Summary
El cultivo axiónico a escala de banco facilita la caracterización microalgal y la optimización de la productividad antes del posterior escalado del proceso. Los fotobiorreactores proporcionan el control necesario para experimentos microalgas fiables y reproducibles y se pueden adaptar para cultivar de forma segura microalgas con los gases corrosivos (CO2, SO2,NO2) de las emisiones de combustión municipal o industrial.
Abstract
Los fotobiorreactores son sistemas de cultivo iluminados para experimentos con microorganismos fototróficos. Estos sistemas proporcionan un entorno estéril para el cultivo de microalgas con la composición de la temperatura, el pH y el gas y el control del caudal. A escala de banco, los fotobiorreactores son ventajosos para los investigadores que estudian las propiedades microalgas, la productividad y la optimización del crecimiento. A escala industrial, los fotobiorreactores pueden mantener la pureza del producto y mejorar la eficiencia de la producción. El video describe la preparación y el uso de un fotobiorreactor a escala de banco para el cultivo de microalgas, incluido el uso seguro de insumos de gas corrosivo, y detalla las mediciones de biomasa relevantes y los cálculos de productividad de biomasa. Específicamente, el video ilustra el almacenamiento de cultivo microalgal y la preparación para la inoculación, el montaje y esterilización del fotobiorreactor, las mediciones de concentración de biomasa y un modelo logístico para la productividad de la biomasa microalgal con tasa cálculos que incluyen productos máximos y globales de biomasa. Además, dado que hay un creciente interés en los experimentos para cultivar microalgas utilizando emisiones de gases de desecho simuladas o reales, el video cubrirá las adaptaciones de equipos fotobiorreactores necesarias para trabajar con gases corrosivos y discutir el muestreo seguro en tales escenarios.
Introduction
Los fotobiorreactores son útiles para experimentos controlados y el cultivo de productos microalgas más puros de lo que se puede lograr mediante estanques abiertos. El cultivo de microalgas en fotobiorreactores a escala de banco apoya el desarrollo de conocimientos fundamentales que pueden utilizarse para el escalado de procesos. Ligeros cambios en las condiciones ambientales pueden alterar significativamente los experimentos microbiológicos y confundir los resultados1. Un proceso estéril con control de sparging de temperatura, pH y gas es ventajoso para estudiar las propiedades y el rendimiento de los microalgas en condiciones variadas. Además, el control sobre las concentraciones de gas de entrada, la temperatura, la fuerza de cizallamiento de la mezcla y el pH medio pueden apoyar diversas especies que de otro modo son difíciles de cultivar. Los fotobiorreactores se pueden ejecutar como un proceso por lotes con alimentación y sparging continuos de gas, o como un sistema de flujo a través de chemostat con alimentación y sparging continuos de gas, además de insumos de nutrientes de aguas residuales de fluidez y efluentes. Aquí, demostramos el proceso por lotes con alimentación continua de gas y sparging.
El uso de fotobiorreactores aborda varios desafíos de cultivo y producción de microalgas. El campo generalmente lucha con las preocupaciones de contaminación por otros microorganismos, la utilización eficiente del sustrato (que es especialmente importante en el caso de la mitigación delCO2 o el tratamiento de aguas residuales)2, control de pH, variabilidad de iluminación y productividad de biomasa3. Los fotobiorreactores permiten a los investigadores estudiar una amplia gama de fototróteles en sistemas de lotes estrechamente controlados, donde incluso las especies de crecimiento lento están protegidas de depredadores o microorganismos competidores4. Estos sistemas de lotes también son mejores para facilitar mayores tasas de utilización de CO2 y productividad de biomasa porque son sistemas cerrados que son más propensos a estar en equilibrio con los gases suministrados. La tecnología fotobiorreactor también ofrece control de pH, la falta de la cual ha obstaculizado la alta productividad de la biomasa en estudios anteriores5. A escala de banco, el nivel de control ofrecido por los fotobiorreactores es ventajoso para los investigadores. A escalas industriales más grandes, los fotobiorreactores se pueden utilizar para mantener la pureza comercial de los bioproductos y mejorar la eficiencia de la producción para aplicaciones nutracéuticas, cosméticas, alimentarias o de piensos6.
Las microalgas son de gran interés para la biosecuestro de CO2 porque pueden fijar rápidamente elCO2 como carbono de biomasa. Sin embargo, la mayoría de las fuentes antropogénicas de CO2 están contaminadas con otros gases o contaminantes corrosivos y tóxicos (NOx, SOx, CO, Hg), dependiendo de la fuente de combustible del proceso de combustión. El creciente interés por el secuestro sostenible de CO2 ha impulsado el desarrollo de tecnologías fotobiorreactoras para tratar las emisiones ricas enCO2,como las de las centrales eléctricas de carbón(cuadro 1). Desafortunadamente, existe un riesgo inherente de exposición humana y ambiental a los contaminantes corrosivos y tóxicos durante los procesos de investigación y ampliación. Como tal, describir el montaje y funcionamiento seguro de los biorreactores utilizando gases corrosivos es necesario e instructivo.
