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Culture de microalgues et quantification de la biomasse dans un photobioréacteur à l'échelle du banc avec des gaz de flue corrosif

Published: December 19, 2019 doi: 10.3791/60566
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Civil and Environmental Engineering, University of Iowa

Summary

La culture halenique à l'échelle du banc facilite la caractérisation microalgale et l'optimisation de la productivité avant l'intensification des processus ultérieurs. Les photobioréacteurs fournissent le contrôle nécessaire pour des expériences microalgal fiables et reproductibles et peuvent être adaptés pour cultiver en toute sécurité des microalgues avec les gaz corrosifs (CO2, SO2, NO2) à partir d'émissions de combustion municipales ou industrielles.

Abstract

Les photobioréacteurs sont des systèmes de culture illuminés pour des expériences sur les micro-organismes phototrophes. Ces systèmes fournissent un environnement stérile pour la culture microalgale avec la température, le pH, et la composition de gaz et le contrôle du débit. À l'échelle du banc, les photobioréacteurs sont avantageux pour les chercheurs qui étudient les propriétés microalgues, la productivité et l'optimisation de la croissance. À l'échelle industrielle, les photobioréacteurs peuvent maintenir la pureté du produit et améliorer l'efficacité de la production. La vidéo décrit la préparation et l'utilisation d'un photobioréacteur à l'échelle du banc pour la culture de microalgues, y compris l'utilisation sécuritaire d'intrants de gaz corrosifs, et détaille les mesures pertinentes de la biomasse et les calculs de productivité de la biomasse. Plus précisément, la vidéo illustre le stockage et la préparation de la culture microalgale pour l'inoculation, l'assemblage et la stérilisation des photobioréacteurs, les mesures de la concentration de biomasse et un modèle logistique pour la productivité de la biomasse microalgale à taux les produits de biomasse maximaux et globaux. De plus, comme les expériences visant à cultiver des microalgues à l'aide d'émissions de gaz à déchets simulées ou réelles couvrent les adaptations nécessaires à l'équipement de photobioréacteur pour travailler avec des gaz corrosifs et discuter de l'échantillonnage en toute sécurité dans tels scénarios.

Introduction

Les photobioréacteurs sont utiles pour les expériences contrôlées et la culture de produits microalgues plus purs que ce qui peut être réalisé par des étangs ouverts. La culture de microalgues dans les photobioréacteurs à l'échelle du banc soutient le développement de connaissances fondamentales qui peuvent être utilisées pour l'intensification des procédés. De légères modifications des conditions environnementales peuvent modifier considérablement les expériences microbiologiques et confondre les résultats1. Un processus stérile avec la température, le pH, et le contrôle de sparging de gaz est avantageux pour étudier des propriétés et des performances microalgal escopiques dans des conditions variées. En outre, le contrôle des concentrations de gaz d'entrée, de la température, de la force de cisaillement provenant du mélange et du pH moyen peut soutenir diverses espèces qui sont autrement difficiles à cultiver. Les photobioréacteurs peuvent être exécutés comme un processus de lot avec l'alimentation et la sparging continues de gaz, ou comme système d'écoulement de chemostat avec l'alimentation continue de gaz et sparging plus les entrées influentes et d'effluent sépulration d'eau usées nutritives. Ici, nous démontrons le processus de lot avec l'alimentation continue de gaz et de sparging.

L'utilisation de photobioréacteurs répond à plusieurs défis de culture et de production microalgues. Le champ est généralement aux prises avec des préoccupations de contamination par d'autres micro-organismes, l'utilisation efficace du substrat (ce qui est particulièrement important dans le cas de l'atténuation du CO2 ou le traitement des eaux usées)2, la lutte contre le pH, la variabilité de l'éclairage, et la productivité de la biomasse3. Les photobioréacteurs permettent aux chercheurs d'étudier un large éventail de phototrophes dans des systèmes de lots étroitement contrôlés, où même les espèces à croissance lente sont protégées contre les prédateurs ou les micro-organismes concurrents4. Ces systèmes de lots facilitent également mieux les taux d'utilisation du CO2 et la productivité de la biomasse parce qu'il s'agit de systèmes fermés qui sont plus susceptibles d'être en équilibre avec les gaz fournis. La technologie des photobioréacteurs offre également un contrôle du pH, dont l'absence a entravé la productivité élevée de la biomasse dans les études antérieures5. À l'échelle du banc, le niveau de contrôle offert par les photobioréacteurs est avantageux pour les chercheurs. À de plus grandes échelles industrielles, les photobioréacteurs peuvent être utilisés pour maintenir la pureté des bioproduits commerciaux et améliorer l'efficacité de la production pour les applications nutraceutiques, cosmétiques, alimentaires ou alimentaires6.

Les microalgues sont d'un grand intérêt pour la bioséquestration du CO2, car elles peuvent rapidement fixer le CO2 sous forme de carbone de biomasse. Cependant, la plupart des sources anthropiques de CO2 sont contaminées par d'autres gaz ou contaminants corrosifs et toxiques (NOx, SOx, CO, Hg), selon la source de carburant du processus de combustion. L'intérêt croissant pour la séquestration durable du CO2 a incité le développement de technologies de photobioréacteur pour traiter les émissions riches enCO2,comme celles des centrales au charbon (tableau 1). Malheureusement, il existe un risque inhérent d'exposition humaine et environnementale aux contaminants corrosifs et toxiques au cours des processus de recherche et d'intensification. En tant que tel, la description de l'assemblage et de l'exploitation sécuritaires des bioréacteurs à l'aide de gaz corrosifs est nécessaire et instructive.

