Summary
Dieser Artikel beschreibt die Protokolle, die verwendet werden, um eine neuartige Impfstoffbereitstellungsplattform, "Polybubbles", zu erstellen, um eine verzögerte Burst-Freisetzung zu ermöglichen. Polyester einschließlich Poly (Milch-Co-Glykolsäure) und Polycaprolacton wurden verwendet, um die Polybubbleen zu bilden und kleine Moleküle und Antigen wurden als Ladung verwendet.
Abstract
Impfstoffabgabestrategien, die die Exposition von Fracht gegenüber organischen Lösungsmitteln begrenzen und gleichzeitig neuartige Freisetzungsprofile ermöglichen, sind entscheidend für die Verbesserung der Impfabdeckung weltweit. Hier wird eine neuartige injizierbare, ultraviolett-heilbare und verzögerte Burst-Release-plattform namens Polybubbles eingeführt. Cargo wurde in Polyester-basierte Polybubbles injiziert, die in 10% Carboxymethycellulose-basierter wässriger Lösung gebildet wurden. Dieses Papier enthält Protokolle, um die sphärische Form der Polybubbles beizubehalten und die Ladungsplatzierung und -aufbewahrung zu optimieren, um die Frachtmenge innerhalb der Polybubbles zu maximieren. Um die Sicherheit zu gewährleisten, wurden die chlorierten Lösungsmittelingehalte innerhalb der Polybubbleen mittels Neutronenaktivierungsanalyse analysiert. Release-Studien wurden mit kleinen Molekülen als Ladung innerhalb der Polybubble durchgeführt, um eine verzögerte Burst-Freisetzung zu bestätigen. Um das Potenzial für die On-Demand-Lieferung der Ladung weiter aufzuzeigen, wurden Gold-Nanostäbe in der Polymerhülle gemischt, um eine Nahinfrarot-Laseraktivierung zu ermöglichen.
Introduction
Begrenzte Impfabdeckung führt zum Tod von 3 Millionen Menschen, die speziell durch durch Impfung vermeidbareKrankheiten1 verursacht werden. Unzureichende Lagerungs- und Transportbedingungen führen zur Verschwendung funktioneller Impfstoffe und tragen so zu einer reduzierten globalen Immunisierung bei. Darüber hinaus führt eine unvollständige Impfung aufgrund der Nichteinhaltung der erforderlichen Impfpläne auch zu einer begrenzten Impfabdeckung, insbesondere in Entwicklungsländern2. Innerhalb des empfohlenen Zeitraums sind mehrere Besuche des medizinischen Personals erforderlich, um Booster-Shots zu erhalten, wodurch der Prozentsatz der Bevölkerung mit vollständiger Impfung begrenzt wird. Daher müssen neue Strategien für die kontrollierte Impfstoffabgabe entwickelt werden, um diese Herausforderungen zu umgehen.
Zu den derzeitigen Bemühungen um die Entwicklung von Impfstoffabgabetechnologien gehören emulsionsbasierte Polymersysteme3,4. Die Ladung ist jedoch häufig einer größeren Menge an organischem Lösungsmittel ausgesetzt, die potenziell Aggregation und Denaturierung verursachen kann, insbesondere im Zusammenhang mitproteinbasierterLadung 5,6. Wir haben eine neuartige Impfstoff-Lieferplattform entwickelt, "Polybubbles", die potenziell mehrere Laderäume beherbergen kann, während das Frachtvolumen, das dem Lösungsmittel7ausgesetzt ist, minimiert wird. In unserer Polybubble-Kernschalenplattform wird beispielsweise eine Ladetasche mit einem Durchmesser von 0,38 mm (SEM) in die Mitte einer 1 mm Polybubble injiziert. In diesem Fall würde die Fläche der Ladung, die organischem Lösungsmittel ausgesetzt ist, etwa 0,453 mm2betragen. Nach Berücksichtigung der Packungsdichte von Kugeln (Mikropartikeln) innerhalb einer Kugel (Cargo Depot) beträgt das tatsächliche Volumen der Mikropartikel (10 m Durchmesser), die in das Depot passen könnten, 0,17 mm3. Das Volumen eines Mikropartikels beträgt 5,24x10-8 mm3 und somit beträgt die Anzahl der Partikel, die in das Depot passen können, 3,2x106 Partikel. Wenn jedes Mikropartikel 20 Ladetaschen (als Ergebnis einer Doppelemulsion) mit einem Durchmesser von 0,25 m hat, beträgt die Fläche der Ladung, die organischem Lösungsmittel ausgesetzt ist, 1274 mm2. Das Frachtdepot innerhalb der Polybubble hätte somit eine 2800-fach geringere Oberfläche, die organischem Lösungsmittel ausgesetzt wäre als organischer lösungsmittelexponierter Ladung in Mikropartikeln. Unsere Plattform auf Polyesterbasis kann somit die Menge der Fracht, die organischen Lösungsmitteln ausgesetzt ist, potenziell reduzieren, was andernfalls zu Ladungsaggregation und Instabilität führen kann.
