Summary
Her præsenterer vi en protokol til hurtigt og nemt at måle nuklear faktor Kappa-lys-kæde forstærker af aktiverede B-celler (NF-κB) aktivering i cellelinjer, der udtrykker NF-κB:: luciferase reporter konstruerer, via målinger af luminescens i celle lysatet. Desuden bestemmes genekspression via RT-qPCR isoleret fra celler inficeret med salmonella typhimurium.
Abstract
Den dikemeje transkriptionsfaktoren NF-κB regulerer mange cellulære respons veje, herunder inflammatoriske veje ved at inducere ekspression af forskellige cytokiner og kemo okiner. NF-κb er konstitutivt udtrykt og er afsondret i cytosol af den hæmmende protein nukleare faktor af Kappa Light polypeptid gene forstærker i B-celle inhibitor, alpha (iκbα). Aktivering af NF-κB kræver nedbrydning af IκBα, som derefter udsætter et nukleart lokaliserings signal på NF-κB og fremmer sin handel med kernen. Når i kernen, NF-κB binder sig til promotor regionen af NF-κB Target gener såsom interleukin 6 (IL-6) og IL-23, at fremme deres udtryk.
Aktivering af NF-κB sker uafhængigt af transskription eller oversættelse. Derfor skal tilstanden for aktivering af NF-κB måles enten ved at kvantificere NF-κB specifikt i kernen eller ved at kvantificere ekspression af NF-κB-målgener. I denne protokol, celler stabilt transficeret med en NF-κb:: luciferase reporter konstruere er analyseret for NF-κb aktivering ved hjælp af in vitro vævskultur teknikker. Disse celler er inficeret med salmonella typhimurium at aktivere NF-κb, som trafiker til kernen og binder sig til κb sites i arrangøren regionen luciferase, inducerende sit udtryk. Cellerne lyseres og analyseres med der-analysesystemet. Mængden af der produceret af cellerne korrelerer med intensiteten af luminescens signalet, som detekteres af en plade læser. Luminescens signalet genereret af denne procedure giver en hurtig og meget følsom metode til at vurdere NF-κB aktivering under en række betingelser. Denne protokol anvender også kvantitativ reverse transkription PCR (RT-qPCR) til at detektere relative mRNA-niveauer, der er tegn på genekspression.
Introduction
Den nukleare faktor-κB (NF-κB) familie af proteiner er vigtige transskription aktivatorer, der regulerer genekspression i forskellige biologiske veje. Aktivering af NF-κb inducerer transkriptionen af målgener, hvoraf mange er vigtige for immun-og inflammatoriske reaktioner, celle spredning, stress respons og cancer progression1,2. NF-κB spiller en integrerende rolle i at mæere tidlige inflammatoriske resultater for patogenclearance. I betragtning af de mange biologiske processer medieret af NF-κB aktivering, afbrydelser i sin signalering kan have alvorlige konsekvenser for sundhed og sygdom. Tab af funktion mutationer i NF-κB signalering er forbundet i flere immundefekt fænotyper, mens gevinst af funktion mutationer er forbundet med flere typer af kræft, herunder B-celle lymfomer og brystkræft3. Desuden, mange patogener har vist sig at direkte moduere aktivering tilstand af NF-κb gennem ekspression af virulensfaktorer4,5,6,7.
Aktivering af NF-κB er kendt for at være en konsekvens af mange variable stimuli, herunder bakterielle produkter såsom lipopolysaccharider (LPS), flagellin og peptidoglycans kendt som patogen-associerede molekylære mønstre (pamper). Disse brochurer opdages ved mønstergenkendelse receptorer (PRRs) såsom bompenge-lignende receptorer (TLRs) og NOD-lignende receptorer (NLRs) fører til aktivering af NF-κB og den efterfølgende ekspression af en matrix af NF-κB-afhængige inflammatoriske gener8. Ud over at PRR aktivering af Pamler, andre bakterie produkter, såsom bakterielle Effector proteiner, kan inducere aktivering af NF-κB. Interessant, bakterier også udtrykke Effector proteiner, der aktivt dæmpe NF-κB pathway og forbedre deres patogenicitet, understreger betydningen af NF-κB som en væsentlig mægler af immunitet9.
Der er fem forskellige under enheder, der udgør NF-κB-dimere; P50, P52, RelA (P65), RelB og cRel. De to vigtigste NF-κB Heterodimere er P50: RelA og P52: RelB dimers. De aktiverede NF-κb dimerer binder sig til DNA-steder, kendt som κb-lokaliteter, i arrangøren og forstærker-regionerne i forskellige målgener. Under normale homeostatiske forhold interagerer NF-κB med en familie af inhibitorer, der kaldes IκB-proteiner, for at forblive inaktive. Ved stimulering fosforyleres IκB af IκB kinase (IKK), som gør det muligt at være målrettet mod allestedsnærværende og efterfølgende nedbrydning. Nedbrydning af IκB aktiverer NF-κB ved at afsløre et nukleart lokaliserings signal. NF-κB omfordeler derefter til kernen, hvor den binder κB-lokaliteter i arrangøren-området af Target-gener og fremmer transkriptionen10. Således aktivering af NF-κb opregulerer mRNA ekspression af NF-κb Target gener, og denne ændring kan måles gennem RNA kvantificering assays såsom rt-qPCR11.
Der findes flere metoder, som almindeligvis anvendes til måling af aktivering af NF-κB, herunder elektroforetiske mobilitets Skift assays (EMSA), nuklear translokation og gen reporter assays. EMSA anvendes til påvisning af protein komplekser med nukleinsyrer. Stimulerede celler fraktioneres for at isolere nukleare proteiner, herunder den translokeres NF-κb, som derefter inkuberet med radioaktivt mærkede nukleotider, der indeholder NF-κb-bindings domænet. Prøverne køres på en gel og afbildet af Autoradiografi af 32P-mærket nukleinsyre. Hvis NF-κB er til stede i proteinfraktionen, vil det binde nucleotider, som vil migrere langsommere gennem gelen og præsentere som diskrete bands. Nukleare fraktioner af celler, der mangler aktiveret NF-κB (f. eks. ustimulerede kontrol celler), vil ikke producere nogen bånd, da nucleotider migrerer hurtigere til enden af gelen. En væsentlig ulempe ved denne metode er, at den stort set er kvantitativ i binær forstand (dvs. til eller fra) og ikke i tilstrækkelig grad indfanger meningsfulde forskelle i NF-κB-bindings kapacitet. Desuden er denne metode ikke overveje kromatin strukturer, der er funktionelt vigtige for NF-κb Target gener12,13.
