Summary
Здесь мы представляем протокол для быстрого и легкого измерения ядерного фактора каппа-свет-цепной-усилитель активированных В-клеток (NF-ЗБ) активации в клеточных линиях, выражающих NF-ЗВ::luciferase репортер строит, с помощью измерений люминесценции в клеточном лисате. Кроме того, экспрессия генов определяется с помощью RT-qPCR, изолированного из клеток, инфицированных Salmonella Typhimurium.
Abstract
Димерический транскрипционный фактор NF-ЗБ регулирует многие клеточные пути реагирования, в том числе воспалительные пути, вызывая выражение различных цитокинов и хемокин. NF-ЗB является составно выражена и поглощена цитозолом ингибирующим белковым ядерным фактором усилителя полипептидного гена каппа в ингибиторе В-клеток, альфа (I-B). Активация НФ-ЗБ требует деградации ИЗБЗ, который затем выставляет сигнал ядерной локализации на NF-QB и способствует его обороту в ядро. Попав в ядро, НФ-ЗБ связывается с промоторной областью генов NF-ЗБ, таких как интерлейкин 6 (IL-6) и IL-23, чтобы способствовать их выражению.
Активация НФ-КБ происходит независимо от транскрипции или перевода. Таким образом, состояние активации NF-ЗB должно измеряться либо количественной оценкой NF-'S B конкретно в ядре, либо количественной экспрессией генов цели NF-NB. В этом протоколе клетки, зависшие с помощью NF-ЗБ::luciferase репортер асссы для активации NF-ЗБ с использованием методов культуры тканя in vitro. Эти клетки заражены Salmonella Typhimurium для активации NF-ЗВ, который прогуливается к ядру и связывается с местами ЗБ в области промотора люциферазы, вызывая его выражение. Клетки лизаны и проанализированы с помощью системы анализа люциферазы. Количество люциферазы, вырабатываемой клетками, коррелирует с интенсивностью люминесценционного сигнала, который обнаруживается считывателем пластин. Люминесценционный сигнал, генерируемый этой процедурой, обеспечивает быстрый и высокочувствительный метод оценки активации NF-ЗВ в различных условиях. Этот протокол также использует количественную обратную транскрипцию PCR (RT-qPCR) для обнаружения относительных уровней мРНК, которые свидетельствуют о экспрессии генов.
Introduction
Семейство белков, обладающие ядерным фактором-ЗБ (NF-), являются важными активаторами транскрипции, которые регулируют экспрессию генов различными биологическими путями. Активация NF-ЗB индуцирует транскрипцию генов-мишеней, многие из которых важны для иммунных и воспалительных реакций, пролиферации клеток, реакции на стресс и прогрессирование рака1,2. НФ-ЗБ играет важную роль в посредничестве ранних воспалительных исходов для очистки патогенов. Учитывая многочисленные биологические процессы, при посредничестве активации НФ-ЗБ, сбои в ее сигнализации могут иметь серьезные последствия для здоровья и болезней. Потеря функциональных мутаций в сигнализации NF-ЗБ связана с несколькими фенотипами иммунодефицита, в то время как увеличение функциональных мутаций связано с несколькими типами рака, включая В-клеточные лимфомы и ракмолочнойжелезы 3 . Кроме того, было показано, что многие патогенные микроорганизмы непосредственно модулируют состояние активации NF-Q B через выражение факторов вирулентности4,5,6,7.
Активация НФ-ЗБ, как известно, является следствием многих переменных стимулов, включая бактериальные продукты, такие как липополисахариды (LPS), флагеллин и пептидогликан, известные как патогенные молекулярные модели (PAMP). Эти PAMPs обнаруживаются рецепторами распознавания образов (PRRs), такими как платные рецепторы (TLRs) и Нод-подобные рецепторы (NLRs), что приводит к активации NF-ЗВ и последующему выражению массива NF-'B-зависимых воспалительных генов8. В дополнение к активации PRR PAMPs, другие бактериальные продукты, такие как бактериальные эффекторные белки, могут вызвать активацию NF-ЗВ. Интересно, что бактерии также выражают эффекторные белки, которые активно утихают путь NF-ЗB и повышают их патогенность, подчеркивая важность NF-ЗВ как важного посредника иммунитета9.
Есть пять различных подразделений, которые образуют Димы NF-'B; p50, p52, RelA (p65), RelB и cRel. Двумя основными гетеродимами НФ-КБ являются p50:RelA и p52:RelB dimers. Активированные димеры NF-'B связываются с участками ДНК, известными как участки ЗБ, в области промотора и усилителя различных генов-мишеней. При нормальных гомеостатических условиях, NF-ЗБ взаимодействует с семейством ингибирующих белков, известных как белки I'B, чтобы оставаться неактивными. При стимуляции, I'B фосфорилируется ИКБ Кинасе (IKK), что позволяет ему быть мишенью для повсеместности, а затем деградации. Деградация ИЗБ активирует NF-ЗБ, показывая сигнал ядерной локализации. Затем НФ-ЗБ перемещается в ядро, где связывает участки ЗБ в области промоториков генов-мишеней и способствует транскрипции10. Таким образом, активация NF-ЗB upregulates mRNA выражение NF-ЗБ целевых генов, и это изменение может быть измерено с помощью РНК количественной ассы, такие как RT-qPCR11.
Существует несколько методов, которые обычно используются для измерения активации NF-ЗВ, включая анализы смещения электрофоретической подвижности (EMSA), транслокацию ядерного оружия и анализы репортеров генов. EMSA используется для обнаружения белковых комплексов с нуклеиновыми кислотами. Стимулированные клетки фракционируются для изоляции ядерных белков, включая трансумизированный NF-NB, который затем инкубируется радиомаркированными нуклеотидами, содержащими связующий домен NF-'B. Образцы работают на геле и сображаются на авторрадиографию 32P-маркировки нуклеиновой кислоты. Если НФ-ЗБ присутствует в белковой фракции, он свяжет нуклеотиды, которые будут мигрировать медленнее через гель и будут представляться в виде дискретных полос. Ядерные фракции клеток, не обладающих активированным NF-ЗB (например, нестимулированные контрольные элементы) не будут производить полос, поскольку нуклеотиды мигрируют быстрее к концу геля. Основным недостатком этого метода является то, что он в значительной степени количественный в двоичном смысле (т.е. в выключенном или выключенном) и не отражает должным образом значимых различий в связывающей способности NF-ЗБ. Кроме того, этот метод не учитывает структуры хроматина, которые функционально важны для генов nF-ЗB12,13.