Polybubbleen werden nach dem Phasentrennprinzip gebildet, bei dem das Polyester in organischer Phase in eine wässrige Lösung injiziert wird, was zu einer kugelförmigen Blase führt. Fracht in der wässrigen Phase kann dann in die Mitte der Polybubble injiziert werden. Ein weiterer Laderaum kann möglicherweise innerhalb der Polybubble erreicht werden, indem eine andere Ladung mit der Polymerhülle vermischt wird. Die Polybubble in diesem Stadium wird formbar sein und dann ausgehärtet werden, um eine solide Polybubble Struktur mit Ladung in der Mitte zu führen. Sphärische Polybubbles wurden gegenüber anderen geometrischen Formen gewählt, um die Ladekapazität innerhalb der Polybubble zu erhöhen und gleichzeitig die Gesamtgröße der Polybubble zu minimieren. Polybubbles mit Ladung in der Mitte wurden ausgewählt, um eine verzögerte Burst-Release zu demonstrieren. Polybubbleen wurden auch mit einem Nahinfrarot-(NIR)-empfindlichen (d. h. theranostisch-fähigen) Mittel, nämlich Gold-Nanostäben (AuNR), eingebaut, um eine Temperaturerhöhung der Polybubbleen zu verursachen. Dieser Effekt könnte möglicherweise einen schnelleren Abbau erleichtern und zur Steuerung der Kinetik in zukünftigen Anwendungen verwendet werden. In diesem Artikel beschreiben wir unseren Ansatz, Polybubbleen zu formen und zu charakterisieren, eine verzögerte Burstfreisetzung aus den Polybubbleen zu erreichen und AuNR in die Polybubbles zu integrieren, um eine NIR-Aktivierung zu verursachen.
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Protocol
1. Polycaprolacyontriacrylat (PCLTA) Synthese
- 3,2 ml 400 Da Polycaprolacyon (PCL) über Nacht bei 50 °C in einem offenen 200 ml runden Bodenkolben und K2CO3 in einer Glasdurchstechflasche bei 90 °C trocknen.
- Mischen Sie das Triol mit 6,4 ml Dichlormethan (DCM) und 4,246 g Kaliumcarbonat (K2CO3) unter Argon.
- 2,72 ml Acrylylchlorid in 27,2 ml DCM mischen und tropfenweise in das Reaktionsgemisch im Kolben über 5 min geben.
- Bedecken Sie das Reaktionsgemisch mit Aluminiumfolie und lassen Sie es bei Raumtemperatur 24 h unter Argon ungestört.
- Filtern Sie nach 24 h das Reaktionsgemisch mit einem Filterpapier auf einem Buchner-Trichter unter Vakuum, um überschüssige Reagenzien zu entsorgen.
- Ausfällungfiltrat aus Schritt 1.5, das das endbedeckte Polymer in Derethylether in einem 1:3 (vol/vol) und Rotovape bei 30 °C enthält, um den Diethylether zu entfernen.
2. Bildung der Polybubble
HINWEIS: Das Einspritzen von Polymer in das deionisierte (DI) Wasser würde dazu führen, dass die Polybubbles auf den Boden der Durchstechflasche wandern, was zu abgeflachten Böden führt. Verwenden Sie 10% (wt/vol) Carboxymethylcellulose (CMC) füllen Sie stattdessen die Glasdurchstechflasche, um polybubble Abflachung zu vermeiden.
- Bereiten Sie 10% (wt/vol) CMC-Lösung in DI-Wasser vor.
- Füllen Sie eine 0,92 ml Glasdurchstechflasche mit 0,8 ml 10% CMC mit einer 1 ml Transferpipette.
- Mischen Sie 1000 mg/ml von 14 kDa PCL in DCM und synthetisieren SIE PCLTA in einem 1:3 (vol/vol) für ein Gesamtvolumen von 200 l oder bereiten Sie 200 l von 1000 mg/ml von 5 kDa Poly (Milch-Co-Glykolsäure) Diakrylat (PLGADA) in Chloroform vor.
- Mischen Sie das 2-Hydroxy-4-(2-Hydroxyethoxy)-2-Methylpropiophenon (Photoinitiator) mit dem Polymergemisch (PLGADA oder PCL/PCLTA) in 0,005:1 (vol/vol).
- Laden Sie 200 l Polymergemisch in eine 1 ml Glasspritze, die auf einer Spritzenpumpe montiert ist, die mit einem Dosier-Edelstahlrohr mit einem Innendurchmesser von 0,016 Zoll verbunden ist.
- Verwenden Sie einen Mikromotor, um die Vorwärts- und Rückwärtsbewegung des Polymerrohres zu steuern, um Polymer in die 10% CMC in der Glasdurchstechflasche zu injizieren, um die Polybubble zu bilden.
- Härten Sie die Polybubbleen unter ultraviolett (UV) bei 254 nm Wellenlänge für 60 s bei 2 W/cm2.
- Blitz einfrieren die Polybubbleen in flüssigem Stickstoff und lyophilisieren über Nacht bei 0,010 mBar Vakuum und bei -85 °C.
- Trennen Sie die Polybubbles von der getrockneten CMC mit Zangen und waschen Sie die Polybubbles mit DI-Wasser, um restliche CMC zu entfernen. Beachten Sie, dass andere Polymere wahrscheinlich mit Modifikationen verwendet werden können, um die Freisetzungskinetik zu verändern.
3. Modulation des Polybubble-Durchmessers
- Füllen Sie eine 0,92 ml Glasdurchstechflasche mit 10% CMC mit einer 1 ml Transferpipette.
