NF-κB-afhankelijke Luciferase activering en kwantificering van genexpressie in met salmonella geïnfecteerde weefselkweek cellen

Summary

Hier presenteren we een protocol om snel en gemakkelijk te meten nucleaire factor Kappa-Light-Chain-Enhancer van geactiveerde B-cellen (NF-κB) activering in cellijnen die NF-κB:: Luciferase reporter constructies, via metingen van luminescentie in de cel lysaat. Bovendien wordt genexpressie bepaald via RT-qPCR geïsoleerd uit cellen die besmet zijn met salmonella typhimurium.

Abstract

De dimeer transcriptiefactor NF-κb regelt veel cellulaire respons trajecten, waaronder ontstekings trajecten door het induceren van de expressie van verschillende cytokinen en chemokines. NF-κB is grondwettelijk uitgedrukt en wordt in de cytosol door de remmende proteïne-nucleaire factor van Kappa Light polypeptide Gene Enhancer in B-cellen remmer, Alfa (IκBα) gesequereerd. Activering van NF-κB vereist de afbraak van IκBα, die vervolgens een nucleair lokalisatie signaal op NF-κB blootstelt en zijn handel in de Nucleus bevordert. Eenmaal in de Nucleus bindt NF-κB aan de promotor regio van NF-κB doel genen zoals Interleukine 6 (IL-6) en IL-23, om hun expressie te promoten.

De activering van NF-κB vindt plaats onafhankelijk van transcriptie of vertaling. Daarom moet de activeringsstatus van NF-κB worden gemeten door de NF-κB specifiek in de Nucleus te kwantificeren, of door de expressie van NF-κB-doel genen te kwantificeren. In dit protocol worden cellen stabiel met een NF-κB:: Luciferase reporter construct geassageerd voor NF-κB-activering met behulp van in vitro weefselkweek technieken. Deze cellen zijn geïnfecteerd met salmonella typhimurium om NF-κb te activeren, die naar de Nucleus tradt en zich bindt aan de κb-sites in de Promoter regio van Luciferase, waardoor de uitdrukking ervan wordt induceren. Cellen zijn gelyseerd en geanalyseerd met het plaats-testsysteem. De hoeveelheid plaats geproduceerd door de cellen correleert met de intensiteit van het luminescentie signaal, die wordt gedetecteerd door een plaat lezer. Het luminescentie signaal dat door deze procedure wordt gegenereerd, biedt een snelle en zeer gevoelige methode om de activering van NF-κB onder een reeks voorwaarden te beoordelen. Dit protocol maakt ook gebruik van kwantitatieve reverse transcriptie PCR (RT-qPCR) om relatieve mRNA-niveaus te detecteren die indicatief zijn voor genexpressie.

Introduction

De nucleaire factor-κB (NF-κB) familie van eiwitten zijn belangrijke transcriptie Activators die de genexpressie in verschillende biologische trajecten reguleren. Activering van NF-κb induceert transcriptie van doel genen, waarvan vele belangrijk zijn voor immuun-en ontstekingsreacties, celproliferatie, stress reacties en progressie van kanker^1,2. NF-κB speelt een integrale rol in het bemedieren van vroege inflammatoire uitkomsten voor pathogeen klaring. Gezien de vele biologische processen bemiddeld door NF-κB activering, verstoringen in de signalering kunnen ernstige gevolgen hebben voor de gezondheid en ziekte. Verlies van functie mutaties in NF-κB-signalering zijn geassocieerd met verschillende immuundeficiëntie fenotypes, terwijl de winst van functie mutaties gepaard gaat met verschillende soorten kankers, waaronder B-cell lymfoomen en borstkanker³. Bovendien is gebleken dat veel pathogenen de activeringsstatus van NF-κb direct moduleren door expressie van virulentie factoren^4,5,6,7.

Activering van NF-κB is bekend als een gevolg van vele variabele stimuli, waaronder bacteriële producten zoals lipopolysacchariden (LPS), flagellin en peptidoglycans bekend als pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen (PAMPs). Deze PAMPs worden gedetecteerd door patroonherkenning receptoren (PRRs) zoals de tolplichtige receptoren (TLRs) en NOD-achtige receptoren (NLRs) leidt tot de activering van NF-κB en de daaropvolgende uitdrukking van een array van NF-κB-afhankelijke inflammatoire genen⁸. Naast PRR activering door PAMPs, andere bacteriële producten, zoals bacteriële Effector eiwitten, kan de activering van NF-κB induceren. Interessant, bacteriën ook uitdrukken Effector eiwitten die actief het NF-κB-traject te verzachten en hun pathogeniteit te verbeteren, onderstrepen het belang van NF-κB als een essentiële bemiddelaar van immuniteit⁹.

Er zijn vijf verschillende subeenheden die de NF-κB dimers vormen; P50, P52, RelA (p65), RelB en cRel. De twee belangrijkste NF-κB heterodimers zijn de P50: RelA en de P52: RelB dimers. De geactiveerde NF-κb Dimeren binden aan DNA-sites, bekend als κb-sites, in de organisator en versterker regio's van verschillende doel genen. Onder normale homeostatische omstandigheden communiceert NF-κB met een familie van remmer-eiwitten die bekend staan als IκB-eiwitten om inactief te blijven. Bij stimulatie wordt IκB gefosforyleerd door IκB kinase (IKK), waardoor het doelwit kan worden van alomtegenwoordige installaties en vervolgens afbraak. Afbraak van IκB activeert NF-κB door een nucleair lokalisatie signaal te onthullen. NF-κB gaat vervolgens naar de Nucleus, waar het κB-sites bindt in de Promoter regio van doel genen en transcriptie¹⁰bevordert. Dus, activering van NF-κB upregulates mRNA expressie van NF-κB doel genen, en deze verandering kan worden gemeten door middel van RNA kwantificerings testen zoals RT-qPCR¹¹.