På samme måde som den foregående metode er der en "non-Shift"-analyse, hvor multi-brønd plader er belagt med nukleotider, der indeholder en NF-κB-bindings sekvens. Efter behandling af celler med nukleare fraktioner af protein, NF-κB vil binde til nucleotider bundet til brønden. Anti-NF-κB antistoffer tilsættes derefter, som vil interagere med den bundne NF-κB og producere et kolorimetrisk signal proportional med mængden af NF-κB, hvilket indikerer graden af NF-κB aktivering. Denne metode er fordelagtig i forhold til EMSA, idet den ikke kræver radioaktivt mærkede nukleinsyre og er kvantitativ i sammenligning. Men, en advarsel af denne metode er, at det igen ikke skelner mellem kromatin stater af NF-κB mål gener14.
En anden metode, hvormed NF-κB aktivering kan påvises, er ved kromatin immunopræcipitation (ChIP), hvorved DNA og interagere proteiner er kryds forbundet med formaldehyd og immunoprecipitated med specifikke anti-NF-κB antistoffer. De specifikke nukleotidfragmenter renses og identificeres derefter gennem PCR amplifikation eller direkte High gennemløb Sequencing. Resultater genereret fra denne metode giver semi-kvantitative resultater af NF-κB binding aktivitet med Target gener. Resultaterne er imidlertid meget afhængige af fikserings forholdene og rensnings processerne ved hvert trin15.
I nukleare translokation assays stimuleres cellerne til at inducere NF-κB aktivering og derefter fast. Anti-P65-antistoffer tilsættes til faste celler. Alternativt kan P65-under enheden selv mærkes med et fluorescerende peptid, såsom grønt fluorescerende grønt (GFP). I begge tilfælde vil immunofluorescens gøre det muligt at billed lokalisering af P65 for at bestemme cellulær distribution. Ved at måle andelen af cytosolisk og nukleare lokaliseret protein, kan investigatorerne bestemme den relative aktiveringstilstand af NF-κb. En ulempe ved denne metode er, at immunofluorescens er forholdsvis tidskrævende, kræver dyre antistoffer, og har brug for relativt større teknisk ekspertise16.
Reporter gener er almindeligt anvendte værktøjer til at studere de regulatoriske og udtryks mønstre af et gen af interesse. Typisk er reporter gener konstrueret fra arrangøren sekvens af et gen af interesse smeltet til et gen kodning for en let detekterbar protein. Proteiner med enzymatiske aktiviteter, fluorescens eller luminescens egenskaber er almindeligt valgt for deres evne til at blive analyseret og kvantificeret. Således fungerer udlæsning (f. eks. luminescens, fluorescens) som et signal til påvisning af genekspression. Disse reporter konstruktioner kan derefter indføres i forskellige celletyper, såsom epiteliale celler eller makrofager.
Beskrevet i protokollen er brugen af en klonet Hela Cell line (Hela 57a), der er stabilt transficeret med en der reporter, der indeholder tre eksemplarer af κb konsensus af immunglobulin κ-Chain Promoter region17. Ekspression af der er afhængig af aktivering af NF-κb, som opstår efter celle stimulation. Stimulerede celler let lyseres ved hjælp af cellelyse buffer leveres i der assay kit. En del af celle lysatet blandes derefter med der assay buffer, der indeholder luciferin. Luciferin er underlaget for der og er nødvendig for generering af lys i nærværelse af der. Efter at have kombineret analyse bufferen med lysbilledet udsender opløsningen lys i en proces, der kaldes luminescens. Mængden af produceret lys, givet i lumen, er proportional med mængden af der til stede i lysatet og tjener som et mål for NF-κb aktivering. Lumen aflæsninger fortolkes i forhold til en ustimuleret standard til at tage højde for baseline NF-κB aktivitet og selve signalet er stabilt i flere minutter for at give mulighed for pålidelig måling. Desuden er den Hela 57a cellelinje stabilt transficeret med en NF-κb-uafhængig β-galactosidase reporter. Β-galactosidase-indberetteren udtrykkes konstitutivt, og β-galactosidaseaktivitet kan måles til kontrol af cellernes levedygtighed eller variation i celle numrene17. Luciferaseværdierne kan derefter justeres til β-galactosidaseværdierne og rapporteres som fold stigning over de ustimulerede kontrol celler.
Da NF-κB er en transkriptionsfaktor, der er ansvarlig for det øgede ekspression af NF-κB-afhængige målgener, er et opfølgende eksperiment til kontrol for NF-κB-afhængig øget genekspression kvantitativ reverse transkription polymerase kædereaktion ( RT-qPCR). RT-qPCR er en meget følsom metode, hvormed ændringer i genekspression kan kvantificeres over flere størrelsesordener. Stimuleret og kontrol celler høstes for RNA via phenol-chloroform ekstraktion. Efter faseadskillelse udvindes RNA som den vigtigste bestanddel af det vandige lag. RNA udfældede derefter og vaskes for at producere en ren pellet. Denne pellet er derefter rekonstitueret og yderligere renset for kontaminerende DNA via DNase behandling. Den rene RNA er derefter omvendt transskriberet til at skabe komplementære DNA (cDNA). Dette cDNA kan derefter analyseres ved hjælp af kvantitative PCR-teknikker, hvor den overflod af en specifik mRNA-sekvens kvantificeres for at bestemme genekspression. Denne teknik ikke belyse Translationel kontrol, post translationel modifikation, protein overflod, eller protein aktivitet. Men, mange gener, især dem, der er involveret i pro-inflammatoriske processer, reguleres via NF-κB og deres mRNA overflod er vejledende for deres udtryk.
Den metode, der foreslås her udnytter en hurtig og enkel måde, hvorpå NF-κB aktivering kan påvises via luminescens assays af cellulære lysate. RT-qPCR af NF-κB Target genekspression kan bruges til at kvantificere ekspression af bestemte gener, samt validere funktionel aktivitet af NF-κB aktivering. De store fordele ved et sådant system er dets enkelhed og hastighed, som giver mulighed for høj gennemløbs screening af en række betingelser, der modutere NF-κB aktivering. Denne protokol er egnet til andre cellelinjer, der udtrykker en NF-κb:: luciferase reporter, og er blevet demonstreret i stabilt transficeret RAW 264.7 celler18. Mængden af tid, der kræves til at håndtere prøver, startende fra celle lysis til at generere et luminescens signal, er minimal og tager spændvidden på omkring en time. Måling af NF-κB kræver kun grundlæggende laboratorieudstyr såsom uigennemsigtige plader, en plade læser, der er i stand til at måle luminescens, og enkel dataanalyse software såsom et regnearksprogram.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. celle Passaging og såning
- Der opretholdes HeLa 57A-celler i en 75 cm2 -kolbe indeholdende 10 ml dulbecco's modificerede eagle's Media (DMEM) suppleret med 5% varme inaktiveret føtal bovint serum (FBS) ved 37 °c i en 5% Co2 -inkubator.
