Summary
Burada, nf-κB::luciferase reporter constructs,hücre lysate parlaklık ölçümleri yoluyla, hücre hatlarında aktif B hücrelerinin (NF-κB) aktivasyonunun nükleer faktör kappa-ışık-zincir arttırıcısını hızlı ve kolay bir şekilde ölçmek için bir protokol saklıyız. Ayrıca, gen ekspresyonu Salmonella Typhimurium ile enfekte hücrelerden izole RT-qPCR ile belirlenir.
Abstract
Dimerik transkripsiyon faktörü NF-κB çeşitli sitokinler ve kemokinler ifade indükleyerek inflamatuar yollar da dahil olmak üzere birçok hücresel yanıt yollarını düzenler. NF-κB konstitutively ifade edilir ve B hücreleri inhibitörü kappa ışık polipeptid gen arttırıcı inhibitör protein nükleer faktör tarafından sitosol içinde sekestre edilir, alfa (IκBα). NF-κB'nin aktivasyonu, IκBα'nın bozulmasını gerektirir, bu da NF-κB'de nükleer bir lokalizasyon sinyalini ortaya çıkarır ve çekirdeğin ticaretini teşvik eder. Çekirdekte nf-κB, ininterlökin 6 (IL-6) ve IL-23 gibi nf-κB hedef genlerinin promotor bölgesine bağlanır ve ekspresyonların dışavurumlarını destekler.
NF-κB'nin aktivasyonu transkripsiyon veya çeviriden bağımsız olarak gerçekleşir. Bu nedenle, NF-κB'nin aktivasyon durumu, nf-κB'nin özellikle çekirdekteki sayısallaştırılması veya NF-κB hedef genlerinin ifadelerinin ölçülmesi ile ölçülmelidir. Bu protokolde, nf-κB ile transfeced hücreler::luciferase muhabir yapısı in vitro doku kültürü teknikleri kullanılarak NF-κB aktivasyonu için test edilir. Bu hücreler Salmonella Typhimurium ile enfekte nf-κB etkinleştirmek için, hangi çekirdeğe trafik ve luciferase organizatörü bölgede κB sitelerine bağlanır, ifadesini indükleyen. Hücreler lysed ve luciferase test sistemi ile analiz edilir. Hücreler tarafından üretilen luciferase miktarı bir plaka okuyucu tarafından algılanan lüminesans sinyalinin yoğunluğu ile ilişkilidir. Bu yordam tarafından oluşturulan Parlaklık sinyali, NF-κB aktivasyonunu çeşitli koşullar altında değerlendirmek için hızlı ve son derece hassas bir yöntem sağlar. Bu protokol aynı zamanda gen ekspresyonunun göstergesi olan bağıl mRNA düzeylerini saptamak için kantitatif ters transkripsiyon PCR (RT-qPCR) kullanır.
Introduction
Nükleer faktör-κB (NF-κB) protein ailesi, çeşitli biyolojik yollarda gen ekspresyonunu düzenleyen önemli transkripsiyon aktivatörleridir. NF-κB aktivasyonu hedef genlerin transkripsiyon indükler, birçoğu bağışıklık ve inflamatuar yanıtlar için önemlidir, hücre çoğalması, stres yanıtları ve kanser ilerlemesi1,2. NF-κB patojen temizliği için erken inflamatuar sonuçlar aracılık ayrılmaz bir rol oynar. NF-κB aktivasyonunun aracılık ettiği birçok biyolojik süreç göz önüne alındığında, sinyalizasyonundaki aksaklıklar sağlık ve hastalık açısından ciddi sonuçlar doğurabilir. NF-κB sinyalizasyonunda fonksiyon mutasyonlarının kaybı çeşitli immün yetmezlik fenotiplerinde ilişkilidir, fonksiyon mutasyonlarının kazanımı ise B hücreli lenfomalar ve meme kanserleri de dahil olmak üzere çeşitli kanser türleri ile ilişkilidir3. Ayrıca, birçok patojenler doğrudan virülansfaktörlerininekspresyonu ile NF-κB aktivasyon durumunu modüle gösterilmiştir 4,5,6,7.
NF-κB aktivasyonu, patojenle ilişkili moleküler desenler (PAMP) olarak bilinen lipopolisakkaritler (LPS), flagellin ve peptidoglikanlar gibi bakteriyel ürünler de dahil olmak üzere birçok değişken uyaranların bir sonucu olarak bilinmektedir. Bu PAMP'ler, NF-κB aktivasyonuna ve NF-κB'ye bağlı inflamatuar genlerin bir dizi sinin sonraki ekspresyonuna yol açan Toll benzeri reseptörler (TLR) ve Nod benzeri reseptörler (NLR) gibi patern tanıma reseptörleri (PrR' ler) tarafından tespit edilir8. PAMP'ler tarafından PRR aktivasyonuna ek olarak, bakteriyel efektör proteinler gibi diğer bakteriyel ürünler NF-κB aktivasyonuna neden olabilir. İlginçtir, bakteriler de aktif NF-κB yolu zayıflatmak ve patojenik geliştirmek etkileyici proteinlerifade, bağışıklık önemli bir aracı olarak NF-κB önemini vurgulayan9.
NF-κB dimer'lerini oluşturan beş farklı alt birim vardır; p50, p52, RelA (p65), RelB ve cRel. İki ana NF-κB heterodimerp50:RelA ve p52:RelB dimers vardır. Aktif NF-κB dimers ÇEŞITLI hedef genlerin organizatörü ve arttırıcı bölgelerde, κB siteleri olarak bilinen DNA sitelerine bağlanır. Normal homeostatik koşullar altında, NF-κB inhibisyon proteinleri olarak bilinen bir aile ile etkileşime girebilmekte olup inaktif kalır. Uyarılma üzerine, IκB IκB Kinase (IKK) tarafından fosforile edilir, hangi her yerde hedeflenmesağlar, ve daha sonra bozulma. IκB'nin bozulması, nükleer bir lokalizasyon sinyali ortaya çıkararak NF-κB'yi harekete geçirir. NF-κB daha sonra çekirdeğe aktarır ve burada hedef genlerin promotör bölgesindeki κB sitelerini bağlar ve transkripsiyon10'uteşvik eder. Böylece NF-κB'nin aktivasyonu NF-κB hedef genlerinin mRNA ekspresyonunu düzenler ve bu değişiklik RT-qPCR11gibi RNA niceleme leri ile ölçülebilir.
Elektroforetik hareketlilik kayması tahlilleri (EMSA), nükleer translokasyon ve gen muhabiri tahlilleri de dahil olmak üzere NF-κB aktivasyonunun ölçümü için yaygın olarak kullanılan çeşitli yöntemler vardır. EMSA nükleik asitler ile protein kompleksleri tespit etmek için kullanılır. Uyarılmış hücreler nükleer proteinleri izole etmek için fraksiyona alınırlar, transreretik NF-κB de dahil olmak üzere, daha sonra NF-κB bağlayıcı etki alanını içeren radyoetiketli nükleotitlerle kuluçkaya yatırılır. Örnekler bir jel üzerinde çalıştırılır ve 32P etiketli nükleik asit otoradyografi ile görüntülenir. Protein fraksiyonunda NF-κB mevcutsa, jel den daha yavaş göç edecek ve ayrıbantlar halinde mevcut olan nükleotitleri bağlar. Aktif NF-κB'den yoksun hücrelerin nükleer fraksiyonları (örneğin, uyarılmamış kontrol hücreleri) nükleotitler jelin ucuna daha hızlı göç ettikçe hiçbir bant üretmez. Bu yöntemin önemli bir dezavantajı, ikili anlamda büyük ölçüde nicel olmasıdır (yani, açık veya kapalı) ve NF-κB bağlama kapasitesinde anlamlı farklılıkları yeterince yakalayamamaktır. Ayrıca, bu yöntem fonksiyonel NF-κB hedef genler için önemli olan kromatin yapıları dikkate almaz12,13.