Как и в предыдущем методе, существует «несдвигающийся» асссе, в котором многоколодцные пластины покрыты нуклеотидами, содержащими связывающую последовательность NF-ЗБ. После обработки клеток ядерными фракциями белка, NF-ЗВ будет связываться с нуклеотидами, связанными с колодцем. Затем добавляются антитела против NF-'B, которые будут взаимодействовать с связанным NF-NB и производить колоритный сигнал, пропорциональный количеству NF-'B, указывая степень активации NF-'B. Этот метод является выгодным по сравнению с EMSA в том, что он не требует радиомаркировки нуклеиновые кислоты и является количественным, в сравнении. Тем не менее, предостережение этого метода является то, что он снова не различает хроматин состояния NF-ЗB целевых генов14.
Другим методом, с помощью которого может быть обнаружена активация НФ-ЗВ, является иммунопрецилатация хроматина (ЧИП), при котором ДНК и взаимодействующие белки связаны между собой формальдегидом и иммунопреципицидом с конкретными антителами анти-НФ-ЗБ. Специфические фрагменты нуклеотидов затем очищаются и идентифицируются с помощью усиления ПЦР или прямого секвенирования высокой пропускной способности. Результаты, полученные от этого метода, дают полуколичественные результаты связывающей активности NF-ЗB с генами-мишени. Тем не менее, результаты сильно зависят от условий фиксации и процессов очистки на каждом шагу15.
В ядерных транслокационных анализах клетки стимулируются, чтобы вызвать активацию NF-'B, а затем фиксироваться. Анти-p65 антитела добавляются в фиксированные клетки. Кроме того, само подразделение p65 может быть помечено флуоресцентным пептидом, таким как зеленый флуоресцентный зеленый (GFP). В любом случае, иммунофлуоресценция позволит визуализации локализации p65 для определения клеточного распределения. Измеряя долю цитосолильного и ядерного локализованного белка, исследователи могут определить относительное состояние активации NF-ЗБ. Недостатком этого метода является то, что иммунофлуоресценция сравнительно отнимает много времени, требует дорогостоящих антител и требует относительно большей технической экспертизы16.
Репортер гены обычно используются инструменты для изучения нормативных и экспрессии моделей гена интереса. Как правило, гены репортеров строятся из промоторной последовательности гена, интересующего его, слитого в кодирование генов для легко обнаруживаемого белка. Белки с ферментативной деятельностью, флуоресценцией или люминесценцией обычно выбираются для их способности анализироваться и количественно осваиваться. Таким образом, считывание (например, люминесценция, флуоресценция) служит сигналом для обнаружения экспрессии гена. Эти конструкции репортера могут быть введены в различные типы клеток, такие как эпителиальные клетки или макрофаги.
Описанным в протоколе является использование клонированной линии клеток HeLa (HeLa 57A), которая заглушается лучиферазы репортер, содержащий три копии консенсуса в области иммуноглобулина и цепи промоутера 17. Выражение люциферазы зависит от активации NF-ЗБ, которая происходит после стимуляции клеток. Стимулированные клетки легко лизаются с помощью буфера лиза клетки, предусмотренного в наборе для проверки люциферазы. Часть клеточного лизата затем смешивается с люциферазы ассеа буфер, который содержит люциферин. Люциферин является субстратом люциферазы и необходим для генерации света в присутствии люциферазы. После объединения буфера ассеса с лизатом, решение будет излучать свет в процессе, известном как люминесценция. Количество света, производимого в люменах, пропорционально количеству люциферазы, присутствующее в лисате, и служит мерой активации NF-ЗБ. Показания люмюна интерпретируются по сравнению с нестимулированным стандартом для учета исходной активности NF-ЗВ, а сам сигнал стабилен в течение нескольких минут, что позволяет обеспечить надежное измерение. Кроме того, линия клеток HeLa 57A заглушается репортером NF-qB-независимого з-галактозидаза. Репортер з-галактозидаза является constitutively выражена, и активность в й-галактозидазе может быть измерена для контроля жизнеспособности клеток или изменения в количестве клеток17. Значения люциферазы затем могут быть скорректированы с учетом значений з-галактозидаза и сообщены как увеличение раза по сравнению с нестимулированными контрольными клетками.
Поскольку NF-ЗB является транскрипционным фактором, ответственным за повышение экспрессии nF-'sB-зависимых целевых генов, последующий эксперимент по контролю за nF-'SB-зависимым повышенным экспрессией генов является количественную обратную реакцию транскрипции полимеразной цепи ( RT-qPCR). RT-qPCR является высокочувствительным методом, с помощью которого изменения в экспрессии генов могут быть количественно в течение нескольких порядков величины. Стимулированные и контрольные клетки собирают для РНК через экстракцию фенола-хлороформа. После фазового разделения РНК извлекается в качестве основного компонента ваквого слоя. РНК затем осаждается и промывается для получения чистого гранулы. Этот гранулы затем воссозданы и дальнейшего очищены от загрязняющих ДНК с помощью лечения DNase. Чистая РНК затем обратное транскрибируется для создания дополнительной ДНК (кДНК). Это cDNA может быть проанализировано с помощью количественных методов ПЦР, где обилие конкретной последовательности мРНК количественно определить экспрессию генов. Этот метод не разъясняет трансляционный контроль, пост трансляционную модификацию, изобилие белков или белковую активность. Тем не менее, многие гены, особенно те, которые участвуют в провоспалительных процессах, регулируются через NF-ЗB и их изобилие мРНК свидетельствует об их выражении.
Предложенный здесь метод использует быстрый и простой способ, с помощью которого активация NF-ЗБ может быть обнаружена с помощью люминесценционных анализов клеточного лизата. RT-qPCR экспрессии гена NF-QB может быть использован для количественной оценки экспрессии определенных генов, а также для проверки функциональной активности активации NF-ЗB. Основными преимуществами такой системы являются ее простота и скорость, что позволяет высокой пропускной состав скрининга ряда условий, которые модулируют активацию NF-ЗВ. Этот протокол подходит для других клеточных линий, выражающих NF-ЗБ::luciferase репортер, и было продемонстрировано в стабилизированных RAW264.7 клеток18. Количество времени, необходимого для обработки образцов, начиная от клеточного лиза до генерации люминесценции сигнала, является минимальным и занимает промежуток около часа. Для измерения NF-ЗБ требуется только базовое лабораторное оборудование, такое как непрозрачные пластины, считыватель пластин, способный измерять люминесценцию, и простое программное обеспечение для анализа данных, такое как программа электронных таблиц.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Перевалка и посев наячки
- Поддерживать клетки HeLa 57A в колбе 75 см2, содержащей 10 мл модифицированных носителей Орла Dulbecco (DMEM), дополненных 5% теплоинактивированной сывороткой крупного рогатого скота плода (FBS) при температуре 37 градусов по Цельсию в 5% CO2 инкубатора.
