Summary
Denne artikkelen beskriver protokollene som brukes til å produsere en ny vaksine levering plattform, "polybubbles," for å muliggjøre forsinket burst utgivelse. Polyester, inkludert poly(melkesyre-co-glykolsyre) og polykaptrokton ble brukt til å danne polybobbles og små molekyler og antigen ble brukt som last.
Abstract
Vaksineleveringsstrategier som kan begrense eksponeringen av last til organisk løsningsmiddel samtidig som nye utgivelsesprofiler er avgjørende for å forbedre immuniseringsdekningen over hele verden. Her introduseres en ny injiserbar, ultrafiolett herdbar og forsinket burst release- slik at vaksineleveringsplattform kalt polybobler innføres. Last ble injisert i polyesterbaserte polybobbles som ble dannet i 10% karboksymethycellulose-basert vandig løsning. Dette papiret inneholder protokoller for å opprettholde sfærisk form av polyboblene og optimalisere lastplassering og oppbevaring for å maksimere mengden last i polyboblene. For å sikre sikkerheten ble klorert løsemiddelinnhold i polyboblene analysert ved hjelp av nøytronaktiveringsanalyse. Utgivelsesstudier ble utført med små molekyler som last i polybubble for å bekrefte forsinket burst release. For ytterligere å vise potensialet for on-demand levering av lasten, gull nanorods ble blandet i polymer skallet for å muliggjøre nær-infrarød laser aktivering.
Introduction
Begrenset immuniseringsdekning resulterer i at 3 millioner mennesker er spesielt forårsaket av vaksineforekomstssykdommer1. Utilstrekkelige lagrings- og transportforhold fører til svie av funksjonelle vaksiner og bidrar dermed til redusert global immunisering. I tillegg forårsaker ufullstendig vaksinasjon på grunn av ikke å følge de nødvendige vaksineplanene også begrenset vaksinedekning, spesielt i utviklingsland2. Flere besøk til medisinsk personell er nødvendig innen den anbefalte perioden for å motta boosterskudd, og dermed begrense prosentandelen av befolkningen med fullstendig vaksinasjon. Derfor er det behov for å utvikle nye strategier for kontrollert vaksinelevering for å omgå disse utfordringene.
Nåværende innsats for å utvikle vaksineleveringsteknologier inkluderer emulsjonsbaserte polymersystemer3,,4. Lasten er imidlertid ofte utsatt for større mengde organisk løsemiddel som potensielt kan forårsake aggregering og denaturation, spesielt i sammenheng med proteinbasert last5,,6. Vi har utviklet en ny vaksine levering plattform, "polybubbles", som potensielt kan huse flere lasterom samtidig minimere volumet av last som er utsatt for løsemiddel7. For eksempel, i vår polybubble kjerne-shell plattform, injiseres en lastlomme med diameter 0,38 mm (SEM) i midten av en 1 mm polybubble. I dette tilfellet vil overflateareal av last utsatt for organisk løsemiddel være ca. 0,453 mm2. Etter å ha vurdert pakningstettheten av kuler (mikropartikler) innenfor en sfære (lastedepot), er det faktiske volumet av mikropartikler (10 μm i diameter) som kan passe inn i depotet 0,17 mm3. Volumet av en mikropartikkel er 5,24x10-8 mm3 og dermed antall partikler mikropartikler som kan passe depotet er ~ 3.2x106 partikler. Hvis hver mikropartikkel har 20 lastelommer (som følge av dobbel-emulsjon) på 0,25 μm diameter, er overflaten av last utsatt for organisk løsemiddel 1274 mm2. Cargo depot innenfor polybubble dermed ville ha ~ 2800 ganger mindre overflateareal utsatt for organisk løsemiddel sammenlignet med organisk løsemiddel-eksponert last i mikropartikler. Vår polyesterbaserte plattform kan dermed potensielt redusere mengden last utsatt for organisk løsemiddel som ellers kan forårsake lastaggregasjon og ustabilitet.
Polybobbles dannes basert på faseseparasjonsprinsipp hvor polyesteren i organisk fase injiseres i en vandig løsning som resulterer i en sfærisk boble. Last i vandig fase kan deretter injiseres i midten av polybubble. Et annet lasterom kan potensielt oppnås i polybubble ved å blande en annen last med polymerskallet. Polybubble på dette stadiet vil være formbar og vil da bli kurert for å resultere i en solid polybubble struktur med last i midten. Sfæriske polybobler ble valgt fremfor andre geometriske former for å øke lastekapasiteten i polybubble samtidig som den totale størrelsen på polybubble. Polybubbles med last i sentrum ble valgt for å demonstrere forsinket burst release. Polybubbles ble også innlemmet med nær infrarød (NIR)- følsom (det vil si theranostic-aktivering) agent, nemlig gull nanorods (AuNR), for å forårsake økning i temperaturen på polyboblene. Denne effekten kan potensielt legge til rette for raskere nedbrytning og kan brukes til å kontrollere kinetikk i fremtidige applikasjoner. I dette papiret beskriver vi vår tilnærming til å danne og karakterisere polybobler, for å oppnå forsinket burst utgivelse fra polyboblene, og å innlemme AuNR i polyboblene for å forårsake NIR-aktivering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Polycaprolacyone triacrylate (PCLTA) syntese
- Tørk 3,2 ml 400 Da polykaprolakyon (PCL) triol over natten ved 50 °C i åpen 200 ml rund bunnkolbe og2CO3 i et hetteglass med glass ved 90 °C.