Cette méthode est destinée à l'utilisation d'un photobioréacteur à l'échelle du banc de 2 L pour la croissance des microalgues dans des conditions expérimentales soigneusement contrôlées. Le protocole décrit le stockage microalgal, la préparation d'inoculum, et la configuration et la stérilisation de photobioréacteur. Au-delà de l'exploitation de base, ce travail décrit les mesures de la biomasse microalgale et les calculs de productivité de la biomasse, et l'adaptation de l'équipement pour la culture des microalgues avec des gaz corrosifs. Le protocole décrit ci-dessous est approprié pour les chercheurs qui cherchent à exercer un plus grand contrôle expérimental, optimiser les conditions de croissance microalgal, ou la culture axénique d'une gamme de microbes phototrophes. Cette méthode ne décrit pas les matériaux appropriés pour la culture de microbes qui produisent ou consomment des gaz inflammables (p. ex. CH4, H2,etc.) 7.

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Protocol

1. Utilisation et échantillonnage sécuritaires d'un photobioréacteur sparged avec des gaz corrosifs

REMARQUE : Cette méthode ne décrit pas les procédures appropriées pour l'échantillonnage sûr des cultures microalgues qui produisent ou consomment des gaz hautement inflammables.

  1. Gérer les gaz toxiques comme un risque pour la santé humaine.
    REMARQUE : Selon le Plan d'hygiène chimique de l'Université de l'Iowa, les auteurs ont travaillé avec le coordonnateur de la sécurité-incendie de l'Université et l'agent d'hygiène industrielle de l'environnement de l'Université pour élaborer un protocole de sécurité pour travailler avec les gaz toxiques.
  2. Mettre en place un système de surveillance des gaz toxiques avec des capteurs pour chacun des gaz toxiques utilisés. Calibrer les capteurs selon les instructions du fabricant. Test de bosse (vérifier la fonctionnalité du capteur et de l'alarme avec les gaz d'étalonnage) fréquemment, selon les instructions du fabricant. Localisez le moniteur de gaz juste à l'extérieur du capot de fumée.
  3. Avant de commencer toute expérience de gaz corrosif, informez le personnel à proximité du système de risque et d'alarme. En outre, aviser les intervenants d'urgence locaux appropriés. Afficher des panneaux sur les entrées du laboratoire en précisant quels gaz dangereux sont utilisés.
    1. Demandez à tout le personnel à proximité d'évacuer si du gaz toxique est détecté. Aviser les superviseurs de laboratoire et le personnel d'intervention d'urgence.
      REMARQUE : En cas de panne de courant, la tour de régulation du gaz arrêtera le flux de gaz lorsqu'elle perdra de la puissance. Toutefois, si le système de chauffage, de ventilation et de climatisation de la pièce ou le capot de fumée diminue sans panne de courant, cela entraînera une fuite de gaz toxique.
  4. Modélisez la concentration possible accumulée de gaz toxiques dans la pièce si le capot de fumée devait échouer en utilisant la feuille de calcul de modélisation mathématique IH MOD8 de l'American Industrial Hygiene Association (AIHA) pour chaque gaz.
    1. Obtenir l'approvisionnement de la pièce / taux d'air d'échappement, Q, en m3 min-1 du personnel d'entretien du bâtiment HVAC ou technicien HVAC. Calculer le volume, V, du laboratoire (L x W x H) en m3. Calculer le taux d'émission de contaminants, G, de chaque type de gaz toxique en mg min-1, en utilisant l'équation 1 adaptée de la loi sur le gaz idéal:
      Equation 1(1)
      où P est la fraction de pression exercée par le gaz toxique à 1 atm (ppm gaz/106 ppm), le gaz Q est le débit du gaz dans L min-1, R est la constante de gaz universel (0,082057 L'atm-mol-1 K-1), T est la température en K, et MW est le poids moléculaire du gaz en g mol-1.
    2. Utilisez les valeurs pour V, Q, et G pour chaque gaz (calculé à l'étape 1.4.1) dans le "Modèle de chambre bien mélangé avec option de cesser la génération et la purge de la salle de modèle" dans la feuille de calcul IH MOD pour calculer les concentrations de gaz de pièce accumulées pour chaque gaz sur une période de simulation de 1440 min (24 h). Comparez ces valeurs aux limites d'exposition (tableau 2)9.