- Aspirer cellekultur medier, og vask med 1 mL 0,05% trypsin-EDTA-opløsning. Indsug trypsin, og Udskift den med yderligere 1 mL. Kolben anbringes i en 37 °C-inkubator i 4-5 min, så cellerne kan løsne sig fra kolben.
- Tilsæt 9 mL celledyrkningsmedier, og vask forsigtigt bunden af kolben et par gange for at opløse cellerne og danne en homogen suspension.
- HeLa 57A cellerne 1:6 eller 1:8 fortyndes i friske medier og frø til nye kolber. Passage celler, når de er 90% flydende eller hver tredje dag og vedligeholde celler på mindst 25% konfluency.
- En dag før celle stimulation, trypsinize HeLa 57A celler og suspendere i 10 mL af vækstmedier. Tæl cellerne i suspension ved hjælp af et hemocytometer og brug vækstmedier til at fortynde cellerne til en endelig koncentration på 2,5 x 105 celler/ml i et 50 ml konisk rør.
- Overfør 250 μL cellesuspension (~ 6,25 x 104 celler) til hver brønd på en 48-brønd plade. Periodisk hætte og vend det koniske rør for at sikre en homogen cellesuspension. Trykpladen forsigtigt på siden for at sikre, at cellerne fordeles ensartet i brøndene.
- Pladen overføres til 37 °C i en 5% CO2 -inkubator, og cellerne kan fastgøres og vokse fra den ene dag til den anden.
2. fremstilling af bakterier
- To dage før infektion, stribe frosne bestande af salmonella på lb agar plader til fremstilling af enkelt kolonier. Overfør pladerne til en inkubator, der er indstillet til 37 °C, og lad væksten natten over.
- En dag før infektion tilsættes 3 mL lysogeny bouillon (LB) til sterile bakterielle kulturrør, hvilket tilføjer passende antibiotika til medierne.
- Ved hjælp af en steril inokulering loop, vælge en enkelt koloni fra stribede bakterielle kulturer og røre Løkken til lb medierne. Hætten rørene efter inokulering og kassere løkken.
- Placer rørene i en ryste inkubator sat til 37 °C, 180 rpm, og lad det vokse natten over.
- På infektions dagen, hente overnight bakterielle kulturer fra inkubator.
- Forbered rør til subkultur ved tilsætning af 3 mL frisk LB, indeholdende antibiotika, når det er relevant.
- Overfør 30 μL af den overnattende bakteriekultur (1 i 100 fortynding) til de frisklavede medier. Anbring rørene i en ryste inkubator, der er indstillet til 37 °C i 3 timer.
- Efter 3 h inkubation, Overfør 1 mL steril LB bouillon til en plastik kuvette til at fungere som blank. Overfør 900 μL LB til de andre cuvetter, der skal anvendes til analyse af prøven.
- Overfør 100 μL bakteriel subkultur til en kuvette, der indeholder 900 μL LB, og pipette op og ned flere gange for at blande. Gentag dette for hver bakteriel suspension.
- Drej spektrofotometret for at måle den optiske tæthed (OD) af bakteriekulturer ved en bølgelængde på 600 nm (OD600).
- Placer blank i Spektrofotometer. Vær opmærksom på orienteringen, da der bør være et mærke mod toppen indikerer sådan.
- Luk låget, og tryk på den tomme knap på spektrofotometret for at få baggrunds absorbansen.
- Udskift den blanke kuvette med et prøve kuvette i samme retning, og tryk på Read.
- Registrer OD600 -værdierne af disse prøver. Multiplicer værdien med 10 for at gøre det til en fortyndingsfaktor.
- Den bakterielle subkultur fortyndes med frisk LB for at opnå en absorbans værdi på ca. 1,0, hvilket omtrent svarer til 1 x 109 CFU/ml. Denne suspension 1:10 fortyndes i en kuvette og måles absorbansen — hvilket bør give en værdi på ~ 0,1.
- I et nyt rør tilsættes en passende mængde af den fortyndede subkultur til Fresh LB for at opnå en suspension på 1 x 108 CFU/ml, der skal anvendes som inokulum.
- Fremstil seriefortyndinger af inokulum ved at overføre 50 μL bakteriel suspension til et rør, der indeholder 450 μL steril PBS (10-fold fortynding), indtil der fremstilles en endelig fortynding på ca. 102 CFU/ml.
- Overfør 100 μL af de to laveste fortyndinger (102 og 103 svarende til henholdsvis 10 og 100 kolonidannende enheder) til en lb-agar plade, og spred suspensionen med en celle spreder for at opnå enkelt kolonier. Disse plader overføres til en 37 °C inkubator og Inkubér om natten.
- Den følgende dag tæller kolonierne og beregner den bakterielle koncentration af det initiale inokulum for at bestemme den faktiske inokulum koncentration.
3. infektion af celler
Bemærk: på dette tidspunkt bør cellerne være på omkring 90% konfluency. For HeLa 57A-celler i en 48-brønd plade er dette ca. 1 x 105 celler pr. brønd. Celler vil blive inficeret med mangfoldighed af infektion (MOI) på 10, eller 106 CFU/brønd.
- Mærk låget af pladen i henhold til de infektions tilstande, der vil blive brugt til hver brønd, med hver betingelse gøres i tre eksemplarer.
- Tilsæt 10 μL af inokulum til passende brønde. Tilsæt 10 μL steril LB til ikke-inficerede kontrol brønde.
- For at synkronisere infektionstidspunktet skal pladen placeres i en bordplade centrifugeres og spinne ved 500 x g i 5 minutter, hvilket sikrer, at pladen er kontra balanceret.
- Overfør inficerede celler til en 5% CO2 inkubator ved 37 °c i 1 time.
- Placer en alikvot celle dyrkningsmedie i et 37 °C-vandbad til brug i næste trin.