Er bestaan verschillende methoden en worden vaak gebruikt voor de meting van NF-κB-activering, waaronder elektroforetisch mobiliteits verschuiving-assays (EMSA), nucleaire translocatie en genreporter-assays. EMSA wordt gebruikt om eiwitcomplexen met nucleïnezuren op te sporen. De gestimuleerde cellen worden gefractioneerd om nucleaire eiwitten te isoleren, waaronder de translocatie NF-κb, die vervolgens wordt geïntrigeerd met van-nucleotiden die het NF-κb-bindings domein bevatten. De monsters worden uitgevoerd op een gel en afbeelding gemaakt door autoradiografie van ³²P-gelabelde nucleïnezuur. Als NF-κB aanwezig is in de eiwitfractie, zal het de nucleotiden binden, die langzamer door de gel zullen migreren en als discrete bands presenteren. Kern fracties van cellen die niet zijn geactiveerd NF-κB (bijv. ongestimuleerde controle cellen) produceren geen banden als de nucleotiden sneller migreren naar het einde van de gel. Een groot nadeel van deze methode is dat het grotendeels kwantitatief is in de binaire zin (d.w.z., aan of uit) en onvoldoende zinvolle verschillen vastlegt in de NF-κB-bindingscapaciteit. Bovendien beschouwt deze methode geen chromatine structuren die functioneel belangrijk zijn voor NF-κb doel genen^12,13.

Net als bij de vorige methode is er een "non-Shift"-test waarbij multi-well-platen zijn bekleed met nucleotiden die de NF-κB-bindingsvolgorde bevatten. Na behandeling van cellen met kern fracties van eiwitten, zal NF-κB binden aan de nucleotiden gebonden aan de put. Anti-NF-κB antilichamen worden vervolgens toegevoegd, die zal interageren met de gebonden NF-κB en produceren een colorimetrische signaal evenredig aan de hoeveelheid NF-κB, met vermelding van de mate van NF-κB activering. Deze methode is gunstig ten opzichte van het EMSA, omdat het geen radiofiele nucleïnezuren vereist en in vergelijking daarmee kwantitatief is. Echter, een nadeel van deze methode is dat het opnieuw geen onderscheid maakt tussen chromatine toestanden van NF-κB doel genen¹⁴.

Een andere methode waarmee NF-κB-activering kan worden gedetecteerd, is door Chromatine-immunoprecipitatie (ChIP), waarbij DNA en interactie eiwitten kruislings worden gekoppeld met formaldehyde en immunoprecipitated met specifieke anti-NF-κB-antilichamen. De specifieke nucleotide-fragmenten worden vervolgens gezuiverd en geïdentificeerd door middel van PCR-versterking of directe hoge doorvoer volgorde. Resultaten gegenereerd op basis van deze methode bieden semi-kwantitatieve resultaten van NF-κB bindende activiteit met doel genen. De resultaten zijn echter sterk afhankelijk van de fixatie condities en zuiveringsprocessen bij elke stap¹⁵.

In nucleaire translocatie testen, cellen worden gestimuleerd voor het opwekken van NF-κB activering en vervolgens vast. Anti-p65 antilichamen worden toegevoegd aan vaste cellen. Als alternatief kan de p65-subeenheid zelf worden getagd met een fluorescerende peptide zoals Green Fluorescent Green (GFP). In beide gevallen zal immunofluorescentie Imaging van de lokalisatie van p65 toestaan om de cellulaire distributie te bepalen. Door het meten van het aandeel cytosolische en nucleaire gelokaliseerde eiwitten kunnen onderzoekers de relatieve activeringsstatus van NF-κB bepalen. Een nadeel van deze methode is dat de immunofluorescentie relatief tijdrovend is, dure antilichamen vereist en een relatief grotere technische expertise nodig heeft¹⁶.

Reporter genen zijn veelgebruikte tools om de regulatoire en expressie patronen van een gen van belang te bestuderen. Typisch, reporter genen zijn opgebouwd uit de organisator sequentie van een gen van belang gesmolten tot een gen coderen voor een gemakkelijk detecteerbaar eiwit. Eiwitten met enzymatische activiteiten, fluorescentie of luminescentie eigenschappen worden vaak gekozen voor hun vermogen om te worden getest en gekwantificeerd. Zo dient de read-out (bijvoorbeeld luminescentie, fluorescentie) als een signaal voor de detectie van de genexpressie. Deze reporter constructies kunnen vervolgens worden geïntroduceerd in verschillende celtypen, zoals epitheelcellen of macrofagen.

Beschreven in het protocol is het gebruik van een gekloonde Hela-cellijn (Hela 57a) die stabiel is getransfeerd met een plaats-reporter met drie kopieën van de κb-consensus van de immunoglobuline κ-Chain Promoter Region¹⁷. Expressie van plaats is afhankelijk van de activering van NF-κb, die optreedt na celstimulatie. Gestimuleerd cellen zijn gemakkelijk gelyseerd met behulp van cellysisbuffer in de plaats-assay kit. Een deel van de cel lysaat wordt vervolgens gemengd met plaats assay buffer die luciferin bevat. Luciferin is het substraat van plaats en is vereist voor het opwekken van licht in de aanwezigheid van plaats. Na het combineren van de assay buffer met het lysaat, zal de oplossing licht uitstralen in een proces dat bekend staat als luminescentie. De hoeveelheid licht geproduceerd, gegeven in lumen, is evenredig aan de hoeveelheid plaats aanwezig zijn in het lysaat en dient als een maatstaf van NF-κb activering. De lumen metingen worden geïnterpreteerd in vergelijking met een niet-gestimuleerde standaard om rekening te houden met de baseline NF-κB-activiteit en het signaal zelf is gedurende enkele minuten stabiel om een betrouwbare meting mogelijk te maken. Daarnaast is de HeLa 57A cellijn stabiel getransfunteerd met een NF-κB-onafhankelijke β-galactosidase Reporter. De β-galactosidase Reporter wordt grondwettelijk uitgedrukt en β-galactosidase-activiteit kan worden gemeten om de levensvatbaarheid van de cel of de variatie in celaantallen¹⁷te controleren. De plaats-waarden kunnen vervolgens worden aangepast aan de β-galactosidase-waarden en worden gerapporteerd als vouw verhoging over de niet-gestimuleerde controle cellen.