Este método es para el uso de un fotobiorreactor a escala de banco de 2 L para el crecimiento de microalgas en condiciones experimentales cuidadosamente controladas. El protocolo describe el almacenamiento de microalgas, la preparación del inóculo y la configuración y esterilización del fotobiorreactor. Más allá de la operación básica, este trabajo describe las mediciones de biomasa microalgal y los cálculos de productividad de la biomasa, y la adaptación del equipo para el cultivo de microalgas con gases corrosivos. El protocolo descrito a continuación es adecuado para los investigadores que buscan ejercer un mayor control experimental, optimizar las condiciones de crecimiento microalgas o cultivar axenéticamente una gama de microbios fototróficos. Este método no describe los materiales adecuados para el cultivo de microbios que producen o consumen gases inflamables (por ejemplo, CH4, H2,etc.) 7.
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Protocol
1. Uso seguro y muestreo de un fotobiorreactor sparged con gases corrosivos
NOTA: Este método no describe los procedimientos adecuados para el muestreo seguro de cultivos microalgas que producen o consumen gases altamente inflamables.
- Gestionar el gas tóxico como un riesgo para la salud humana.
NOTA: De la Universidad de Iowa, el Plan de Higiene Química, los autores trabajaron con el Coordinador de Seguridad contra Incendios de la Universidad y el Oficial de Higiene Industrial de Salud y Seguridad Ambiental de la Universidad para desarrollar un protocolo de seguridad para trabajar con los gases tóxicos. - Configure un sistema de monitoreo de gases tóxicos con sensores para cada uno de los gases tóxicos en uso. Calibre los sensores de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Prueba de golpe (comprobar la funcionalidad del sensor y la alarma con gases de calibración) con frecuencia, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Localice el monitor de gas justo fuera de la campana de humos.
- Antes de comenzar cualquier experimento de gas corrosivo, notifique al personal cercano del sistema de riesgo y alarma. Además, notifique a los socorristas locales correspondientes. Señales de poste en las entradas de laboratorio especificando qué gases peligrosos están en uso.
- Indique a todo el personal cercano que evacúe si se detecta gas tóxico. Notificar a los supervisores de laboratorio y al personal de respuesta de emergencia.
NOTA: En un corte de energía, la torre reguladora de gas detendrá el flujo de gas cuando pierda energía. Sin embargo, si el sistema de calefacción, ventilación y aire acondicionado (HVAC) de la habitación o la campana de humos se caen sin un corte de energía, esto resultará en fugas de gas tóxico.
- Indique a todo el personal cercano que evacúe si se detecta gas tóxico. Notificar a los supervisores de laboratorio y al personal de respuesta de emergencia.
- Modelar la posible concentración acumulada de gases tóxicos en la habitación si la campana de humos fallara utilizando la hoja de cálculo de modelado matemático IH MOD8 de la Asociación Americana de Higiene Industrial (AIHA) para cada gas.
- Obtenga la tarifa de aire de suministro/escape de la habitación, Q, en m3 min-1 del personal de mantenimiento de HVAC del edificio o del técnico de HVAC. Calcular el volumen, V, del laboratorio (L x An x H) en m3. Calcular la tasa de emisión de contaminantes, G, de cada tipo de gas tóxico en mg min-1, utilizando la Ecuación 1 adaptada de la ley de gas ideal:
(1)
donde P es la fracción de presión ejercida por el gas tóxico a 1 atm (ppm gas/106 ppm), el gas Q es el caudal del gas en L min-1, R es la constante de gas universal (0.082057 L-atm-mol-1? K-1), T es la temperatura en K, y MW es el peso molecular del gas en g mol-1. - Utilice los valores para V, Qy G para cada gas (calculado en el paso 1.4.1) en el algoritmo "Modelo de habitación bien mezclado con opción para cesar la generación y la purga de la sala de modelos" en la hoja de cálculo Mod iH para calcular las concentraciones de gas de habitación acumuladas para cada gas durante un período de simulación de 1440 minutos (24 h). Compare estos valores con los límites de exposición (Tabla 2)9.
- Obtenga la tarifa de aire de suministro/escape de la habitación, Q, en m3 min-1 del personal de mantenimiento de HVAC del edificio o del técnico de HVAC. Calcular el volumen, V, del laboratorio (L x An x H) en m3. Calcular la tasa de emisión de contaminantes, G, de cada tipo de gas tóxico en mg min-1, utilizando la Ecuación 1 adaptada de la ley de gas ideal:
(1)2. Preparación del inóculo microalgal
- Preparar el Scenedesmus obliquus inoculum, u otras especies de microalgas seleccionadas para el fotobiorreactor, antes del inicio del experimento transfiriéndolo desde el almacenamiento, ya sea crioconservado o cultivado en medios de agar.
- Añadir 30 x 50 ml de medio de crecimiento microalgal estéril (medio basal de triple nitrógeno Bold [3N-BBM], Tabla 3) a un matraz de agitación estéril (150-250 ml) tapado con un tapón de espuma.