- Аспирная культура клеток и мыть с 1 мл 0,05% трипсин-EDTA раствор. Аспир трипсин и заменить дополнительными 1 мл. Поместите колбу в инкубатор 37 градусов по Цельсию в течение 4-5 минут, чтобы клетки отсоединились от колбы.
- Добавьте 9 мл носителей клеточной культуры и аккуратно промойте дно колбы несколько раз, чтобы выбить клетки и сформировать однородную подвеску.
- Разбавить клетки HeLa 57A 1:6 или 1:8 в свежих носителях и семени в новые колбы. Проход ные клетки, когда они 90% слияния или каждые три дня и поддерживать клетки на уровне не менее 25% выпуклость.
- За день до стимуляции клеток, trypsinize HeLa 57A клеток и приостановить в 10 мл роста средств массовой информации. Подсчитайте клетки в подвеске с помощью гемоцитометра и используйте средства роста для разбавления клеток до конечной концентрации 2,5 х 105 клеток/мл в конической трубке 50 мл.
- Передача 250 л клеточной суспензии (6,25 х 104 ячейки) к каждой скважине из 48-колодца пластины. Периодически крышка и перевернуть коническую трубку, чтобы обеспечить однородную суспензию клеток. Нажмите пластины осторожно на стороне, чтобы убедиться, что клетки распределяют равномерно в колодцах.
- Перенесите пластину на 37 градусов по Цельсию в инкубатор CO2 5% и дайте клеткам прикрепиться и расти на ночь.
2. Подготовка бактерий
- За два дня до заражения, полоса замороженных запасов сальмонеллы на LB агар пластин для производства отдельных колоний. Перенесите пластины в инкубатор, установленный до 37 градусов по Цельсию и дайте ночной рост.
- За день до заражения добавьте 3 мл лисогенного бульона (ЛБ) в стерильные бактериальные тюбики, добавляя соответствующие антибиотики в сми.
- Используя стерильную петлю прививки, выберите одну колонию из полосатых бактериальных культур и коснитесь петли к мультимедиа LB. Cap труб после прививки и отбросить петлю.
- Поместите трубки в встряхивая инкубатор установлен на 37 градусов по Цельсию, 180 об /мин, и позволяют расти на ночь.
- В день заражения извлекать ночные бактериальные культуры из инкубатора.
- Подготовка труб для субкультуры, добавив 3 мл свежего LB, содержащий антибиотики, когда это необходимо.
- Передача 30 зл на ночь бактериальной культуры (1 в 100 разбавления) в свежеприготовленные средства массовой информации. Поместите трубки в дрожащем инкубаторе, установленном при 37 градусах по Цельсию в течение 3 ч.
- После инкубации 3 ч, передача 1 мл стерильного бульона LB в пластиковый кювет, чтобы служить в качестве пробела. Передача 900 ЛБ в другие кюветы для использования для анализа образцов.
- Передача 100 л бактериальной субкультуры в кювет, содержащий 900 ЛБ и пипетки вверх и вниз несколько раз, чтобы смешать. Повторите это для каждой бактериальной подвески.
- Включите спектрофотометр для измерения оптической плотности (OD) бактериальных культур на длине волны 600 нм (OD600).
- Поместите пробел в спектрофотометр. Примите к сведению ориентацию, так как должна быть отметка к вершине, указывающая на такие.
- Закройте крышку и нажмите кнопку Бланк на спектрофотометр, чтобы получить фон поглощения.
- Замените пустой квет с образцом cuvette в той же ориентации и нажмите Читать.
- Запишите значения OD600 этих образцов. Умножьте значение на 10, чтобы учесть фактор разбавления.
- Разбавить бактериальную субкультуру свежим LB для достижения абсорбции значение примерно 1,0, что примерно соответствует 1 х 109 cfu/mL. Разбавить эту подвеску 1:10 в кювете и измерить абсорбцию - что должно дать значение 0,1 евро.
- В новой трубке добавьте соответствующий объем разбавленной субкультуры в свежий LB для достижения подвески 1 х 108 cfu/mL, которые будут использоваться в качестве инокулума.
- Подготовка серийных разбавлений инокулума путем передачи 50 зл бактериальной подвески в трубку, содержащую 450 л стерильных PBS (10-раз раз разбавления) до окончательного разбавления примерно 102 cfu/mL производится.
- Передача 100 зл и меньше двух самых низких разбавлений (102 и 103, соответствующих 10 и 100 колоний, образующих единицы, соответственно) на агарную пластину LB и распространение подвески с помощью распределителя клеток для получения одиночных колоний. Перенесите эти пластины в инкубатор 37 градусов и инкубировать на ночь.
- На следующий день подсчитайте колонии и вычислите бактериальную концентрацию исходного инокулума, чтобы определить фактическую концентрацию инокулума.
3. Инфекция клеток
ПРИМЕЧАНИЕ: На данный момент, клетки должны быть на уровне около 90% выпуклость. Для клеток HeLa 57A в 48-хорошо пластины, это примерно 1 х 105 клеток на хорошо. Клетки будут инфицированы множественностью инфекции (МВД) 10, или 106 cfu/well.
- Этикетка крышку пластины в соответствии с инфекцией условия, которые будут использоваться для каждого колодца, с каждым условием делается в тройной.
- Добавьте 10 зл инокулума в соответствующие скважины. Добавьте 10 л стерильных LB в неинфицированные контрольные скважины.
- Чтобы синхронизировать время заражения, поместите пластину в центрифугу столешницы и вращайтесь при 500 х г в течение 5 мин, гарантируя, что пластина сбалансирована.
- Перенесите инфицированные клетки в инкубатор CO2 на уровне 37 градусов по Цельсию в течение 1 ч.
- Поместите aliquot средств культуры клетки в ванне воды 37 qc для пользы в следующем шаге.
- Через час после инфекции, удалить средства массовой информации клеточной культуры из водяной ванны и протрите внешний вид с 70% этанола. Передача пластины культуры тканей в кабинет биобезопасности.