- Mischen Sie PCL/PCLTA in einem 1:3 (vol/vol) mit 1000mg/mL 14kDa PCL und synthetisieren PCLTA. Den Photoinitiator mit Polymermischung in einem 0,005:1 (vol/vol) mischen.
- Laden Sie das Polymergemisch in eine 1 ml Glasspritze, die auf einer Spritzenpumpe montiert ist und mit einem Dosier-Edelstahlrohr mit einem Innendurchmesser von 0,016 Zoll verbunden ist.
- Verwenden Sie einen Mikromotor, um die Vorwärts- und Rückwärtsbewegung des Polymerrohres zu steuern, um Polymer in die 10% CMC in der Glasdurchstechflasche zu injizieren, um die Polybubble zu bilden.
- Um Polybubbles mit verschiedenen Durchmessern zu erhalten, variieren Sie die Dosierrate von 0,0005 bis 1 l/s.
- Nehmen Sie Bilder der Durchstechflasche mit den Polybubbles mit unterschiedlichem Durchmesser auf.
- Verwenden Sie ImageJ, um den Durchmesser der Polybubbles zu quantifizieren und die Größe der Durchstechflasche als Maßstab zu verwenden.
4. Zentrierung der Ladung innerhalb von Polybubble
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Modulation der PCL/PCLTA-Viskosität mit K2CO3:
HINWEIS: Die Viskosität von PLGADA muss nicht mit K2CO3 geändert werden, da die Viskosität von 5 kDa PLAGDA bei 1000 mg/ml für die Zentrierung der Ladung ausreicht.- Fügen Sie k2CO3 (das nach der PCLTA-Reaktion isoliert wurde) in unterschiedlichen Konzentrationen wie 0 mg/ml, 10 mg/ml, 20 mg/ml, 40 mg/ml und 60 mg/ml zum PCLTA hinzu.
- Messen Sie die dynamische Viskosität der Lösungen, indem Sie die Scherrate mit Rheometrie von 0 auf 1000 1/s ändern.
- Injizieren Sie die Ladung manuell in die Mitte (siehe Schritt 4.2 zur Herstellung des Ladungsgemischs) der Polybubbleen, die mit den PCL/PCLTA-Lösungen mit unterschiedlichen Konzentrationen von K2CO3 (Schritt 4.1.1) gebildet wurden. Bestimmen Sie die optimale Konzentration vonK2CO3, indem Sie beobachten, welche Lösung ab Schritt 4.1.1 zur Retention der Ladung in der Mitte führen kann.
-
Zentrierung der Ladung (bereits gezeigte Machbarkeit mit kleinen Molekülen) mit CMC
- Mischen Sie die Ladung mit 5% (wt/vol) CMC in einem Rotator über Nacht, um die Viskosität der Ladung zu erhöhen.
- In die Polybubble 2 l Ladungsgemisch manuell injizieren und mit UV-Härtung bei 254 nm Wellenlänge für 60 s bei 2 W/cm2fortfahren.
- Blitz einfrieren die Polybubbleen in flüssigem Stickstoff für 30 s und lyophilisieren über Nacht bei 0,010 mBar Vakuum und bei -85 °C.
- Trennen Sie die Polybubbles von der getrockneten CMC mit Zangen und waschen Sie mit DI-Wasser, um restliche CMC zu entfernen.
- Schneiden Sie die Polybubble in die Hälfte und stellen Sie die Hälften mit konfokaler Mikroskopie ab, um sicherzustellen, dass die Ladung zentriert ist (siehe Schritt 6 für die verwendeten Anregungs- und Emissionswellenlängen).
5. Frachtformulierung
HINWEIS: Polybubble-Formulierung kann verschiedene Ladungstypen beherbergen, einschließlich kleiner Moleküle, Proteine und Nukleinsäuren.
- Basierend auf früheren Studien, im Falle von Proteinladung, verwenden Sie Hilfsstoffe einschließlich Polyethylenglykol (PEG)6, Polyvinylpyrrolidon (PVP) und Glykopolymere6, um die Stabilität des Proteins während der Polybubble-Formulierung zu verbessern.
- Form polybubbles basierend auf dem Protokoll in Schritt 2.
- Bereiten Sie die Antigenlösung vor, indem Sie 17,11 g Trehalose zu 625 L HIV gp120/41 Antigen hinzufügen.
- In die Mitte der Polybubble 1 L Antigenlösung manuell injizieren.
- Öffnen Sie Polybubbleen an den Tagen 0, 7, 14 und 21 und erfassen Sie die Fluoreszenz von Antigen mit Anregungs- und Emissionswellenlängen 497 nm bzw. 520 nm.
- Bestimmen Sie die Funktionalität des Antigens mit dem enzymgebundenen Immunsorbent Assay (ELISA) und verwenden Sie 5% fettfreie Milch als Sperrpuffer.
6. Freigabe der Ladung
ANMERKUNG: Kleine Moleküle oder Antigene können als Frachtart verwendet werden
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Kleines Molekül
- Inkubieren Sie Polyblasen mit zentriertem Acriflavin in 400 l Phosphatpuffer-Saline (PBS) bei 37 °C, 50 °C für PLGADA-Polybubbleen und bei 37 °C, 50 °C, 70 °C für PCL/PCLTA-Polybubbleen.