Aangezien NF-κB een transcriptiefactor is die verantwoordelijk is voor de toegenomen expressie van NF-κB-afhankelijke doel genen, is een follow-up experiment om te controleren op NF-κB-afhankelijke verhoogde genexpressie een kwantitatieve omgekeerde transcriptie polymerase-kettingreactie ( RT-qPCR). RT-qPCR is een zeer gevoelige methode waarmee veranderingen in de genexpressie kunnen worden gekwantificeerd over verschillende ordes van grootte. Gestimuleerd en controle cellen worden geoogst voor RNA via fenol-chloroform extractie. Na fasescheiding wordt RNA geëxtraheerd als de belangrijkste component van de waterige laag. RNA wordt vervolgens neergeprecipiteerd en gewassen om een zuivere pellet te produceren. Deze pellet wordt vervolgens gereconstitueerd en verder gereinigd van verontreiniging DNA via DNase behandeling. Het zuivere RNA wordt dan omgekeerd getranscribeerd om aanvullend DNA (cDNA) te creëren. Deze cDNA kan vervolgens worden geanalyseerd via kwantitatieve PCR-technieken, waarbij de overvloed van een specifieke mRNA-sequentie wordt gekwantificeerd om de genexpressie te bepalen. Deze techniek geeft geen duidelijkheid over translationele controle, post translationele modificatie, eiwit overvloed of eiwit activiteit. Echter, veel genen, met name degenen die betrokken zijn bij pro-inflammatoire processen, worden gereguleerd via NF-κB en hun mRNA overvloed is indicatief voor hun uitdrukking.

De voorgestelde methode maakt gebruik van een snelle en eenvoudige manier waarop NF-κB activering kan worden gedetecteerd via luminescentie assays van cellulair lysaat. RT-qPCR van NF-κB target genexpressie kan worden gebruikt om de expressie van bepaalde genen te kwantificeren en om functionele activiteit van NF-κB-activering te valideren. De grote voordelen van een dergelijk systeem zijn de eenvoud en snelheid, die zorgt voor een hoge doorvoer screening van een scala aan voorwaarden die NF-κB activering moduleren. Dit protocol is geschikt voor andere cellijnen die een NF-κB:: Luciferase Reporter, en is aangetoond in stabiel getransformuteerd RAW 264.7 Cells¹⁸. De hoeveelheid tijd die nodig is om monsters te verwerken, beginnend met cellysis om een luminescentie signaal te genereren, is minimaal en duurt ongeveer een uur. Meting van NF-κB vereist alleen basis laboratoriumapparatuur zoals ondoorzichtige platen, een plaat lezer die luminescentie kan meten en eenvoudige gegevensanalyse software zoals een spreadsheetprogramma.

Protocol

1. celpassaging en seeding

1. Houd HeLa 57A cellen in een kolf van 75 cm² met 10 ml van dulbecco's gemodificeerde eagle's media (DMEM) aangevuld met 5% warmte geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS) bij 37 °c in een incubator van 5% Co₂ .
2. Aspirate celkweek media en wassen met 1 mL 0,05% trypsine-EDTA-oplossing. Aspirate trypsine en vervang met een extra 1 mL. Plaats de kolf in een incubator van 37 °C voor 4-5 min om cellen los te maken van de kolf.
3. Voeg 9 mL celkweek media toe en was de bodem van de kolf een paar keer zachtjes om cellen te vervormen en een homogene suspensie.
4. Verdun HeLa 57A cellen 1:6 of 1:8 in verse media en zaaizaad in nieuwe kolven. Doorgang cellen wanneer ze 90% Confluent Health of om de drie dagen en onderhouden van cellen met een minimum van 25% confluency.
5. Een dag vóór celstimulatie, trypsinize HeLa 57A cellen en opschorten in 10 mL van de groeimedia. Tel cellen in suspensie met behulp van een hemocytometer en gebruik groeimedia om cellen te verdunnen tot een uiteindelijke concentratie van 2,5 x 10⁵ cellen/ml in een conische buis van 50 ml.
6. Breng 250 μL celsuspensie (~ 6,25 x 10⁴ cellen) over naar elke put van een 48-well plaat. Regelmatig dop en draai de conische buis om een homogene celsuspensie te garanderen. Tik de plaat zachtjes aan de zijkant om ervoor te zorgen dat de cellen gelijkmatig verdelen in de putjes.
7. Breng de plaat over naar 37 °C in een incubator van 5% CO₂ en laat de cellen 's nachts hechten en groeien.

2. bereiding van bacteriën

1. Twee dagen voor de infectie, streep bevroren voorraden salmonella op lb agar platen om enkele kolonies te produceren. Breng de platen over naar een incubator die is ingesteld op 37 °C en sta groei in de nacht toe.
2. Voeg een dag voor de infectie 3 mL lysogeny Bouillon (LB) toe aan steriele bacteriële kweek buizen, waarbij de juiste antibiotica aan de media worden toegevoegd.
3. Gebruik een steriele inoculatie-lus en kies één kolonie van gestreept bacteriële culturen en raak de lus aan de LB-media aan. Dop de buizen na het inoculeren en gooi de lus weg.
4. Plaats de buisjes in een schud incubator ingesteld op 37 °C, 180 rpm en laat ze 's nachts groeien.
5. Op de dag van de infectie, te halen nachtelijke bacteriële culturen uit de incubator.
6. Bereid buizen voor subcultuur door toe te voegen 3 mL verse LB, met antibiotica indien nodig.
7. Breng 30 μL van de nachtelijke bacteriecultuur (1 in 100 verdunning) over naar de vers bereide media. Plaats de buisjes in een schud incubator ingesteld op 37 °C gedurende 3 uur.
8. Breng na de incubatie van 3 uur 1 mL steriele LB Bouillon in een plastic Cuvette om als blanco te dienen. Breng 900 μL LB over in de andere cuvetten die voor de monsteranalyse moeten worden gebruikt.
9. Breng 100 μL bacteriële subcultuur over in een Cuvette met 900 μL LB en Pipetteer meerdere malen omhoog en omlaag om te mengen. Herhaal dit voor elke bacteriële suspensie.
10. Zet de spectrofotometer aan om de extinctie (OD) van de bacteriële culturen te meten met een golflengte van 600 nm (OD₆₀₀).
11. Plaats de blanco in de spectrofotometer. Neem nota van de oriëntatie, omdat er een markering moet zijn naar de top die aangeeft.
12. Sluit het deksel en druk op de Blanco -knop op de spectrofotometer om de achtergrond absorptie te krijgen.
13. Vervang de lege Cuvette met een monster Cuvette in dezelfde richting en druk op lezen.
14. Noteer de OD₆₀₀ -waarden van deze samples. Vermenigvuldig de waarde met 10 om rekening te kunnen maken met de verdunningsfactor.
15. Verdun de bacteriële subcultuur met verse LB om een absorptiewaarde van ongeveer 1,0 te bereiken, die ongeveer overeenkomt met 1 x 10⁹ kve/ml. Verdun deze suspensie 1:10 in een kuvette en meet de extinctie — wat een waarde van ~ 0,1 moet geven.
16. Voeg in een nieuwe buis een geschikt volume van de verdunde subcultuur toe aan Fresh LB om een suspensie van 1 x 10⁸ CFU/ml te bereiken die als entmateriaal moet worden gebruikt.
17. Bereid seriële verdunningen van het entmateriaal uit door 50 μL bacteriële suspensie over te brengen naar een buisje met 450 μL steriele PBS (10-voudige verdunning) totdat een uiteindelijke verdunning van ongeveer 10² kve/ml wordt gemaakt.
18. Breng 100 μL van de twee laagste verdunningen (10² en 10³ overeenkomend met respectievelijk 10 en 100 kolonie vormende eenheden) over in een lb agar-plaat en verdeel de suspensie met een celstrooier om enkele kolonies te verkrijgen. Breng deze platen over naar een incubator van 37 °C en incuberen 's nachts.
19. De volgende dag telt de kolonies en berekent de bacteriële concentratie van het initiële entmateriaal om de werkelijke entmateriaal concentratie te bepalen.