NOTA: A menos que el matraz esté sparged, sólo una quinta parte del volumen del matraz de agitación debe estar ocupado por medios líquidos. - Utilice un gabinete de bioseguridad para mantener la esterilidad al transferir células a un matraz inclinado o agitar. Para cultivos en agar, utilice un lazo estéril para transferir microalgas de su placa de agar o inclinación al matraz de agitación. Para cultivos crioconservados, descongelar gradualmente la muestra crioconservada y enjuagar el crioprotector de acuerdo con el protocolo elegido10,luego agregue las células al matraz de agitación.
- Células de cultivo en 3N-BBM a 20-25 oC bajo 16 h:8 h de luz: oscuras y temblores a 115-130 rpm.
- Realice un seguimiento del crecimiento de los microalgas a lo largo del tiempo mediante mediciones de densidad óptica (OD) (como en las secciones 5 y 6). Permita que las microalgas alcancen su fase de crecimiento exponencial (2-4 días) antes de transferir las células al fotobiorreactor.
NOTA: Dependiendo del objetivo del experimento, las células pueden enjuagarse de medio de cultivo (este estudio) y/o concentrarse con múltiples pasos de centrifugación antes de la inoculación del biorreactor.
- Añadir 30 x 50 ml de medio de crecimiento microalgal estéril (medio basal de triple nitrógeno Bold [3N-BBM], Tabla 3) a un matraz de agitación estéril (150-250 ml) tapado con un tapón de espuma.
3. Configuración y funcionamiento del fotobiorreactor
- Utilice el fotobiorreactor(Figura 1)para controlar la temperatura, el pH, la velocidad de agitación, los caudales de gas y los caudales de la solución de entrada.
NOTA: El fotobiorreactor se puede utilizar para controlar el flujo de hasta cuatro soluciones de entrada diferentes, comúnmente ácido, base, antiespuma y sustrato.- Prepare 100 ml cada uno de 1 NaOH y 1 N HCl y añada cada uno a una botella de solución de entrada de 250 ml. Utilice la contención secundaria para estas soluciones.
- Almacene las soluciones de entrada medida en botellas tapadas autoclavables equipadas con tubos de inmersión y un tubo de ventilación con un filtro de aire en línea estéril. Conecte los tubos de inmersión a los cuatro puertos de entrada del fotobiorreactor utilizando tubos autoclavables y, durante el funcionamiento del fotobiorreactor, sumerja los tubos de inmersión en las soluciones de entrada. Pasar el tubo autoclavable del dimetro interior (ID) de 1,6 mm entre las soluciones de entrada y sus puertos a través de bombas peristálticas separadas que pueden ser controladas ya sea por caudales seleccionados manualmente o por la retroalimentación de sondas de pH y espuma (en el caso de ácido, base y antiespuma).
- Calibre el medidor de pH del fotobiorreactor antes de la autoclave.
- Conecte la sonda de pH a la torre de control del fotobiorreactor ajustando la sonda a la línea de conexión y girando para bloquearla. Utilice los tampones pH 4 y pH 7 para calibrar el medidor de pH. Espere hasta que los valores se hayan estabilizado antes de aceptar el valor del medidor de pH.
- Desconecte la sonda de pH del cable del medidor de pH que conecta la sonda a la torre de control.
- La superficie esteriliza con 70% de etanol o autoclave la sonda con el reactor. Para autoclave, tapa rinde la sonda de pH firmemente con papel de aluminio.
NOTA: Si la sonda está autoclaveda, existe el riesgo de corrosión del interior de la sonda por daños en el vapor. Este método de limitación no garantiza completamente la prevención de daños. - Añadir 10 mM 4-(2-hidroxietilo)piperazina-1-ácido etanosulfónico (HEPES) tampón al medio de cultivo para un mejor control del pH.
- Inserte y atornille el dedo frío y el condensador de escape en la placa del fotobiorreactor.
- Inserte el puerto de inoculación y atornille firmemente en su lugar. Agregue una longitud de tubo autoclavable a la sección del puerto de inoculación por encima de la placa frontal del fotobiorreactor. Antes de autoclave del biorreactor, sujeta el tubo cerrado con una abrazadera de manguera autoclavable.
- Conecte tubos tapados con filtros estériles a cualquier puerto fotobiorreactor no utilizado.
- Conecte soluciones de entrada de ácido y base a los puertos de entrada del fotobiorreactor a través de tubos autoclavables. Añadir 1,5 L de medio de cultivo.
- Autoclave del reactor y soluciones de entrada asociadas para 30 x 45 min a 121 oC según el volumen de trabajo.
NOTA: Si el medio de cultivo se ve afectado negativamente por el autoclave, agregue el medio después de autoclave en condiciones estériles en una campana de flujo laminar. El protocolo se puede pausar aquí.
ADVERTENCIA: El reactor estará caliente después de retirarse del autoclave. - Fije el motor del impulsor al eje del impulsor y apriete el accesorio.
- Organice los paneles de luz LED simétricamente fuera del biorreactor de acuerdo con los requisitos de iluminación.
- Antes de autoclave, mida y registre la intensidad de la luz con un fotómetro. Coloque el sensor de iluminación dentro del recipiente fotobiorreactor y dirija el sensor hacia la fuente de luz.