Önceki yönteme benzer şekilde, çok kuyulu plakaların NF-κB bağlama dizisini içeren nükleotitlerle kaplandığı bir "kaymaz" töz vardır. Proteinlerin nükleer fraksiyonları ile hücrelerin tedavisisonrasında, NF-κB kuyuya bağlı nükleotitlere bağlanır. Daha sonra anti-NF-κB antikorları eklenir, bu da bağlı NF-κB ile etkileşime girerek NF-κB miktarıyla orantılı olarak nf-κB aktivasyon derecesini gösteren kolorimetrik bir sinyal üretir. Bu yöntem, radyoetiketli nükleik asitler gerektirmemesi ve karşılaştırmaaçısından nicel olması nedeniyle EMSA'ya göre avantajlıdır. Ancak, bu yöntemin bir uyarı yine NF-κB hedef genlerin kromatin durumları arasında ayrım yapmaz14.
NF-κB aktivasyonunun saptabildiği bir diğer yöntem de kromatin immünopresipitasyonu (ChIP) ile, DNA ve etkileşen proteinler formaldehit ile çapraz bağlanır ve spesifik anti-NF-κB antikorları ile immünopsipatatedilir. Belirli nükleotid parçaları daha sonra saflaştırılır ve PCR amplifikasyon veya doğrudan yüksek iş elde etme sıralaması ile tanımlanır. Bu yöntemden elde edilen sonuçlar, NF-κB bağlama aktivitesinin hedef genlerle yarı kantitatif sonuçlarını sağlar. Ancak, sonuçlar son derece heradım15de fiksasyon koşulları ve arıtma işlemleri bağlıdır.
Nükleer translokasyon tahlillerinde hücreler NF-κB aktivasyonunu tetiklemek için uyarılır ve sonra sabitlenir. Sabit hücrelere anti-p65 antikorları eklenir. Alternatif olarak, p65 alt biriminin kendisi yeşil floresan yeşil (GFP) gibi floresan peptid ile etiketlenebilir. Her iki durumda da, immünofluorescence hücresel dağılımı belirlemek için p65 lokalizasyonu görüntüleme sağlayacaktır. Araştırmacılar, sitosolik ve nükleer lokalize protein oranını ölçerek NF-κB'nin göreli aktivasyon durumunu belirleyebilirler. Bu yöntemin bir dezavantajı immünfloresans nispeten zaman alıcı olmasıdır, pahalı antikorlar gerektirir, ve nispeten daha fazla teknik uzmanlık ihtiyacı16.
Muhabir genler, ilgi çeken bir genin düzenleyici ve ifade kalıplarını incelemek için yaygın olarak kullanılan araçlardır. Tipik olarak, muhabir genler kolayca tespit edilebilir bir protein için kodlayan bir gen erimiş ilgi geninin promotör dizisinden inşa edilmiştir. Enzimatik aktiviteler, floresan veya lüminesans özellikleri olan proteinler genellikle analiz ve nicel yetenekleri için seçilir. Böylece, okuma (örneğin, parlaklık, floresan) gen ekspresyonunun saptanması için bir sinyal görevi göremez. Bu muhabir yapıları daha sonra epitel hücreleri veya makrofajlar gibi farklı hücre türlerine tanıtılabilir.
Protokolde açıklanan bir klonlanmış HeLa hücre hattı kullanımı (HeLa 57A) bir luciferase muhabiri ile immünglobulin κ-chain promoter bölge κB konsensüs üç kopyasını içeren bir transfected17. Luciferase ekspresyonu hücre stimülasyonu sonrasında ortaya çıkan NF-κB aktivasyonuna bağlıdır. Uyarılmış hücreler luciferase tsay kitinde sağlanan hücre lisis tamponu kullanılarak kolayca lysed edilir. Hücre lisate bir kısmı daha sonra luciferin içeren luciferase tsay tampon ile karıştırılır. Luciferin luciferase substrat ve luciferase varlığında ışık üretimi için gereklidir. Israr tamponu ile lysate birleştirdikten sonra, çözüm Lüminesans olarak bilinen bir süreçte ışık yayar. Lümenlerde üretilen ışık miktarı, lysate'de bulunan luciferase miktarı ile orantılıdır ve NF-κB aktivasyonunun bir ölçüsü olarak hizmet vermektedir. Lümen okumaları, temel NF-κB aktivitesini hesaba katmak için uyarılmamış bir standarda göre yorumlanır ve sinyalin kendisi güvenilir ölçüm için birkaç dakika stabildir. Buna ek olarak, HeLa 57A hücre hattı stfecably bir NF-κB-bağımsız β-galactosidaz muhabiri ile transfected. Β-galaktosidaz muhabiri kurucu olarak ifade edilir ve β-galaktosidaz aktivitesi hücre canlılığını veya hücre sayılarında değişimi kontrol etmek için ölçülebilir17. Luciferase değerleri daha sonra β-galaktosidaz değerlerine ayarlanabilir ve uyarılmamış kontrol hücreleri üzerinde kat artış olarak rapor edilebilir.
NF-κB, NF-κB bağımlı hedef genlerin artan ekspresyonundan sorumlu bir transkripsiyon faktörü olduğundan, NF-κB bağımlı artmış gen ekspresyonunu kontrol etmek için yapılan bir takip deneyi nicel ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonudur ( RT-qPCR). RT-qPCR, gen ekspresyonundaki değişikliklerin çeşitli büyüklük sıraları üzerinden ölçülebildiği son derece hassas bir yöntemdir. Uyarılmış ve kontrol hücreleri fenol-kloroform ekstraksiyon u yoluyla RNA için hasat edilir. Faz ayrımından sonra, RNA sulu tabakanın ana bileşeni olarak ayıklanır. RNA daha sonra çökeltilir ve saf pelet üretmek için yıkanır. Bu pelet daha sonra yeniden yapılır ve DNase tedavisi ile kirletici DNA'dan daha fazla temizlenir. Saf RNA sonra tamamlayıcı DNA (cDNA) oluşturmak için transkripsiyonu ters yazılır. Bu cDNA daha sonra belirli bir mRNA dizisinin bolluğunun gen ekspresyonunu belirlemek için ölçüldüğü nicel PCR teknikleri ile analiz edilebilir. Bu teknik çevirisel kontrolü, çeviri sonrası modifikasyonu, protein bolluğunu veya protein aktivitesini açıklamaz. Ancak, birçok gen, özellikle pro-inflamatuar süreçlerde yer alanlar, NF-κB ile düzenlenir ve mRNA bolluğu onların ifadelerinin göstergesidir.