2. Préparation de l'inoculum microalgal

  1. Préparer le Scenedesmus obliquus inoculum, ou d'autres espèces microalgues sélectionnées pour le photobioréacteur, avant le début de l'expérience en le transférant du stockage, qu'il soit cryoconservé ou cultivé sur des supports d'agar.
    1. Ajouter 30 à 50 ml de milieu de croissance microalgal stérile (milieu basal triple azote de Bold [3N-BBM], tableau 3) à un flacon de secousse stérile (150 à 250 ml) recouvert d'un bouchon de mousse.
      REMARQUE : À moins que le flacon ne soit sparged, seulement un cinquième du volume de flacon de secousse devrait être occupé par le support liquide.
    2. Utilisez une armoire de biosécurité pour maintenir la stérilité lors du transfert des cellules vers une fiole oblique ou secouer. Pour les cultures sur l'agar, utilisez une boucle stérile pour transférer les microalgues de sa plaque d'agar ou inclinée à la fiole de secousse. Pour les cultures cryoconservées, décongeler graduellement l'échantillon cryoconservé et rincer le cryoprotecteur selon le protocole10choisi, puis ajouter les cellules à la fiole de secousse.
    3. Cellules de culture en 3N-BBM à 20'25 'C sous 16 h:8 h lumière:obscurité et secouant à 115-130 tr/min.
    4. Suivre la croissance microalgale au fil du temps à l'aide de mesures de densité optique (OD) (comme dans les sections 5 et 6). Permettre aux microalgues d'atteindre leur phase de croissance exponentielle (2 à 4 jours) avant de transférer les cellules vers le photobioréacteur.
      REMARQUE : Selon l'objectif de l'expérience, les cellules peuvent être rincées du milieu de culture (cette étude) et/ou concentrées avec des étapes de centrifugation multiples avant l'inoculation du bioréacteur.

3. Configuration et fonctionnement du photobioréacteur

  1. Utilisez le photobioréacteur (figure 1) pour contrôler la température, le pH, le taux d'agitation, les débits de gaz et les débits de solution d'entrée.
    REMARQUE : Le photobioréacteur peut être utilisé pour contrôler le flux de jusqu'à quatre solutions d'entrée différentes, généralement acide, base, antimousse et substrat.
    1. Préparer 100 ml chacun de 1 N NaOH et 1 N HCl et ajouter chacun à une bouteille de solution d'entrée de 250 ml. Utilisez le confinement secondaire pour ces solutions.
    2. Rangez les solutions d'entrée mesurées dans des bouteilles à capuchon automatiques équipées de tubes de trempette et d'un tube d'évent avec un filtre à air inline stérile. Connectez les tubes de trempette aux quatre ports d'entrée du photobioréacteur à l'aide de tubes autoclavables et, pendant l'opération du photobioréacteur, submersez les tubes de trempette dans les solutions d'entrée. Passer le tube automatique de 1,6 mm à l'intérieur du dimètre (ID) entre les solutions d'entrée et leurs ports à l'aide de pompes péristaltiques séparées qui peuvent être contrôlées soit par des débits choisis manuellement, soit par la rétroaction des sondes de pH et de mousse (dans le cas de l'acide, solutions anti-mousse).
  2. Calibrer le compteur de pH du photobioréacteur avant d'autoclaciner.
    1. Connectez la sonde pH à la tour de contrôle du photobioréacteur en installant la sonde à la ligne de raccordement et en tordant pour verrouiller. Utilisez des tampons pH 4 et pH 7 pour calibrer le pH mètre. Attendez que les valeurs se soient stabilisées avant d'accepter la valeur du compteur de pH.
    2. Débranchez la sonde de pH du cordon de mesure de pH qui relie la sonde à la tour de contrôle.
    3. Stériliser à la surface avec 70% d'éthanol ou autoclave la sonde avec le réacteur. Pour autoclave, bouchonder la sonde de pH étroitement avec du papier d'aluminium.
      REMARQUE : Si la sonde est autoclaved, il y a un risque de corrosion de l'intérieur de la sonde des dommages de vapeur. Cette méthode de plafonnement ne garantit pas complètement la prévention des dommages.
    4. Ajouter 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acide (HEPES) tampon au milieu de la culture pour mieux contrôler le pH.
  3. Insérer et visfermer fermé le doigt froid et condensateur d'échappement sur la plaque de tête photobioréacteur.
  4. Insérez le port d'inoculation et vis s'il est bien en place. Ajouter une longueur de tubes autoclavables à la section du port d'inoculation au-dessus de la plaque de tête du photobioréacteur. Avant d'autoclaciner le bioréacteur, pincez le tube fermé avec une pince à tuyau autoclavable.