HINWEIS: Der Grund, warum wir empfehlen, über Körpertemperaturen zu testen, ist a) die Temperatur (50 °C) zu simulieren, bei der die Polybubble beim Lasern der Gold-Nanostäbe (AuNRs) innerhalb von PCL und PLGA erreicht; und b) den Abbauprozess von PCL (50 °C, 70 °C) beschleunigen. - Sammeln Sie zu jedem Zeitpunkt die Überstande und ersetzen Sie sie durch 400 l frische PBS.
- Verwenden Sie einen Plattenleser, um die Fluoreszenzintensitäten in den gesammelten Übersprechern zu quantifizieren.
HINWEIS: Verwenden Sie ex/em von 416 nm/514 nm für Acriflavine.
- Inkubieren Sie Polyblasen mit zentriertem Acriflavin in 400 l Phosphatpuffer-Saline (PBS) bei 37 °C, 50 °C für PLGADA-Polybubbleen und bei 37 °C, 50 °C, 70 °C für PCL/PCLTA-Polybubbleen.
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Antigen
- Inkubieren Sie Polybubbleen mit zentriertem Rinderalbuminserum (BSA)-488 in 400 l PBS bei 37 °C, 50 °C für PLGADA-Polybubbleen und bei 37 °C, 50 °C für PCL/PCLTA-Polybubbleen.
- Sammeln Sie zu jedem Zeitpunkt die Überstande und ersetzen Sie sie durch 400 l frische PBS.
- Verwenden Sie einen Plattenleser, um die Fluoreszenzintensitäten in den gesammelten Übersprechern zu quantifizieren. Verwenden Sie ex/em von 497 nm/520 nm für BSA-488.
HINWEIS: Eine Release-Studie bei 70 °C für PCL/PCLTA-Polybubbleen sollte nicht durchgeführt werden, um zu vermeiden, dass das Antigen extremen Temperaturen aussetzt.
7. Toxizität
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Quantifizierung des Chlorgehalts in Polyblasen mittels Neutronenaktivierungsanalyse (NAA)
- Verwenden Sie Polybubbleen, die für 2, 4, 6, 20 und 24 h für diese Studie bei 0,010 mBar Vakuum und bei -85 °C lyophilisiert wurden.
- Messen Sie 5-9 mg Polybubbleen und legen Sie sie auf LDPE Bestrahlungsfläschchen.
- Bereiten Sie 1000 g/ml Chlorkalibrierungslösung vom nationalen Institut für Normen und Technologie (NIST) -rückverfolgbare Kalibrierlösung vor.
- Verwenden Sie 1-Megawatt Triga-Reaktor, um Neutronenbestrahlungen an jeder Probe mit Neutronenfluzon von 9,1 × 1012 /cm2s für 600 s durchzuführen.
- Übertragen Sie die Polybubbles auf unirradiated Fläschchen.
- Verwenden Sie den HPGe-Detektor, um Gamma-Strahlenspektren für 500 s nach 360 s Zerfallsintervallen zu erhalten.
- Verwenden Sie die NAA-Software von canberra Industries, um die Daten zu analysieren.
-
Quantifizierung des Chlorgehalts, der aus Polybubbleen mit NAA freigesetzt wird
- Inkubieren Sie Polybubbleen, die über Nacht lyophilisiert wurden (bei 0,010 mBar Vakuum und bei -85 °C) in 400 l PBS bei 37 °C.
- Sammeln Sie die Überstande in den Wochen 1, 2 und 3 nach der Inkubation.
- Analysieren Sie die Übersprecher auf den Chlorgehalt mit NAA mit der gleichen Methode wie oben in Schritt 7.1 beschrieben.
8. AuNR-Synthese von Kittler, S., et al.8
- Bereiten Sie die AuNR-Saatlösung vor, indem Sie 250 l 10 mM Chlorauurinsäure (HAuCl4), 7,5 ml 100 mM Cetrimoniumbromid (CTAB) und 600 l mit 10 ml eiskaltem Natriumborohydrid (NaBH4)mischen.
- Bereiten Sie die Wachstumslösung vor, indem Sie 40 ml 100 ml CTAB, 1,7 ml 10 mM HAuCl4, 250 l Silbernitrat (AgNO3) und 270 l mit 17,6 mg/ml Ascorbinsäure in ein Rohr mischen.
- 420 L Saatlösung mit der Wachstumslösung bei 1200 Rpm für 1 min kräftig mischen. Dann lassen Sie die Mischung ungestört für 16 h reagieren.
- Entfernen Sie die überschüssigen Reagenzien aus dem Gemisch durch Zentrifugieren bei 8000 × g für 10 min und entsorgen Sie den Überstand.
9. Hydrophobeisierung von AuNRs durch Soliman, M.G., et al.9
- Stellen Sie den pH-Wert von 1,5 ml synthetisierter CTAB-stabilisierter AuNRs mit 1 mM Natriumhydroxid (NaOH) auf 10 ein.
- Die Lösung mit 0,1 ml 0,3 ml methyliertem PEG (mPEG) Thiol bei 400 Umdrehungen von pm über Nacht umrühren.
- PeGylated AuNRs mit 0,4 M Dodecylamin (DDA) in Chloroform bei 500 Rpm 4 Tage mischen.
- Pipet die obere organische Schicht, die hydrophobe AuNRs enthält, und lagern Sie bei 4 °C bis zur zukünftigen Verwendung.
10. NIR-Aktivierung von Polybubbleen
- Mischen Sie die Polymerlösung (PLGADA oder PCL/PCLTA) mit hydrophobisierten AuNRs in einem 1:9 (vol/vol).