- Bland triol med 6,4 ml diklormetan (DCM) og 4,246 g kaliumkarbonat (K2CO3) under argon.
- Bland 2,72 ml akryloylklorid i 27,2 ml DCM og tilsett dråpe til reaksjonsblandingen i kolben over 5 min.
- Dekk reaksjonsblandingen med aluminiumsfolie og la den stå uforstyrret ved romtemperatur i 24 timer under argon.
- Etter 24 timer filtrerer du reaksjonsblandingen ved hjelp av et filterpapir på en Buchner-trakt under vakuum for å kaste overflødige reagenser.
- Utfellfell filtrat fra trinn 1,5 som inneholder endcapped polymer i dietyleter i en 1:3 (vol / vol) og rotovape ved 30 ° C for å fjerne dietyleteren.
2. Dannelse av polyboble
MERK: Hvis du injiserer polymer i det deioniserte (DI) vannet, vil polybobblene migrere til bunnen av hetteglasset, noe som resulterer i flat bunn. Bruk 10% (wt / vol) karboksymetylcellulose (CMC) fyll hetteglasset i stedet for å unngå polybubble flating.
- Forbered 10% (wt / vol) CMC løsning i DI vann.
- Fyll et 0,92 ml hetteglass med 0,8 ml 10 % CMC ved hjelp av en 1 ml overføringspipet.
- Bland 1000 mg/ml 14 kDa PCL i DCM og syntetisere PCLTA i en 1:3 (vol/vol) for et totalt volum på 200 μL eller klargjør 200 μL av 1000 mg/ml 5 kDa poly (melkesyre-co-glykolsyre) diakrylat (PLGADA) i kloroform.
- Bland 2-hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-metylpropiophenone (fotoinitiator) med polymer (PLGADA eller PCL/PCLTA) blandingen i 0.005:1 (vol /vol).
- Legg 200 μL polymerblanding i en 1 ml glasssprøyte montert på en sprøytepumpe som er koblet til et dispenseringsrør i rustfritt stål med en indre diameter på 0,016 tommer.
- Bruk en mikromotor til å kontrollere polymerrørets fremre og bakoverbevegelse for å injisere polymer i 10% CMC i hetteglasset med glass for å danne polybubblen.
- Herd polybobblene under ultrafiolett (UV) ved 254 nm bølgelengde i 60 s ved 2 W/cm2.
- Blitsen fryser polybobblene i flytende nitrogen og lyofiliseres over natten ved 0,010 mBar vakuum og ved -85 °C.
- Skill polybobblene fra den tørkede CMC ved hjelp av tang og vask polybobblene med DI-vann for å fjerne eventuelle gjenværende CMC. Legg merke til at andre polymerer kan brukes sannsynlig med modifikasjoner for å endre utgivelsen kinetikk.
3. Modulering av polybubble diameter
- Fyll et 0,92 ml hetteglass med 10 % CMC ved hjelp av en 1 ml overføringspipetter.
- Bland PCL / PCLTA i en 1:3 (vol / vol) med 1000mg / ml 14kDa PCL og syntetisere PCLTA. Bland fotoinitiatoren med polymerblanding i en 0,005:1 (vol/vol).
- Last polymerblandingen i en 1 ml glasssprøyte montert på en sprøytepumpe som er koblet til et dispenseringsrør i rustfritt stål med en indre diameter på 0,016 tommer.
- Bruk en mikromotor til å kontrollere polymerrørets fremre og bakoverbevegelse for å injisere polymer i 10% CMC i hetteglasset med glass for å danne polybubblen.
- For å oppnå polybobbles med ulike diametre, varierer dispenseringshastigheten fra 0,0005 til 1 μL/s.
- Ta bilder av hetteglasset med polybobblene med varierende diameter.
- Bruk ImageJ til å kvantifisere diameteren på polybobbles og bruke størrelsen på hetteglasset som skala.
4. Sentrering av last innenfor polybubble
-
Modulasjon av PCL / PCLTA viskositet ved hjelp av K2CO3:
MERK: Viskositeten til PLGADA trenger ikke å endres ved hjelp av K2CO3 fordi viskositeten til 5 kDa PLAGDA ved 1000 mg/ml er tilstrekkelig for sentrering av lasten.- Tilsett K2CO3 (som ble isolert etter PCLTA-reaksjonen) til PCLTA ved varierende konsentrasjoner, inkludert 0 mg/ml, 10 mg/ml, 20 mg/ml, 40 mg/ml og 60 mg/ml.