- En time efter tidspunktet for infektion, fjerne cellekultur medier fra vandbad og tørre det ydre med 70% ethanol. Overfør vævskultur pladen til biosikkerhedskabinettet.
- Ved hjælp af steril teknik, aspirere medier fra brønde og erstatte med 250 μL friske, varme cellekultur medier.
- Returner pladerne til 5% CO2 -inkubator ved 37 °c i yderligere 4 timer.
- Fjern pladerne fra CO2 inkubator og Aspirer mediet fra brøndene. For der analyse fortsætte til trin 4,1. For RNA-isolation fortsættes til trin 5,1.
4. luciferase-analyse
- Tilsæt 100 μL 1x cellelyse buffer til brøndene. Bufferen skal muligvis først fortyndes til en arbejds koncentration, afhængigt af reagenset.
- Pladen overføres til a-80 °C fryser, og der inkubates i mindst 30 minutter for at sikre effektiv cellelyse.
- Placer pladen med frosset celle lysat på en bænk for at tø og forberede der substrat reagenser i henhold til producentens anbefalinger.
- Lad der substrat reagenser ækvibrere til stuetemperatur.
- Tænd for plade læseren, og Åbn det tilsvarende Reader-program. Indstil maskinen til måling af luminescens.
- 10 μL af hver prøve overføres til en brønd af en uigennemsigtig 96-brønd plade.
- Tilsæt 50 μL af Luciferaseanalysesreagenset ved hjælp af en multikanals pipette til hver brønd af den uigennemsigtige plade.
- Tryk forsigtigt pladen på siden for at blande brønde og sørg for, at den nederste overflade er dækket med væske. Anbring pladen i en plade læser, og begynd at læse.
- Kopiér luminescens værdierne til et regnearksprogram, og Afbild resultaterne.
5. RNA-isolation
- Tilsæt 500 μL guanidium thiocyanat til hver brønd, og pipér op og ned flere gange for at sikre fuldstændig lyse.
- Indholdet overføres til et mærket mikrocentrifuge glas. Vedligehold prøver på is så meget som muligt for at opretholde RNA-kvalitet.
- Sæt en bordplade centrifuge til 4 °C og vedligehold centrifugen ved denne temperatur i resten af protokollen.
- Til hvert prøveglas tilsættes 100 μL chloroform, hætte stramt og rystes i 15 s. Inkuber ved stuetemperatur i 10 minutter.
- Centrifugeres ved 12.000 x g i 15 minutter ved 4 °c. I løbet af denne tid, forberede sig til det næste trin af RNA rensning ved at etiketter nye rør.
- Den øvre vandige fase overføres til det nye rør, der indeholder 250 μL isopropanol, idet det er omhyggelig med ikke at forstyrre de midterste eller nedre lag.
- Opbevar ubrugt produkt i a-80 °C fryser, som også kan bruges til proteinanalyse. Den resterende vandige lag kan også fungere som en backup, hvis RNA er nødvendig senere.
- Vortex blandingen af vandigt lag og isopropanol og tillade prøver at sidde ved stuetemperatur i 10 min.
- Prøverne centrifugeres ved 12.000 x g i 10 minutter ved 4 °c.
- Fjern rørene fra centrifuge. RNA-bund fælden danner en hvid pellet på siden og bunden af røret. Åbn rørene, og fjern forsigtigt supernatanten ved at hælde ud i en affaldsbeholder.
- RNA-pellets vaskes ved tilsætning af 500 μL 75% ethanol og vortex.
- Centrifugeres ved 8.000 x g i 5 minutter ved 4 °c.
- Fjern supernatanten ved at hælde ud og igen vaske pellet med 75% ethanol.
- Centrifugeres ved 8.000 x g i 5 minutter ved 4 °c.
- Ved hjælp af en lille volumen pipette (f. eks. 10-200 μL volumen) skal du aspirere så meget af supernatanten som muligt, idet du skal passe på ikke at skubbe nogen væske tilbage i røret eller afkøle pellet med pipettespidsen. Hvis pellet bliver opløst, skal du centrifugeres kortvarigt og prøver igen at fjerne supernatanten.
- Lufttørre RNA-pellets. Hvis pillerne er synlige for enhver prøve, periodisk (hver 5 minutter) kontrollere dem for at se, om de skifter fra hvidt til klart, hvilket indikerer, at de er tørre. Når pillerne begynder at dreje klart, tilsættes 20 μL ultrapure, RNase frit vand for at opløse RNA.
- Hvis pellets ikke var i første omgang synlige for nogen prøver, skal du blot tilføje ultrarent vand 5 min efter fjernelse supernatant.
- For at øge opløseligheden, passere opløsningen et par gange gennem en pipettespids og inkubere i 10 min ved 55-60 °C.
6. DNase behandling af RNA
- For at opretholde RNA-integriteten skal du opbevare RNA-prøver på is, medmindre andet er angivet. På dette tidspunkt kan 10x DNase-bufferen fjernes fra fryseren og tillades at tø på is.
- Spektrofotometer forberedes til analyse af prøver ved at rense alle prøveanalyse flader med en fnugfri klud.
- Tag en baggrunds måling før analyse. For at gøre dette skal du indlæse sensoren med 1,5 μl af det samme ultrarent vand, der bruges til at opløse RNA-pellets. Tryk på knappen Læs Tom for at generere en baggrunds aflæsning.
- Brug fnugfri klud til at tørre instrumentets prøve læsse flade af. Gentag dette trin efter hver prøve aflæsning.
- Indlæs 1,5 μL resuspenderet RNA på prøveholderen, og vælg Læs prøve. Gentag, indtil alle prøver er blevet læst.
- DNase-masterblandingen forberedes ved at kombinere 2,4 μL 10x DNase-buffer og 1 μL DNase pr. prøve i et 1,5 mL mikrocentrifuge glas. Forbered masterblandingen til to ekstra volumener.
- Bland Master Mix ved at svirpe røret flere gange. Centrifugeglasset centrifugeres kortvarigt for at samle indholdet i bunden af røret. Tilsæt 3,4 μL mastermix til 20 μL RNA-prøve. Bland indholdet ved at svirpe og centrifuge kort, som før.
- Prøverne overføres til en varmeblok, der er indstillet til 37 °C i 20 min. Fjern DNase-inaktiverings reagenset fra fryseren og tø ved stuetemperatur.
- 20 min. efter at have anbragt prøver på varme blokken, overføres prøverne til et rørstativ placeret på arbejdsbænken.