  5. Attachez les tubes recouverts de filtres stériles à tous les ports photobioréacteurs inutilisés.
  6. Fixez des solutions d'entrée d'acide et de base aux ports d'entrée de photobioréacteur par l'intermédiaire de tubes autoclavables. Ajouter 1,5 L de milieu de culture.
  7. Autoclave le réacteur et les solutions d'entrée associées pendant 30 à 45 min à 121 oC selon le volume de travail.
    REMARQUE : Si le milieu de culture est affecté négativement par l'autoclacage, ajoutez le support après l'autoclacage dans des conditions stériles dans une hotte de flux laminaire. Le protocole peut être mis en pause ici.
    CAUTION: Le réacteur sera chaud après avoir retiré de l'autoclave.
  8. Fixez le moteur de l'hélice à l'arbre de l'hélice et serrez le raccord.
  9. Disposez les panneaux lumineux LED symétriquement à l'extérieur du bioréacteur selon les exigences d'éclairage.
    1. Avant d'autoclaciner, mesurez et enregistrez l'intensité lumineuse à l'intérieur d'un photomètre. Placez le capteur d'éclairage à l'intérieur du récipient de photobioréacteur et faites face au capteur vers la source de lumière.
  10. Connectez jusqu'à deux bouteilles de gaz pour alimenter les émissions simulées des centrales au charbon (tableau 1) aux microalgues du photobioréacteur.
    REMARQUE : Les concentrations de gaz utilisées dans cette étude se sont rapprochées de celles de la centrale électrique de l'Université de l'Iowa.
    1. Assembler les connexions entre la bouteille de gaz, la tour de régulation du gaz et l'anneau de sparging photobioréacteur. Fixez les régulateurs appropriés capables de la pression de sortie de 20 psi aux bouteilles de gaz. Fixez un tube résistant à la pression iD de 6 mm sur la barbe du tuyau de sortie du régulateur et fixez-les à l'arme à l'air d'une pince à tuyaux. Fixez l'autre extrémité du tube résistant à la pression à l'inlet de gaz régulant la tour à l'aide d'une barbe de tuyau à 6 mm tige rapide raccord de raccord fixé avec une pince à tuyau. Connectez les tubes d'identité de 3,2 mm à la prise de gaz de la tour régulatrice du gaz à l'aide d'un autre raccord de raccord rapide de 6 mm et connectez l'autre extrémité de la tuyauterie de sortie au port d'anneau de sparging à la plaque d'amonce de photobioréacteur.
      REMARQUE : Pour un deuxième gaz d'entrée, répétez l'étape 3.9.1, mais utilisez une barbe de tuyau en forme de T pour consolider les deux conduites de gaz d'entrée à une seule section du tube reliée au port d'anneau d'épargne.
    2. Régler la pression de sortie à 20 psi sur chaque régulateur de gaz et utiliser l'interface du bioréacteur pour définir les débits de gaz expérimentaux.
      REMARQUE : Calculer et déclarer le volume d'air dans des conditions standard par volume de liquide par minute (vvm); diviser le débit de gaz volumeriel par le volume de culture. Rapport en unités de par miniute.
  11. Lorsque vous vous épargnez avec plus d'une bouteille de gaz, confirmez la concentration de CO2 fournie au photobioréacteur avec un capteur de CO2.
    1. Connectez un logiciel (p. ex. GasLab) compatible CO2 au port USB d'un ordinateur. Téléchargez le logiciel le plus récent qui correspond au modèle de capteur CO2. Ouvrez le logiciel et entrez le modèle du capteur, l'intervalle de temps de mesure et la durée de l'enregistrement des données de mesure.
    2. Placez le capteur CO2 et le tube à débit de gaz combiné (avant de relier le tube au bioréacteur) dans un récipient de 100 à 250 ml, plafonné, ventilé (externe au bioréacteur).
      REMARQUE : Au cours de l'expérience, les concentrations de CO2 de l'espace de tête peuvent être mesurées à partir d'un des tubes d'évent sur la plaque de tête du photobioréacteur.
    3. Démarrez les mesures de concentration de CO2 sur l'interface utilisateur et attendez que les mesures s'équilibrent.
    4. Utilisez l'interface utilisateur du photobioréacteur pour ajuster les débits de gaz de chaque réservoir jusqu'au débit total souhaité (0,1 L min-1) et à la concentration de CO2 (12 %) est atteint.
  12. Sur l'interface utilisateur du photobioréacteur, utilisez la fonction STIRR pour définir le taux de rotation de l'hélice. Assurez-vous que le taux de mélange est assez rapide pour que le milieu de culture assimile les bulles de gaz sparged.
    REMARQUE : Certaines espèces de microalgues ont des structures cellulaires faibles et seront endommagées ou rompues par une forte force de cisaillement.