- Mål de dynamiske viskositetene til løsningene ved å endre skjærhastigheten fra 0 til 1000 1/s ved hjelp av reometry.
- Injiser lasten manuelt i midten (se trinn 4.2 for å klargjøre lastblandingen) av polyboblene som ble dannet ved hjelp av PCL/PCLTA-løsningene med forskjellige konsentrasjoner av K2CO3 (trinn 4.1.1). Bestem den optimale konsentrasjonen av K2CO3 ved å observere hvilken løsning fra trinn 4.1.1 som kan føre til oppbevaring av lasten i midten.
-
Sentrering av lasten (allerede vist gjennomførbarhet med små molekyler) med CMC
- Bland lasten med 5% (wt / vol) CMC i en rotator over natten for å øke viskositeten til lasten.
- Injiser manuelt 2 μL lastblanding i polyboblen og fortsett med UV-herding ved 254 nm bølgelengde i 60 s ved 2 W/cm2.
- Blitsen fryser polyboblene i flytende nitrogen i 30 s og lyofiliseres over natten ved 0,010 mBar vakuum og ved -85 °C.
- Skill polybobblene fra den tørkede CMC ved hjelp av tang og vask med DI-vann for å fjerne eventuelle gjenværende CMC.
- Skjær polybubble i to og bilde halvdelene ved hjelp av konfokal mikroskopi for å sikre at lasten er sentrert (se trinn 6 for eksitasjon og utslipp bølgelengder som brukes).
5. Formulering av last
MERK: Polybubble formulering kan huse ulike lasttyper, inkludert små molekyler, proteiner og nukleinsyrer.
- Basert på tidligere studier, i tilfelle av proteinlast, bruk hjelpestoffer, inkludert polyetylenglykol (PEG)6, polyvinylpyrrolidon (PVP) og glykolymerer6 for å forbedre stabiliteten av protein under polybubble formulering.
- Form polybobbles basert på protokollen i trinn 2.
- Forbered antigenoppløsningen ved å tilsette 17,11 g trehalose til 625 μL HIV gp120/41 antigen.
- Injiser manuelt 1 μL antigenoppløsning midt i polyboblen.
- Åpne polybobler på dag 0, 7, 14 og 21, og registrere fluorescens av antigen med eksitasjon og utslipp bølgelengder 497 nm og 520 nm, henholdsvis.
- Bestem funksjonaliteten til antigenet ved hjelp av enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA) og bruk 5 % fettfri melk som en blokkerende buffer.
6. Utslipp av last
MERK: Lite molekyl eller antigen kan brukes som lasttype
-
Lite molekyl
- Inkuber polybubbles med sentrert akriflavin i 400 μL fosfatbuffer saltvann (PBS) ved 37 °C, 50 °C for PLGADA polybubbles og ved 37 °C, 50 °C, 70 °C for PCL/PCLTA polybubbles.
MERK: Grunnen til at vi anbefaler å teste over kroppstemperaturer er å a) simulere temperaturen (50 °C) der polybubblen når mens du laserer gullnanorodene (AuNRs) i PCL og PLGA; og b) akselerere nedbrytningsprosessen av PCL (50 °C, 70 °C). - På hvert tidspunkt samler du supernativa og erstatter med 400 μL fersk PBS.
- Bruk en plateleser til å kvantifisere fluorescensintensitetene i de innsamlede supernativa.
MERK: Bruk ex/em på 416 nm/514 nm for acriflavine.
- Inkuber polybubbles med sentrert akriflavin i 400 μL fosfatbuffer saltvann (PBS) ved 37 °C, 50 °C for PLGADA polybubbles og ved 37 °C, 50 °C, 70 °C for PCL/PCLTA polybubbles.
-
Antigen
- Inkuber polybubbles med sentrert storfe albumin serum (BSA)-488 i 400 μL PBS ved 37 °C, 50 °C for PLGADA polybubbles og ved 37 °C, 50 °C for PCL/PCLTA polybobbles.
- På hvert tidspunkt samler du supernativa og erstatter med 400 μL frisk PBS.
- Bruk en plateleser til å kvantifisere fluorescensintensitetene i de innsamlede supernativa. Bruk ex/em av 497 nm/520 nm for BSA-488.
MERK: Frigjøringsstudie ved 70 °C for PCL/PCLTA polybobler bør ikke utføres for å unngå å utsette antigenet for ekstrem temperatur.
7. Toksisitet
-
Kvantifisere klorinnhold i polybobler ved hjelp av nøytronaktiveringsanalyse (NAA)
- Bruk polybobbles som var lyofilisert i 2, 4, 6, 20 og 24 timer for denne studien ved 0,010 mBar vakuum og ved -85 °C.