- Conecte hasta dos cilindros de gas para suministrar las emisiones simuladas de la central eléctrica de carbón(Tabla 1)a las microalgas del fotobiorreactor.
NOTA: Las concentraciones de gas utilizadas en este estudio se aproximaron a las de la central eléctrica de la Universidad de Iowa.- Montar las conexiones entre el cilindro de gas, la torre reguladora de gas y el anillo de sparging del fotobiorreactor. Conecte los reguladores apropiados capaces de presión de salida de 20 psi a los cilindros de gas. Fije el tubo resistente a la presión ID de 6 mm a la barba de la manguera de salida del regulador y fíjelo con una abrazadera de manguera. Fije el otro extremo del tubo resistente a la presión a la entrada de gas de la torre reguladora de gas utilizando una barba de manguera a un accesorio de conexión rápida del vástago de 6 mm asegurado con una abrazadera de manguera. Conecte el tubo ID de 3,2 mm a la salida de gas de la torre reguladora de gas utilizando otro accesorio de conexión rápida de 6 mm y conecte el otro extremo del tubo de salida al puerto del anillo de sparging en la placa principal del fotobiorreactor.
NOTA: Para un segundo gas de entrada, repita el paso 3.9.1, pero utilice una barba de manguera en forma de T para consolidar las dos líneas de gas de entrada en una sola sección del tubo conectado al puerto del anillo de sparging. - Ajuste la presión de salida a 20 psi en cada regulador de gas y utilice la interfaz del biorreactor para establecer los caudales de gas experimentales.
NOTA: Calcular e informar del volumen de aire en condiciones estándar por volumen de líquido por minuto (vvm); dividir el caudal volumétrico del gas por el volumen de cultivo. Informe en unidades de por miniute.
- Montar las conexiones entre el cilindro de gas, la torre reguladora de gas y el anillo de sparging del fotobiorreactor. Conecte los reguladores apropiados capaces de presión de salida de 20 psi a los cilindros de gas. Fije el tubo resistente a la presión ID de 6 mm a la barba de la manguera de salida del regulador y fíjelo con una abrazadera de manguera. Fije el otro extremo del tubo resistente a la presión a la entrada de gas de la torre reguladora de gas utilizando una barba de manguera a un accesorio de conexión rápida del vástago de 6 mm asegurado con una abrazadera de manguera. Conecte el tubo ID de 3,2 mm a la salida de gas de la torre reguladora de gas utilizando otro accesorio de conexión rápida de 6 mm y conecte el otro extremo del tubo de salida al puerto del anillo de sparging en la placa principal del fotobiorreactor.
- Cuando se spargen con más de un cilindro de gas, confirme la concentración de CO2 suministrada al fotobiorreactor con un sensor deCO2.
- Conecte un sensor CO2 compatible con software (por ejemplo, GasLab) al puerto USB de un ordenador. Descargue el software más reciente que corresponde al modelo de sensor CO2. Abra el software e introduzca el modelo del sensor, el intervalo de tiempo de medición y la duración del registro de datos de medición.
- Coloque el sensor CO2 y el tubo de flujo de gas combinado (antes de conectar el tubo con el biorreactor) en un recipiente ventilado de 100 a 250 ml, tapado (externo al biorreactor).
NOTA: Durante el experimento, las concentraciones de CO2 del espacio de cabeza se pueden medir a partir de uno de los tubos de ventilación de la placa frontal del fotobiorreactor. - Inicie las mediciones de concentración de CO2 en la interfaz de usuario y espere a que las mediciones se equilibren.
- Utilice la interfaz de usuario del fotobiorreactor para ajustar los caudales de gas de cada tanque hasta el caudal total deseado (0,1 L min-1) y la concentración deCO2 (12%) se logra.
- En la interfaz de usuario del fotobiorreactor, utilice la función STIRR para establecer la velocidad de rotación del impulsor. Asegúrese de que la velocidad de mezcla sea lo suficientemente rápida como para que el medio de cultivo asimile las burbujas de gas esparticadas.
NOTA: Ciertas especies de microalgas tienen estructuras celulares débiles y serán dañadas o rotas por una alta fuerza de cizallamiento.
4. Adaptación del fotobiorreactor y la configuración experimental para el uso de gases tóxicos
ADVERTENCIA: Los gases corrosivos en gases de combustión reales o simulados son corrosivos y tóxicos. Estos gases representan un riesgo grave si se inhalan.
NOTA: Este método no describe los materiales adecuados para el cultivo seguro de microbios que producen o consumen gases altamente inflamables (es decir, metano, hidrógeno, etc.).
- Sustituya los componentes de latón, plástico y tubos estándar por materiales resistentes a la corrosión.
- Utilice acero inoxidable para resistir de forma fiable la corrosión de los ácidos fuertes formados por la reacción entre NOx o SOx y el agua. Sustituya los accesorios de conexión rápida de plástico en las entradas y salidas de gas de la torre reguladora de gas por accesorios de conexión rápida de acero inoxidable. Utilice reguladores de acero inoxidable para cilindros de gas, incluida la barra de manguera de salida en lugar de latón.