- Vortex forsigtigt indholdet af DNase inaktiverings reagens. Overfør 2,6 μL DNase inaktiverings reagens til de rør, der indeholder RNA, og svip rørene for at skabe en homogen blanding.
- Prøverne centrifugeres ved 12.000 x g i 1 min.
- Pipette forsigtigt supernatanten til et nyt, mærket rør.
7. omvendt transskription af mRNA til cDNA
- Forbered en Master Mix afhængigt af mængden af prøver plus to ekstra for at konto for tab gennem pipettering (tabel 1). Brug 1 μg RNA, og tilsæt H2O til et volumen på 50 μl i alt.
| Reagens | Volumen (μL) | Endelig koncentration |
| MgCl2 (25mm) | 3,5 | 1,75 mM |
| Reverse transkriptionsbuffer (10x) | 5 | 1x |
| dNTP mix (10 μM, hver) | 2,5 | 500 nm |
| tilfældig hexamer (100 μM) | 1,25 | 2,5 μM |
| Multiscribe reverse transkriptase (50 U/μL) | 1 | 1 e/μL |
| Rnasehæmmer (20 e/μL) | 1,25 | 1,25 U/μL |
| RNA (1 μg) | 20 ng/uL | |
| H2O | Top op til 50 |
Tabel 1: komponenter og opskrift til reverse transskription Master mix.
- Stikprøverne stramt og mærk PCR-rørene på siden, da etiketterne på låget kan fjernes fra termocycleren på et senere tidspunkt. Mix af vortexing.
- Centrifuge rørene centrifugeres kortvarigt for at indsamle prøver til bunden af røret.
- PCR-rørene placeres i en termo cycler, og prøverne køres under følgende indstillinger:
25 °C i 10 min, 48 °C i 30 min, 95 °C i 5 min, og hold derefter ved 10 °C. - Overfør rør, der indeholder nyligt syntetiserede cDNA til a-20 °C fryser eller brug straks i qPCR analyse.
8. klargøring og lastning af plader til RT-qPCR-analyse
- Før du starter, planlægger du opsætningen af 384-Well qPCR-pladen til analyse af prøver.
- Tø primere og cDNA på is.
- Forbered en Master Mix (Se tabel 2), plus ca. 10% ekstra for at aflægge regnskab for tab gennem pipettering.
| Reagens | Volumen (μL) |
| 10 μM F primer | 1 |
| 10 μM R primer | 1 |
| Ultrapure H2O | 4 |
| 2x SYBR grøn | 10 |
Tabel 2: komponenter og opskrift på qPCR Master mix.
- Vortex Master Mix og dispenserer 8 μL i brøndene på 384-brønd pladen ved hjælp af en repeater-pipette. Prøver vil blive analyseret i duplikat for hver primer og cDNA prøve kombination.
- Ved hjælp af en P10 (eller mindre) pipette overføres 2 μL cDNA for at duplikere brønde for hvert primer-sæt, der skal analyseres. Udskift spidser efter hver brønd for at undgå krydskontaminering.
- Forsegl pladen ved forsigtigt at påføre den selvklæbende film på overfladen, hvilket sikrer, at alle brønde er dækket. Tryk på filmen ved hjælp af en tætning padle eller rulle for at forsegle fast.
- Anbring pladen i en centrifuge med en tom plade som modvægt. Centrifuge pladen centrifugeres ved 500 x g i 5 min.
9. kørsel af Termocycleren til qPCR-analyse
- Tænd for computeren og real-time PCR instrument.
- Åbn RT-qPCR-softwaren, og vælg nyt eksperiment.
- Under fanen Opsætning skal du vælge eksperiment egenskaber, hvor parametrene for kørslen kan indstilles.
- Definer eksperimentnavnet, som angiver filnavnet og de indstillinger, der bruges til at gemme resultater.
- For valg af instrumentskal du vælge det instrument, der aktuelt er tilsluttet, og som skal køre analysen. Vælg kørselsmetode for komparativ CT (δδct) .
- Vælg Sybr grønne reagenser som det fluorescerende DNA-farvestof, der skal anvendes, og standard som rampe hastigheden.
- Sørg for, at feltet ud for Medtag smelte kurve er markeret.
- Under fanen Definer skal du tildele mål (dvs. gener, der skal forstærkes) og prøver (dvs. forsøgsbetingelser).
- Vælg fanen Tildel . Mærk brøndene med passende mål og prøver, da de svarer til laste ordningen for 384-brønd pladen.
- Vælg Kør metode. Brug de parametre, der er angivet i analysen (tabel 3).
| Hold scenen | PCR Stage | Smelte kurve stadie | |||||
| Trin 1 | Trin 2 | Trin 1 | Trin 2 | Trin 1 | Trin 2 | Trin 3 | |
| Temp | 50 °C | 95 °C | 95 °C | 60 °C | 95 °C | 60 °C | 95 °C |
| Tid | 2:00 | 10:00 | 0:15 | 1:00 | 0:15 | 1:00 | 0:15 |
| Data indsamling | Ja | Ja | |||||
| Antal cyklusser | 1x | 40x | 1x | ||||
Tabel 3: cyklusparametre for termo cycler.
- Placer 384-brønd pladen i termocycleren og start analysen.
10. analyse af qPCR-resultater med Delta-Delta CT-metoden (2-δδct)
- Analysér resultater genereret fra qPCR-reaktionen for fejl, der kan forstyrre downstream-analysen. Mange fejl vil blive markeret automatisk af systemet.
- For korrekt konstrueret primere, bør smelte kurver kun have en spids. Udelukke brønde, der indeholder en smelte kurve med mere end en spids fra yderligere analyse.