- Mål 5-9 mg polybobler og plasser dem på LDPE bestrålings hetteglass.
- Forbered 1000 g/ml klorkalibreringsløsning fra nasjonalt institutt for standarder og teknologi (NIST)-sporbar kalibreringsløsning.
- Bruk 1 megawatt Triga reaktor til å utføre nøytronbestrålinger på hver prøve med nøytron flythastighet på 9,1 × 1012 / cm2· s for 600 s.
- Overfør polybobblene til enstrålte hetteglass.
- Bruk HPGe-detektoren til å oppnå gammastrålespektra i 500 s etter 360 s forfallsintervaller.
- Bruk NAA-programvare fra Canberra Industries til å analysere dataene.
-
Kvantifisere klorinnhold utgitt fra polybobler ved hjelp av NAA
- Inkuber polybobler som ble lyofilisert over natten (ved 0,010 mBar vakuum og ved -85 °C) i 400 μL PBS ved 37 °C.
- Samle supernativa i uke 1, 2 og 3 etter inkubasjon.
- Analyser supernativa for klorinnhold ved hjelp av NAA ved hjelp av samme metode som beskrevet ovenfor i trinn 7.1.
8. AuNR syntese av Kittler, S., et al.8
- Klargjør AuNR-såingsoppløsning ved å blande 250 μL 10 mM klorosentrisk syre (HAuCl4),7,5 ml 100 mM cetrimoniumbromid (CTAB) og 600 μL på 10 mM iskald natriumbohydrid (NaBH4).
- Forbered vekstløsning ved å blande 40 ml 100 ml CTAB, 1,7 ml 10 mM HAuCl4,250 μL sølvnitrat (AgNO3)og 270 μL μL på 17,6 mg/ml askorbinsyre til et rør.
- Bland kraftig 420 μL frøløsning med vekstløsningen ved 1200 o/min i 1 min. La deretter blandingen stå uforstyrret for å reagere i 16 timer.
- Fjern overflødige reagenser fra blandingen ved å sentrifugere ved 8000 × g i 10 min og kast supernatanten.
9. Hydrofobeisering av AuNRs av Soliman, M.G., et al.9
- Juster pH på 1,5 ml syntetisert CTAB-stabiliserte AuNRs til 10 ved hjelp av 1 mM natriumhydroksid (NaOH).
- Rør oppløsningen med 0,1 ml på 0,3 mM metylert PEG (mPEG) tiol ved 400 o/min over natten.
- Bland PEGylated AuNRs med 0,4 M dodecylamin (DDA) i kloroform ved 500 o/min i 4 dager.
- Rør ut det øverste organiske laget som inneholder hydrofobeiserte AuNRs og oppbevares ved 4 °C til fremtidig bruk.
10. NIR-aktivering av polybobler
- Bland polymerløsningen (PLGADA eller PCL/PCLTA) med hydrofobeiserte AuNRs i en 1:9 (vol/vol).
- Tilsett photoinitiator til polymer-AuNR blandingen i en 0,005:1 (vol / vol).
- Form polybobbles ved å injisere polymer-AuNR-blandingen i et 0,92 ml hetteglass med 10% CMC (wt/vol) (se trinn 2).
- Herd polybobblene ved 254 nm bølgelengde i 60 s ved 2 W/cm2.
- Blits fryse i flytende nitrogen for 30 s og lyofilisere over natten på 0.010 mBar vakuum og ved -85 °C.
- Skill de tørkede polybobbles ved hjelp av tang og vask med DI vann for å fjerne eventuelle gjenværende CMC.
- Inkuber polybobblene i 400 μL PBS ved 37 °C.
- Aktiver polyboblene ved hjelp av 801 nm NIR laser på 8A i 5 min hver mandag, onsdag og fredag.
- Ta frem-ser infrarøde (FLIR) bilder av polybubble før og etter laser aktivering for å oppnå temperaturverdier.
- Beregn temperaturforskjeller mellom før og etter laseraktivering basert på temperaturverdiene fra FLIR-bildene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Polybubbles ble i stor grad karakterisert ved hjelp av SEM og NAA. Lasten var vellykket sentrert for å resultere i en forsinket burst utgivelse. Polybubbles ble også vellykket laseraktivert på grunn av tilstedeværelsen av AuNRs i polyboblene.
Karakterisering av polybubble
Polybobbles injisert i en vandig løsning uten CMC resulterte i en flat polybubble på grunn av deres kontakt med bunnen av hetteglasset (figur 1A, B). Delvis utflating ble observert når 5 % CMC-basert vandig oppløsning ble brukt i stedet for DI-vann (figur 1C). Deretter resulterte 10% CMC-basert vandig løsning i hetteglasset med polybubble suspendert i løsningen og dermed vellykket vedlikehold av sfæren av polybubble (figur 1D).