- Utilice tubos de politetrafluoroetileno (PTFE) o acetato de vinilo etílico natural (EVA) para resistir la corrosión de gases NOx y SOx (respectivamente) en las conexiones entre el cilindro de gas a la torre reguladora de gas y la torre reguladora de gas al fotobiorreactor.
- Después del autoclave, ensamble el fotobiorreactor y los cilindros de gas dentro de una campana de humo. Coloque el fotobiorreactor en una mesa dentro de la contención secundaria y coloque los cilindros de gas en los cilindros de pie o en un estante para cilindros.
- Después de iniciar el flujo de gas, utilice un detector de fugas de líquido de tipo burbuja para comprobar si hay fugas de gas en todas las conexiones entre los cilindros de gas y el biorreactor. Utilice un frasco de lavado lleno con una dilución 1:100 (v:v) de jabón para platos: agua para cubrir la conexión con una pequeña corriente de solución de jabón.
NOTA: Las fugas se indicarán burbujeando en las conexiones. - Al iniciar los experimentos de microalgas, comience a sparging y luego ajuste el pH antes de la inoculación (como en los experimentos fotobiorreactores estándar).
NOTA: Es muy recomendable amortiguar el medio de cultivo durante los experimentos con gases corrosivos, ya que los gases de entrada son muy ácidos. - Inocular el fotobiorreactor aspirando el inóculo microalgal preparado en una jeringa estéril, colocando la jeringa en el tubo unido al puerto de inoculación, abriendo la abrazadera de tubo de inoculación y deprimiendo la jeringa.
- Compruebe el monitor de gas, las presiones de los cilindros de gas y el fotobiorreactor dos veces al día (y antes del muestreo) en busca de niveles elevados de gas tóxico o indicación de fugas.
- Limite la abertura de la faja de la campana de humo a una anchura que permita alcanzar los reguladores del biorreactor y de los cilindros de gas. Para evitar el riesgo de exposición a la inhalación, asegúrese de que la abertura no exponga al personal por encima de la región del torso.
- Gire los reguladores de los cilindros de gas a la posición cerrada para cesar el flujo de gas al reactor. Cierre la faja de la campana de humos y deje 5 minutos para que la campana evacúe los gases corrosivos antes de tomar muestras del cultivo del fotobiorreactor.
- Muestre dentro de la campana de humos abriendo un puerto de la placa principal y utilizando un pipeta serológica estéril o dibujando el cultivo en una jeringa a través del puerto de inoculación/muestra. Asegure los puertos del fotobiorreactor antes de abrir los cilindros de gas y reanudar el experimento.
5. Medición de la productividad de la biomasa microalgas
- Utilice una curva de calibración para relacionar las mediciones de cultivo microalgal OD750 con las concentraciones de biomasa microalgas secas.
- Preparar varios matraces (mínimo: 4, volumen mínimo de trabajo: 500 ml) con medio microalgal estéril e inocular con las especies de interés (por ejemplo, S. obliquus en este estudio).
- Mida el cultivo OD750 hasta que el crecimiento sea exponencial, y muestree rápidamente los matraces filtrando los volúmenes conocidos (mínimo de 100 ml) del contenido con una membrana de filtro de 0,45 m de masa conocida. Utilice botes de pesaje de aluminio cubierto o recipientes de vidrio para soportar la biomasa y los filtros a medida que se secan.
- Masa de la biomasa y los filtros después del secado durante aproximadamente 18 x 24 h en un horno entre 80 o 100 oC. Para verificar el secado completo, mida de nuevo después de 2 x 3 h adicionales para determinar si la masa se ha estabilizado.
- Restar la masa del filtro de la biomasa combinada y la masa de filtro para calcular la masa de biomasa.
- Trazar la curva de calibración medida OD750 con respecto a la concentración de biomasa (masa de biomasa dividida por el volumen de cultivo filtrado) y ajustar los datos con una regresión lineal.
6. Modelado de la productividad de la biomasa y cálculos de tarifas
- Calcule las concentraciones de biomasa del experimento a partir de mediciones OD750 utilizando la regresión lineal de la curva de calibración (determinada en la sección 5).
- Ajustar los datos de crecimiento microalgal por lotes de la fase exponencial a la fase estacionaria con una regresión logística (Ecuación 2) en el software de gráficos y estadísticas(Tabla de materiales):
(2)
donde L es el valor máximo de concentración de biomasa de la curva, k es la pendiente relativa de la fase exponencial (tiempo-1), xo es el tiempo del punto medio de la curva sigmoidal, y x es el tiempo.- Introduzca manualmente la ecuación logística anterior. Seleccione Ajustar una curva con regresión no lineal en la ficha Análisis del software. A la izquierda del cuadro Parámetros: Regresión no lineal, elija Crear nueva ecuación en el cuadro desplegable Nuevo. Utilice la ecuación explícita predeterminada como tipo de ecuación, asigne un nombre a la nueva función y defina la nueva función como Y - L/(1+ exp(-k*(x-b))), donde b representa xo.
- Calcular la productividad global de la biomasa del lote de microalgas dividiendo la diferencia entre las concentraciones finales e iniciales de biomasa por la diferencia entre los tiempos finales y los tiempos iniciales.
