurige en nauwkeurige kalibratiecurve gegevens. Om mogelijke optische interferenties te voorkomen, is het belangrijk dat metingen voor de kalibratiecurve en tijdens het experiment worden uitgevoerd in gelijkwaardige achtergrond oplossingen. Daarnaast moet de ijkcurve worden gemaakt met metingen uit microalgen in de groeifase (s) die de meeste representatief zijn voor die in de experimenten. Bepaalde microalgal soorten kunnen dramatische verschillen in celgrootte hebben tijdens verschillende groeifases die de extinctie en gepercipieerde biomassa concentraties kunnen veranderen. Er moet worden opgemerkt dat de productiviteit van biomassa verband heeft met, maar niet gelijkwaardig is aan de groeisnelheid. De specifieke groeisnelheid hangt af van het aantal cellen (verandering in celdichtheid over tijd/celdichtheid) en de specifieke productiviteit van de biomassa is afhankelijk van de bulk massa van cellen (verandering in mg/L biomassa in de loop van de tijd per mg/L biomassa)¹³ aanwezig.

Wanneer biomassa concentraties van microalgen worden gemodelleerd met een logistieke curve, kunnen experimentele resultaten zinvol worden vergeleken door interpolatie van biomassa concentraties en het nauwkeurig berekenen van biomassa productiviteiten. Bij de interpretatie van deze experimentele resultaten moet echter worden gezorgd voor voorzichtigheid; het is ongepast om de totale en maximale batch biomassa productiviteit te vergelijken. Hoewel de maximale biomassa-productiviteits waarden nuttig zijn om batch resultaten te vergelijken, is de algehele productiviteit van biomassa misleidend zonder verdere informatie over de duur van het experiment en de groeifasen van de microalgen. Deze tarieven veranderen continu tijdens de lag, log groei, en stationaire fasen.

Tijdens experimenten met corrosieve gassen die kenmerkend zijn voor elektriciteitscentrales of industriële verbrandingsemissies, dient voorzichtigheid te worden betracht voor zowel de gezondheid van de mens als de levensduur van de apparatuur. Standaardonderdelen moeten worden vervangen door robuustere materialen en verbruiksgoederen zoals slangen moeten worden geïnspecteerd en vaker worden vervangen om corrosie te weerstaan, lekken te voorkomen en menselijke blootstelling te vermijden. Extra veiligheidsmaatregelen en risicobewustzijn zijn essentieel voor een veilige en succesvolle werking en bemonstering. De methode is niet geschikt voor ontvlambare gassen omdat er potentieel voor gasaccumulatie in de headspace is en de apparatuur niet is ontworpen voor dergelijke Risico's, noch geschikt is voor een veilige aanpassing aan dergelijke omstandigheden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biostat A bioreactor	Sartorius Stedim		2-liter bioreactor for microbial fermentation; designed to be autoclaved; pH, temperature, gas flow rate control
Bump test NO2 gas	Grainger	GAS34L-112-5	Calibration gas for MultiRAE gas detector
Bump test O2, CO, LEL gas	Grainger	GAS44ES-301A	Calibration gas for MultiRAE gas detector
Bump test SO2 gas	Grainger	GAS34L-175-5	Calibration gas for MultiRAE gas detector
Corrosion resistant tubing for NO2 gas	Swagelok	SS-XT4TA4TA4-6	PTFE Core Hose Smooth Bore X Series—Fiber Braid and 304 SS Braid Reinforcement
Corrosion resistant tubing for SO2 gas	QC Supply	120325	Reinforced Braided Natural EVA Tubing - 1/4" ID
cozIR 100% CO2 meter	Gas Sensing Solutions Ltd.	CM-0121 at CO2meter.com	CO2 meter for concentrations up to 100%
cozIR 20% CO2 meter	Gas Sensing Solutions Ltd.	CM-0123 at CO2meter.com	CO2 meter for concentrations up to 20%
Durapore Membrane Filter, 0.45 μm	Millipore Sigma	HVLP04700	Hydrophilic, plain white, 47 mm diameter, 0.45 μm pore size, PVFD membrane filters
Gas cylinder regulators	Praxair	PRS 40221331-660	Single-stage stainless steel regulator configured for 0-15 psi outlet assembly diaphragm valve with 1/4" MNPT threads, Stainless steel to resist corrosion from NOx and SOx
Gas cylinders	Praxair	Ulta-zero air, high purity CO2, or custom gas composition	Dependent on study objectives
Gas monitoring and leak detection system	RAE Systems by Honeywell	MAB3000235E020	Pumped model that detects O2, SO2, NO2, CO, and LEL
GasLab software	GasLab	v2.0.8.14	Software for CO2 meter measurements and data logging
Hose barb	Grainger	Item # 3DTN3	Used to adapt regulators to tubing, Stainless steel to resist corrosion from NOx and SOx
K30 1% CO2 meter	Senseair	CM-0024 at CO2meter.com	CO2 meter for concentrations less than 1%
LED grow panels	Roleadro	HY-MD-D169-S	Red & blue LED light panels
Memosens dissolved oxygen probe	Endress+ Hauser	COS22D-19M6/0	Autoclavable (with precautions) dissolved oxygen probe for bioreactor
Memosens pH probe	Endress+ Hauser	CPS71D-7TB41	Autoclavable (with precautions) pH probe for bioreactor
Oven, Isotemp 500 Series	Fisher Scientific	13246516GAQ	Small oven for drying
Prism GraphPad software	GraphPad Software	Version 7.03 or 8.0.1	Graphing software for data organization, data analysis, and publication-quality graphs
Stem to hose barb fitting	Swagelok	SS-4-HC-A-6MTA	Stainless Steel Hose Connector, 6 mm Tube Adapter, 1/4 in. Hose ID
Tubing, dilute acid/base transfer	Allied Electronics and Automation	6678441	Silicone TP Process Tubing; 1.6mm Bore Size; 3000mm Long; Food Grade
Tubing, gas transfer	Allied Electronics and Automation	6678444	Silicone TP Process Tubing; 3.2mm Bore Size; 3000mm Long; Food Grade