- Photoinitiator in einem 0,005:1 (vol/vol) in die Polymer-AuNR-Mischung geben.
- Bilden Sie Polyblasen, indem Sie das Polymer-AuNR-Gemisch in eine 0,92 ml Glasdurchstechflasche mit 10% CMC (wt/vol) injizieren (siehe Schritt 2).
- Härten Sie die Polybubbleen bei 254 nm Wellenlänge für 60 s bei 2 W/cm2.
- Blitzeinfrieren in flüssigem Stickstoff für 30 s und Lyophilisieren über Nacht bei 0,010 mBar Vakuum und bei -85 °C.
- Trennen Sie die getrockneten Polybubbles mit Zangen und waschen Sie sie mit DI-Wasser, um eventuelle Reste von CMC zu entfernen.
- Inkubieren Sie die Polyblasen in 400 l PBS bei 37 °C.
- Aktivieren Sie die Polybubbles mit 801 nm NIR-Laser bei 8A für 5 min jeden Montag, Mittwoch und Freitag.
- Nehmen Sie vorausschauende Infrarot-Bilder (FLIR) der Polybubble vor und nach der Laseraktivierung auf, um Temperaturwerte zu erhalten.
- Berechnen Sie Temperaturunterschiede zwischen vor und nach der Laseraktivierung basierend auf den Temperaturwerten aus den FLIR-Bildern.
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Representative Results
Polybubbles wurden mit SEM und NAA extensiv charakterisiert. Die Fracht wurde erfolgreich zentriert, um zu einer verzögerten Burst-Freigabe zu führen. Polybubbles wurden auch erfolgreich laseraktiviert, da AuNRs innerhalb der Polybubbles vorliegen.
Polybubble-Charakterisierung
Polybubbleen, die in eine wässrige Lösung ohne CMC injiziert wurden, führten aufgrund ihres Kontakts mit der Unterseite der Glasdurchstechflasche zu einer abgeflachten Polybubble (Abbildung 1A,B). Eine teilweise Abflachung wurde beobachtet, wenn 5% CMC-basierte wässrige Lösung anstelle von DI-Wasser verwendet wurde (Abbildung 1C). Anschließend führte eine 10% CMC-basierte wässrige Lösung in der Glasdurchstechflasche dazu, dass Polybubble in der Lösung aufgehängt wurde und somit die Sphärität der Polybubble erfolgreich gewartet wurde (Abbildung 1D).
Cargo-Zentrierung
Die Einspritzung von Ladung in die Polybubble in Abwesenheit von CMC führte zu Leckagen, die keine Ladungsrückhaltung innerhalb der Polybubble verursachten (Abbildung 3). Um dieser Herausforderung entgegenzuwirken, wurden zwei Ansätze verwendet: 1) die Viskosität von PCLTA wurde erfolgreich mit K2CO3 erhöht, das nach dem Endcapping von PCL Triol mit Triacrylat isoliert wurde (Abbildung 2), und 2) die Viskosität der Ladung wurde erfolgreich erhöht, nachdem die Ladung mit 5% CMC gemischt wurde (Abbildung 3, Abbildung 4). Die Viskosität der PLGADA-Polybubbleen reichte aus, um die Zentrierung der Ladung zu erleichtern und wurde daher nicht mit K2CO3moduliert.
Antigen-Funktionalität
HIV gp120/41 Antigen wurde vor der Injektion in die Polybubble mit und ohne Trehalose gemischt (Abbildung 5). Die Bindungswirkung des Antikörpers an das Antigen (als Funktionalität bezeichnet) mit und ohne Trehalose wurde beobachtet, um keinen statistisch signifikanten Unterschied zu haben.
Release-Studien ohne Laseraktivierung
Verzögerte Burst-Freisetzungen wurden in PLGADA-Polybubbleen mit Acriflavine in der Mitte an den Tagen 19 und 5 für Polybubbleen beobachtet, die bei 37 °C(Abbildung 6A) bzw. 50 °C(Abbildung 6B)inkubiert wurden. Verzögerte Burst-Releases wurden auch in PCL/PCLTA-Polybubbleen mit Acriflavine in der Mitte an den Tagen 160 und 60 für Polybubbleen beobachtet, die bei 50 °C(Abbildung 7A) bzw. 70 °C(Abbildung 7B)inkubiert wurden. Diese Freisetzungsstudien wurden in Ermangelung laseraktivierbarer AuNRs durchgeführt.
In-vitro-Laseraktivierung von Polybubbleen
Polybubbles mit AuNRs in der Schale wurden erfolgreich mehrfach in PLGADA Polybubbles (Abbildung 8A) und PCL/PCLTA Polybubbles (Abbildung 8B) laseraktiviert. Temperaturänderungen vor und nach der Laseraktivierung waren 10 ± 1 °C und 5 ± 1 °C in PCL/PCLTA-Polybubbleen mit höherer bzw. niedrigerer AuNR-Konzentration in der Schale. Die vor und nach der Laseraktivierung beobachteten Temperaturänderungen betrugen 11 ± 2 °C und 6 ± 1 °C in PLGADA-Polybubbleen mit höherer bzw. niedrigerer AuNR-Konzentration in der Schale.