- Calcular la productividad máxima de la biomasa del lote de microalgas a partir de la derivada de la Ecuación 2 (Ecuación 3) en el punto medio sigmoide, cuando x x o.
(3)
(2)
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Representative Results
Se estableció una curva de calibración para las microalgas verdes, S. obliquus,cosechada en fase exponencial, con OD750 y concentraciones de biomasa seca(Figura 2). La regresión lineal tenía un valor R2 de 0,9996.
Se inició un cultivo de S. obliquus en un matraz Erlenmeyer de 250 ml de un cultivo almacenado en una placa de agar refrigerada. La microalga fue inoculada en 3N-BBM con 10 mM de tampón HEPES y esparcida con 2.2% CO2 en un fotobiorreactor de 2 L con volumen de trabajo de 1.5 L (0.07 vvm)(Figura 1). El lote fue rastreado a través de OD750; las concentraciones de biomasa se calcularon a partir de la curva de calibración y, a continuación, se modelaron con una curva logística(Figura 3). El fotobiorreactor mantuvo el cultivo a pH 6,8, 100 cm3 min-1 caudal total de gas, continuo 280 m-2 s-1 iluminación, y 27 oC. La curva logística ajusta los datos de concentración de biomasa de la fase exponencial a la fase estacionaria. A partir del modelo logístico, la concentración máxima de biomasa durante el lote fue de 2070 a 20 mg de L-1,la productividad máxima de la biomasa se produjo a 4,6 días, y la tasa de productividad específica de la biomasa fue de 1,0 d-1. La productividad máxima de la biomasa, calculada a partir de la derivada de la curva logística en el momento del crecimiento máximo, fue de 532 a 60 mg de L-1 d-1.
El modelo de habitación bien mezclado se utilizó para calcular la concentración acumulada de NO2,SO2y CO en el caso de fallo de la campana de humo durante 24 horas. Estos valores se compararon con los límites de exposición (Tabla 2). Por ejemplo, en el escenario donde 0.05 L min-1 de 400 ppm NO2 se libera durante un período de fallo de la campana de humo de 24 h, el modelo de habitación bien mezclado con las entradas de G calculado s 0,0377 mg min-1, Q a 0,0001 m3 min-1, V a 100 m3, y el tiempo máximo para la simulación de 1440 min predicela acumulación de 2 a 0,54 mg m-3 (0,29 ppm), que está por encima del límite de exposición crónica aceptable (American Conference of Governmental Industrial Hygienists limit threshold . TLV]) y por debajo del límite de exposición a corto plazo (STEL).
Un ensayo preliminar prometedor con gases de combustión simulados alcanzó una mayor tasa máxima de productividad de la biomasa de microalgas (690 x 70 mg L-1 d-1) que la del 12% deCO2 y el aire ultracero (510 x 40 mg L-1 d-1)(figura 4). Antes del experimento, se calibraba un monitor de gas con CO, NO2y SO2. El experimento de gases de combustión simulados se llevó a cabo sin ningún riesgo para el personal o daños en el equipo por gases corrosivos.
Figura 1: Fotobiorreactor de sobremesa iluminado por luces LED rojas y azules. El fotobiorreactor funciona como un reactor por lotes de 2 L con un volumen de trabajo de 1,5 L. El fotobiorreactor se alimenta continuamente con gases a través del anillo de sparging y el exceso de ventilación de gas a través de los puertos de la placa frontal. Adaptado con permiso de Molitor et al.5. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Curva de calibración relacionada con OD750 con S. obliquus peso seco de la célula. La absorción de la luz del cultivo celular de S. obliquus se midió a 750 nm, luego las células se filtraron y se secaron para obtener mediciones de peso seco celular. Reimpreso con permiso de Molitor et al.5. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Datos de crecimiento de S. obliquus a 2,2% deco2 modelados con una regresión logística. Los puntos de datos representan valores de biomasa calculados a partir de mediciones de densidad óptica. Los datos se han modelado con una regresión logística a través de un ajuste de mínimos cuadrados; 
donde L á 1955 mg L-1, k a 1,154 d-1, y x0 a 3,317 d. R2 a 0,995. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Crecimiento modelado de S. obliquus al 12% de CO2,con y sin componentes adicionales de gases de combustión simulados. Las mediciones de biomasa de cada lote de microalgas se modelaron con regresiones logísticas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Componente | Por ciento |
| H2O | 12.6% |
| CO2 | 11.6% |
| O2 | 5.8% |
| Co | 0.048% |
| ASÍ QUE2 | 0.045% |
| NO2 | 0.022% |
| N2 | 69.9% |
Cuadro 1: Composición de las emisiones de las centrales eléctricas de carbón. Estas cantidades se promediaron de los datos de emisiones de la central eléctrica de la Universidad de Iowa recopilados a intervalos de minutos en el lapso de 10 h.