3. infectie van cellen

Notes: op dit punt moeten de cellen ongeveer 90% confluency zijn. Voor HeLa 57A cellen in een 48-goed plaat, dit is ongeveer 1 x 10⁵ cellen per put. Cellen zullen worden geïnfecteerd met multipliciteit van infectie (MOI) van 10, of 10⁶ kve/goed.

1. Label de deksel van de plaat volgens de infectie condities die voor elk goed zullen worden gebruikt, waarbij elke aandoening in drievat wordt gedaan.
2. Voeg 10 μL van het entmateriaal toe aan de juiste putjes. Voeg 10 μL steriele LB aan niet-geïnfecteerde controle putten toe.
3. Om de tijd van de infectie te synchroniseren, plaatst u de plaat in een tafelblad centrifuge en spin op 500 x g gedurende 5 minuten, zodat de plaat evenwichtig is.
4. Breng geïnfecteerde cellen over naar een incubator van 5% CO₂ bij 37 °c gedurende 1 uur.
5. Plaats een hoeveelheid celkweek media in een waterbad van 37 °C voor gebruik in de volgende stap.
6. Een uur na de infectie, verwijder celkweek media uit waterbad en veeg de buitenkant af met 70% ethanol. Transfer weefselkweek plaat naar bioveiligheid Cabinet.
7. Gebruik steriele techniek, aspiraat media uit putten en vervang met 250 μL van verse, warme celkweek media.
8. Retour platen naar de 5% CO₂ incubator bij 37 °c voor 4 uur extra.
9. Verwijder platen uit CO₂ incubator en aspireren de media uit de putten. Voor plaats-analyse gaat u verder met stap 4,1. Voor RNA-isolatie gaat u verder met stap 5,1.

4. Luciferase-analyse

1. Voeg 100 μL 1x celllysisbuffer toe aan de putjes. De buffer moet mogelijk eerst worden verdund tot een werkconcentratie, afhankelijk van het reagens.
2. Breng de plaat over in een vriezer van 80 °C en inbroed gedurende ten minste 30 minuten om een efficiënte cellyse te waarborgen.
3. Plaats de plaat met bevroren cellysaat op een bank om te ontdooien en bereid plaats substraat reagentia volgens de aanbevelingen van de fabrikant.
4. Laat plaats substraat reagentia op kamertemperatuur gaan.
5. Zet de plaat lezer aan en open het bijbehorende lezer programma. Stel de machine in op meting van de luminescentie.
6. Breng 10 μL van elk monster over in een put van een ondoorzichtige 96-goed plaat.
7. Voeg aan elk goed van de ondoorzichtige plaat 50 μL van de Luciferase-test reagens toe met behulp van een meerkanaalspipet.
8. Tik zachtjes op de plaat aan de zijkant om putten te mengen en zorg ervoor dat het bodemoppervlak bedekt is met vloeistof. Plaats de plaat in een plaat lezer en begin met lezen.
9. Kopieer de luminescentie waarden naar een spreadsheetprogramma en plot de resultaten.

5. RNA-isolatie

1. Voeg 500 μL guanidium thiocyanaat toe aan elk goed en Pipetteer meerdere malen omhoog en omlaag om volledige lysis te garanderen.
2. Breng de inhoud over naar een gelabelde micro centrifugebuis. Houd zo veel mogelijk monsters op ijs om de RNA-kwaliteit te behouden.
3. Zet een tafelblad centrifuge op 4 °C en onderhoud de centrifuge bij deze temperatuur voor de rest van het protocol.
4. Voeg aan elke monsterbuis 100 μL chloroform, dop strak, en schud gedurende 15 s. Incubate bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
5. Centrifugeer bij 12.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °c. Gedurende deze tijd, voor te bereiden op de volgende stap van RNA zuivering door het labelen van nieuwe buizen.
6. Breng de bovenste waterige fase over naar de nieuwe buis met 250 μL isopropanol, en zorg ervoor dat de middelste of onderste lagen niet worden verstoord.
7. Bewaar ongebruikt product in een vriezer van 80 °C, die ook kan worden gebruikt voor eiwitanalyse. De residuele waterige laag kan ook dienen als een back-up als RNA later nodig is.
8. Vortex het mengsel van waterige laag en isopropanol en laat monsters om te zitten bij kamertemperatuur 10 min.
9. Centrifugeer de monsters bij 12.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °c.
10. Verwijder buisjes van centrifuge. RNA precipitaat vormt een witte pellet aan de zijkant en onderkant van de buis. Open de buizen en verwijder voorzichtig de supernatant door in een afvalbak te gieten.
11. Was de RNA-pellet door 500 μL van 75% ethanol en Vortex toe te voegen.
12. Centrifugeer bij 8.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c.
13. Verwijder het supernatant door uit te gieten en de pellet opnieuw te wassen met 75% ethanol.
14. Centrifugeer bij 8.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c.
15. Gebruik een pipet met een klein volume (bijv. 10-200 μL volume), zuig zoveel mogelijk van het supernatant op, wees voorzichtig dat u geen vloeistof terugplaatst in de buis of de pellet aflost met de pipetpunt. Als de pellet wordt ontkomt, centrifugeer kort en opnieuw proberen te verwijderen supernatant.
    1. Lucht-droog de RNA-pellets. Als de pellets zichtbaar zijn voor elk monster, controleer dan periodiek (elke 5 minuten) op hen om te zien of ze van wit naar helder veranderen, wat aangeeft dat ze droog zijn. Zodra de pellets helder beginnen te draaien, voeg dan 20 μL Ultrapure toe, RNase vrij water om het RNA op te lossen.
    2. Als pellets aanvankelijk niet zichtbaar waren voor monsters, voeg dan gewoon ultrapuur water toe 5 min na het verwijderen van supernatant.
16. Om de oplosbaarheid te verhogen, geeft u de oplossing een paar keer door een pipetpunt en inbroed u gedurende 10 minuten bij 55-60 °C.