- Eksportér CT-værdierne til et regnearksprogram for at analysere dataene ved hjælp af ΔΔCt-metoden. Der findes et foreslået format (tabel 4). Den sidste kolonne er prøvens ændring af fold udtrykket i forhold til kontrolprøverne.
| Rengørings-gen (Gapdh) | Gen af interesse (IL6) | ||||||||||
| CT1 | CT2 | Ave CT | CT1 | CT2 | Ave CT | ΔCt | Ave ΔCt ctrls | ΔΔCt | 2 ^-(ΔΔCt) | GEOMIDDELVÆRDI | |
| Control 1 | 15,33 | 15,37 | 15,35 | 26,81 | 26,91 | 26,86 | 11,51 | 10,51 | 1,00 | 0,50 | 1,00 |
| Control 2 | 16,83 | 16,77 | 16,80 | 26,89 | 26,92 | 26,91 | 10,11 | 10,51 | -0,41 | 1,33 | |
| Control 3 | 17,56 | 17,53 | 17,54 | 27,38 | 27,56 | 27,47 | 9,93 | 10,51 | -0,59 | 1,50 | |
| Sl1344 1 | 15,50 | 15,41 | 15,45 | 22,15 | 22,13 | 22,14 | 6,69 | 10,51 | -3,83 | 14,21 | 13,23 |
| SL1344 2 | 16,02 | 15,98 | 16,00 | 23,01 | 22,96 | 22,98 | 6,98 | 10,51 | -3,53 | 11,57 | |
| SL1344 3 | 17,27 | 17,30 | 17,28 | 23,99 | 23,98 | 23,98 | 6,70 | 10,51 | -3,82 | 14,09 | |
| SIPA sopB sopE2 1 | 15,38 | 15,41 | 15,39 | 23,31 | 23,09 | 23,20 | 7,80 | 10,51 | -2,71 | 6,56 | 7,29 |
| SIPA sopB sopE2 2 | 16,01 | 16,05 | 16,03 | 23,89 | 23,92 | 23,91 | 7,88 | 10,51 | -2,64 | 6,23 | |
| SIPA sopB sopE2 3 | 16,78 | 16,78 | 16,78 | 24,02 | 24,06 | 24,04 | 7,27 | 10,51 | -3,25 | 9,49 | |
| SIPA sopB SopE2 sopE 1 | 15,52 | 15,60 | 15,56 | 27,04 | 27,03 | 27,03 | 11,47 | 10,51 | 0,96 | 0,51 | 0,79 |
| SIPA sopB SopE2 sopE 2 | 15,56 | 15,59 | 15,57 | 26,37 | 26,42 | 26,39 | 10,82 | 10,51 | 0,31 | 0,81 | |
| SIPA sopB SopE2 sopE 3 | 15,91 | 15,92 | 15,91 | 26,24 | 26,12 | 26,18 | 10,27 | 10,51 | -0,25 | 1,19 | |
Tabel 4: format til analyse af qPCR-data.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den analyse, der er beskrevet her, fokuserer på aktivering af transkriptionsfaktoren NF-κb ved hjælp af en NF-κb-afhængig der-reporter, som er stabilt transficeret til en linje af Hela-celler. Aktiveret NF-κB omfordeler sig til kernen, hvor det binder κB bindingssteder af målgener, herunder de pro-inflammatoriske cytokiner IL6 og IL23. En generel oversigt over NF-κB aktivering er afbildet i figur 1. Den gramnegative bakterie Salmonella enterica blev typhimurium blev anvendt i dette studie som en aktivator af NF-κb og efterfølgende ekspression af IL6 (figur 2). En af de vigtigste virulensfaktorer, der kræves for patogenesen er type III Sekretions system-1 (T3SS-1), der tillader S. Typhimurium at inficere celler og inducere NF-κB aktivering. Funktionen af T3SS-1 er at levere bakterielle proteiner, kaldet efftorer, i værtscellerne. Her Effector proteiner målrette talrige cellulære signalering veje til at mægle invasion af Host epitelceller. Den NF-κB aktivering induceret af S. Typhimurium er for det meste afhængig af T3SS-1 Effector proteiner SopE, SipA, SopB og SopE218. Her blev HeLa 57A-celler inficeret med Wild type S. Typhimurium Strain SL1344 og to mutante stammer, som mangler enten tre (SIPA, SopB, SopE2) eller fire (SIPA, Sopb, SopE2, sope) Effector proteiner. Figur 2 er et repræsentativt eksperiment af NF-κb-afhængig der-aktivering(figur 2a) og IL6 -genekspression (figur 2B) i Hela 57a-celler, der er inficeret med S. Typhimurium stammer. Infektion med vildtype SL1344 stamme inducerer et stærkt der signal, som er faldet i celler inficeret med SIPA, sopb, SopE2 tredobbelt mutant (sope-afhængige respons), og reduceret til kontrolniveauer med SIPA, sopb, SopE2, sope Quadruple mutant. De relative luminescens enheder (RLU) korrelerer med IL6 ekspressions niveauerne (figur 2). Figur 3 repræsenterer de resultater, der GENERERES af rt-qPCR-analysen.
Figur 1: skematisk for aktivering af NF-κB og downstream-udlæsninger. Beskrevet ovenfor, er NF-κB bevaret i cytosol i en inaktiv tilstand af det hæmmende protein IκBα. Både interne og eksterne stimuli kan bidrage til aktivering af IKK, som fosforylerer IκBα og forårsager den efterfølgende proteosomal nedbrydning. Nedbrydning af IκBα afslører det nukleare lokaliserings signal af NF-κB, som fremmer translokation. I kernen, aktiveret NF-κB binder sig til κB bindingssteder af Target gener, fremme deres transkription og udtryk. Målgener, såsom cytokinerne IL6 og IL23, udtrykkes og kvantificeres via RT-qPCR. I Hela 57a-cellerne udtrykkes der efter aktivering af NF-κb, som kan kvantificeres via luminescens analyser. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: repræsentative data for luminescens assay og RT-qPCR-analyse efter S. Typhimurium infektion af HeLa 57A celler. 1 x 105 Hela 57a celler blev inficeret med 106 CFU (Moi = 10) af log fase S. Typhimurium Wild type SL1344 eller de mutante stammer, som mangler SipA, SopB og SopE2, og SipA, SopB, SopE2 og SopE. Efter 1 time blev medierne udskiftet, og inkubationen fortsatte i yderligere fire timer. A) cellerne blev behandlet med henblik på ekspression af der via luminescens assays. B) cellerne blev UDVUNDET af RNA, som blev anvendt til rt-qPCR-analyse. Relative ekspression af målgener ved brug af Delta-Delta CT-metoden (2-δδct) vises. Den gennemsnitlige og standardafvigelse for triplicat brønde vises. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: opsummerende resultater genereret fra rt-qPCR-analyse. A) der vises et forstærknings plot for brøndene, som forstærker gapdh fra Hela 57a-celler, der er inficeret med S. Typhimurium. (B) smelte kurve plot af brønde, der indeholder gapdh primere, viser en enkelt smelte spids svarende til ca. 84 °c. C) dublerede brønde, der indeholder primere til Il-6. En af brøndene viser en anden smelte spids, som angivet med en sort pil, og bør udelukkes fra analyse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det vigtigste bidrag af den beskrevne protokol er, at det giver en hurtig og nem metode til at detektere NF-κB aktivering i celler, som giver mulighed for høj gennemløbs analyse af flere stimulerende betingelser eller lægemidler, der påvirker NF-κB aktivering. Her beskriver vi en protokol for NF-κB aktivering i salmonella-inficerede Hela celler. Disse celler kan bruges til infektion med andre patogener samt at studere virkningen af bakteriel infektion på NF-κB aktivering. Desuden, NF-κb-afhængige der aktivering i Hela 57a celler kan bruges til at screene for aktivatorer eller hæmmere af signalering veje fører til NF-κb aktivering. Her frø vi HeLa 57A celler i 48-brønd plader, men disse eksperimenter kan skaleres op til 96-og endda 384-brønd plader for at give mulighed for flere prøver pr. eksperiment. HeLa 57A celler konstitutivt Express LacZ, som kan måles som en intern kontrol for celle nummer og levedygtighed ved hjælp af β-gal assays. Den protokol, der er beskrevet her, gælder for brug i cellelinjer, enten stabilt eller transitivt transficeret med en NF-κb:: luciferase reporter konstruere. Den rå 264.7 makrofag cellelinje er allerede blevet brugt til et sådant formål18. Det er vigtigt, at denne metode ikke skelner mellem aktivering af de forskellige homo/Heterodimere af de fem forskellige NF-κB-under enheder. De forskellige NF-κB homo-heterodimer-komplekser har forskellige tilhørsforhold til promotor-sekvenser samt forskellige transkriptionelle konsekvenser21. Det er muligt, at aktivering af en specifik NF-κB-dimer glemmes ved hjælp af den her beskrevne reporter på grund af lav affinitets binding til κB-bindings stederne fra immunglobulin κ-Chain Promoter-regionen.