| Gas tóxico | Twa | Techo | Stel | NIOSH IDLH | NIOSH REL | ACGIH TLV | Descripción de los CDC |
| Co | 35 ppm | 200 ppm | - | 1.200 ppm | 35 ppm | 25 ppm | Incoloro, inodoro |
| ASÍ QUE2 | 2 ppm | 100 ppm | 5 ppm | 100 ppm | 2 ppm | 2 ppm | Gas incoloro con un olor característico, irritante y penetrante |
| NO2 | 3 ppm | 5 ppm | 1 ppm | 13 ppm | 1 ppm | 0,2 ppm | Líquido de color marrón amarillento o gas marrón rojizo (por encima de 70 oF) con un olor picante y acre |
Tabla 2: Límites y descripciones de exposición de gases tóxicos (CO, SO2, NO2) en gases de combustión. OSHA TWA: promedio ponderado por tiempo (generalmente 8 h período), CEILING: valor que nunca se debe alcanzar, STEL: límite de exposición a corto plazo (TWA más de 15 min), NIOSH IDLH: peligro para la vida y la salud, NIOSH REL: límite de exposición de 15 minutos, ACGIH TLV: límite aceptable de exposición crónica, sin efectos adversos.
| Compuesto | Mm |
| NaNO3 | 8.82 x 100 |
| MgSO4x 7H2O | 3.04 x 10-1 |
| Nacl | 4.28 x 10-1 |
| K2HPO4 | 4.31 x 10-1 |
| KH2PO4 | 1.29 x 100 |
| CaCl2x 2H2O | 1.70 x 10-1 |
| ZnSO4x 7H2O | 3.07 x 10-2 |
| MnCl2s4H2O | 7.28 x 10-3 |
| MoO3 | 4.93 x 10-3 |
| CuSO4x 5H2O | 6.29 x 10-3 |
| Co(NO3)2s6H2O | 1.68 x 10-3 |
| H3BO3 | 1.85 x 10-1 |
| Edta | 1.71 x 10-1 |
| Koh | 5.52 x 10-1 |
| FeSO4x 7H2O | 1.79 x 10-2 |
| H2SO4 (concentrado) | 1 x 10-3 l |
Tabla 3: Composición del medio basal de Triple Nitrógeno Bold (3N-BBM). La cantidad de nitrógeno se ha triplicado del medio basal11original de Bold.
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Discussion
Los experimentos de fotobiorreactores por lotes y axensicos con pH regulado, temperatura, caudal de gas y concentración de gas promueven resultados significativos al eliminar la contaminación por cepas de algas no objetivo y variabilidad en condiciones de cultivo. La cinética precisa del crecimiento del cultivo puro se puede obtener incluso en presencia de gases corrosivos (CO2, SO2, NO2), que sirven como nutrientes, convirtiendo los gases de desecho en un producto valioso como la alimentación animal.
Antes de comenzar cualquier experimento de microalgas, el cultivo de microalga elegido debe tomarse del almacenamiento y readaptarse al cultivo líquido. El cultivo de las microalgas en fase exponencial mejora la probabilidad de que los experimentos tengan condiciones iniciales equivalentes y de que las microalgas no se estanquen en fase de retraso después de la inoculación.
Las curvas de calibración relacionadas con la densidad óptica y las concentraciones de biomasa son especialmente importantes durante los estudios de productividad de biomasa. La alta productividad de la biomasa microalgal es uno de los objetivos clave de la industria de los microalgas y, como tal, es a menudo un indicador del éxito de la investigación12. Por lo tanto, los cálculos precisos de las concentraciones de biomasa a partir de mediciones de densidad óptica deben derivar de datos de curvas de calibración específicos, precisos y precisos. Para evitar posibles interferencias ópticas, es importante que las mediciones para la curva de calibración y durante el experimento se realicen en soluciones de fondo equivalentes. Además, la curva de calibración debe realizarse con mediciones tomadas de microalgas en la(s) fase(s) de crecimiento más representativa(s) de las realizadas en los experimentos. Ciertas especies de microalgas pueden tener diferencias dramáticas en el tamaño de las células durante diferentes fases de crecimiento que pueden alterar la densidad óptica y las concentraciones percibidas de biomasa. Cabe señalar que la productividad de la biomasa está relacionada con la tasa de crecimiento, pero no equivalente a ella. La tasa de crecimiento específica depende del número de células (cambio en la densidad celular en el tiempo/densidad celular) presentes, y la productividad específica de la biomasa depende de la masa mayor de las células (cambio en la biomasa mg/L a lo largo del tiempo por mg/L de biomasa)13 presentes.
Cuando las concentraciones de biomasa microalgas se modelan con una curva logística, los resultados experimentales se pueden comparar significativamente interpolando las concentraciones de biomasa y calculando con precisión las productos de biomasa. Sin embargo, se debe tener cuidado al interpretar estos resultados experimentales; es inapropiado comparar la productividad total y máxima de la biomasa por lotes. Si bien los valores máximos de productividad de biomasa son útiles para comparar los resultados de los lotes, la productividad global de la biomasa es engañosa sin más información sobre la duración del experimento y las fases de crecimiento microalgal. Estas tasas cambian continuamente durante el retraso, el crecimiento del registro y las fases estacionarias.