4. Adaptation du photobioréacteur et installation expérimentale pour l'utilisation de gaz toxiques

CAUTION : Les gaz corrosifs dans les gaz de combustion réels ou simulés sont corrosifs et toxiques. Ces gaz présentent un risque sérieux s'ils sont inhalés.
REMARQUE : Cette méthode ne décrit pas les matériaux appropriés pour la culture sécuritaire de microbes qui produisent ou consomment des gaz hautement inflammables (c.-à-d. méthane, hydrogène, etc.).

  1. Remplacez les composants en laiton, en plastique et les tubes standard par des matériaux résistants à la corrosion.
    1. Utilisez de l'acier inoxydable pour résister de façon fiable à la corrosion des acides forts formés par la réaction entre NOx ou SOx et l'eau. Remplacez les raccords de raccord age rapides en plastique aux entrées de gaz et aux prises de la tour réglementant le gaz par des raccords de raccord rapide en acier inoxydable. Utilisez des régulateurs en acier inoxydable pour les bouteilles de gaz, y compris la barbe de tuyau de sortie plutôt que le laiton.
    2. Utilisez des tubes en polytétrafluoroéthylène (PTFE) ou en acétate de vinyle éthylique naturel (EVA) pour résister à la corrosion des gaz NOx et SOx (respectivement) sur les connexions entre la bouteille de gaz à la tour de régulation du gaz et la tour régulatrice du gaz au photobioréacteur.
  2. Après l'autoclacage, assemblez le photobioréacteur et les bouteilles de gaz dans une hotte de fumée sans rendez-vous. Placez le photobioréacteur sur une table à l'intérieur du confinement secondaire et placez les bouteilles de gaz dans des colliers de cylindres libres ou un porte-cylindres.
  3. Après avoir initié le flux de gaz, utilisez un détecteur de fuite liquide de type bulle pour vérifier s'il y a des fuites de gaz dans toutes les connexions entre les bouteilles de gaz et le bioréacteur. Utilisez une bouteille de lavage remplie d'une dilution 1:100 (v:v) de savon à vaisselle: l'eau pour couvrir la connexion avec un petit flux de solution de savon.
    REMARQUE : Les fuites seront indiquées en bouillonnant aux connexions.
  4. Lorsque vous lancez les expériences microalgues, commencez à sparging puis ajustez le pH avant l'inoculation (comme dans les expériences photobioréacteur standard).
    REMARQUE : Il est fortement recommandé de tamponner le milieu de culture pendant les expériences sur les gaz corrosifs, car les gaz d'entrée sont fortement acides.
  5. Inoculer le photobioréacteur en aspirant l'inoculum microalgal préparé dans une seringue stérile, en installant la seringue à la tuyauterie attachée au port d'inoculation, en ouvrant le serrage de tubes d'inoculation et en déprimant la seringue.
  6. Vérifiez le moniteur de gaz, les pressions des bouteilles de gaz et le photobioréacteur deux fois par jour (et avant l'échantillonnage) pour décevoir des niveaux élevés de gaz toxiques ou des fuites.
  7. Limitez l'ouverture de la ceinture de capot de fumée à une largeur qui permet d'atteindre le bioréacteur et les régulateurs de bouteilles de gaz. Pour éviter le risque d'exposition par inhalation, assurez-vous que l'ouverture n'expose pas le personnel au-dessus de la région du torse.
  8. Tournez les régulateurs de bouteilles de gaz à la position fermée pour arrêter le flux de gaz vers le réacteur. Fermez la ceinture de capuchon de fumée et laissez 5 min pour le capot pour évacuer les gaz corrosifs avant d'échantillonner la culture de photobioréacteur.
  9. Échantillonnez dans le capot de fumée soit en ouvrant un port de plaque d'entrée et en utilisant un tuyau sérologique stérile ou en dessinant la culture dans une seringue par le port d'inoculation/échantillonnage. Sécurisez les ports photobioréacteurs avant d'ouvrir les bouteilles de gaz et de reprendre l'expérience.

5. Mesurer la productivité de la biomasse microalgale

  1. Utilisez une courbe d'étalonnage pour relier les mesures de la culture microalgale OD750 aux concentrations de biomasse microalgale séchée.
    1. Préparer plusieurs flacons (minimum : 4, volume de travail minimum : 500 ml) avec milieu microalgal stérile et inoculer avec les espèces d'intérêt (p. ex. S. obliquus dans cette étude).
    2. Mesurer la culture OD750 jusqu'à ce que la croissance soit exponentielle, et rapidement sacrifier l'échantillon des flacons en filtrant les volumes connus (minimum de 100 ml) du contenu avec une membrane de filtre de 0,45 m de masse connue. Utilisez des bateaux à pesée en aluminium couvert ou des récipients en verre pour soutenir la biomasse et les filtres pendant qu'ils sont séchés.
    3. Masser la biomasse et les filtres après le séchage pendant environ 18 à 24 h dans un four entre 80 et 100 oC. Pour vérifier le séchage complet, mesurez à nouveau après un supplément de 2 à 3 h pour déterminer si la masse s'est stabilisée.
    4. Soustrayez la masse du filtre de la biomasse combinée et la masse de filtre pour calculer la masse de biomasse.
    5. Tracer la courbe d'étalonnage en mesure de la concentration de biomasse (masse de biomasse divisée par le volume de la culture filtrée) et adapter les données à une régression linéaire.

6. Modélisation de la productivité de la biomasse et calculs de taux

  1. Calculer les concentrations expérimentales de biomasse à partir des mesures OD750 à l'aide de la régression linéaire de la courbe d'étalonnage (déterminée à la section 5).
  2. Ajuster les données de croissance microalgale par lots, du décalage à la phase exponentielle à la phase stationnaire avec une régression logistique (équation 2) dans le logiciel de graphique et de statistiques (Tableau des matériaux):
    Equation 2(2)
    où L est la valeur maximale de concentration de biomasse de la courbe, k est la pente relative de la phase exponentielle (temps-1), xo est le temps du point médian de la courbe sigmoïdale, et x est le temps.
    1. Entrez manuellement l'équation logistique ci-dessus. Sélectionnez Ajuster une courbe avec régression non linéaire sur l'onglet Analyse dans le logiciel. À gauche de la boîte Degression non linéaire, choisissez Créer une nouvelle équation sous la nouvelle case de déclassement. Utilisez l'équation explicite par défaut comme type d'équation, nommez la nouvelle fonction et définissez la nouvelle fonction comme Y 'L/(1 'exp(-k'(x-b)),où b représente xo.
  3. Calculer la productivité globale de la biomasse du lot microalgue en divisant la différence entre les concentrations finales et initiales de biomasse par la différence entre les heures finales et initiales.
  4. Calculer la productivité maximale de la biomasse du lot microalgue à partir du dérivé de l'équation 2 (équation 3) au point médian sigmoïde, lorsque x xo.
    Equation 3(3)

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Representative Results

Une courbe d'étalonnage des microalgues vertes, S. obliquus, récoltée dans la phase exponentielle, a été établie avec des concentrations d'OD750 et de biomasse séchée(figure 2). La régression linéaire avait une valeur R2 de 0,9996.