Det er vigtigt at bemærke, at de betingelser, der er egnede til stimulering af en cellelinje, ikke kan anvendes direkte på en anden. Derfor anbefales det kraftigt, at Analysebetingelserne optimeres i hvert analyse system. Tid af infektion, MOI, varigheden af narkotikabehandling, Drug dosis, og såning betingelser er alle vigtige overvejelser at tage hensyn til ved vurderingen af NF-κB aktivering. For eksempel er rå 264.7 makrofager mere følsomme over for salmonella infektion, der kræver forskellige betingelser for at producere et lignende luminescens signal som set med Hela 57a celler18.
Under luminescens målinger er det ikke ualmindeligt, at kant brønde har betydeligt forskellige værdier end de andre brønde, der blev stimuleret på samme måde. Dette er typisk på grund af højere fordampning satser af kanten brønde på pladen fører til øget stof koncentration. Dette kan afhjælpes ved at tilføje serum frie medier til rummet mellem brøndene, for plader, der tillader det, ændre låg/plade kombinationer for at reducere fordampning, eller udelade kant brønde helt, hvis spørgsmål fortsætter.
Udtrykt i pattedyrceller, Firefly der har en halveringstid på flere timer og er generelt betragtes som stabile med henblik på de fleste reporter assays22. Længere behandlingsvarigheder end dem, der er beskrevet her, kan udføres pålideligt. Men det der assay system, der anvendes her, producerer et stabilt signal kun for det første minut og hurtigt forringes efter det. Derfor er det meget vigtigt, at luminescens målingen foretages hurtigt efter blanding af celle lysat og substrat.
NF-κB er en transkriptionsfaktor for en lang række gener, herunder cytokiner og kemo okiner (dvs., Il6 og Il23). Måling af NF-κB-afhængig luciferaseaktivitet betyder ikke nødvendigvis, at disse cytokiner og kemo okiner udtrykkes. Denne metode kan supplere eksisterende molekylære kvantificerings teknikker ved at tjene som en potentiel første skærm til karakterisering af betingelser, der påvirker NF-κB aktivitet, som derefter kan funktionelt valideres gennem RT-qPCR. Funktionel validering af NF-κB-aktivering kan også udføres via Western blot-analyse eller funktionelle analyser, der er specifikke for et protein af interesse i tilfælde, hvor mRNA-kvantificering muligvis ikke er hensigtsmæssig. Dette er tilfældet for interleukin-Beta (Il1b), et gen, hvis transskription er induceret af NF-κb binding, men protein produktet kræver post translationel modifikation for at danne det modne produkt23,24.
Den specifikke RNA-isolations protokol, som er beskrevet her, er ikke den eneste, der kan anvendes til brug i RT-qPCR-analysen, og andre foretrukne metoder, såsom kommercielt tilgængelige kits, kan i stedet anvendes. Det er vigtigt at bemærke, at kvaliteten af RNA er meget vigtigt for processen, og så RNA bør holdes på is så meget som muligt for at forhindre nedbrydning. Det er vigtigt at køre gentagne reaktioner i RT-qPCR-Reaktionerne for at konstatere, at PCR-reaktionerne er konsistente, da pipette ringen af sådanne små volumener ved indlæsning af 384-brønd pladen ofte kan være årsag til fejl. CT-værdierne for husholdnings genet skal være konsistente mellem prøverne, og afvigelser fra dette kan være tegn på ineffektive rengøringstrin eller uoverensstemmelser i RNA-koncentrationerne under reverse transkriptionen, som kan påvirke de endelige resultater. Det er også vigtigt at kontrollere smelte kurven efter hvert qPCR-eksperiment. Tilstedeværelsen af en top tyder på, at qPCR primere forstærker et enkelt gen. Flere kurver tyder på, at der er off-Target gen amplifikation eller tilstedeværelsen af primer dimers. I begge tilfælde tyder flere toppe i smelte kurven på, at primere skal redesignet for at sikre specificitet. Med så meget plads til variation, motion og raffinement af god teknik på hvert trin er afgørende for at generere nøjagtige og reproducerbare resultater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forskning i Keestra-Gounder Lab er støttet af tilskud fra NIAID af NIH under Award nummer R21AI122092 og fra American diabetes Association underpris nummer 1-18-JDF-035.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adhesive film | VWR International | 60941-070 | |
| Chloroform | Fisher Bioreagents | C298-500 | |
| DMEM | Thermo Fisher | 11665092 | |
| DNAse treatment kit | Qiagen | 79254 | |
| dNTPs | Promega | U1511 | |
| Ethanol | Fisher Bioreagents | BP2818100 | molecular grade |
| FBS | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| HeLa 57A cells | Ref # 15 | ||
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368814 | |
| Isopropanol | Fisher Bioreagents | BP26181 | |
| Kanamycin | Fisher Bioreagents | BP906-5 | |
| LB agar | Fisher Bioreagents | BP1425-500 | |
| Lysogeny broth | Fisher Bioreagents | BP1426-500 | |
| MgCl2 | Fisher Chemical | ||
| NanoDrop ND-1000 | Thermo Scientific | spectrophotometer | |
| Promega luciferase assay system | Promega | E1501 | Cell lysis buffer & luciferin substrate |
| Random Hexamers | Thermo Scientific | SO142 | |