Durante los experimentos con gases corrosivos que son característicos de las emisiones de la central eléctrica o de la combustión industrial, se debe tener precaución tanto para la salud humana como para la longevidad del equipo. Las piezas estándar deben reemplazarse con materiales más robustos, y los consumibles como los tubos deben ser inspeccionados y reemplazados con más frecuencia para resistir la corrosión, evitar fugas y evitar la exposición humana. Las medidas de seguridad adicionales y la concienciación sobre el riesgo son esenciales para un funcionamiento y un muestreo seguros y exitosos. El método no es adecuado para gases inflamables porque existe la posibilidad de acumulación de gases dentro del espacio de la cabeza y el equipo no está diseñado para tales riesgos ni es adecuado para una adaptación segura a tales condiciones.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este material se basa en el trabajo apoyado por la National Science Foundation Graduate Research Fellowship under Grant No. 1546595. Cualquier opinión, hallazgo, y conclusiones o recomendaciones expresadas en este material son las de los autores y no reflejan necesariamente las opiniones de la Fundación Nacional de Ciencia. El trabajo también fue apoyado por una beca de investigación de graduados y gobiernos estudiantiles profesionales de la Universidad de Iowa, y la fundación allen S. Henry de la Fundación de la Universidad de Iowa. La investigación se llevó a cabo en el Laboratorio de Fitotecnologías W. M. Keck. Los autores desean agradecer al personal de la central eléctrica de la Universidad de Iowa, especialmente a Mark Maxwell, su experiencia y apoyo financiero para los gases de combustión simulados. Los autores también quieren reconocer a Emily Moore por su ayuda con el muestreo y el análisis y Emily Greene por su ayuda y participación en el video del protocolo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biostat A bioreactor | Sartorius Stedim | 2-liter bioreactor for microbial fermentation; designed to be autoclaved; pH, temperature, gas flow rate control | |
| Bump test NO2 gas | Grainger | GAS34L-112-5 | Calibration gas for MultiRAE gas detector |
| Bump test O2, CO, LEL gas | Grainger | GAS44ES-301A | Calibration gas for MultiRAE gas detector |
| Bump test SO2 gas | Grainger | GAS34L-175-5 | Calibration gas for MultiRAE gas detector |
| Corrosion resistant tubing for NO2 gas | Swagelok | SS-XT4TA4TA4-6 | PTFE Core Hose Smooth Bore X Series—Fiber Braid and 304 SS Braid Reinforcement |
| Corrosion resistant tubing for SO2 gas | QC Supply | 120325 | Reinforced Braided Natural EVA Tubing - 1/4" ID |
| cozIR 100% CO2 meter | Gas Sensing Solutions Ltd. | CM-0121 at CO2meter.com | CO2 meter for concentrations up to 100% |
| cozIR 20% CO2 meter | Gas Sensing Solutions Ltd. | CM-0123 at CO2meter.com | CO2 meter for concentrations up to 20% |
| Durapore Membrane Filter, 0.45 μm | Millipore Sigma | HVLP04700 | Hydrophilic, plain white, 47 mm diameter, 0.45 μm pore size, PVFD membrane filters |
| Gas cylinder regulators | Praxair | PRS 40221331-660 | Single-stage stainless steel regulator configured for 0-15 psi outlet assembly diaphragm valve with 1/4" MNPT threads, Stainless steel to resist corrosion from NOx and SOx |
| Gas cylinders | Praxair | Ulta-zero air, high purity CO2, or custom gas composition | Dependent on study objectives |
| Gas monitoring and leak detection system | RAE Systems by Honeywell | MAB3000235E020 | Pumped model that detects O2, SO2, NO2, CO, and LEL |
| GasLab software | GasLab | v2.0.8.14 | Software for CO2 meter measurements and data logging |
| Hose barb | Grainger | Item # 3DTN3 | Used to adapt regulators to tubing, Stainless steel to resist corrosion from NOx and SOx |
| K30 1% CO2 meter | Senseair | CM-0024 at CO2meter.com | CO2 meter for concentrations less than 1% |
| LED grow panels | Roleadro | HY-MD-D169-S | Red & blue LED light panels |
| Memosens dissolved oxygen probe | Endress+ Hauser | COS22D-19M6/0 | Autoclavable (with precautions) dissolved oxygen probe for bioreactor |
| Memosens pH probe | Endress+ Hauser | CPS71D-7TB41 | Autoclavable (with precautions) pH probe for bioreactor |
| Oven, Isotemp 500 Series | Fisher Scientific | 13246516GAQ | Small oven for drying |
| Prism GraphPad software | GraphPad Software | Version 7.03 or 8.0.1 | Graphing software for data organization, data analysis, and publication-quality graphs |
| Stem to hose barb fitting | Swagelok | SS-4-HC-A-6MTA | Stainless Steel Hose Connector, 6 mm Tube Adapter, 1/4 in. Hose ID |
| Tubing, dilute acid/base transfer | Allied Electronics and Automation | 6678441 | Silicone TP Process Tubing; 1.6mm Bore Size; 3000mm Long; Food Grade |
| Tubing, gas transfer | Allied Electronics and Automation | 6678444 | Silicone TP Process Tubing; 3.2mm Bore Size; 3000mm Long; Food Grade |
References
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