Last sentrering
Lastinjeksjon i polyboble i fravær av CMC resulterte i lekkasje forårsaker ingen oppbevaring av last i polybubble (figur 3). For å motvirke denne utfordringen ble to tilnærminger brukt: 1) viskositeten til PCLTA ble vellykket økt ved hjelp av K2CO3 som ble isolert etter endcapping PCL triol med triacrylate (Figur 2), og 2) viskositet av lasten ble vellykket økt etter å ha blandet lasten med 5% CMC (Figur 3, Figur 4). Viskositeten til PLGADA polybubbles var tilstrekkelig til å lette sentrering av lasten og dermed ikke ble modulert ved hjelp av K2CO3.
Antigen funksjonalitet
HIV gp120/41 antigen ble blandet med og uten trehalose før injeksjon i polybubble (figur 5). Bindende effektivitet av antistoff til antigenet (betent som funksjonalitet) med og uten trehalose ble observert å ikke ha noen statistisk signifikant forskjell.
Frigi studier uten laseraktivering
Forsinkede burst utgivelser ble observert i PLGADA polybubbles med akriflavin i midten på dag 19 og 5 for polybobler inkubert ved henholdsvis 37 °C (figur 6A) og 50 °C (figur 6B). Forsinkede burst utgivelser ble også observert i PCL / PCLTA polybubbles med akriflavin i midten på dag 160 og 60 for polybobler inkubert ved 50 ° C (figur 7A) og 70 ° C (figur 7B), henholdsvis. Disse frigjøringsstudiene ble utført i fravær av laseraktiverbare AuNRs.
In vitro laser aktivering av polybobler
Polybobler med AuNRs i skallet ble vellykket laseraktivert flere ganger i PLGADA polybobler (figur 8A) og PCL / PCLTA polybubbles (figur 8B). Temperaturendringer fra før og etter laseraktivering var henholdsvis 10 ± 1 °C og 5 ± 1 °C i PCL/PCLTA polybobler med høyere og lavere AuNR-konsentrasjon i skallet. Temperaturendringer observert før og etter laseraktivering var henholdsvis 11 ± 2 °C og 6 ± 1 °C i PLGADA polybobler med høyere og lavere AuNR-konsentrasjon i skallet.
Figur 1: Opprettholde sfære av polybobler. SEM bilder av (A) 14 kDa PCL/300 Da PCLTA flatet polybubble på grunn av kontakt av polybubble med bunnen av glass hetteglasset; (B)14 kDa PCL/300 Da PCLTA polybubble fra toppen som ikke var i kontakt med glassbunnen; (C) PCL / PCLTA polybubbles med mindre grad av flating når injisert i en 5% CMC løsning sammenlignet med DI vannoppløsning, forårsaker dannelsen av halvkule-lignende form på kontakt med hetteglasset; (D) polybubble som ikke nådde bunnen av hetteglasset når det injiseres i en 10% CMC-løsning, slik at den sfæriske formen opprettholdes. Alle skalastenger som er angitt er 500 μm. Dette tallet er endret fra Lee et al.7. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Modulering av PCLTA viskositet. Konsentrasjonen av K2CO3 ble økt fra 0 til 80 mg/ml i PCLTA, og dynamisk viskositet ble observert å øke proporsjonalt med konsentrasjonen av K2CO3. Dette tallet er endret fra Arun Kumar et al10. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Lastinjeksjon i polybubben med og uten CMC. Topppanelet viser rammer hentet fra videoen av lastlekkasje under injeksjon i fravær av CMC. Bunnpanelet viser rammer hentet fra videoen av lastretensjon i polybubble i nærvær av 5% CMC. Dette tallet er endret fra Lee et al.7. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Sentrert last. Fluorescerende mikroskopbilder av (A) PCL / PCLTA polybubble med sentrert last, (B) PCL / PCLTA polybubble med last i skallet og sentrert ikke-fluorescerende fargestoff. Dette tallet er endret fra Arun Kumar et al10. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Antigenfunksjonalitet med trehalose. Funksjonaliteten til HIV gp120/41 med og uten trehalose i polyboblen ble analysert ved hjelp av ELISA. Den bindende effektiviteten av et antistoff mot proteinet anses generelt som en indikator på proteinets funksjonalitet. Når vi diskuterer funksjonaliteten til antigen i denne studien, har vi tenkt at det skal bety at det hjelper antistoffene som binder proteinet av interesse (som er en indikator for proteinfunksjonalitet). Ingen statistisk signifikans ble observert mellom de to gruppene. Konfidensintervaller angis med faste og stiplede linjer. Dette tallet er endret fra Lee et al.7. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Forsinket burst utgivelse fra PLGADA polybobler. Utgivelsesstudier som viser forsinkede burst utgivelser fra PLGADA polybobler med akriflavin i midten ved (A) 37 °C,(B) 50 °C. Solid linje indikerer den monterte kurven som er oppnådd basert på datapunktene. Dette tallet er endret fra Arun Kumar et al10. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Forsinket burst-utgivelse fra PCL/PCLTA polybobler. Utgivelsesstudier som viser forsinkede serieutgivelser fra PCL/PCLTA polybobler med acriflavine i midten ved (A) 50 °C,(B) 70 °C. Dette tallet er endret fra Arun Kumar et al10. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: NIR laseraktivering av polybobler. Temperaturendring observert før og etter NIR laseraktivering i (A) PLGADA polybobbles, (B) PCL / PCLTA polybobler med høyere og lavere konsentrasjon av AuNRs i polymer skallet. Denne temperaturøkningen kan utnyttes til potensielt å fremskynde polymerforringelsen som fører til tidligere utslipp av lasten. Dette tallet er endret fra Arun Kumar et al10. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dagens teknologier og utfordringer
Emulsjonsbaserte mikro- og nanopartikler har blitt ofte brukt som legemiddelleveringsbærere. Selv om utgivelsen kinetikk av lasten fra disse enhetene har blitt grundig studert, kontrollere burst release kinetikk har vært en stor utfordring11. Last allsidighet og funksjonalitet er også begrenset i emulsjonsbaserte systemer på grunn av eksponering av last til overskytende vandige og organiske løsemidler. Proteinbasert last er ofte ikke kompatibel med mikro- og nanopartikler på grunn av muligheten for lastdeningenning og aggregering12. I tillegg til laststabilitet er lastkinetikk spesielt viktig i sammenheng med vaksiner på grunn av behovet for boosterskudd som fører til serokonversjon. Tidligere forsøk på å løse disse utfordringene i vaksinelevering har ikke vært tilstrekkelig vellykket, da begrepet enkeltinjeksjonsvaksinesystemer har eksistert i et par tiår og ennå ikke er klinisk oversatt.
Vår blandingsvaksineleveringsplattform kan potensielt overvinne utfordringene med økt eksponering av last til organisk løsningsmiddel ved å minimere det eksponerte lastvolumet. Denne teknologien kan potensielt romme minst to lasterom: last i skallet og lasten i sentrum. Polybubbles med sentrert last kan brukes til å kontrollere burst utgivelsen av lasten samtidig som den er kompatibel med ulike lasttyper, inkludert små molekyler og antigen. I denne studien brukte vi polyester med varierende nedbrytningstid, PLGADA (kortere nedbrytningstid) og PCL / PCLTA (lengre nedbrytningstid), som polymerbærere og acriflavine (lite molekyl) som lasttype for å demonstrere forsinket burst utgivelse. I de følgende avsnittene beskriver vi de avgjørende trinnene i å danne polybobler som er i stand til å muliggjøre både forsinket burst-utgivelse og NIR-aktivering, spesielt for fremtidige on-demand leveringsprogrammer.
Last sentrering innenfor polybubble
Godssentraling var en av de betydelige utfordringene som ble oppdaget under utformingen av polyboblene. Umiddelbart etter injeksjonen ville lasten migrere til overflaten og lastelommen ville bli stabilisert uten å sprekke inn i vandig 10% CMC-løsningen. Polybubbles med slik off-sentrert last kan resultere i tidligere utgivelse på grunn av den ikke-ensartede tykkelsen på polymeren rundt lasten. Modulering viskositeten av polymer og lasten var dermed avgjørende for å løse problemer knyttet til last sentrering. Viskositeten til lasten ble økt ved å blande lastløsningen med 5% CMC. For å øke viskositeten til polymeren, kunne polymerens molekylære vekt ha blitt modifisert. Men økende molekylvekt resulterer ofte i langsommere polymerforringelse og forårsaker dermed ytterligere forsinkelse i lastutløsning. Viskositeten til polymeren ble dermed endret ved å øke konsentrasjonen av polymeren. Høyere konsentrasjon (1000 mg/ml) var tilstrekkelig til å øke viskositeten til PLGADA. Viskositeten til PCL/PCLTA var imidlertid ikke tilstrekkelig til å beholde lasten i midten. Dermed ble K2CO3 som ble isolert etter endcapping reaksjonen av PCLTA brukt til å øke viskositeten til PCLTA.
Ny forsinket utgivelse
Forsinket burst release ble observert fra utgivelsen studier utført ved hjelp av polybobler med sentrert last. Lite molekyl (acriflavine) ble brukt som sentrert last i polyboblene for å studere frigjøringsprofilen. Unike frigjøringsprofiler ble observert basert på polyesteren som ble brukt på grunn av forskjellen i polymerenes nedbrytningstid. Burst utgivelsen ble observert tidligere i PLGADA polybubbles sammenlignet med pcl / PCLTA polybubbles. Tidlig lastutløsning ble observert i PLGADA polybobler fordi PLGA forringes raskere sammenlignet med PCL13. Ved vellykket modulering av utgivelseskinetikk med to typer polyester, ønsket vi videre å konstruere polybubble for å potensielt muliggjøre behovsbetinget frigjøring av lasten.