- Используя стерильную технику, аспирируйте носители из скважин и заменяйте 250 зл и свежими, теплыми средствами культуры клеток.
- Вернуть пластины в 5% CO2 инкубатор ат.ру при 37 градусах по Цельсию еще 4 ч.
- Удалите пластины из инкубатора CO2 и аспирировать средства массовой информации из скважин. Для люциферазы анализ продолжает шаг 4.1. Для изоляции РНК перейти к шагу 5.1.
4. Анализ Люциферазы
- Добавьте 100 зл 1x буфер акселя 1x ячейки в скважины. Буфер может быть сначала разбавлен до рабочей концентрации, в зависимости от реагента.
- Перенесите пластину в морозильную камеру -80 градусов и инкубировать в течение не менее 30 минут, чтобы обеспечить эффективный лиза клеток.
- Поместите пластину, содержащую замороженные лизаты клеток на скамейке, чтобы разморозить и подготовить люциферазы субстрат реагентов в соответствии с рекомендациями производителя.
- Разрешить люциферазы субстрат реагентов уравновесить до комнатной температуры.
- Включите считыватель пластины и откройте соответствующую программу чтения. Установите машину для измерения люминесценции.
- Перенесите 10 зл каждого образца в колодец непрозрачной пластины 96 колодцей.
- Добавьте 50 зл люцернаса Ассей реагент с помощью многоканального пипетка к каждой скважине непрозрачной пластины.
- Аккуратно коснитесь пластины на стороне, чтобы смешать колодцы и убедиться, что нижняя поверхность покрыта жидкостью. Поместите тарелку в считыватель пластин и инициируйте чтение.
- Копируйте значения люминесценции в программу электронной таблицы и нарисуйте результаты.
5. Изоляция РНК
- Добавьте 500 л гуанидия тиоцианата к каждой скважине и пипетку вверх и вниз несколько раз, чтобы обеспечить полный лизис.
- Перенесите содержимое в помеченную микроцентрифугую трубку. Поддерживайте образцы на льду как можно больше для поддержания качества РНК.
- Установите центрифугу столешницы до 4 градусов по Цельсию и поддерживайте центрифугу при такой температуре на оставшуюся часть протокола.
- К каждой пробе трубки добавьте 100 кЛ хлороформа, плотно застрять и встряхните в течение 15 с. Инкубировать при комнатной температуре в течение 10 минут.
- Центрифуга при 12 000 х г в течение 15 мин при 4 градусах Цельсия. В течение этого времени, подготовиться к следующему шагу очистки РНК путем маркировки новых труб.
- Перенесите верхнюю ваквистую фазу в новую трубку, содержащую 250 л изопропанола, стараясь не нарушить средний или нижний слои.
- Храните неиспользованный продукт в морозильной камере -80 градусов, который также может быть использован для анализа белка. Остаточный вавный слой может также служить в качестве резервного, если РНК необходима позже.
- Vortex смесь водиного слоя и изопропанола и позволяют образцам сидеть при комнатной температуре в течение 10 минут.
- Центрифуги образцы на 12000 х г в течение 10 мин при 4 градусах По Цельсию.
- Удалите трубки из центрифуги. РНК осадок образует белый гранулы на стороне и нижней части трубки. Откройте трубки и осторожно удалите супернатант, выливая в мусорный контейнер.
- Вымойте гранулы РНК, добавив 500 л 75% этанола и вихря.
- Центрифуга при 8000 х г в течение 5 мин при 4 градусах По цельсию.
- Удалите супернатант, выливая и снова мыть гранулы с 75% этанола.
- Центрифуга при 8000 х г в течение 5 мин при 4 градусах По цельсию.
- Используя небольшую объемную пипетку (например, объем 10-200 л), аспирировать как можно больше супернатанта, стараясь не заталкивать жидкость обратно в трубку и не выбить гранулы наконечником пипетки. Если гранулы вытесняются, центрифуга кратко и снова попытаться удалить супернатант.
- Воздушно-сухие гранулы РНК. Если гранулы видны для любого образца, периодически (каждые 5 минут) проверить их, чтобы увидеть, если они меняются от белого к ясному, указывая, что они сухие. Как только гранулы начинают поворачиваться ясно, добавьте 20 зл и глоток ультрачистых, RNase свободной воды, чтобы растворить РНК.
- Если гранулы изначально не были видны для каких-либо образцов, просто добавьте ультрачистую воду 5 мин после удаления супернатанта.
- Чтобы увеличить растворимость, пройдите раствор несколько раз через кончик пипетки и инкубировать в течение 10 минут при 55-60 градусах Цельсия.
6. DNase Лечение РНК
- Чтобы сохранить целостность РНК, храните образцы РНК на льду, если не указано иное. В это время буфер 10x DNase может быть удален из морозильной камеры и разрешено оттаять на льду.
- Подготовьте спектрофотометр для анализа образцов, очистив все поверхности анализа образцов тканью, свободной ворсом.
- Провести фоновое измерение до анализа. Для этого загрузите датчик 1,5 л той же ультрачистой воды, используемой для растворения рнковых гранул. Нажмите кнопку Read Blank, чтобы создать фоновое чтение.
- Используйте ткань без ворса, чтобы вытереть образец погрузочной поверхности инструмента. Повторите этот шаг после каждого прочтения образца.
- Загрузите 1,5 зл на держатель повторной РНК и выберите Выборка. Повторяйте до тех пор, пока не будут прочитаны все образцы.
- Подготовьте мастер-микс DNase, объединив 2,4 л 10-x буфера DNase и 1 зл и L DNase, в образец, в 1,5 мл микроцентрифуговой трубки. Подготовьте мастер-микс для двух дополнительных томов.
- Смешайте мастер смесь, щелкнув трубку несколько раз. Кратко центрифуга трубки для сбора содержимого в нижней части трубки. Добавьте 3,4 злики мастермикса к 20 ЗЛ образца РНК. Смешайте содержимое, щелкая и центрифуги кратко, как и раньше.
- Перенесите образцы в теплоблок, установленный при температуре 37 градусов по Цельсию в течение 20 мин. Удалите реагент инактивации DNase из морозильной камеры и оттаивайте при комнатной температуре.
- 20 мин после размещения образцов на теплоблоке, перенесите образцы на трубную стойку, размещенную на рабочей скамейке.