Burada önerilen yöntem, NF-κB aktivasyonunun hücresel lysate'nin lüminesans tahlilleri ile saptanabileceği hızlı ve basit bir yöntem kullanır. NF-κB hedef gen ekspresyonunun RT-qPCR'ı belirli genlerin ekspresyonunu ölçmek ve NF-κB aktivasyonunun fonksiyonel aktivitesini doğrulamak için kullanılabilir. Böyle bir sistemin en büyük avantajları, NF-κB aktivasyonunu modüle eden bir dizi koşulun yüksek iş gücü taramasına olanak tanıyan sadeliği ve hızıdır. Bu protokol bir NF-κB ifade diğer hücre hatları için uygundur::luciferase muhabiri, ve stable transfected RAW264.7 hücreleri18gösterilmiştir . Hücre lisisinden itibaren bir lüminesans sinyali oluşturmaya kadar numuneleri işlemek için gereken süre çok azdır ve yaklaşık bir saatlik bir zaman dilimini alır. NF-κB ölçümü sadece opak plakalar, parlaklığı ölçebilen bir plaka okuyucu ve elektronik tablo programı gibi basit veri analizi yazılımları gibi temel laboratuvar ekipmanı gerektirir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Hücre Geçişi ve Tohumlama
- Dulbecco'nun modifiye Kartal medyasının (DMEM) 10 mL'sini içeren 75 cm2'lik bir şişedeki HeLa 57A hücrelerini %5 CO2 kuluçka makinesinde 37 °C'de %5 ısı inaktive edilmiş fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenince koruyun.
- Aspire hücre kültürü ortam ve yıkama 1 mL 0.05% tripsin-EDTA çözeltisi. Tripsin ini aspire edin ve ek 1 mL ile değiştirin. Hücrelerin şişeden ayrılmasını sağlamak için şişeyi 37 °C'lik bir kuluçka makinesine 4-5 dakika yerleştirin.
- Hücre kültürü ortamının 9 mL'sini ekleyin ve hücreleri yerinden çıkarmak ve homojen bir süspansiyon oluşturmak için şişenin altını birkaç kez hafifçe yıkayın.
- Seyreltin HeLa 57A hücreleri 1:6 veya 1:8 taze medya ve tohum yeni şişeler içine. Geçiş hücreleri % 90'ı konfluent olduğunda veya her üç günde bir hücreleri en az %25 birarada tutarlar.
- Hücre stimülasyonundan bir gün önce HeLa 57A hücrelerini deneyin ve 10 mL büyüme ortamında askıya alın. Hemositometre kullanarak askıdaki hücreleri sayın ve hücreleri 50 mL konik tüpte 2,5 x 105 hücre/mL'lik son konsantrasyona seyreltmek için büyüme ortamını kullanın.
- 250 μL hücre süspansiyonu (~6,25 x 104 hücre) 48 kuyulu bir plakanın her kuyuya aktarın. Homojen bir hücre süspansiyonu sağlamak için konik tüpü periyodik olarak kapatın ve ters çevirin. Hücrelerin kuyularda düzgün bir şekilde dağdığından emin olmak için plakaya yan tarafta hafifçe dokunun.
- Plakayı %5 CO2 kuluçka makinesinde 37 °C'ye aktarın ve hücrelerin bir gecede bağlanmasını ve büyümesini bekleyin.
2. Bakterilerin Hazırlanması
- Enfeksiyondan iki gün önce, tek koloniler üretmek için LB agar plakaları üzerine Salmonella serisi dondurulmuş stokları. Plakaları 37 °C'ye ayarlanmış bir kuluçka makinesine aktarın ve bir gecede büyümeye izin verin.
- Enfeksiyondan bir gün önce steril bakteri kültür tüplerine 3 mL likit et suyu (LB) ekleyin ve ortama uygun antibiyotikleri ekleyin.
- Steril bir aşılama döngüsü kullanarak, çizgili bakteri kültürlerinden tek bir koloni seçin ve lb ortama döngü dokunun. Aşı yaptıktan sonra tüpleri kaplayın ve döngüyü atın.
- Tüpleri 37 °C, 180 rpm'de sallanan bir kuluçka makinesine yerleştirin ve bir gecede büyümesini bekleyin.
- Enfeksiyon günü, kuvözden bir gecede bakteri kültürlerini alın.
- Uygun olduğunda antibiyotik içeren 3 mL taze LB ekleyerek alt kültür için tüpler hazırlayın.
- Bir gecede bakteri kültürünün 30 μL'sini (100'de 1 seyreltme) yeni hazırlanmış ortama aktarın. Tüpleri 37 °C'de 3 saat boyunca sallayarak bir kuluçka makinesine yerleştirin.
- 3 saat kuluçkadan sonra, 1 mL steril LB suyu plastik bir cuvette içine boş olarak hizmet vermek için aktarın. Numune analizi için kullanılacak diğer cuvettelere 900 μL LB aktarın.
- 100 μL bakteriyel alt kültürü 900 μL LB ve pipet içeren bir cuvette birkaç kez karıştırmak için aktarın. Her bakteriyel süspansiyon için bunu tekrarlayın.
- 600 nm (OD600)dalga boyunda bakteri kültürlerinin optik yoğunluğunu (OD) ölçmek için spektrofotometreyi açın.
- Boşluğu spektrofotometreye yerleştirin. Oryantasyona dikkat edin, çünkü bu tür bir işaret gösteren en üste doğru bir işaret olmalıdır.
- Kapağı kapatın ve arka plan absorbansını elde etmek için spektrofotometredeki Boş düğmesine basın.
- Boş cuvette'yi aynı oryantasyonda bir örnek cuvette ile değiştirin ve Okutuşuna basın.
- Bu örneklerin OD600 değerlerini kaydedin. Seyreltme faktörlerini hesaba katmak için değeri 10 ile çarpın.
- Kabaca 1 x 109 cfu/mL'ye karşılık gelen yaklaşık 1,0 emici değer elde etmek için bakteriyel alt kültürü taze LB ile seyreltin. Bir cuvette bu süspansiyon 1:10 seyreltin ve absorbans ölçmek - ~ 0.1 bir değer vermelidir.
- Yeni bir tüpte, seyreltilmiş alt kültürün uygun bir hacmini taze LB'ye ekleyerek inokül olarak kullanılmak üzere 1 x 108 cfu/mL süspansiyon elde edin.
- Yaklaşık 102 cfu/mL son seyreltme yapılana kadar 450 μL steril PBS (10 kat seyreltme) içeren bir tüpe 50 μL bakteriyel süspansiyon aktararak inokülseri seyreltme hazırlayın.
- En düşük iki seyreltmenin 100 μL'sini (sırasıyla 10 ve 100 koloni şekillendirme ünitesinekarşılık gelen 10 00 000) lb agar plakasına aktarın ve tek kolonielde etmek için süspansiyonu bir hücre dağıtıcısı ile yayın. Bu plakaları 37 °C'lik bir kuluçka makinesine aktarın ve bir gecede kuluçkaya yatırın.
- Ertesi gün kolonileri saymak ve gerçek inoculum konsantrasyonu belirlemek için ilk inoculum bakteri konsantrasyonu hesaplamak.
3. Hücrelerin Enfeksiyonu
NOT: Bu noktada, hücreler yaklaşık% 90 birleşim olmalıdır. 48 kuyulu bir plakadaki HeLa 57A hücreleri için bu, her kuyuda yaklaşık 1 x 105 hücredir. Hücreler 10 enfeksiyon (MOI) veya 106 cfu / iyi çokluğu ile enfekte olacaktır.