| Real-time GAPDH forward primer | 5'-CCAGGAAATGAGCTTGAC AAAGT-3' |
||
| Real-time GAPDH reverse primer | 5-'CCCACTCCTCCACCT TTGAC-3' |
||
| Real-time IL-23 forward primer | 5-'GAGCCTTCTCTGCTCCC TGAT-3' |
||
| Real-time IL-23 reverse primer | 5'-AGTTGGCTGAGGCCCAGTAG-3' | ||
| Real-time IL-6 forward primer | 5'-GTAGCCGCCCCACACAGA-3' | ||
| Real-time IL-6 reverse primer | 5'-CATGTCTCCTTTCTCAGG GCTG-3' |
||
| Reverse Transcriptase | Applied Biosystems | 4308228 | |
| RNAse inhibitor | Thermo Scientific | EO0381 | |
| RT buffer | Promega | A3561 | |
| SL1344 | Ref # 17 | ||
| SL1344 ΔsipA sopB::MudJ sopE2::pSB1039 | Ref # 18 | ||
| SL1344 ΔsopE ΔsipA sopB::MudJ sopE2::pSB1039 | Ref # 18 | ||
| SYBR green | Applied Biosystems | 4309155 | 2x mastermix |
| Tri-reagent | Molecular Research Center | TR 118 | guanidine thiocyanate |
| Trypsin -EDTA | Thermo Fisher | 25300054 | 0.05% Trypsin-EDTA |
| Ultrapure water | Fisher Bioreagents | BP248450 | |
| Well plate for PCR | VWR International | 89218-294 | 384-well plate |
References
- Liu, T., Zhang, L., Joo, D., Sun, S. C. NF-kappaB signaling in inflammation. Signal Transduction and Targeted Therapy. 2, (2017).
- Piva, R., Belardo, G., Santoro, M. G. NF-kappaB: a stress-regulated switch for cell survival. Antioxidants & Redox Signaling. 8 (3-4), 478-486 (2006).
- Lawrence, T. The nuclear factor NF-kappaB pathway in inflammation. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (6), a001651 (2009).
- Hargett, D., Rice, S., Bachenheimer, S. L. Herpes simplex virus type 1 ICP27-dependent activation of NF-kappaB. Journal of Virology. 80 (21), 10565-10578 (2006).
- Zaragoza, C., et al. Viral protease cleavage of inhibitor of kappaBalpha triggers host cell apoptosis. Proceedings of the National Academy of Sciences United States of America. 103 (50), 19051-19056 (2006).
- Gao, X., et al. Bacterial effector binding to ribosomal protein s3 subverts NF-kappaB function. PLOS Pathogens. 5 (12), e1000708 (2009).
- Kravchenko, V. V., et al. Modulation of gene expression via disruption of NF-kappaB signaling by a bacterial small molecule. Science. 321 (5886), 259-263 (2008).
- Kawai, T., Akira, S. Signaling to NF-kappaB by Toll-like receptors. Trends in Molecular Medicine. 13 (11), 460-469 (2007).
- Pinaud, L., Sansonetti, P. J., Phalipon, A. Host Cell Targeting by Enteropathogenic Bacteria T3SS Effectors. Trends in Microbiology. 26 (4), 266-283 (2018).
- Karin, M. How NF-kappaB is activated: the role of the IkappaB kinase (IKK) complex. Oncogene. , (1999).
- Berti, R., et al. Quantitative real-time RT-PCR analysis of inflammatory gene expression associated with ischemia-reperfusion brain injury. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 22 (9), 1068-1079 (2002).
- Fried, M., Crothers, D. M. Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Research. 9 (23), 6505-6525 (1981).
- Holden, N. S., Tacon, C. E. Principles and problems of the electrophoretic mobility shift assay. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 63 (1), 7-14 (2011).
- Renard, P., et al. Development of a sensitive multi-well colorimetric assay for active NFkappaB. Nucleic Acids Research. 29 (4), E21 (2001).
- Nowak, D. E., Tian, B., Brasier, A. R. Two-step cross-linking method for identification of NF-kappaB gene network by chromatin immunoprecipitation. Biotechniques. 39 (5), 715-725 (2005).
- Ernst, O., Vayttaden, S. J., Fraser, I. D. C. Measurement of NF-kappaB Activation in TLR-Activated Macrophages. Methods in Molecular Biology. 1714, 67-78 (2018).
- Rodriguez, M. S., Thompson, J., Hay, R. T., Dargemont, C. Nuclear retention of IkappaBalpha protects it from signal-induced degradation and inhibits nuclear factor kappaB transcriptional activation. Journal of Biological Chemistry. 274 (13), 9108-9115 (1999).
- Mendez, J. M., Kolora, L. D., Lemon, J. S., Dupree, S. L., Keestra-Gounder, A. M. Activation of the endoplasmic reticulum stress response impacts the NOD1 signaling pathway. Infection and Immunity. , (2019).
- Hoiseth, S. K., Stocker, B. A. D. Aromatic-Dependent Salmonella-Typhimurium Are Non-Virulent and Effective as Live Vaccines. Nature. 291 (5812), 238-239 (1981).
- Keestra, A. M., et al. Manipulation of small Rho GTPases is a pathogen-induced process detected by NOD1. Nature. 496 (7444), 233-237 (2013).
- Wong, D., et al. Extensive characterization of NF-kappaB binding uncovers non-canonical motifs and advances the interpretation of genetic functional traits. Genome Biology. 12 (7), R70 (2011).
- Gupta, R., et al. Firefly luciferase mutants as sensors of proteome stress. Nature Methods. 8 (10), 879-884 (2011).
- Cogswell, J. P., et al. NF-kappa B regulates IL-1 beta transcription through a consensus NF-kappa B binding site and a nonconsensus CRE-like site. Journal of Immunology. 153 (2), 712-723 (1994).
- Thornberry, N. A., et al. A Novel Heterodimeric Cysteine Protease Is Required for Interleukin-1-Beta Processing in Monocytes. Nature. 356 (6372), 768-774 (1992).