Une culture S. obliquus a été lancée dans un flacon Erlenmeyer de 250 ml provenant d'une culture stockée dans une assiette d'agar réfrigérée. Le microalga a été inoculé en 3N-BBM avec 10 mM de tampon HEPES et sparged avec 2,2% CO2 dans un photobioréacteur de 2 L avec 1,5 L volume de travail (0,07 vvm) (Figure 1). Le lot a été suivi via OD750; les concentrations de biomasse ont été calculées à partir de la courbe d'étalonnage, puis modélisées avec une courbe logistique (figure 3). Le photobioréacteur a maintenu la culture à pH 6,8, 100 cm3 min-1 débit total de gaz, continu 280 m-2 s-1 illumination, et 27 oC. La courbe logistique correspond aux données de concentration de biomasse allant du décalage à la phase exponentielle à la phase stationnaire. D'après le modèle logistique, la concentration maximale de biomasse pendant le lot était de 2070 à 20 mg L-1,la productivité maximale de la biomasse s'est produite à 4,6 jours, et le taux de productivité spécifique de la biomasse était de 1,0 d-1. La productivité maximale de la biomasse, calculée à partir du dérivé de la courbe logistique au moment de la croissance maximale, était de 532 à 60 mg L-1 d-1.

Le modèle de pièce bien mélangé a été employé pour calculer la concentration accumulée de NO2,SO2, et CO dans le cas de la défaillance de capot de fumée pendant 24 h. Ces valeurs ont été comparées aux limites d'exposition(tableau 2). Par exemple, dans le scénario où 0,05 L min-1 de 400 ppm NO2 est libéré pendant une période de défaillance du capot de fumée de 24 h, le modèle de pièce bien mélangé avec des entrées de G calculés 0,0377 mg min-1, Q - 0,0001 m3 min-1, V - 100 m3, et le temps maximum pour la simulation - 1440 min prédit L'accumulation NO2 à 0,54 mg-3 (0,29 ppm), ce qui est au-dessus de la limite d'exposition chronique acceptable (Conférence américaine des hygiénistes industriels gouvernementaux limite seuil [ ACGIH TLV]) et en dessous de la limite d'exposition à court terme (STEL).

Un essai préliminaire prometteur avec du gaz de combustion simulé a permis d'obtenir un taux de productivité microalgal de biomasse microalgal plus élevé (690 à 70 mg L-1 d-1) que celui de 12 % de CO2 et d'air ultra-zéro (510 à 40 mg L-1 d-1) (Figure 4). Avant l'expérience, un moniteur de gaz a été calibré avec CO, NO2, et SO2. L'expérience de gaz de combustion simulée a été réalisée sans aucun risque pour le personnel ou des dommages à l'équipement causés par les gaz corrosifs.

Figure 1
Figure 1 : Photobioréacteur de banc-dessus illuminé par les lumières rouges et bleues de LED. Le photobioréacteur fonctionne comme un réacteur à lots de 2 L avec un volume de travail de 1,5 L. Le photobioréacteur est continuellement alimenté avec des gaz à travers l'anneau d'épargtage et les évents de gaz excédentaires à travers les ports de la plaque d'ahead. Adapté avec la permission de Molitor et coll.5. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Courbe de calibration reliant oD750 au poids sec des cellules S. obliquus. L'absorption de lumière de la culture cellulaire de S. obliquus a été mesurée à 750 nm, puis les cellules ont été filtrées et séchées pour obtenir des mesures de poids sec de cellules. Réimprimé avec la permission de Molitor et coll.5. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Données de croissance de S. obliquus à 2,2 % d'entrée CO2 modélisée avec une régression logistique. Les points de données représentent les valeurs de biomasse calculées à partir de mesures de densité optique. Les données ont été modélisées avec une régression logistique à travers un ajustement au moins carrés; Equation 4 où L - 1955 mg L-1, k - 1,154 d-1, et x0 - 3,317 d. R2 - 0,995. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Croissance modélisée de S. obliquus à 12 % CO2, avec et sans composants de gaz de cheminée simulés supplémentaires. Les mesures de biomasse de chaque lot de microalgues ont été modélisées avec des régressions logistiques. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Composant Pourcentage
H2O 12.6%
CO2 (EN) 11.6%
O2 5.8%
CO (en) 0.048%
DONC2 0.045%
NON2 0.022%
N2 69.9%

Tableau 1 : Composition des émissions des centrales au charbon. Ces quantités ont été moyennes à partir des données sur les émissions des centrales électriques de l'Université de l'Iowa recueillies à intervalles infimes sur une période de 10 h.