- Her bir kuyu için kullanılacak enfeksiyon koşullarına göre plakanın kapağını etiketlayın, her koşul triplicate olarak yapılmaktadır.
- Uygun kuyulara 10 μL inokül ekleyin. Enfekte olmayan kontrol kuyularına 10 μL steril LB ekleyin.
- Enfeksiyon süresini senkronize etmek için plakayı bir masa üstü santrifüje yerleştirin ve 5 00 x g'da 5 dk boyunca döndürün, böylece plaka dengelenir.
- Enfekte hücreleri 37 °C'de %5 CO2 kuluçka makinesine 1 saat aktarın.
- Bir sonraki adımda kullanılmak üzere 37 °C'lik bir su banyosuna hücre kültürü ortamının bir aliquot'u yerleştirin.
- Enfeksiyon zamanından bir saat sonra, su banyosundan hücre kültürü ortamını çıkarın ve %70 etanol ile dış yüzeyi silin. Doku kültür plakasını biyogüvenlik kabinesine aktarın.
- Steril tekniği kullanarak, kuyulardan aspirasyon ortamı ve taze, sıcak hücre kültürü medya 250 μL ile değiştirin.
- Plakaları 37 °C'de %5 CO2 kuluçka makinesine 4 saat daha iade edin.
- CO2 kuluçka makinesinden plakaları çıkarın ve medyayı kuyulardan aspire edin. Luciferase analizi için adım 4.1 devam edin. RNA yalıtımı için adım 5.1'e geçin.
4. Luciferase Analizi
- Kuyulara 100 μL 1x hücre lisis tamponu ekleyin. Tampon ilk reaktif bağlı olarak, bir çalışma konsantrasyonu seyreltilmiş gerekebilir.
- Plakayı -80 °C'lik bir dondurucuya aktarın ve etkili hücre lisisi sağlamak için en az 30 dakika kuluçkaya yatırın.
- Dondurulmuş hücre lisatiçeren plakayı bir tezgahın üzerine yerleştirin ve üreticinin tavsiyelerine göre luciferase substrat reaktiflerini hazırlayın.
- Luciferase substrat reaktiflerin oda sıcaklığını dengelemesine izin verin.
- Plaka okuyucuyu açın ve ilgili okuyucu programını açın. Makineyi parlaklığı ölçecek şekilde ayarlayın.
- Her numunenin 10 μL'sini opak 96 kuyuluk bir kuyuya aktarın.
- Opak plakanın her kuyusuna çok kanallı pipet kullanarak Luciferase Assay Reaktifinin 50 0L'sini ekleyin.
- Kuyuları karıştırmak ve alt yüzeyin sıvıyla kaplı olduğundan emin olmak için yan taraftaki tabağa hafifçe dokunun. Plakayı bir plaka okuyucuya yerleştirin ve okumayı başlatın.
- Parlaklık değerlerini elektronik tablo programına kopyalayın ve sonuçları çizin.
5. RNA İzolasyon
- Her kuyuya 500 μL guanidium tiyosiyanat ekleyin ve tam bir lizin sağlanması için birkaç kez pipet yukarı ve aşağı.
- İçeriği etiketli bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. RNA kalitesini korumak için numuneleri mümkün olduğunca buzüzerinde saklayın.
- 4 °C'ye bir masa üstü santrifüj ayarlayın ve protokolün geri kalanı için bu sıcaklıkta santrifüj korumak.
- Her numune tüpüne 100 μL kloroform ekleyin, sıkıca kaplayın ve 15 s. 10 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yatın.
- 4 °C'de 15 dk için 12.000 x g santrifüj. Bu süre zarfında, yeni tüpler etiketleyerek RNA arıtma sonraki adım için hazırlayın.
- Üst sulu fazı 250 μL izopropanol içeren yeni tüpe aktarın, orta veya alt katmanları rahatsız etmemeye dikkat edin.
- Kullanılmayan ürünü protein analizi için de kullanılabilen -80 °C'lik bir dondurucuda saklayınız. RNA daha sonra gerekirse artık sulu katman da yedek olarak hizmet verebilir.
- Vortex sulu tabaka ve izopropanol karışımı ve örnekleri 10 dakika oda sıcaklığında oturup izin.
- Numuneleri 12.000 x g'de 10 dakika 4 °C'de santrifüj edin.
- Tüpleri santrifüjden çıkarın. RNA çökelti tüpün yan ve alt kısmında beyaz bir pelet oluşturur. Tüpleri açın ve bir atık kabına dökerek supernatant dikkatle çıkarın.
- RNA peletini %75 etanol ve girdap 500 μL ekleyerek yıkayın.
- 4 °C'de 5 dk için 8.000 x g santrifüj.
- Dışarı dökerek supernatant çıkarın ve tekrar% 75 etanol ile pelet yıkayın.
- 4 °C'de 5 dk için 8.000 x g santrifüj.
- Küçük hacimli bir pipet (örn. 10-200°L hacim) kullanarak, herhangi bir sıvıyı tüpe geri itmemeye veya pipet ucuyla peleti yerinden çıkarmamaya dikkat edin. Pelet yerinden olursa, santrifüj kısa ve tekrar supernatant kaldırmaya çalışın.
- RNA peletlerini havayla kurutun. Peletler herhangi bir örnek için görünürse, periyodik olarak (her 5 dakikada bir) beyazdan temizliğe doğru değişip değişmediklerini kontrol edin ve kuru olduklarını belirtin. Peletler açık dönmeye başladıktan sonra, RNA'yı eritmek için 20°L ultra saf, RNa serbest su ekleyin.
- Peletler başlangıçta herhangi bir örnek için görünür değilse, sadece supernatant çıkardıktan sonra ultrasaf su 5 dk ekleyin.
- Çözünürlüğü artırmak için, çözeltiyi bir pipet ucu ile birkaç kez geçirin ve 55-60 °C'de 10 dakika kuluçkaya yatırın.
6. RNA'nın DNase Tedavisi
- RNA bütünlüğünü korumak için, aksi belirtilmedikçe RNA örneklerini buz üzerinde saklayın. Şu anda, 10x DNase tampon dondurucu dan kaldırılabilir ve buz üzerinde çözülmeye izin.
- Tüm numune analiz yüzeylerini tüy bırakmayan bir bezle temizleyerek spektrofotometreyi numune analizi için hazırlayın.
- Analizden önce bir arka plan ölçümü alın. Bunu yapmak için sensörü RNA peletlerini eritmek için kullanılan aynı ultra saf suyun 1,5 00 000'ı ile yükleyin. Arka plan okuması oluşturmak için Boş Oku düğmesine basın.
- Cihazın numune yükleme yüzeyini silmek için tüy bırakmayan bezi kullanın. Her örnek okumadan sonra bu adımı tekrarlayın.
- 1,5 μL'lik yeniden askıya alınan RNA'yı numune sahibine yükleyin ve Read Sample'ıseçin. Tüm örnekler okunana kadar tekrarlayın.
- 1,5 mL mikrosentrifuge tüpte numune başına 2,4 μL 10x DNase tamponu ve 1 μL DNase birleştirerek DNase ana karışımını hazırlayın. Ana karışımı iki ekstra birim için hazırlayın.