Abbildung 1: Aufrechterhaltung der Sphärizität von Polybubbleen. SEM-Bilder von (A) 14 kDa PCL/300 Da PCLTA abgeflachte Polybubble durch den Kontakt von Polybubble mit der Unterseite der Glasdurchstechflasche; (B) 14 kDa PCL/300 Da PCLTA Polybubble von oben, die nicht in Kontakt mit dem Glasboden war; (C) die PCL/PCLTA-Polybubbles mit geringerem Abflachungsgrad, wenn sie in eine 5%ige CMC-Lösung im Vergleich zu DI-Wasserlösung injiziert werden, was die Bildung einer hemisphärenähnlichen Form am Kontaktpunkt mit der Durchstechflasche verursacht; (D) Polybubble, die nicht den Boden der Glasdurchstechflasche erreicht, wenn sie in eine 10% CMC-Lösung injiziert wird, so dass die kugelförmige Form beibehalten werden kann. Alle angegebenen Skalenstäbe sind 500 m. Diese Zahl wurde von Lee et al.7geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Modulation der PCLTA-Viskosität. Die Konzentration vonK2CO3 wurde von 0 auf 80 mg/ml in PCLTA erhöht und die dynamische Viskosität wurde beobachtet, um mit der Konzentration vonK2CO3proportional zu zunehmen. Diese Zahl wurde von Arun Kumar et al10geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Cargo-Injektion in die Polybubble mit und ohne CMC. Das obere Panel zeigt Rahmen, die aus dem Video von Ladungslecks während der Injektion in Abwesenheit von CMC extrahiert wurden. Das untere Panel zeigt Rahmen, die aus dem Video der Ladungsaufbewahrung innerhalb der Polybubble in Gegenwart von 5% CMC extrahiert wurden. Diese Zahl wurde von Lee et al.7geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Zentrierte Ladung. Fluoreszierende Mikroskopbilder von (A) PCL/PCLTA Polybubble mit zentrierter Ladung, (B) PCL/PCLTA Polybubble mit Ladung in der Schale und zentriertem nicht fluoreszierendem Farbstoff. Diese Zahl wurde von Arun Kumar et al10geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Antigen-Funktionalität mit Trehalose. Die Funktionalität von HIV gp120/41 mit und ohne Trehalose innerhalb der Polybubble wurde mit ELISA analysiert. Die Bindungseffizienz eines Antikörpers an das Protein wird allgemein als Indikator für die Funktionalität des Proteins angesehen. Wenn wir die Funktionalität von Antigen in dieser Studie diskutieren, beabsichtigen wir, dass es bedeutet, dass es die Antikörper unterstützt, die das Protein von Interesse binden (was ein Indikator für die Proteinfunktionalität ist). Zwischen den beiden Gruppen wurde keine statistische Signifikanz beobachtet. Konfidenzintervalle werden durch durchgezogene und gepunktete Linien angezeigt. Diese Zahl wurde von Lee et al.7geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Verzögerte Burst-Freisetzung von PLGADA-Polybubbles. Release-Studien, die verzögerte Burst-Releases von PLGADA-Polybubbleen mit Acriflavine in der Mitte bei (A) 37 °C, (B) 50 °C zeigen. Durchgezogene Linie zeigt die angepasste Kurve an, die basierend auf den Datenpunkten erhalten wurde. Diese Zahl wurde von Arun Kumar et al10geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7: Verzögerte Burst-Freisetzung von PCL/PCLTA-Polybubbles. Release-Studien, die verzögerte Burst-Releases von PCL/PCLTA-Polybubbleen mit Acriflavine in der Mitte bei (A) 50 °C, (B) 70 °C zeigen. Diese Zahl wurde von Arun Kumar et al10geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 8: NIR-Laseraktivierung von Polybubbleen. Temperaturänderung vor und nach der NIR-Laseraktivierung in (A) PLGADA Polybubbles, (B) PCL/PCLTA Polybubbles mit höherer und niedrigerer Konzentration von AuNRs in der Polymerschale. Dieser Temperaturanstieg könnte genutzt werden, um den Polymerabbau zu beschleunigen, der zu einer früheren Freisetzung der Ladung führt. Diese Zahl wurde von Arun Kumar et al10geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Aktuelle Technologien und Herausforderungen
Emulsionsbasierte Mikro- und Nanopartikel wurden häufig als Träger von Arzneimittelzufuhrenthalten verwendet. Obwohl die Freisetzungskinetik der Ladung von diesen Geräten ausgiebig untersucht wurde, war die Steuerung der Burst-Release-Kinetik eine große Herausforderung11. Die Vielseitigkeit und Funktionalität von Fracht ist auch bei Emulsionssystemen eingeschränkt, da die Ladung übermäßig wässrigen und organischen Lösungsmitteln ausgesetzt ist. Proteinbasierte Fracht ist aufgrund der Möglichkeit der Ladungsdenaturierung und Aggregation12oft nicht mit Mikro- und Nanopartikeln kompatibel. Neben der Ladungsstabilität ist die Ladungskinetik im Zusammenhang mit Impfstoffen besonders wichtig, da Booster-Shots benötigt werden, die zur Serokonversion führen. Frühere Bemühungen, diese Herausforderungen bei der Impfstoffabgabe anzugehen, waren nicht erfolgreich genug, da der Begriff der Systeme für Einzelinjektionsimpfstoffe seit einigen Jahrzehnten besteht und noch nicht klinisch übersetzt wurde.