- Аккуратно вихрь содержимое реагента dNase инактивации. Передача 2,6 л инактивации DNase реагента в трубки, содержащие РНК, а затем Флик труб для создания однородной смеси.
- Центрифуг и образцы при 12 000 х г в течение 1 мин.
- Тщательно пипетка супернатант к новой, помечены трубки.
7. Обратная транскрипция мРНК к кДНК
- Подготовка мастер смесь в зависимости от количества образцов плюс два дополнительных для учета потерь через пипетки(Таблица 1). Используйте 1 мкг РНК и добавьте H2O в объем е 50 Л.
| Реагента | Объем (КЛ) | Окончательная концентрация |
| MgCl2 (25mM) | 3.5 | 1,75 мМ |
| Обратный буфер транскрипции (10x) | 5 | 1x |
| смесь dNTP (10 мкм, каждый) | 2.5 | 500 нм |
| случайный гексемер (100 мкм) | 1.25 | 2,5 км |
| Мультикриб наяпримина ярыка (50 U/L) | 1 | 1 U/l |
| Ингибитор RNase (20 U/L) | 1.25 | 1.25 U/L |
| РНК (1 мкг) | 20 нг/ул | |
| H2O | пополнить до 50 |
Таблица 1: Компоненты и рецепт для обратной транскрипции мастер смеси.
- Cap образцов плотно и этикетки ПЦР трубки на стороне, как этикетки на крышке могут быть удалены из нагретой крышкой термоциклора позже. Смешайте путем вихря.
- Кратко центрифуги пЦР трубки для сбора образцов в нижней части трубки.
- Поместите пЦР-трубки в термоциклер и запустите образцы в следующих настройках:
25 градусов по Цельсию в течение 10 мин, 48 градусов по Цельсию в течение 30 мин, 95 градусов по Цельсию в течение 5 минут, а затем удерживайте при 10 градусах По Цельсию. - Передача труб, содержащих недавно синтезированные кДНК, в морозильную камеру -20 градусов или немедленно используйте в анализе qPCR.
8. Подготовка и загрузка плиты для анализа РТ-кПКР
- Перед запуском спланируйте установку пластины qPCR с 384 скважинами для анализа образцов.
- Оттепель грунтовки и cDNA на льду.
- Подготовьте мастер-микс (см. таблицу 2),плюс примерно 10% дополнительно для учета потерь через пипетки.
| Реагента | Объем (КЛ) |
| 10 КМ F праймер | 1 |
| 10 КМ R праймер | 1 |
| Ультрачистый H2O | 4 |
| 2x SYBR зеленый | 10 |
Таблица 2: Компоненты и рецепт мастер-микса qPCR.
- Vortex мастер смесь и обойтись 8 qL в колодцы 384-колодец пластины с помощью ретранслятора пипетки. Образцы будут проанализированы в дубликатдля для каждой комбинации образца грунтовки и кДНК.
- Используя пипетку P10 (или меньше), перенесите 2 qL кДНК для дублирования скважин для каждого грунтового набора для анализа. Заменить советы после каждого колодца, чтобы избежать перекрестного загрязнения.
- Печать пластины, тщательно нанося клей пленки на поверхность, гарантируя, что все скважины покрыты. Нажмите на пленку с помощью герметичной весло или ролика, чтобы плотно запечатать.
- Поместите тарелку в центрифугу, с пустой пластиной в качестве противовеса. Центрифуге пластины на 500 х г в течение 5 мин.
9. Запуск термоциклора для анализа qPCR
- Питание на компьютере и в режиме реального времени PcR инструмент.
- Откройте программное обеспечение RT-qPCR и выберите новый эксперимент.
- Под вкладкой Настройка выберите Experiment Properties,где можно установить параметры для запуска.
- Определите имя эксперимента,которое установит имя файла и параметры, используемые для хранения результатов.
- Для выбора инструментоввыберите подключенный в настоящее время инструмент, который будет работать с анализом. Выберите метод запуска сравнительного КТ.
- Выберите SYBR Зеленые реагенты в качестве флуоресцентного красителя ДНК, который будет использоваться и стандарт в качестве скорости рампы.
- Убедитесь, что поле рядом с включением melt Curve проверяется.
- Под вкладкой Define назначаются цели (т.е. гены, которые должны быть усилены) и образцы (т.е. экспериментальные условия).
- Выберите вкладку Assign. Пометьте скважины соответствующими целями и образцами, так как они соответствуют схеме погрузки 384-й пластины.
- Выберите метод выполнения. Используйте параметры для анализа, перечисленных в(Таблица 3).
| Удержание стадии | Этап ПЦР | Этап растопить кривую | |||||
| Шаг 1 | Шаг 2 | Шаг 1 | Шаг 2 | Шаг 1 | Шаг 2 | Шаг 3 | |
| Temp | 50 кв. c | 95 кв. c | 95 кв. c | 60 кк | 95 кв. c | 60 кк | 95 кв. c |
| Время | 2:00 | 10:00 | 0:15 | 1:00 | 0:15 | 1:00 | 0:15 |
| Сбор данных | Да | Да | |||||
| Количество циклов | 1x | 40x | 1x | ||||
Таблица 3: Параметры цикла для термоциклора.
- Поместите 384-хорошо пластины в термоциклер и начать анализ.
10. Анализ результатов qPCR с помощью метода Дельта-дельта Ct (2--
- Анализ результатов, полученных в результате реакции qPCR, на ошибки, которые могут помешать анализу ниже по течению. Многие ошибки будут автоматически помечены системой.
- Для правильно построенных грунтовок, таяние кривых должны иметь только один пик. Исключите любые скважины, содержащие кривую расплава с более чем одним пиком, из дальнейшего анализа.