- Tüpü birkaç kez hareket ettirerek ana karışımı karıştırın. Kısaca tüpün altındaki içeriği toplamak için tüp santrifüj. 20 μL RNA numunesine 3,4 μL mastermix ekleyin. Daha önce olduğu gibi, kısa bir süre flicking ve santrifüj tarafından karıştırın içeriği.
- Numuneleri 20 dk. 37 °C'de ayarlanmış bir ısı bloğuna aktarın.
- 20 dk ısı bloğu üzerine örnekleri yerleştirdikten sonra, çalışma tezgahına yerleştirilen bir tüp raförnekleri aktarın.
- DNase inaktivasyon reaktifinin içeriğini yavaşça girdaplayın. 2,6 μL DNase inaktivasyon reaktifini RNA içeren tüplere aktarın ve homojen bir karışım oluşturmak için tüpleri hareket ettirin.
- 1 dk için 12.000 x g'de numuneleri santrifüj edin.
- Dikkatle pipet yeni, etiketli tüp için supernatant.
7. mRNA'nın cDNA'ya ters transkripsiyonu
- Numune miktarına bağlı olarak bir ana karışım ve pipetleme yoluyla kaybı hesaba katmak için iki ekstra karışım hazırlayın (Tablo 1). 1 μg RNA kullanın ve toplam 50°L'lik bir hacme H2O ekleyin.
| Reaktif | Hacim (3L) | Son Konsantrasyon |
| MgCl2 (25mM) | 3.5 | 1,75 mM |
| Ters transkripsiyon tamponu (10x) | 5 | 1 x |
| dNTP karışımı (her biri 10 μM) | 2.5 | 500 nm |
| rastgele hexamer (100 μM) | 1.25 | 2,5 μM |
| Multiscribe ters transkriptaz (50 U/μL) | 1 | 1 U/μL |
| RNase inhibitörü (20 U/μL) | 1.25 | 1.25 U/μL |
| RNA (1 μg) | 20 ng/uL | |
| H2O | 50'ye kadar üst |
Tablo 1: Ters transkripsiyon ana karışımı için bileşenler ve reçete.
- Numuneleri sıkıca kapatın ve yan taraftaki PCR tüpleri, kapaktaki etiketler daha sonra termocycler'ın ısıtılmış kapağından çıkarılabileceği nden etiketleyin. Girdap ile karıştırın.
- Kısaca pcr tüpleri tüpün altına örnek toplamak için santrifüj.
- PCR tüplerini bir termocycler'a yerleştirin ve örnekleri aşağıdaki ayarların altında çalıştırın:
10 dk için 25 °C, 30 dk için 48 °C, 5 dk için 95 °C ve ardından 10 °C'de tutun. - Yeni sentezlenen cDNA içeren tüpleri -20 °C'lik bir dondurucuya aktarın veya qPCR analizinde hemen kullanın.
8. RT-qPCR Analizi için Hazırlama ve Yükleme Plakası
- Başlamadan önce, numune analizi için 384-well qPCR plakakurulum planı.
- Buz üzerinde astar ve cDNA çözülür.
- Ana karışımı hazırlayın (bkz. Tablo 2),ayrıca pipetleme yoluyla kaybı nı hesaba katmak için yaklaşık %10 ekstra.
| Reaktif | Hacim (3L) |
| 10 μM F astar | 1 |
| 10 μM R astar | 1 |
| Ultrasaf H2O | 4 |
| 2x SYBR yeşil | 10 |
Tablo 2: QPCR ana karışımının bileşenleri ve tarifi.
- Girdap ana karışımı ve bir tekrarlayıcı pipet kullanarak 384-iyi plaka kuyularına 8 μL dağıtmak. Numuneler her astar ve cDNA örnek kombinasyonu için çoğaltılamaz olarak analiz edilecektir.
- P10 (veya daha küçük) pipet kullanarak, analiz edilecek her astar kümesi için yinelenen kuyulara 2 μL cDNA aktarın. Çapraz kontaminasyonu önlemek için her kuyudan sonra uçları değiştirin.
- Yapışkan filmi yüzeye dikkatlice uygulayarak plakayı kapatın ve tüm kuyuların kapalı olmasını sağlayın. Sıkıca mühürlemek için bir sızdırmazlık kürek veya rulo kullanarak film basın.
- Bir kontrütük içinde plaka yerleştirin, bir denge olarak boş bir plaka ile. 5 dk için 500 x g plaka santrifüj.
9. QPCR Analizi için Thermocycler'ın Çalıştırıl
- Bilgisayarda ve gerçek zamanlı PCR cihazında güç.
- RT-qPCR yazılımını açın ve Yeni Deneyseçin.
- Kurulum sekmesinin altında, çalıştırma parametrelerinin ayarlanabileceği Deneme Özellikleri'niseçin.
- Sonuçları depolamak için kullanılan dosya adını ve ayarlarını ayarlayacak Olan Deneme Adınıtanımlayın.
- Enstrüman Seçimiiçin, analizi çalıştıracak olan şu anda bağlı olan aracı seçin. Karşılaştırmalı CT (ΔΔCt) çalıştırma yöntemini seçin.
- Kullanılacak floresan DNA boyası olarak SYBR Yeşil Reaktifleri ve rampa hızı olarak Standart'ı seçin.
- Erime Eğrisi Ekle'nin yanındaki kutunun işaretli olduğundan emin olun.
- Tanımsekmesi'nin altında, hedefleri (yani güçlendirilecek genler) ve örnekler (yani deneysel koşullar) atayın.
- Atla sekmesini seçin. Kuyuları 384 kuyulu plakanın yükleme şemasına karşılık gelen uygun hedefler ve numunelerle etiketleyin.
- Çalıştır Yönteminiseçin. (Tablo3)listelenen analiz parametrelerini kullanın.
| Sahne Yi tutun | PCR Sahne Alanı | Erime Eğrisi Aşaması | |||||
| Adım 1 | Adım 2 | Adım 1 | Adım 2 | Adım 1 | Adım 2 | Adım 3 | |
| Temp | 50 °C | 95 °C | 95 °C | 60 °C | 95 °C | 60 °C | 95 °C |
| Zaman | 2:00 | 10:00 | 0:15 | 1:00 | 0:15 | 1:00 | 0:15 |
| Veri Toplama | Evet | Evet | |||||
| Döngü sayısı | 1 x | 40x | 1 x | ||||
Tablo 3: Termocycler için çevrim parametreleri.
- 384 kuyulu plakayı termocycler'a yerleştirin ve analize başlayın.
10. Delta-delta Ct Yöntemi ile QPCR Sonuçlarının Analizi (2-ΔΔCt)
- Akış analizini engelleyebilecek hatalar için qPCR reaksiyonundan oluşturulan sonuçları analiz edin. Birçok hata sistem tarafından otomatik olarak işaretlenir.
- Düzgün bir şekilde inşa edilmiş astarlar için, erime eğrilerinin yalnızca bir tepe noktası olmalıdır. Daha fazla analiz birden fazla tepe ile erime eğrisi içeren kuyular hariç.