Unsere Polybubble-Impfstoff-Lieferplattform kann die Herausforderungen mit einer erhöhten Exposition von Fracht gegenüber organischen Lösungsmitteln potenziell bewältigen, indem das exponierte Frachtvolumen minimiert wird. Diese Technologie kann potenziell mindestens zwei Laderäume beherbergen: Fracht in der Schale und Fracht im Zentrum. Polybubbles mit zentrierter Ladung können verwendet werden, um die Burst-Freisetzung der Ladung zu steuern, während sie mit verschiedenen Frachttypen kompatibel sind, einschließlich kleiner Moleküle und Antigen. In dieser Studie verwendeten wir Polyester mit unterschiedlichen Abbauzeiten, PLGADA (kürzere Abbauzeit) und PCL/PCLTA (längere Abbauzeit), als Polymerträger und Acriflavin (kleines Molekül) als Ladungstyp, um eine verzögerte Burstfreisetzung zu demonstrieren. In den folgenden Abschnitten beschreiben wir die entscheidenden Schritte bei der Bildung von Polybubbles, die sowohl eine verzögerte Burst-Release- als auch eine NIR-Aktivierung ermöglichen, insbesondere für zukünftige On-Demand-Bereitstellungsanwendungen.
Cargo-Zentrierung innerhalb der Polybubble
Cargo Centering war eine der großen Herausforderungen, die bei der Formulierung der Polybubbles aufgetreten sind. Unmittelbar nach der Injektion wanderte die Ladung an die Oberfläche und die Frachttasche würde stabilisiert, ohne in die wässrige 10% CMC-Lösung zu platzen. Polybubbles mit einer solchen zentrierten Ladung können aufgrund der ungleichmäßigen Dicke des Polymers, das die Ladung umgibt, zu einer früheren Freisetzung führen. Die Modulation der Viskosität des Polymers und der Ladung war daher entscheidend für die Lösung von Problemen im Zusammenhang mit der Frachtzentrierung. Die Viskosität der Ladung wurde durch Mischen der Frachtlösung mit 5% CMC erhöht. Um die Viskosität des Polymers zu erhöhen, hätte das Molekulargewicht des Polymers modifiziert werden können. Die Erhöhung des Molekulargewichts führt jedoch häufig zu einem langsameren Polymerabbau, was zu einer weiteren Verzögerung bei der Ladungsfreigabe führt. Die Viskosität des Polymers wurde somit durch Erhöhung der Polymerkonzentration verändert. Eine höhere Konzentration (1000 mg/ml) reichte aus, um die Viskosität von PLGADA zu erhöhen. Die Viskosität von PCL/PCLTA reichte jedoch nicht aus, um die Ladung in der Mitte zu halten. So wurde K2CO3, das nach der Endkapping-Reaktion von PCLTA isoliert wurde, verwendet, um die Viskosität von PCLTA zu erhöhen.
Neuartige verzögerte Veröffentlichung
Verzögerte Burst-Freisetzung wurde aus den Release-Studien beobachtet, die mit den Polybubbles mit zentrierter Ladung durchgeführt wurden. Kleines Molekül (Acriflavin) wurde als zentrierte Ladung in den Polybubbles verwendet, um das Freisetzungsprofil zu untersuchen. Aufgrund des Unterschieds in der Abbauzeit der Polymere wurden eindeutige Freisetzungsprofile auf der Grundlage des verwendeten Polyesters beobachtet. Burst-Release wurde früher in PLGADA Polybubbles im Vergleich zu PCL/ PCLTA Polybubbles beobachtet. Eine frühe Ladungsfreigabe wurde in PLGADA Polybubbles beobachtet, da PLGA im Vergleich zu PCL13schneller abgebaut wird. Nach erfolgreicher Modulation der Freisetzungskinetik mit zwei Arten von Polyestern wollten wir die Polybubble weiter entwickeln, um eine mögliche On-Demand-Freisetzung der Ladung zu ermöglichen.
NIR-Aktivierung von Polybubbleen
Die Freigabe der Ladung auf Anfrage in Bezug auf den Zeitpunkt der Bedürfnisse der Patienten war eine Schwierige, um mit aktuellen Lieferstrategien14zu erreichen. Wir vermuteten, dass eine Beschleunigung der Ladungsfreigabe bei Bedarf möglich sein könnte, indem der Polymerabbau durch den Einsatz von NIR-empfindlichen (d.h. theranostisch-fähigen) Mitteln beschleunigt wird. AuNRs wurden ausgiebig auf ihre Fähigkeit untersucht, mit EINEM NIR-Laser aktiviert zu werden, der einige Zentimeter durch die Haut reisen kann15. CTAB-stabilisierte AuNRs wurden daher auf der Grundlage des Protokolls von Kittler, S, et al. erstellt und auf der Grundlage der von Solimon, M.G., et al. veröffentlichten Methoden hydrophobisiert. Polybubbles mit hydrophobisierten AuNRs in der Schale wurden dann mit NIR-Laser zu gewünschten Zeitpunkten für 5 min bestrahlt, um Temperaturänderungen zu beobachten. Die Temperaturen vor und nach dem Laser wurden anhand der FLIR-Bilder gemessen. Die ausgehärtete Polymerschale trug dazu bei, die Form von AuNRs während der Laseraktivierung zu erhalten und ermöglichte so mehrere NIR-Aktivierungen von Polybubbleen. Dies ist eine interessante Beobachtung, da in früheren Literatur, AuNRs sind oft bekannt, ihre stabähnliche Form zu verlieren (entscheidend für die NIR-Aktivierung) durch Laseraktivierung16. Die erfolgreiche Laseraktivierung der Polybubbles mit AuNRs könnte den Weg zur Steuerung der On-Demand-Freisetzung der Ladung in der nächsten Generation von Polybubbles ebnen.