NIR-aktivering av polybobler
On-demand utgivelsen av lasten med hensyn til tidspunktet for pasientenes behov har vært utfordrende å oppnå ved hjelp av dagens leveringsstrategier14. Vi hypotetisk at fremskynde lasten utgivelsen on-demand kan være mulig ved å akselerere polymer nedbrytning gjennom bruk av NIR- sensitive (det vil si theranostic-aktivering) agenter. AuNRs har blitt grundig studert for deres evne til å bli aktivert ved hjelp av NIR laser som kan reise noen centimeter gjennom huden15. CTAB-stabiliserte AuNRs ble dermed utarbeidet basert på protokollen av Kittler, S, et al. og ble hydrofobicized basert på metodene publisert av Solimon, M.G., et al. Polybobler med hydrofobeiserte AuNRs i skallet ble deretter bestrålt med NIR laser på ønskede tidspunkter i 5 min for å observere temperaturendring. Temperaturer før og etter laser ble målt basert på FLIR-bildene. Herdet polymer skall bidro til å bevare formen på AuNRs under laseraktiveringen og dermed muliggjør flere NIR aktiveringer av polybobler. Dette er en interessant observasjon fordi i tidligere litteratur, AuNRs har ofte vært kjent for å miste sin stang-lignende form (avgjørende for NIR aktivering) på grunn av laser aktivering16. Den vellykkede laseraktiveringen av polybobblene med AuNRs kan bane vei for å kontrollere on-demand-utgivelsen av lasten i neste generasjon polybobler.
Betydning og fremtidige anvendelser
Resultatene fra denne studien viser dermed at polybobler har potensial til å bli brukt som en ny vaksine leveringsplattform. Utarbeidelse av polybobler beskrevet i dette papiret vil ytterligere gjøre det mulig for andre forskere å bruke polybobbles som en leveringsplattform for andre terapeutiske applikasjoner. For eksempel, i tillegg til vaksinelevering, kan polybobbles også potensielt brukes til å levere synergistiske terapeutiske midler med varierende frigjøringskinetikk. Videre er polybobbles laget av polyester som er biologisk nedbrytbare og har blitt brukt i mange FDA-godkjente medisinske enheter. Vi har ytterligere validert sikkerheten til polybobler ved å vise at kloret som frigjøres fra polybobler, er godt innenfor sikkerhetsnivåene anbefalt av EPA17. Dermed har vår roman, injiserbare, UV-herdbare polybubble plattform potensial til å bli brukt som en sikker og effektiv narkotikaleveringsplattform for en rekke lasttyper.
Begrensninger av denne teknologien
Polybubble plattformteknologi kan brukes som en vaksine levering plattform potensielt muliggjør kontrollert utgivelse. Våre studier fremhever allsidigheten til denne plattformen som er i stand til å levere forskjellige lasttyper, inkludert antigener og små molekyler. En av de nåværende begrensningene i denne teknologien er imidlertid at lasten for tiden injiseres manuelt. For skaleringsformål, vi er for tiden engineering en automatisert plattform som vil muliggjøre injeksjon (det vil si som en rekke) av last i polybubble og vil potensielt bidra til å lindre bekymringer om salgbarhet av denne teknologien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfattere har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke Dr. Bryan E. Tomlin tilknyttet elementanalyselaboratoriet i kjemiavdelingen ved TAMU som hjalp til med nøytronaktiveringsanalysen (NAA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Step Ultra Tetramethylbezidine (TMB)-Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Substrate Solution | Thermo scientific | 34028 | |
| 2-Hydroxy-2-methylpropiophenone | TCI AMERICA | H0991 | |
| 450 nm Stop Solution for TMB Substrate | Abcam | ab17152 | |
| Acryloyl chloride | Sigma Aldrich | A24109-100G | |
| Acriflavine | Chem-Impex International | 22916 | |
| Anhydrous ethyl ether | Fisher Chemical | E138-500 | |
| Anti-HIV1 gp120 antibody conjugated to horseradish peroxidase (HRP) | |||
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher BioReagents | BP9700100 | |
| BSA-CF488 dye conjugates | Invitrogen | A13100 | |
| Bromosalicylic acid | Acros Organics | AC162142500 | |
| Carboxymethylcellulose (CMC) | Millipore Sigma | 80502-040 | |
| Centrimonium bromide (CTAB) | MP Biomedicals | ICN19400480 | |
| Chloroform | Fisher Chemical | C2984 | |
| Coating buffer | Abcam | ab210899 | |
| Dichloromethane (DCM) | Sigma Aldrich | 270997-1L | |
| Diethyl ether | Fisher Chemical | E1384 | |
| Dodeacyl Amine | Acros Organics | AC117665000 | |
| Doxorubicin hydrochloride | Fisher BioReagents | BP251610 | |
| L-ascorbic acid | Acros Organics | A61 100 | |
| Legato 100 Syringe Pump | KD Scientific | 14 831 212 | |
| mPEG thiol | Laysan Bio | NC0702454 | |
| Nonfat dry milk | Andwin Scientific | NC9022655 | |
| Potassium carbonate | Acros Organics | AC424081000 | |
| Phosphate saline buffer | Fisher BioReagents | BP3991 | |
| (Poly(caprolactone) | Sigma Aldrich | 440744-250G | |
| (Poly(caprolactone) triol | Acros Organics | AC190730250 | |
| Poly (lactic-co-glycolic acid) diacrylate | CMTec | 280050 | |
| Potassium carbonate | Acros Organics | AC424081000 | |
| Recombinant HIV1 gp120 + gp41 protein | Abcam | ab49054 | |
| Silver nitrate | Acros Organics | S181 25 | |
| Sodium borohydride | Fisher Chemical | S678 10 | |
| Tetrachloroauric acid | Fisher Chemical | G54 1 | |
| Trehalose | Acros Organics | NC9022655 | |
| Triethyl amine | Acros Organics | AC157910010 |
References
- World Health Organization. Global Immunization: Worldwide Disease Incidence. , Children's Hospital of Philadelphia. https://www.chop.edu/centers-programs/vaccine-education-center/global-immunization/diseases-and-vaccines-world-view (2018).