6. DNase behandeling van RNA

1. Om RNA-integriteit te behouden, bewaart u RNA-monsters op ijs, tenzij anders vermeld. Op dit moment kan de 10x DNase buffer worden verwijderd uit de vriezer en mag ontdooien op ijs.
2. Maak de spectrofotometer klaar voor monsteranalyse door alle monsteranalyse oppervlakken te reinigen met een pluisvrije doek.
3. Maak voorafgaand aan de analyse een achtergrond meting. Om dit te doen, laadt u de sensor met 1,5 μL van hetzelfde ultrapuur water dat wordt gebruikt om de RNA-pellets op te lossen. Druk op de knop leeg lezen om een achtergrond lezing te genereren.
4. Gebruik de pluisvrije doek om het laadoppervlak van het instrument te wissen. Herhaal deze stap na elke voorbeeld meting.
5. Laad 1,5 μL resuspendeerde RNA naar de monsterhouder en selecteer Lees sample. Herhaal dit totdat alle voorbeelden zijn gelezen.
6. Bereid DNase Master mix voor met een combinatie van 2,4 μL 10x DNase buffer en 1 μL DNase, per monster, in een micro centrifugebuis van 1,5 mL. Bereid de Mastermix voor twee extra volumes.
7. Meng de Master mix door de buis meerdere malen te flikken. Centrifugeer de buis kort om de inhoud aan de onderkant van de buis te verzamelen. Voeg 3,4 μL Mastermix toe aan 20 μL RNA-monster. Meng de inhoud door kort te flikken en te centrifugeren, zoals voorheen.
8. Breng de monsters gedurende 20 minuten over in een warmte blok op 37 °C. Verwijder de DNase inactivatie reagens uit de vriezer en ontdooien bij kamertemperatuur.
9. 20 minuten na het plaatsen van monsters op het warmte blok, breng de monsters over naar een buisrek geplaatst op de werkbank.
10. Draai de inhoud van het DNase inactivatie reagens zachtjes in de Vortex. Breng 2,6 μL DNase inactivatie reagens over naar de buisjes met RNA en veeg vervolgens de buizen om een homogeen mengsel te creëren.
11. Centrifugeer de monsters bij 12.000 x g gedurende 1 minuut.
12. Pipetteer de supernatant voorzichtig met een nieuwe, gelabelde buis.

7. omgekeerde transcriptie van mRNA naar cDNA

1. Bereid een Mastermix voor, afhankelijk van de hoeveelheid samples plus twee extra voor verlies door pipetteren (tabel 1). Gebruik 1 μg RNA en voeg H₂O toe aan een volume van 50 μL totaal.

Reagens	Volume (μL)	Eindconcentratie
MgCl2 (25mm)	3,5	1,75 mM
Omgekeerde transcriptie buffer (10x)	5	1x
dNTP mix (elk 10 μM)	2,5	500 nm
willekeurige hexamer (100 μM)	1,25	2,5 μM
Multiscribe reverse transcriptase (50 U/μL)	1	1 U/μL
RNase-remmer (20 U/μL)	1,25	1,25 U/μL
RNA (1 μg)		20 ng/uL
H2O	Top tot 50

Tabel 1: componenten en recept voor reverse transcriptie Master Mix.

2. Steek de monsters strak en label de PCR-buisjes aan de zijkant omdat de labels op het deksel later kunnen worden verwijderd uit het verwarmde deksel van de Thermocycler. Meng door vortexing.
3. Centrifugeer de PCR-buizen kort om monsters op de bodem van de buis te verzamelen.
4. Plaats de PCR-buisjes in een thermocycler en voer de monsters uit onder de volgende instellingen:
   25 °C gedurende 10 min, 48 °C gedurende 30 min, 95 °C gedurende 5 min, en vervolgens vasthouden bij 10 °C.
5. Transfer buisjes met nieuw gesynthetiseerd cDNA naar a-20 °C vriezer of onmiddellijk in qPCR-analyse gebruiken.

8. voorbereiding en Laadplaat voor RT-qPCR-analyse

1. Plan de installatie van de 384-well qPCR-plaat voor sample analyse voordat u begint.
2. De primers en cDNA op ijs ontdooien.
3. Bereid een hoofdmix voor (Zie tabel 2), plus ongeveer 10% extra voor verlies door pipetteren.

Reagens	Volume (μL)
10 μM F primer	1
10 μM R primer	1
Ultrapure H2O	4
2x SYBR groen	10

Tabel 2: componenten en recept voor qPCR Master Mix.