- ΔΔCt yöntemini kullanarak verileri çözümlemek için Ct değerlerini bir elektronik tablo programına dışa aktarın. Önerilen biçim sağlanır (Tablo 4). Son sütun, denetim örneklerine göre örneğin kat ifade değişimidir.
| Temizlik geni (GAPDH) | İlgi geni (IL6) | ||||||||||
| Ct1 | Ct2 | Ave Ct | Ct1 | Ct2 | Ave Ct | ΔCt | Ave ΔCt ctrls | ΔΔCt | 2^-(ΔΔCt) | Geomean | |
| Kontrol 1 | 15.33 | 15.37 | 15.35 | 26.81 | 26.91 | 26.86 | 11.51 | 10.51 | 1.00 | 0.50 | 1.00 |
| Kontrol 2 | 16.83 | 16.77 | 16.80 | 26.89 | 26.92 | 26.91 | 10.11 | 10.51 | -0.41 | 1.33 | |
| Kontrol 3 | 17.56 | 17.53 | 17.54 | 27.38 | 27.56 | 27.47 | 9.93 | 10.51 | -0.59 | 1.50 | |
| Sl1344 1 | 15.50 | 15.41 | 15.45 | 22.15 | 22.13 | 22.14 | 6.69 | 10.51 | -3.83 | 14.21 | 13.23 |
| SL1344 2 | 16.02 | 15.98 | 16.00 | 23.01 | 22.96 | 22.98 | 6.98 | 10.51 | -3.53 | 11.57 | |
| SL1344 3 | 17.27 | 17.30 | 17.28 | 23.99 | 23.98 | 23.98 | 6.70 | 10.51 | -3.82 | 14.09 | |
| sipA sopB sopE2 1 | 15.38 | 15.41 | 15.39 | 23.31 | 23.09 | 23.20 | 7.80 | 10.51 | -2.71 | 6.56 | 7.29 |
| sipA sopB sopE2 2 | 16.01 | 16.05 | 16.03 | 23.89 | 23.92 | 23.91 | 7.88 | 10.51 | -2.64 | 6.23 | |
| sipA sopB sopE2 3 | 16.78 | 16.78 | 16.78 | 24.02 | 24.06 | 24.04 | 7.27 | 10.51 | -3.25 | 9.49 | |
| sipA sopB sopE2 sopE 1 | 15.52 | 15.60 | 15.56 | 27.04 | 27.03 | 27.03 | 11.47 | 10.51 | 0.96 | 0.51 | 0.79 |
| sipA sopB sopE2 sopE 2 | 15.56 | 15.59 | 15.57 | 26.37 | 26.42 | 26.39 | 10.82 | 10.51 | 0.31 | 0.81 | |
| sipA sopB sopE2 sopE 3 | 15.91 | 15.92 | 15.91 | 26.24 | 26.12 | 26.18 | 10.27 | 10.51 | -0.25 | 1.19 | |
Tablo 4: QPCR verilerini analiz etme biçimi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada açıklanan tsay, NF-κB'ye bağlı luciferase muhabiri kullanılarak transkripsiyon faktörü NF-κB'nin aktivasyonuna odaklanarak HeLa hücrelerinin bir hattına dönüştürüldü. Aktive NF-κB, pro-inflamatuar sitokinler IL6 ve IL23de dahil olmak üzere hedef genlerin κB bağlayıcı bölgelerini bağladığı çekirdeğe aktarır. NF-κB aktivasyonuna genel bir genel bakış Şekil 1'degösterilmiştir. Gram-negatif bakteri Salmonella enterica serovar Typhimurium bu çalışmada NF-κB'nin aktivatörve sonraki IL6 ekspresyonu olarak kullanılmıştır (Şekil 2). Patogenez için gerekli olan başlıca virülans faktörlerinden biri S'yeizin veren Tip III Salgı Sistemi-1 (T3SS-1) Tiphimurium hücreleri enfekte etmek ve NF-κB aktivasyon indüklemek için. T3SS-1'in işlevi, bakteriyel proteinleri, yani efektörleri konak hücrelere ulaştırmaktır. Burada efektör proteinler konak epitel hücrelerinin invazyonuna aracılık etmek için çok sayıda hücresel sinyal yollarını hedeflemektedir. Starafından indüklenen NF-κB aktivasyonu . Tiphimurium çoğunlukla T3SS-1 efektör proteinlerSopE, SipA, SopB ve SopE218bağlıdır. Burada, HeLa 57A hücreleri yabani tip Sile enfekte edildi. Tiphimurium suş SL1344 ve iki mutant suşları ya üç eksik(SipA, SopB, SopE2) veya dört(SipA, SopB, SopE2, SopE) efektör proteinler. Şekil 2, HeLa57A hücrelerinde NF-κB'ye bağlı luciferase aktivasyonunun(Şekil 2A)ve IL6 gen ekspresyonunun(Şekil 2B)temsili bir deneyidir. Tiphimurium suşları. Yabani tip SL1344 suşu ile enfeksiyon SipA, SopB, SopE2 üçlü mutant (SopE bağımlı yanıt) ile enfekte hücrelerde azalır ve SipA, SopB, SopE2, SopE2, SopE dörtlü mutant ile kontrol seviyelerine indirgenir güçlü bir luciferase sinyali neden olur. Bağıl lüminesans birimleri (RLU) IL6 ifade düzeyleri ile ilişkilidir(Şekil 2). Şekil 3 RT-qPCR analizinden elde edilen sonuçları temsil eder.