- Paul, A., Bera, M., Gupta, P., Singh, N. D. P. o-Hydroxycinnamate for sequential photouncaging of two different functional groups and its application in releasing cosmeceuticals. Organic and Biomolecular Chemistry. 17 (33), 7689-7693 (2019).
- Kumari, A., Yadav, S. K., Yadav, S. C. Biodegradable polymeric nanoparticles based drug delivery systems. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 75 (1), 1-18 (2010).
- Dai, C., Wang, B., Zhao, H. Microencapsulation peptide and protein drugs delivery system. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 41 (2-3), 117-120 (2005).
- Souery, W. N., et al. Controlling and quantifying the stability of amino acid-based cargo within polymeric delivery systems. Journal of Control Release. 300, 102-113 (2019).
- Wang, W. Advanced protein formulations. Protein Science. 24 (7), 1031-1039 (2015).
- Lee, J., et al. An ultraviolet-curable, core-shell vaccine formed via phase separation. Journal of Biomedical Materials Research Part A. , (2019).
- Kittler, S., Hickey, S. G., Wolff, T., Eychmüller, A. Easy and Fast Phase Transfer of CTAB Stabilised Gold Nanoparticles from Water to Organic Phase. Zeitschrift für Physikalische Chemie. 229, 235 (2015).
- Soliman, M. G., Pelaz, B., Parak, W. J., del Pino, P. Phase Transfer and Polymer Coating Methods toward Improving the Stability of Metallic Nanoparticles for Biological Applications. Chemistry of Materials. 27 (3), 990-997 (2015).
- Arun Kumar, S., Good, J., Hendrix, D., Yoo, E., Kim, D., Deo, K. A., Jhan, Y. Y., Gaharwar, A. K., Bishop, C. J. Nanoengineered Light-Activatable Polybubbles for On?Demand Therapeutic Delivery. Adv. Funct. Mater. , 2003579 (2020).
- Wuthrich, P., Ng, S. Y., Fritzinger, B. K., Roskos, K. V., Heller, J. Pulsatile and delayed release of lysozyme from ointment-like poly(ortho esters). Journal of Controlled Release. 21 (1), 191-200 (1992).
- Wang, W. Instability, stabilization, and formulation of liquid protein pharmaceuticals. International Journal of Pharmaceutics. 185 (2), 129-188 (1999).
- Wong, D. Y., Hollister, S. J., Krebsbach, P. H., Nosrat, C. Poly(epsilon-caprolactone) and poly (L-lactic-co-glycolic acid) degradable polymer sponges attenuate astrocyte response and lesion growth in acute traumatic brain injury. Tissue Engineering. 13 (10), 2515-2523 (2007).
- Davoodi, P., et al. Drug delivery systems for programmed and on-demand release. Advanced Drug Delivery Reviews. 132, 104-138 (2018).
- Huang, Y. C., Lei, K. F., Liaw, J. W., Tsai, S. W. The influence of laser intensity activated plasmonic gold nanoparticle-generated photothermal effects on cellular morphology and viability: a real-time, long-term tracking and monitoring system. Photochemical and Photobiological Sciences. 18 (6), 1419-1429 (2019).
- Link, S., Burda, C., Nikoobakht, B., El-Sayed, M. A. Laser-Induced Shape Changes of Colloidal Gold Nanorods Using Femtosecond and Nanosecond Laser Pulses. The Journal of Physical Chemistry B. 104 (26), 6152-6163 (2000).
- U.S. Environmental Protection Agency. Chlorine. , https://www.epa.gov/sites/production/files/2016-09/documents/chlorine.pdf (2000).