4. Vortex de Master Mix en doseer 8 μL in de putjes van de 384-well plate met behulp van een repeater pipet. Monsters worden in tweevoud geanalyseerd voor elke primer-en cDNA-monster combinatie.
5. Gebruik een P10 (of kleinere) pipet en breng 2 μL cDNA over naar dubbele putjes voor elke primer die moet worden geanalyseerd. Vervang tips na elk goed om kruisbesmetting te voorkomen.
6. Sluit de plaat af door de zelfklevende folie voorzichtig op het oppervlak te aanbrengen, zodat alle putjes bedekt zijn. Druk de film met behulp van een Seal paddle of roller om stevig te verzegelen.
7. Plaats de plaat in een centrifuge, met een lege plaat als tegenwicht. Centrifugeer de plaat gedurende 5 minuten bij 500 x g .

9. de Thermocycler uitvoeren voor qPCR-analyse

1. Schakel de computer en het real-time PCR-apparaat in.
2. Open de RT-qPCR-software en selecteer Nieuw experiment.
3. Selecteer onder het tabblad instellen de optie experiment eigenschappen, waarbij de parameters voor de uitvoering kunnen worden ingesteld.
4. Definieer de naamvan het experiment, waarmee de bestandsnaam en de instellingen voor het opslaan van de resultaten worden ingesteld.
5. Selecteer voor de instrument selectiehet momenteel verbonden instrument dat de analyse zal uitvoeren. Selecteer vergelijkende CT-uitvoeringsmethode (δδct) .
6. Selecteer Sybr groene reagentia als de FLUORESCERENDE DNA-kleurstof die moet worden gebruikt en standaard als de helling snelheid.
7. Zorg ervoor dat het vakje naast smelt curve opnemen is aangevinkt.
8. Wijs onder het tabblad definiëren doelen toe (d.w.z. de te versterkte genen) en monsters (d.w.z. experimentele omstandigheden).
9. Selecteer het tabblad toewijzen . label de putten met de juiste doelen en monsters, omdat ze overeenkomen met het laad schema van de 384-boorput.
10. Selecteer uitvoeringsmethode. Gebruik de parameters voor analyse vermeld in (tabel 3).

	Fase vasthouden		PCR-fase		Smelt curve fase
	Stap 1	Stap 2	Stap 1	Stap 2	Stap 1	Stap 2	Stap 3
Temp	50 °C	95 °C	95 °C	60 °C	95 °C	60 °C	95 °C
Tijd	2:00	10:00	0:15	1:00	0:15	1:00	0:15
Gegevensverzameling				Ja			Ja
Aantal cycli	1x		40x		1x

Tabel 3: cyclus parameters voor Thermocycler.

11. Plaats de 384-put plaat in de thermocycler en start de analyse.

10. analyse van qPCR-resultaten met de Delta-Delta CT-methode (2^-δδct)

1. Analyseer de resultaten die zijn gegenereerd op basis van de qPCR-reactie op fouten die de downstream-analyse kunnen verstoren. Veel fouten worden automatisch door het systeem gemarkeerd.
2. Voor goed geconstrueerde primers moeten de smelt curven maar één piek hebben. Sluit putten met een smelt curve uit met meer dan één piek uit verdere analyse.
3. Exporteer de CT-waarden naar een spreadsheetprogramma om de gegevens te analyseren met behulp van de methode ΔΔCt. Er wordt een voorgestelde indeling opgegeven (tabel 4). De laatste kolom is de vouw expressie wijziging van het voorbeeld ten opzichte van de besturings voorbeelden.

	Huishoudelijk gen (Gapdh)			Gen van belang (IL6)
	CT1	CT2	Ave CT	CT1	CT2	Ave CT	ΔCt	Ave ΔCt CtrlS	ΔΔCt	2 ^-(ΔΔCt)	Gem
Controle 1	15,33	15,37	15,35	26,81	26,91	26,86	11,51	10,51	1,00	0,50	1,00
Controle 2	16,83	16,77	16,80	26,89	26,92	26,91	10,11	10,51	-0,41	1,33
Controle 3	17,56	17,53	17,54	27,38	27,56	27,47	9,93	10,51	-0,59	1,50
Sl1344 1	15,50	15,41	15,45	22,15	22,13	22,14	6,69	10,51	-3,83	14,21	13,23
SL1344 2	16,02	15,98	16,00	23,01	22,96	22,98	6,98	10,51	-3,53	11,57
SL1344 3	17,27	17,30	17,28	23,99	23,98	23,98	6,70	10,51	-3,82	14,09
SIPA sopB sopE2 1	15,38	15,41	15,39	23,31	23,09	23,20	7,80	10,51	-2,71	6,56	7,29
SIPA sopB sopE2 2	16,01	16,05	16,03	23,89	23,92	23,91	7,88	10,51	-2,64	6,23
SIPA sopB sopE2 3	16,78	16,78	16,78	24,02	24,06	24,04	7,27	10,51	-3,25	9,49
SIPA sopB SopE2 sopE 1	15,52	15,60	15,56	27,04	27,03	27,03	11,47	10,51	0,96	0,51	0,79
SIPA sopB SopE2 sopE 2	15,56	15,59	15,57	26,37	26,42	26,39	10,82	10,51	0,31	0,81
SIPA sopB SopE2 sopE 3	15,91	15,92	15,91	26,24	26,12	26,18	10,27	10,51	-0,25	1,19

Tabel 4: formaat voor het analyseren van qPCR-gegevens.