Şekil 1: NF-κB aktivasyonu ve aşağı akım okumalarının şeması. Yukarıda özetlenen NF-κB, inhibitör protein IκBα tarafından inaktif bir durumda sitosol da tutulur. Hem iç hem de dış uyaranlar IkK aktivasyonuna katkıda bulunabilir, hangi fosforilasyon IκBα ve sonraki proteozomal bozulmaya neden olur. IκBα'nın bozulması nf-κB'nin nükleer lokalizasyon sinyalini ortaya çıkarır, bu da translokasyonu teşvik eder. Çekirdekte, aktif NF-κB hedef genlerin κB bağlayıcı bölgelerine bağlanır, transkripsiyon ve ifade teşvik. Sitokinler IL6 ve IL23gibi hedef genler RT-qPCR ile ifade edilir ve ölçülür. HeLa 57A hücreleri luciferase NF-κB aktivasyonu sonrasında ifade edilir, hangi lüminesans tahlilleri ile ölçülebilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: S'den sonra lüminesans tahlil ve RT-qPCR analizinin temsili verileri. HeLa 57A hücrelerinin tiphimurium enfeksiyonu. 1 x 105 HeLa 57A hücreleri 106 cfu (MOI = 10) günlük faz S ile enfekte edildi. Typhimurium yabani tip SL1344, veya Mutant suşları Eksik SipA, SopB ve SopE2, ve SipA, SopB, SopE2 ve SopE. 1 saat sonra ortam değiştirildi ve kuluçka ya da dört saat daha devam etti. (A) Hücreler lüminesans tahlilleri ile luciferase ifadesi için işlenmiştir. (B) Rt-qPCR analizinde kullanılan RNA hücreleri çıkarıldı. Delta-delta Ct yöntemi (2-ΔΔCt)kullanılarak hedef genlerin göreli ekspresyonu gösterilmiştir. Triplicate kuyuların ortalama ve standart sapması gösterilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: RT-qPCR analizinden elde edilen özet sonuçları. (A) S ile enfekte olmuş HeLa 57A hücrelerinden GAPDH'yi yükselten kuyular için bir amplifikasyon çizimi gösterilmiştir. Tiphimurium. (B) GAPDH astarları içeren kuyuların erime eğrisi çizimi yaklaşık 84 °C'ye karşılık gelen tek bir erime tepe noktasını gösterir. (C) IL-6 için astar içeren yinelenen kuyular. Kuyulardan biri, siyah bir okla belirtildiği gibi ikinci bir erime zirvesi gösterir ve analizden dışlanmalıdır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Açıklanan protokolün en önemli katkısı, hücrelerde NF-κB aktivasyonunu saptamak için hızlı ve kolay bir yöntem sunmasıdır, bu da birden fazla uyarıcı koşulun veya NF-κB aktivasyonunu etkileyen ilaçların yüksek iş analizine olanak sağlar. Burada Salmonellaenfekte HeLa hücrelerinde NF-κB aktivasyonu için bir protokol açıklıyoruz. Bu hücreler diğer patojenler ile enfeksiyon için yanı sıra NF-κB aktivasyonu bakteriyel enfeksiyonun etkisini incelemek için kullanılabilir. Buna ek olarak, HeLa 57A hücrelerinde NF-κB bağımlı luciferase aktivasyonu, NF-κB aktivasyonuna yol açan sinyal yollarının aktivatörleri veya inhibitörleri için tarama için kullanılabilir. Burada, HeLa 57A hücrelerini 48 kuyuplakaya seriliyoruz, ancak bu deneyler deney başına daha fazla numune ye izin vermek için 96 ve hatta 384 kuyulu plakalara kadar ölçeklendirilebilir. HeLa 57A hücreleri, β-gal tahlilleri kullanılarak hücre sayısı ve canlılık için bir iç kontrol olarak ölçülebilen LacZ'ı oluşturan bir şekilde ifade eder. Burada açıklanan protokol, bir NF-κB ile geçici olarak transfeced hücre hatlarında kullanım için geçerlidir::luciferase reporter construct. RAW264.7 makrofaj hücre hattı zaten böyle bir amaç için kullanılmıştır18. Daha da önemlisi, bu yöntem beş farklı NF-κB alt biriminin farklı homo/heterodimerlerinin aktivasyonu arasında ayrım yapmaz. Farklı NF-κB homo- heterodimer kompleksleri, promotör dizileri için farklı yakınlıklar yanı sıra farklı transkripsiyonel sonuçları21vardır. İmmünglobulin κ-chain promoter bölgesinden κB bağlayıcı bölgelere düşük afinite bağlanması nedeniyle burada açıklanan muhabir kullanılarak belirli bir NF-κB dimer aktivasyonunun gözden kaçırılması mümkündür.
Bir hücre hattını uyarmak için uygun koşulların diğeri için doğrudan geçerli olmayabileceğini belirtmek önemlidir. Bu nedenle, her bir tsay sisteminde, asay koşullarının optimize edilmesi önerilir. NF-κB aktivasyonunu değerlendirirken enfeksiyon süresi, MOI, ilaç tedavisisüresi, ilaç dozu ve tohumlama koşulları dikkate alınması gereken önemli hususlardır. Örneğin, RAW264.7 makrofajlar, HeLa 57A hücrelerinde görüldüğü gibi benzer bir parlaklık sinyali üretmek için farklı koşullar gerektiren Salmonella enfeksiyonuna karşı daha duyarlıdır18.
Lüminesans ölçümleri sırasında, kenar kuyularının benzer şekilde uyarılmış diğer kuyulardan çok farklı değerlere sahip olması nadir değildir. Bu genellikle artan ilaç konsantrasyonuna yol açan plaka üzerinde kenar kuyularının yüksek buharlaşma oranları nedeniyle. Bu durum, kuyular arasındaki boşluğa serumsuz ortam eklenerek, buna izin veren plakalar için, buharlaşmayı azaltmak için kapak/plaka kombinasyonlarını değiştirerek veya sorunlar devam ederse kenar kuyularını tamamen atlayarak ele alınabilir.
Memeli hücrelerinde ifade, firefly luciferase birkaç saat bir yarı ömrü vardır ve genellikle en muhabirtahliller 22amaçları için istikrarlı olarak kabul edilir. Burada açıklananlardan daha uzun tedavi süreleri güvenilir bir şekilde gerçekleştirilebilir. Ancak, burada kullanılan luciferase tsay sistemi sadece ilk dakika için istikrarlı bir sinyal üretir ve bundan sonra hızla bozulur. Bu nedenle, parlaklık ölçüsühücre lysate ve substrat karıştırıldıktan sonra hızlı bir şekilde yapılması son derece önemlidir.
NF-κB, sitokinler ve kemokinler (yani Il6 ve Il23)dahil olmak üzere genlerin büyük bir dizi için bir transkripsiyon faktörüdür. NF-κB'ye bağlı luciferase aktivitesinin ölçülmesi bu sitokinlerin ve kemokinlerin ifade edilsin. Bu yöntem, nf-κB aktivitesini etkileyen koşulların karakterizasyonu için potansiyel bir ilk ekran olarak hizmet vererek mevcut moleküler nicelleştirme tekniklerini tamamlayabilir ve bu da rt-qPCR ile işlevsel olarak doğrulanabilir. NF-κB aktivasyonunun fonksiyonel doğrulaması, mRNA niceleminin uygun olmadığı durumlarda batı leke analizi veya bir proteine özgü fonksiyonel tahliller ile de yapılabilir. Bu interlökin-beta(Il1b),transkripsiyonu NF-κB bağlanması ile indüklenen bir gen için durumdur, ancak protein ürünü olgun ürün 23 ,24oluşturmak için post translational modifikasyon gerektirir .