- Экспорт значений Ct в программу электронной таблицы для анализа данных с помощью метода «Ct». Предлагается предлагаемый формат(таблица 4). Последняя колонка — это изменение выражения сгиба в образце по отношению к контрольным образцам.
| Ген домашнего хозяйства(GAPDH) | Ген интереса (IL6) | ||||||||||
| Ct1 | Ct2 | Аве Ct | Ct1 | Ct2 | Аве Ct | Кт | Аве Ct ctrls | Кт | 2"-(ККт) | Геомейн | |
| Управление 1 | 15.33 | 15.37 | 15.35 | 26.81 | 26.91 | 26.86 | 11.51 | 10.51 | 1.00 | 0.50 | 1.00 |
| Управление 2 | 16.83 | 16.77 | 16.80 | 26.89 | 26.92 | 26.91 | 10.11 | 10.51 | -0.41 | 1.33 | |
| Управление 3 | 17.56 | 17.53 | 17.54 | 27.38 | 27.56 | 27.47 | 9.93 | 10.51 | -0.59 | 1.50 | |
| Sl1344 1 | 15.50 | 15.41 | 15.45 | 22.15 | 22.13 | 22.14 | 6.69 | 10.51 | -3.83 | 14.21 | 13.23 |
| SL1344 2 | 16.02 | 15.98 | 16.00 | 23.01 | 22.96 | 22.98 | 6.98 | 10.51 | -3.53 | 11.57 | |
| SL1344 3 | 17.27 | 17.30 | 17.28 | 23.99 | 23.98 | 23.98 | 6.70 | 10.51 | -3.82 | 14.09 | |
| sipA sopB sopE2 1 | 15.38 | 15.41 | 15.39 | 23.31 | 23.09 | 23.20 | 7.80 | 10.51 | -2.71 | 6.56 | 7.29 |
| sipA sopB sopE2 2 | 16.01 | 16.05 | 16.03 | 23.89 | 23.92 | 23.91 | 7.88 | 10.51 | -2.64 | 6.23 | |
| sipA sopB sopE2 3 | 16.78 | 16.78 | 16.78 | 24.02 | 24.06 | 24.04 | 7.27 | 10.51 | -3.25 | 9.49 | |
| sipA sopB sopE2 sopE 1 | 15.52 | 15.60 | 15.56 | 27.04 | 27.03 | 27.03 | 11.47 | 10.51 | 0.96 | 0.51 | 0.79 |
| sipA sopB sopE2 sopE 2 | 15.56 | 15.59 | 15.57 | 26.37 | 26.42 | 26.39 | 10.82 | 10.51 | 0.31 | 0.81 | |
| sipA sopB sopE2 sopE 3 | 15.91 | 15.92 | 15.91 | 26.24 | 26.12 | 26.18 | 10.27 | 10.51 | -0.25 | 1.19 | |
Таблица 4: Формат анализа данных qPCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Описанный здесь ассей фокусируется на активации транскрипционного фактора NF-ЗБ с помощью репортера, зависимого от NF-ЗБ luciferase, который заступился в линию клеток HeLa. Активированный NF-ЗБ переносится в ядро, где он связывает связывающие участки генов-мишеней, включая провоспалительные цитокины IL6 и IL23. Общий обзор активации NF-ЗБ изображен на рисунке 1. Грам-отрицательная бактерия Salmonella enterica serovar Typhimurium была использована в данном исследовании в качестве активатора NF-ЗВ и последующего выражения IL6 (Рисунок 2). Одним из основных факторов вирулентности, необходимых для патогенеза является тип III секреции системы-1 (T3SS-1), которая позволяет S. Тифимурий инфицирует клетки и вызывает активацию NF-'B. Функция T3SS-1 заключается в доставке бактериальных белков, называемых эффекторами, в клетки-хозяина. Здесь эффектор белки целевой многочисленные клеточные сигнальные пути для посредничества вторжения принимающих эпителиальных клеток. Активация NF-ЗБ, индуцированная S. Typhimurium в основном зависит от T3SS-1 эффектор белков SopE, SipA, SopB и SopE218. Здесь, HeLa 57A клетки были инфицированы диким типом S. Typhimurium штамм SL1344 и два штамма мутантов не хватает либо три (SipA, SopB, SopE2) или четыре (SipA, SopB, SopE2, SopE2 )эффектор белков. Рисунок 2 является репрезентативным экспериментом nF-зB-зависимой активации люциферазы(рисунок 2A)и экспрессии генов IL6 (Рисунок 2B) в клетках HeLa 57A, инфицированных S. Типимурий штаммов. Инфекция с диким типом штамма SL1344 вызывает сильный сигнал люциферазы, который уменьшается в клетках, инфицированных SipA, SopB, SopE2 тройной мутант (SopE-зависимый ответ), и сводится к уровню контроля с SipA, SopB, SopE2, SopE четырехместный мутант. Относительные единицы люминесценции (RLU) коррелирует с уровнями экспрессии IL6 (рисунок 2). Рисунок 3 представляет результаты анализа RT-qPCR.
Рисунок 1: Схема активации NF-ЗБ и считывания вниз по течению. Очерченный выше, NF-ЗБ сохраняется в цитозоле в неактивном состоянии ингибирующим белком I'B. Как внутренние, так и внешние стимулы могут способствовать активации IKK, который фосфорилаты ИЗБЗ и вызывает его последующую протеосомальную деградацию. Деградация ИЗБЗ показывает сигнал ядерной локализации NF-ЗБ, который способствует транслокации. В ядре активированный NF-ЗБ связывается с связывающими участками генов-мишеней, способствуя их транскрипции и экспрессии. Целевые гены, такие как цитокины IL6 и IL23,выражаются и количественно оцениваются через RT-qPCR. В клетках HeLa 57A люцифераза выражается после активации NF-ЗВ, которая может быть количественно определена с помощью люминесценционных анализов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Репрезентативные данные анализа люминесценции и анализа RT-qPCR после С. Тифимурийная инфекция клеток HeLa 57A. 1 x 105 HeLa 57A клетки были инфицированы 106 cfu (MOI No 10) бревенчатого этапа S. Typhimurium дикого типа SL1344, или штаммов мутантов, не хватает SipA, SopB и SopE2, и SipA, SopB, SopE2 и SopE. После 1 ч средства массовой информации были заменены, и инкубация продолжалась еще четыре часа. (A) Клетки были обработаны для выражения люциферазы через люминесценцию анализы. (B) Клетки были извлечены из РНК, которая была использована для анализа RT-qPCR. Показано относительное выражение генов-мишеней с использованием метода дельта-дельта Ct (2-КТ). Показано среднее и стандартное отклонение тройных скважин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Сводные результаты, полученные в результате анализа RT-qPCR. (A) Участок усиления показан для скважин, усиливающих ГАПДХ из клеток HeLa 57A, инфицированных S. Тифимурий. (B) Расплавленный кривой участок скважин, содержащих праймеры GAPDH показывает один пик расплава, соответствующий примерно 84 градусов по Цельсию. (C) Двойные скважины, содержащие грунтовки для Ил-6. Одна из скважин отображает второй пик расплава, обозначаемый черной стрелкой, и должна быть исключена из анализа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Основной вклад описанного протокола заключается в том, что он обеспечивает быстрый и простой метод обнаружения активации NF-ЗB в клетках, что позволяет проводить анализ высокой пропускной активности нескольких стимулирующих состояний или препаратов, влияющих на активацию NF-ЗВ. Здесь мы описываем протокол для активации NF-ЗБ в клетках Сальмонеллы-инфицированныхHeLa. Эти клетки могут быть использованы для заражения другими патогенными микроорганизмами, а также для изучения влияния бактериальной инфекции на активацию NF-З. Кроме того, активация люциферазы, зависимой от NF-'B в клетках HeLa 57A, может быть использована для проверки для активации активаторов или ингибиторов сигнальных путей, ведущих к активации NF-ЗВ. Здесь мы семя HeLa 57A клеток в 48-колодись пластин, но эти эксперименты могут быть масштабированы до 96- и даже 384-колодец пластин, чтобы больше образцов за эксперимент. Клетки HeLa 57A, которые самовыражаются, которые можно измерить как внутренний контроль за числом клеток и жизнеспособностью с помощью анализов. Описанный здесь протокол применим для использования в клеточных линиях либо запоздалым, либо преходяще трансфицируясь с помощью NF-ЗБ::luciferase репортера конструкции. ДЛЯ этойцелиуже используется линия макрофагов RAW264.7. Важно отметить, что этот метод не проводит различия между активацией различных гомо/гетеродимеров пяти различных подразделений NF-'B. Различные комплексы Гомо-ИБ имеют различные сходства для промоторных последовательностей, а также различные транскрипционные последствия21. Вполне возможно, что активация конкретного NF-ЗБ димера пропущена с помощью репортера, описанного здесь, из-за низкой сродства, связывающейся с обязательными участками зБ из области промотора иммуноглобулина.