Representative Results

De hier beschreven bepaling richt zich op de activering van de transcriptiefactor NF-κb met behulp van een NF-κb-afhankelijke plaats-reporter die stabiel is omgezet in een lijn van HeLa-cellen. Geactiveerde NF-κB-trans lokaliseert naar de Nucleus waar de κB-bindingsplaatsen van doel genen worden gebonden, waaronder de pro-inflammatoire cytokines IL6 en IL23. Een algemeen overzicht van NF-κB-activering wordt afgebeeld in afbeelding 1. De gram-negatieve bacterie salmonella heliobacter Serovar typhimurium werd in deze studie gebruikt als een activator van NF-κb en daaropvolgende uitdrukking van IL6 (Figuur 2). Een van de belangrijkste virulentie factoren die nodig zijn voor pathogenese is het type III secretie systeem-1 (T3SS-1) dat Skan toestaan. Typhimurium te infecteren cellen en voor het opwekken van NF-κB activering. De functie van de T3SS-1 is het leveren van bacteriële eiwitten, zogenaamde Effectors, in gastheer cellen. Hier Effector eiwitten richten op tal van cellulaire signalering trajecten te bemiddel-invasie van gastheer epitheelcellen. De NF-κB activering geïnduceerd door S. Typhimurium is meestal afhankelijk van de T3SS-1 Effector eiwitten SopE, SipA, SopB en SopE2¹⁸. Hier werden HeLa 57A cellen geïnfecteerd met het wilde type S. Typhimurium stam SL1344 en twee mutanten stammen ontbreekt ofwel drie (SIPA, sopb, SopE2) of vier (SIPA, Sopb, SopE2, sope) Effector eiwitten. Figuur 2 is een representatief experiment van NF-κb-afhankelijke plaats-activering (Figuur 2a) en IL6 -genexpressie (Figuur 2B) in Hela 57a-cellen die zijn geïnfecteerd met de S. Typhimurium stammen. Infectie met het wild type SL1344 spanning induceert een sterk plaats signaal dat is gedaald in cellen geïnfecteerd met de SIPA, sopb, SopE2 Triple Mutant (sope-afhankelijke respons), en teruggebracht tot controleniveaus met de SIPA, sopb, SopE2, sope quadruple mutant. De relatieve luminescentie units (RLU) correlaten met de IL6 uitdrukkings niveaus (Figuur 2). Figuur 3 geeft de resultaten van de Rt-qPCR-analyse aan.

Figuur 1: schematische voorstelling van NF-κB-activering en downstream-uitlezingen. Hierboven beschreven, wordt NF-κB bewaard in de cytosol in een inactieve toestand door het remmende eiwit IκBα. Zowel interne als externe stimuli kunnen bijdragen tot de activatie van IKK, die IκBα fosforyleert en de daaropvolgende proteosomale afbraak veroorzaakt. Afbraak van IκBα onthult het nucleaire lokalisatie signaal van NF-κB, dat translocatie bevordert. In de Nucleus, geactiveerde NF-κB bindt aan κB binding sites van doel genen, het bevorderen van hun transcriptie en expressie. Doel genen, zoals de cytokines IL6 en IL23, worden uitgedrukt en GEKWANTIFICEERD via Rt-qPCR. In Hela 57a cellen plaats wordt uitgedrukt na NF-κb activering, die kan worden gekwantificeerd via luminescentie assays. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 2: representatieve gegevens van luminescentie test en RT-qPCR-analyse na S. Tyhimurium infectie van HeLa 57A cellen. 1 x 10⁵ Hela 57a cellen werden geïnfecteerd met 10⁶ CFU (MOI = 10) van log fase S. Typhimurium wild type SL1344, of de Mutant stammen ontbreekt SipA, SopB en SopE2, en SipA, SopB, SopE2 en SopE. Na 1 uur werd de media vervangen en de incubatietijd duurde nog vier extra. (A) cellen werden verwerkt voor expressie van plaats via luminescentie-assays. (B) cellen werden geëxtraheerd uit RNA, dat werd gebruikt voor Rt-qPCR-analyse. Relatieve expressie van doel genen met behulp van de Delta-Delta CT-methode (2^-δδct) wordt weergegeven. De gemiddelde en standaarddeviatie van drievat putten worden getoond. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 3: overzichts resultaten gegenereerd door de Rt-qPCR-analyse. A) een versterkings plot wordt getoond voor de putten die gapdh versterken van HeLa 57a-cellen die zijn geïnfecteerd met S. Typhimurium. B) smelt curve plot van putten die gapdh-primers bevatten, toont een enkele smelt piek overeenkomend met ongeveer 84 °c. C) dubbele putjes met primers voor Il-6. Een van de putten toont een tweede smelt piek, zoals aangegeven door een zwarte pijl, en moet worden uitgesloten van analyse. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Discussion

De belangrijkste bijdrage van het beschreven protocol is dat het biedt een snelle en eenvoudige methode voor het opsporen van NF-κB activering in cellen, die zorgt voor een hoge doorvoer analyse van meerdere stimulerende voorwaarden of geneesmiddelen die de NF-κB activering beïnvloeden. Hier beschrijven we een protocol voor de NF-κB-activering in met salmonellageïnfecteerde HeLa-cellen. Deze cellen kunnen worden gebruikt voor infectie met andere pathogenen ook om te bestuderen van de impact van bacteriële infectie op NF-κB activering. Bovendien, NF-κb-afhankelijke plaats activering in Hela 57a cellen kan worden gebruikt om te schermen voor Activators of remmers van signalering trajecten leidt tot NF-κb activering. Hier, we zaad HeLa 57A cellen in 48-goed platen, maar deze experimenten kunnen worden geschaald tot 96-en zelfs 384-well platen om toe te staan voor meer monsters per experiment. HeLa 57A cellen constitutief Express LacZ, die kan worden gemeten als een interne controle voor het celnummer en de levensvatbaarheid met behulp van β-gal assays. Het hier beschreven protocol is van toepassing voor gebruik in cellijnen ofwel stabiel of transitief met een NF-κB:: Luciferase reporter construct. De RAW 264.7 macrofaag cellijn is al gebruikt voor een dergelijk doel¹⁸. Belangrijk is dat deze methode geen onderscheid maakt tussen de activering van de verschillende homo/heterodimers van de vijf verschillende NF-κB-subeenheden. De verschillende NF-κB homo-heterodimer complexen hebben verschillende affiniteiten voor de organisator sequenties, evenals verschillende transcriptionele gevolgen²¹. Het is mogelijk dat de activering van een specifieke NF-κB dimeer wordt gemist met behulp van de verslaggever hier beschreven als gevolg van lage affiniteit binding aan de κB binding sites van de immunoglobuline κ-Chain Promoter regio.

Het is belangrijk op te merken dat de voorwaarden die geschikt zijn voor het stimuleren van één cellijn niet direct toepasbaar zijn op een andere. Daarom wordt het ten zeerste aanbevolen de testcondities in elk assay-systeem te optimaliseren. Tijd van infectie, Moi, duur van medicamenteuze behandeling, drug dosis, en zaaien voorwaarden zijn alle belangrijke overwegingen om rekening te houden bij het beoordelen van NF-κb activering. RAW 264.7 macrofagen zijn bijvoorbeeld gevoeliger voor salmonella infectie die verschillende omstandigheden vereisen om een vergelijkbaar luminescentie signaal te produceren zoals gezien met Hela 57a cellen¹⁸.