Burada açıklanan özel RNA yalıtım protokolü RT-qPCR analizinde kullanılmak üzere kullanılabilecek tek protokol değildir ve bunun yerine ticari olarak kullanılabilen kitler gibi diğer tercih edilen yöntemler kullanılabilir. RNA'nın kalitesinin süreç için çok önemli olduğunu ve bu nedenle RNA'nın bozulmasını önlemek için mümkün olduğunca buzda tutulması gerektiğini unutmayın. 384 kuyulu plakayı yüklerken bu kadar küçük hacimlerin pipetlenmesi genellikle hataya neden olabileceğinden, RT-qPCR reaksiyonlarında yinelenen reaksiyonların PCR reaksiyonlarının tutarlı olduğunu tespit etmek önemlidir. Temizlik geninin ct değerleri numuneler arasında tutarlı olmalıdır ve bu sapmalar, nihai sonuçları etkileyebilecek ters transkripsiyon sırasında RNA konsantrasyonlarında verimsiz temizleme adımlarının veya tutarsızlıklarının göstergesi olabilir. Ayrıca her qPCR deneyden sonra erime eğrisini kontrol etmek önemlidir. Bir tepenin varlığı, qPCR astarlarının tek bir geni yükseltdiğini gösterir. Birden fazla eğri, hedef dışı gen amplifikasyonu veya astar dimer varlığı olduğunu göstermektedir. Her iki durumda da, erime eğrisinde birden fazla tepe noktası, astarların özgüllüğü sağlamak için yeniden tasarlanılması gerektiğini düşündürmektedir. Değişkenlik için çok fazla oda ile, egzersiz ve her adımda iyi tekniğin rafine doğru ve tekrarlanabilir sonuçlar üretmek için gereklidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Keestra-Gounder laboratuvarındaki araştırmalar, NIH'nin NIAID'inin R21AI122092 Ödülü kapsamında ve Amerikan Diyabet Derneği'nin 1-18-JDF-035 ödül numarası altında verdiği bağışlarla desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adhesive film | VWR International | 60941-070 | |
| Chloroform | Fisher Bioreagents | C298-500 | |
| DMEM | Thermo Fisher | 11665092 | |
| DNAse treatment kit | Qiagen | 79254 | |
| dNTPs | Promega | U1511 | |
| Ethanol | Fisher Bioreagents | BP2818100 | molecular grade |
| FBS | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| HeLa 57A cells | Ref # 15 | ||
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368814 | |
| Isopropanol | Fisher Bioreagents | BP26181 | |
| Kanamycin | Fisher Bioreagents | BP906-5 | |
| LB agar | Fisher Bioreagents | BP1425-500 | |
| Lysogeny broth | Fisher Bioreagents | BP1426-500 | |
| MgCl2 | Fisher Chemical | ||
| NanoDrop ND-1000 | Thermo Scientific | spectrophotometer | |
| Promega luciferase assay system | Promega | E1501 | Cell lysis buffer & luciferin substrate |
| Random Hexamers | Thermo Scientific | SO142 | |
| Real-time GAPDH forward primer | 5'-CCAGGAAATGAGCTTGAC AAAGT-3' |
||
| Real-time GAPDH reverse primer | 5-'CCCACTCCTCCACCT TTGAC-3' |
||
| Real-time IL-23 forward primer | 5-'GAGCCTTCTCTGCTCCC TGAT-3' |
||
| Real-time IL-23 reverse primer | 5'-AGTTGGCTGAGGCCCAGTAG-3' | ||
| Real-time IL-6 forward primer | 5'-GTAGCCGCCCCACACAGA-3' | ||
| Real-time IL-6 reverse primer | 5'-CATGTCTCCTTTCTCAGG GCTG-3' |
||
| Reverse Transcriptase | Applied Biosystems | 4308228 | |
| RNAse inhibitor | Thermo Scientific | EO0381 | |
| RT buffer | Promega | A3561 | |
| SL1344 | Ref # 17 | ||
| SL1344 ΔsipA sopB::MudJ sopE2::pSB1039 | Ref # 18 | ||
| SL1344 ΔsopE ΔsipA sopB::MudJ sopE2::pSB1039 | Ref # 18 | ||
| SYBR green | Applied Biosystems | 4309155 | 2x mastermix |
| Tri-reagent | Molecular Research Center | TR 118 | guanidine thiocyanate |
| Trypsin -EDTA | Thermo Fisher | 25300054 | 0.05% Trypsin-EDTA |
| Ultrapure water | Fisher Bioreagents | BP248450 | |
| Well plate for PCR | VWR International | 89218-294 | 384-well plate |
References
- Liu, T., Zhang, L., Joo, D., Sun, S. C. NF-kappaB signaling in inflammation. Signal Transduction and Targeted Therapy. 2, (2017).
- Piva, R., Belardo, G., Santoro, M. G. NF-kappaB: a stress-regulated switch for cell survival. Antioxidants & Redox Signaling. 8 (3-4), 478-486 (2006).
- Lawrence, T. The nuclear factor NF-kappaB pathway in inflammation. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (6), a001651 (2009).
- Hargett, D., Rice, S., Bachenheimer, S. L. Herpes simplex virus type 1 ICP27-dependent activation of NF-kappaB. Journal of Virology. 80 (21), 10565-10578 (2006).
- Zaragoza, C., et al. Viral protease cleavage of inhibitor of kappaBalpha triggers host cell apoptosis. Proceedings of the National Academy of Sciences United States of America. 103 (50), 19051-19056 (2006).
- Gao, X., et al. Bacterial effector binding to ribosomal protein s3 subverts NF-kappaB function. PLOS Pathogens. 5 (12), e1000708 (2009).
- Kravchenko, V. V., et al. Modulation of gene expression via disruption of NF-kappaB signaling by a bacterial small molecule. Science. 321 (5886), 259-263 (2008).
- Kawai, T., Akira, S. Signaling to NF-kappaB by Toll-like receptors. Trends in Molecular Medicine. 13 (11), 460-469 (2007).
- Pinaud, L., Sansonetti, P. J., Phalipon, A. Host Cell Targeting by Enteropathogenic Bacteria T3SS Effectors. Trends in Microbiology. 26 (4), 266-283 (2018).
- Karin, M. How NF-kappaB is activated: the role of the IkappaB kinase (IKK) complex. Oncogene. , (1999).
- Berti, R., et al. Quantitative real-time RT-PCR analysis of inflammatory gene expression associated with ischemia-reperfusion brain injury. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 22 (9), 1068-1079 (2002).
- Fried, M., Crothers, D. M. Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Research. 9 (23), 6505-6525 (1981).
- Holden, N. S., Tacon, C. E. Principles and problems of the electrophoretic mobility shift assay. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 63 (1), 7-14 (2011).
- Renard, P., et al. Development of a sensitive multi-well colorimetric assay for active NFkappaB. Nucleic Acids Research. 29 (4), E21 (2001).
- Nowak, D. E., Tian, B., Brasier, A. R. Two-step cross-linking method for identification of NF-kappaB gene network by chromatin immunoprecipitation. Biotechniques. 39 (5), 715-725 (2005).
- Ernst, O., Vayttaden, S. J., Fraser, I. D. C. Measurement of NF-kappaB Activation in TLR-Activated Macrophages. Methods in Molecular Biology. 1714, 67-78 (2018).
- Rodriguez, M. S., Thompson, J., Hay, R. T., Dargemont, C. Nuclear retention of IkappaBalpha protects it from signal-induced degradation and inhibits nuclear factor kappaB transcriptional activation. Journal of Biological Chemistry. 274 (13), 9108-9115 (1999).
- Mendez, J. M., Kolora, L. D., Lemon, J. S., Dupree, S. L., Keestra-Gounder, A. M. Activation of the endoplasmic reticulum stress response impacts the NOD1 signaling pathway. Infection and Immunity. , (2019).
- Hoiseth, S. K., Stocker, B. A. D. Aromatic-Dependent Salmonella-Typhimurium Are Non-Virulent and Effective as Live Vaccines. Nature. 291 (5812), 238-239 (1981).
- Keestra, A. M., et al. Manipulation of small Rho GTPases is a pathogen-induced process detected by NOD1. Nature. 496 (7444), 233-237 (2013).
- Wong, D., et al. Extensive characterization of NF-kappaB binding uncovers non-canonical motifs and advances the interpretation of genetic functional traits. Genome Biology. 12 (7), R70 (2011).
- Gupta, R., et al. Firefly luciferase mutants as sensors of proteome stress. Nature Methods. 8 (10), 879-884 (2011).
- Cogswell, J. P., et al. NF-kappa B regulates IL-1 beta transcription through a consensus NF-kappa B binding site and a nonconsensus CRE-like site. Journal of Immunology. 153 (2), 712-723 (1994).
- Thornberry, N. A., et al. A Novel Heterodimeric Cysteine Protease Is Required for Interleukin-1-Beta Processing in Monocytes. Nature. 356 (6372), 768-774 (1992).