Важно отметить, что условия, подходящие для стимуляции одной клеточной линии, не могут быть непосредственно применимы к другой. Поэтому настоятельно рекомендуется оптимизировать условия ассеидов в каждой системе асссе. Время инфекции, МВД, продолжительность медикаментозного лечения, доза препарата и условия посева являются важными соображениями, которые следует учитывать при оценке активации НФ-ЗВ. Например, RAW264.7 макрофаги более чувствительны к инфекции сальмонеллы, требующих различных условий для получения аналогичного сигнала люминесценции, как видно с клетками HeLa 57A18.
Во время измерений люминесценции, это не редкость для краев скважин, чтобы иметь значительно иные значения, чем другие скважины, которые были аналогичным стимулом. Это, как правило, из-за более высоких темпов испарения краевых колодцев на пластине, что приводит к повышению концентрации наркотиков. Это может быть решена путем добавления сыворотки свободных носителей в пространстве между скважинами, для пластин, которые позволяют ему, изменяя крышку / пластины комбинации для уменьшения испарения, или опустить края скважин полностью, если проблемы сохраняются.
Выраженный в клетках млекопитающих, светлячок luciferase имеет период полураспада в несколько часов и, как правило, рассматривается как стабильный для целей большинства репортер анализы22. Более длительные сроки лечения, чем описанные здесь, могут быть надежно выполнены. Тем не менее, система анализов люциферазы, используемая здесь, производит стабильный сигнал только в первую минуту и быстро ухудшается после этого. Поэтому очень важно, чтобы мера люминесценции была сделана быстро после смешивания клеточного лизата и субстрата.
НФ-ЗБ является транскрипционным фактором для большого массива генов, включая цитокины и хемокины (т.е. Il6 и Il23). Измерение активности nF-'B-зависимой люциферазы не обязательно означает, что эти цитокины и хемокины выражены. Этот метод может дополнить существующие методы молекулярной количественной оценки, выступая в качестве потенциального первого экрана для характеристики условий, влияющих на активность NF-QB, которые затем могут быть функционально проверены с помощью RT-qPCR. Функциональная проверка активации NF-ЗБ также может быть выполнена с помощью западного анализа помарки или функциональных анализов, характерных для белка, интересуемого в тех случаях, когда количественная оценка мРНК может быть нецелесообразной. Это относится к интерлейкина-бета (Il1b), ген, транскрипция которого индуцируется NF-ЗБ связывания, но белковый продукт требует после трансляционной модификации для формирования зрелого продукта23,24.
Описанный здесь конкретный протокол изоляции РНК не единственный, который может быть использован для использования в анализе RT-qPCR, и вместо этого можно использовать другие предпочтительные методы, такие как коммерчески доступные комплекты. Важно отметить, что качество РНК очень важно для процесса и поэтому РНК должна храниться на льду как можно больше, чтобы предотвратить деградацию. Важно запустить дубликаты реакций в rt-qPCR реакций, чтобы удостовериться, что реакции ПЦР являются последовательными, как труба таких небольших объемов при загрузке 384-хорошо пластины часто может быть причиной ошибки. Ct значения гена домашнего хозяйства должны быть последовательными между образцами, и отклонения от этого могут свидетельствовать о неэффективных шагах очистки или расхождениях в концентрациях РНК во время обратной транскрипции, которые могут повлиять на окончательные результаты. Важно также проверить кривую расплава после каждого эксперимента qPCR. Наличие одного пика говорит о том, что праймеры qPCR усиливают один ген. Несколько кривых позволяют предположить, что существует вне целевого усиления гена или наличие грунтовки димеров. В любом случае, несколько пиков, присутствующих в кривой плавления, предполагают, что грунтовки должны быть переработаны для обеспечения специфичности. Что так много возможностей для изменчивости, физические упражнения и уточнение хорошей техники на каждом шагу имеют важное значение для получения точных и воспроизводимых результатов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Исследования в лаборатории Keestra-Gounder поддерживаются грантами от NIAID NIH под номером премии R21AI122092 и от Американской диабетической ассоциации под номером премии 1-18-JDF-035.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adhesive film | VWR International | 60941-070 | |
| Chloroform | Fisher Bioreagents | C298-500 | |
| DMEM | Thermo Fisher | 11665092 | |
| DNAse treatment kit | Qiagen | 79254 | |
| dNTPs | Promega | U1511 | |
| Ethanol | Fisher Bioreagents | BP2818100 | molecular grade |
| FBS | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| HeLa 57A cells | Ref # 15 | ||
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368814 | |
| Isopropanol | Fisher Bioreagents | BP26181 | |
| Kanamycin | Fisher Bioreagents | BP906-5 | |
| LB agar | Fisher Bioreagents | BP1425-500 | |
| Lysogeny broth | Fisher Bioreagents | BP1426-500 | |
| MgCl2 | Fisher Chemical | ||
| NanoDrop ND-1000 | Thermo Scientific | spectrophotometer | |