Bedeutung und zukünftige Anwendungen
Die Ergebnisse dieser Studie zeigen somit, dass Polybubbles das Potenzial haben, als neuartige Impfstoffabgabeplattform genutzt zu werden. Die In diesem Dokument beschriebene Herstellung von Polybubbles wird es anderen Forschern weiter ermöglichen, Polybubbles als Bereitstellungsplattform für andere therapeutische Anwendungen zu verwenden. Beispielsweise können Polybubbles neben der Impfstoffabgabe auch potenziell zur Abgabe synergistischer therapeutischer Wirkstoffe mit unterschiedlicher Freisetzungskinetik verwendet werden. Darüber hinaus bestehen Polybubbles aus Polyestern, die biologisch abbaubar sind und in vielen FDA-zugelassenen Medizinprodukten verwendet wurden. Wir haben die Sicherheit von Polybubbles weiter validiert, indem wir gezeigt haben, dass das aus Polybubbleen freigesetzte Chlor weit unter den von der EPA17empfohlenen Sicherheitsniveaus liegt. So hat unsere neuartige, injizierbare, UV-härtebare Polybubble-Plattform das Potenzial, als sichere und effektive Arzneimittelabgabeplattform für eine Vielzahl von Frachtarten eingesetzt zu werden.
Einschränkungen dieser Technologie
Die Polybubble-Plattformtechnologie kann als Impfstoff-Bereitstellungsplattform eingesetzt werden, die eine kontrollierte Freisetzung ermöglicht. Unsere Studien unterstreichen die Vielseitigkeit dieser Plattform, die in der Lage ist, verschiedene Frachtarten, einschließlich Antigene und kleine Moleküle, zu liefern. Eine der aktuellen Einschränkungen dieser Technologie ist jedoch, dass die Ladung derzeit manuell injiziert wird. Für Skalierungszwecke entwickeln wir derzeit eine automatisierte Plattform, die die Injektion (d. h. als Array) von Fracht innerhalb der Polybubble ermöglicht und möglicherweise dazu beitragen wird, die Bedenken hinsichtlich der Umsetzbarkeit dieser Technologie zu zerstreuen.
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Disclosures
Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir danken Dr. Bryan E. Tomlin, der dem Elementaranalyselabor der TAMU angeschlossen ist und bei der Neutronenaktivierungsanalyse (NAA) geholfen hat.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Step Ultra Tetramethylbezidine (TMB)-Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Substrate Solution | Thermo scientific | 34028 | |
| 2-Hydroxy-2-methylpropiophenone | TCI AMERICA | H0991 | |
| 450 nm Stop Solution for TMB Substrate | Abcam | ab17152 | |
| Acryloyl chloride | Sigma Aldrich | A24109-100G | |
| Acriflavine | Chem-Impex International | 22916 | |
| Anhydrous ethyl ether | Fisher Chemical | E138-500 | |
| Anti-HIV1 gp120 antibody conjugated to horseradish peroxidase (HRP) | |||
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher BioReagents | BP9700100 | |
| BSA-CF488 dye conjugates | Invitrogen | A13100 | |
| Bromosalicylic acid | Acros Organics | AC162142500 | |
| Carboxymethylcellulose (CMC) | Millipore Sigma | 80502-040 | |
| Centrimonium bromide (CTAB) | MP Biomedicals | ICN19400480 | |
| Chloroform | Fisher Chemical | C2984 | |
| Coating buffer | Abcam | ab210899 | |
| Dichloromethane (DCM) | Sigma Aldrich | 270997-1L | |
| Diethyl ether | Fisher Chemical | E1384 | |
| Dodeacyl Amine | Acros Organics | AC117665000 | |
| Doxorubicin hydrochloride | Fisher BioReagents | BP251610 | |
| L-ascorbic acid | Acros Organics | A61 100 | |
| Legato 100 Syringe Pump | KD Scientific | 14 831 212 | |
| mPEG thiol | Laysan Bio | NC0702454 | |
| Nonfat dry milk | Andwin Scientific | NC9022655 | |
| Potassium carbonate | Acros Organics | AC424081000 | |
| Phosphate saline buffer | Fisher BioReagents | BP3991 | |
| (Poly(caprolactone) | Sigma Aldrich | 440744-250G | |
| (Poly(caprolactone) triol | Acros Organics | AC190730250 | |
| Poly (lactic-co-glycolic acid) diacrylate | CMTec | 280050 | |
| Potassium carbonate | Acros Organics | AC424081000 | |
| Recombinant HIV1 gp120 + gp41 protein | Abcam | ab49054 | |
| Silver nitrate | Acros Organics | S181 25 | |
| Sodium borohydride | Fisher Chemical | S678 10 | |
| Tetrachloroauric acid | Fisher Chemical | G54 1 | |
| Trehalose | Acros Organics | NC9022655 | |
| Triethyl amine | Acros Organics | AC157910010 |
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