Gaz toxique Twa Plafond Stel NIOSH IDLH NIOSH REL ACGIH TLV CDC Description
CO (en) 35 ppm 200 ppm - 1 200 ppm 35 ppm 25 ppm Incolore, inodore
DONC2 2 ppm 100 ppm 17 h 100 ppm 2 ppm 2 ppm Gaz incolore avec une odeur caractéristique, irritante et piquante
NON2 13 h 17 h 1 ppm 13 ppm 1 ppm 0,2 ppm Liquide brun jaunâtre ou gaz brun-rougeâtre (au-dessus de 70 oF) avec une odeur âcre et âcre

Tableau 2 : Limites d'exposition et descriptions des gaz toxiques (CO, SO2, NO2) dans les gaz de combustion. OSHA TWA: moyenne pondérée en fonction du temps (généralement 8 h période), CEILING: valeur jamais atteinte, STEL: limite d'exposition à court terme (TWA de plus de 15 min), NIOSH IDLH: danger pour la vie et la santé, NIOSH REL: limite d'exposition de 15 min, ACGIH TLV: limite d'exposition chronique acceptable, pas d'effets néfastes.

Composé Mm
NaNO3 Annonces 8,82 x 100
MgSO47H2O 3,04 x 10-1
Nacl 4,28 x 10-1
K2HPO4 4,31 x 10-1
KH2PO4 1,29 x 100
CaCl2h2H 2O 1,70 x 10-1
ZnSO47H2O 3,07 x 10-2
MnCl24H2O 7,28 x 10-3
MoO3 4,93 x 10-3
CuSO45H2O 6,29 x 10-3
Co(NO3)2'6H2O 1,68 x 10-3
H3BO3 1,85 x 10-1
Edta 1,71 x 10-1
Koh 5,52 x 10-1
FeSO47H2O 1,79 x 10-2
H2SO4 (concentré) 1 x 10-3 l

Tableau 3 : Composition du milieu basal triple azote de Bold (3N-BBM). La quantité d'azote a été triplée par le milieu basal11de l'original Bold.

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Discussion

Les expériences de photobioréacteur par lots et axeniques avec le pH réglementé, la température, le débit de gaz et la concentration de gaz favorisent des résultats significatifs en éliminant la contamination par les souches d'algues non ciblées et la variabilité des conditions de culture. La cinétique de croissance pure précise de culture peut être obtenue même en présence des gaz corrosifs (CO2, SO2, NO2), qui servent de nutriments, transformant les gaz résiduaires en un produit précieux tel que l'alimentation animale.

Avant de commencer toute expérience microalgale, la culture de microalgue choisie doit être prise du stockage et réadaptée à la culture liquide. La croissance des microalgues en phase exponentielle améliore la probabilité que les expériences aient des conditions initiales équivalentes et que les microalgues ne stagnent pas en phase de décalage après l'inoculation.

Les courbes de calibration relatives à la densité optique et aux concentrations de biomasse sont particulièrement importantes lors des études sur la productivité de la biomasse. Une productivité élevée de la biomasse microalgale est l'un des principaux objectifs de l'industrie des microalgues et, à ce titre, est souvent un indicateur du succès de la recherche12. Par conséquent, des calculs précis des concentrations de biomasse à partir de mesures de densité optique doivent provenir de données sur les courbes d'étalonnage spécifiques, précises et précises. Pour éviter les interférences optiques potentielles, il est important que les mesures de la courbe d'étalonnage et pendant l'expérience soient effectuées dans des solutions de fond équivalentes. En outre, la courbe d'étalonnage doit être faite avec des mesures prises à partir de microalgues dans la phase de croissance (s) le plus représentatif de ceux dans les expériences. Certaines espèces de microalgues peuvent avoir des différences dramatiques dans la taille des cellules au cours de différentes phases de croissance qui peuvent modifier la densité optique et les concentrations de biomasse perçues. Il convient de noter que la productivité de la biomasse est liée, mais non équivalente, au taux de croissance. Le taux de croissance spécifique dépend du nombre de cellules (changement de densité cellulaire au fil du temps/densité cellulaire) présent, et la productivité spécifique de la biomasse dépend de la masse massive des cellules (changement de biomasse mg/L au fil du temps par mg/L de biomasse)13 présent.

Lorsque les concentrations de biomasse microalgale sont modélisées avec une courbe logistique, les résultats expérimentaux peuvent être comparés de manière significative en interpolant les concentrations de biomasse et en calculant avec précision les productivités de biomasse. Cependant, il faut faire attention à l'interprétation de ces résultats expérimentaux; il est inapproprié de comparer la productivité globale et maximale de la biomasse par lots. Bien que les valeurs maximales de productivité de la biomasse soient utiles pour comparer les résultats des lots, la productivité globale de la biomasse est trompeuse sans plus d'informations sur la durée de l'expérience et les phases de croissance microalgal. Ces taux changent continuellement pendant le décalage, la croissance des billes et les phases stationnaires.