| Promega luciferase assay system | Promega | E1501 | Cell lysis buffer & luciferin substrate |
| Random Hexamers | Thermo Scientific | SO142 | |
| Real-time GAPDH forward primer | 5'-CCAGGAAATGAGCTTGAC AAAGT-3' |
||
| Real-time GAPDH reverse primer | 5-'CCCACTCCTCCACCT TTGAC-3' |
||
| Real-time IL-23 forward primer | 5-'GAGCCTTCTCTGCTCCC TGAT-3' |
||
| Real-time IL-23 reverse primer | 5'-AGTTGGCTGAGGCCCAGTAG-3' | ||
| Real-time IL-6 forward primer | 5'-GTAGCCGCCCCACACAGA-3' | ||
| Real-time IL-6 reverse primer | 5'-CATGTCTCCTTTCTCAGG GCTG-3' |
||
| Reverse Transcriptase | Applied Biosystems | 4308228 | |
| RNAse inhibitor | Thermo Scientific | EO0381 | |
| RT buffer | Promega | A3561 | |
| SL1344 | Ref # 17 | ||
| SL1344 ΔsipA sopB::MudJ sopE2::pSB1039 | Ref # 18 | ||
| SL1344 ΔsopE ΔsipA sopB::MudJ sopE2::pSB1039 | Ref # 18 | ||
| SYBR green | Applied Biosystems | 4309155 | 2x mastermix |
| Tri-reagent | Molecular Research Center | TR 118 | guanidine thiocyanate |
| Trypsin -EDTA | Thermo Fisher | 25300054 | 0.05% Trypsin-EDTA |
| Ultrapure water | Fisher Bioreagents | BP248450 | |
| Well plate for PCR | VWR International | 89218-294 | 384-well plate |
References
- Liu, T., Zhang, L., Joo, D., Sun, S. C. NF-kappaB signaling in inflammation. Signal Transduction and Targeted Therapy. 2, (2017).
- Piva, R., Belardo, G., Santoro, M. G. NF-kappaB: a stress-regulated switch for cell survival. Antioxidants & Redox Signaling. 8 (3-4), 478-486 (2006).
- Lawrence, T. The nuclear factor NF-kappaB pathway in inflammation. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (6), a001651 (2009).
- Hargett, D., Rice, S., Bachenheimer, S. L. Herpes simplex virus type 1 ICP27-dependent activation of NF-kappaB. Journal of Virology. 80 (21), 10565-10578 (2006).
- Zaragoza, C., et al. Viral protease cleavage of inhibitor of kappaBalpha triggers host cell apoptosis. Proceedings of the National Academy of Sciences United States of America. 103 (50), 19051-19056 (2006).
- Gao, X., et al. Bacterial effector binding to ribosomal protein s3 subverts NF-kappaB function. PLOS Pathogens. 5 (12), e1000708 (2009).
- Kravchenko, V. V., et al. Modulation of gene expression via disruption of NF-kappaB signaling by a bacterial small molecule. Science. 321 (5886), 259-263 (2008).
- Kawai, T., Akira, S. Signaling to NF-kappaB by Toll-like receptors. Trends in Molecular Medicine. 13 (11), 460-469 (2007).
- Pinaud, L., Sansonetti, P. J., Phalipon, A. Host Cell Targeting by Enteropathogenic Bacteria T3SS Effectors. Trends in Microbiology. 26 (4), 266-283 (2018).
- Karin, M. How NF-kappaB is activated: the role of the IkappaB kinase (IKK) complex. Oncogene. , (1999).
- Berti, R., et al. Quantitative real-time RT-PCR analysis of inflammatory gene expression associated with ischemia-reperfusion brain injury. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 22 (9), 1068-1079 (2002).
- Fried, M., Crothers, D. M. Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Research. 9 (23), 6505-6525 (1981).
- Holden, N. S., Tacon, C. E. Principles and problems of the electrophoretic mobility shift assay. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 63 (1), 7-14 (2011).
- Renard, P., et al. Development of a sensitive multi-well colorimetric assay for active NFkappaB. Nucleic Acids Research. 29 (4), E21 (2001).
- Nowak, D. E., Tian, B., Brasier, A. R. Two-step cross-linking method for identification of NF-kappaB gene network by chromatin immunoprecipitation. Biotechniques. 39 (5), 715-725 (2005).
- Ernst, O., Vayttaden, S. J., Fraser, I. D. C. Measurement of NF-kappaB Activation in TLR-Activated Macrophages. Methods in Molecular Biology. 1714, 67-78 (2018).
- Rodriguez, M. S., Thompson, J., Hay, R. T., Dargemont, C. Nuclear retention of IkappaBalpha protects it from signal-induced degradation and inhibits nuclear factor kappaB transcriptional activation. Journal of Biological Chemistry. 274 (13), 9108-9115 (1999).
- Mendez, J. M., Kolora, L. D., Lemon, J. S., Dupree, S. L., Keestra-Gounder, A. M. Activation of the endoplasmic reticulum stress response impacts the NOD1 signaling pathway. Infection and Immunity. , (2019).
- Hoiseth, S. K., Stocker, B. A. D. Aromatic-Dependent Salmonella-Typhimurium Are Non-Virulent and Effective as Live Vaccines. Nature. 291 (5812), 238-239 (1981).
- Keestra, A. M., et al. Manipulation of small Rho GTPases is a pathogen-induced process detected by NOD1. Nature. 496 (7444), 233-237 (2013).
- Wong, D., et al. Extensive characterization of NF-kappaB binding uncovers non-canonical motifs and advances the interpretation of genetic functional traits. Genome Biology. 12 (7), R70 (2011).
- Gupta, R., et al. Firefly luciferase mutants as sensors of proteome stress. Nature Methods. 8 (10), 879-884 (2011).
- Cogswell, J. P., et al. NF-kappa B regulates IL-1 beta transcription through a consensus NF-kappa B binding site and a nonconsensus CRE-like site. Journal of Immunology. 153 (2), 712-723 (1994).
- Thornberry, N. A., et al. A Novel Heterodimeric Cysteine Protease Is Required for Interleukin-1-Beta Processing in Monocytes. Nature. 356 (6372), 768-774 (1992).