Tijdens luminescentie metingen is het niet ongewoon dat de rand putten aanzienlijk verschillende waarden hebben dan de andere putjes die op dezelfde manier werden gestimuleerd. Dit is meestal te wijten aan hogere verdampingssnelheden van de rand putjes op de plaat die leiden tot een verhoogde geneesmiddelconcentratie. Dit kan worden aangepakt door het toevoegen van serum vrije media aan de ruimte tussen de putjes, voor platen die het toelaten, het veranderen van deksel/plaat combinaties om verdamping te verminderen, of laat de rand putten volledig weg als er problemen blijven bestaan.

Uitgedrukt in zoogdiercellen, Firefly plaats heeft een halfwaardetijd van enkele uren en wordt over het algemeen beschouwd als stabiel voor de doeleinden van de meeste reporter assays²². Langere behandelingsduur dan de hier beschreven kunnen betrouwbaar worden uitgevoerd. Het plaats-testsysteem dat hier wordt gebruikt, produceert echter alleen voor de eerste minuut een stabiel signaal en verslechveert daarna snel. Daarom is het zeer belangrijk dat de luminescentie maat snel wordt gemaakt na het mengen van cellysaat en substraat.

NF-κB is een transcriptiefactor voor een groot aantal genen, waaronder cytokines en chemokines (d.w.z. Il6 en Il23). Het meten van NF-κb-afhankelijke plaats-activiteit betekent niet noodzakelijkerwijs dat deze cytokines en chemokines worden uitgedrukt. Deze methode kan bestaande moleculaire kwantificerings technieken aanvullen door te dienen als een potentieel eerste scherm voor de karakterisering van aandoeningen die de NF-κB-activiteit beïnvloeden, die vervolgens functioneel kunnen worden gevalideerd via RT-qPCR. Functionele validatie van NF-κB activering kan ook worden uitgevoerd via Western Blot analyse of functionele assays specifiek voor een eiwit van belang in gevallen waar mRNA kwantificering mogelijk niet geschikt. Dit is het geval voor Interleukine-Beta (Il1b), een gen waarvan de transcriptie wordt geïnduceerd door NF-κb binding, maar het eiwit product vereist post translationele modificatie om het volwassen product^23,24te vormen.

Het specifieke RNA-isolatie protocol dat hier wordt beschreven, is niet de enige die kan worden gebruikt voor gebruik in de RT-qPCR-analyse, en andere voorkeurs methoden, zoals in de handel verkrijgbare kits, kunnen in plaats daarvan worden toegepast. Het is belangrijk op te merken dat de kwaliteit van het RNA zeer belangrijk is voor het proces en dat RNA zo veel mogelijk op ijs moet worden gehouden om afbraak te voorkomen. Het is belangrijk om in de RT-qPCR-reacties dubbele reacties uit te voeren om vast te stellen dat de PCR-reacties consistent zijn, omdat het pipetteren van dergelijke kleine volumes bij het laden van de 384-well plate vaak een fout kan veroorzaken. CT-waarden van het huishoudelijk gen moeten consistent zijn tussen monsters, en afwijkingen hiervan kunnen indicatief zijn voor inefficiënte reinigingsstappen of discrepanties in RNA-concentraties tijdens omgekeerde transcriptie die van invloed kunnen zijn op de uiteindelijke resultaten. Het is ook belangrijk om de smelt curve na elk qPCR-experiment te controleren. De aanwezigheid van één piek suggereert dat de qPCR-primers een enkel gen versterken. Meerdere curven suggereren dat er niet-doelwit gen versterking of aanwezigheid van primer dimers. In beide gevallen suggereren meerdere pieken in de smelt curve dat de primers opnieuw moeten worden ontworpen om de specificiteit te waarborgen. Met zo veel ruimte voor variabiliteit, zijn oefening en verfijning van goede techniek bij elke stap essentieel voor het genereren van nauwkeurige en reproduceerbare resultaten.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesive film	VWR International	60941-070
Chloroform	Fisher Bioreagents	C298-500
DMEM	Thermo Fisher	11665092
DNAse treatment kit	Qiagen	79254
dNTPs	Promega	U1511
Ethanol	Fisher Bioreagents	BP2818100	molecular grade
FBS	Sigma-Aldrich	F0926
HeLa 57A cells			Ref # 15
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit	Applied Biosystems	4368814
Isopropanol	Fisher Bioreagents	BP26181
Kanamycin	Fisher Bioreagents	BP906-5
LB agar	Fisher Bioreagents	BP1425-500
Lysogeny broth	Fisher Bioreagents	BP1426-500
MgCl2	Fisher Chemical
NanoDrop ND-1000	Thermo Scientific		spectrophotometer
Promega luciferase assay system	Promega	E1501	Cell lysis buffer & luciferin substrate
Random Hexamers	Thermo Scientific	SO142
Real-time GAPDH forward primer			5'-CCAGGAAATGAGCTTGAC AAAGT-3'
Real-time GAPDH reverse primer			5-'CCCACTCCTCCACCT TTGAC-3'
Real-time IL-23 forward primer			5-'GAGCCTTCTCTGCTCCC TGAT-3'
Real-time IL-23 reverse primer			5'-AGTTGGCTGAGGCCCAGTAG-3'
Real-time IL-6 forward primer			5'-GTAGCCGCCCCACACAGA-3'
Real-time IL-6 reverse primer			5'-CATGTCTCCTTTCTCAGG GCTG-3'
Reverse Transcriptase	Applied Biosystems	4308228
RNAse inhibitor	Thermo Scientific	EO0381
RT buffer	Promega	A3561
SL1344			Ref # 17
SL1344 ΔsipA sopB::MudJ sopE2::pSB1039			Ref # 18
SL1344 ΔsopE ΔsipA sopB::MudJ sopE2::pSB1039			Ref # 18
SYBR green	Applied Biosystems	4309155	2x mastermix
Tri-reagent	Molecular Research Center	TR 118	guanidine thiocyanate
Trypsin -EDTA	Thermo Fisher	25300054	0.05% Trypsin-EDTA
Ultrapure water	Fisher Bioreagents	BP248450
Well plate for PCR	VWR International	89218-294	384-well plate