Lors d'expériences avec des gaz corrosifs caractéristiques des émissions des centrales électriques ou de la combustion industrielle, il faut faire preuve de prudence en ce qui concerne la santé humaine et la longévité de l'équipement. Les pièces standard doivent être remplacées par des matériaux plus robustes, et les consommables tels que les tubes doivent être inspectés et remplacés plus fréquemment pour résister à la corrosion, prévenir les fuites et éviter l'exposition humaine. Des mesures de sécurité supplémentaires et une sensibilisation aux risques sont essentielles à un fonctionnement et à un échantillonnage sûrs et efficaces. La méthode n'est pas appropriée pour les gaz inflammables parce qu'il y a un potentiel d'accumulation de gaz dans l'espace de tête et que l'équipement n'est ni conçu pour de tels risques ni adapté à une adaptation sûre à de telles conditions.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Ce matériel est basé sur des travaux soutenus par la National Science Foundation Graduate Research Fellowship dans le cadre de la subvention no 1546595. Toute opinion, constatation, conclusions ou recommandations exprimées dans ce document sont celles des auteurs et ne reflètent pas nécessairement celles de la National Science Foundation. Le travail a également été soutenu par une subvention de recherche de l'Université de l'Iowa Graduate and Professional Student Government, et la Fondation de l'Université de l'Iowa, Allen S. Henry dotation. Des recherches ont été menées au Laboratoire de phytotechnologies W. M. Keck. Les auteurs tient à remercier le personnel de la centrale électrique de l'Université de l'Iowa, en particulier Mark Maxwell, pour son expertise et son soutien financier pour les gaz de combustion simulés. Les auteurs aimeraient également remercier Emily Moore pour son aide à l'échantillonnage et à l'analyse et Emily Greene pour son aide et sa participation à la vidéo du protocole.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biostat A bioreactor Sartorius Stedim 2-liter bioreactor for microbial fermentation; designed to be autoclaved; pH, temperature, gas flow rate control
Bump test NO2 gas Grainger GAS34L-112-5 Calibration gas for MultiRAE gas detector
Bump test O2, CO, LEL gas Grainger GAS44ES-301A Calibration gas for MultiRAE gas detector
Bump test SO2 gas Grainger GAS34L-175-5 Calibration gas for MultiRAE gas detector
Corrosion resistant tubing for NO2 gas Swagelok SS-XT4TA4TA4-6 PTFE Core Hose Smooth Bore X Series—Fiber Braid and 304 SS Braid Reinforcement
Corrosion resistant tubing for SO2 gas QC Supply 120325 Reinforced Braided Natural EVA Tubing - 1/4" ID
cozIR 100% CO2 meter Gas Sensing Solutions Ltd. CM-0121 at CO2meter.com CO2 meter for concentrations up to 100%
cozIR 20% CO2 meter Gas Sensing Solutions Ltd. CM-0123 at CO2meter.com CO2 meter for concentrations up to 20%
Durapore Membrane Filter, 0.45 μm Millipore Sigma HVLP04700 Hydrophilic, plain white, 47 mm diameter, 0.45 μm pore size, PVFD membrane filters
Gas cylinder regulators Praxair PRS 40221331-660 Single-stage stainless steel regulator configured for 0-15 psi outlet assembly diaphragm valve with 1/4" MNPT threads, Stainless steel to resist corrosion from NOx and SOx
Gas cylinders Praxair Ulta-zero air, high purity CO2, or custom gas composition Dependent on study objectives
Gas monitoring and leak detection system RAE Systems by Honeywell MAB3000235E020 Pumped model that detects O2, SO2, NO2, CO, and LEL
GasLab software GasLab v2.0.8.14 Software for CO2 meter measurements and data logging
Hose barb Grainger Item # 3DTN3 Used to adapt regulators to tubing, Stainless steel to resist corrosion from NOx and SOx
K30 1% CO2 meter Senseair CM-0024 at CO2meter.com CO2 meter for concentrations less than 1%
LED grow panels Roleadro HY-MD-D169-S Red & blue LED light panels
Memosens dissolved oxygen probe Endress+ Hauser COS22D-19M6/0 Autoclavable (with precautions) dissolved oxygen probe for bioreactor
Memosens pH probe Endress+ Hauser CPS71D-7TB41 Autoclavable (with precautions) pH probe for bioreactor
Oven, Isotemp 500 Series Fisher Scientific 13246516GAQ Small oven for drying
Prism GraphPad software GraphPad Software Version 7.03 or 8.0.1 Graphing software for data organization, data analysis, and publication-quality graphs
Stem to hose barb fitting Swagelok SS-4-HC-A-6MTA Stainless Steel Hose Connector, 6 mm Tube Adapter, 1/4 in. Hose ID
Tubing, dilute acid/base transfer Allied Electronics and Automation 6678441 Silicone TP Process Tubing; 1.6mm Bore Size; 3000mm Long; Food Grade
Tubing, gas transfer Allied Electronics and Automation 6678444 Silicone TP Process Tubing; 3.2mm Bore Size; 3000mm Long; Food Grade

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References

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Sciences de l'environnement Numéro 154 culture des microalgues photobioréacteur cultures hacheniques contrôle expérimental productivité de la biomasse adaptation pour l'utilisation du gaz corrosif
Culture de microalgues et quantification de la biomasse dans un photobioréacteur à l'échelle du banc avec des gaz de flue corrosif
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Molitor, H. R., Williard, D. E.,… More

Molitor, H. R., Williard, D. E., Schnoor, J. L. Microalgae Cultivation and Biomass Quantification in a Bench-Scale Photobioreactor with Corrosive Flue Gases. J. Vis. Exp. (154), e60566, doi:10.3791/60566 (2019).

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