Summary
Denne artikel beskriver de protokoller, der anvendes til at producere en ny vaccine levering platform, "polybobbles," at muliggøre forsinket burst frigivelse. Polyestere, herunder poly (lactic-co-glycolic syre) og polycaprolactone blev brugt til at danne polybobler og små molekyler og antigen blev brugt som last.
Abstract
Vaccine levering strategier, der kan begrænse eksponeringen af last til organisk opløsningsmiddel og samtidig muliggøre nye udgivelse profiler er afgørende for at forbedre immunisering dækning på verdensplan. Her introduceres en ny injicerbar, ultraviolet- helbredes og forsinket burst release- muliggør vaccine levering platform kaldet polybobler. Last blev injiceret i polyester-baserede polybobler, der blev dannet i 10% carboxymethycellulose-baserede vandige opløsning. Dette papir indeholder protokoller til at opretholde sfærisk form af polybobler og optimere lastplacering og fastholdelse for at maksimere mængden af gods i polybobler. For at sikre sikkerheden blev indholdet af chlorerede opløsningsmidler i polyboblerne analyseret ved hjælp af neutronaktiveringsanalyse. Frigivelsesundersøgelser blev udført med små molekyler som last i polyboblet for at bekræfte forsinket burst-frigivelse. For yderligere at vise potentialet for on-demand levering af lasten, guld nanorods blev blandet inden for polymer shell at muliggøre nær-infrarød laser aktivering.
Introduction
Begrænset immunisering dækning resulterer i død af 3 millioner mennesker specifikt forårsaget af vaccine-forebygges sygdomme1. Utilstrækkelige opbevarings- og transportforhold fører til spild af funktionelle vacciner og bidrager dermed til reduceret global immunisering. Desuden medfører ufuldstændig vaccination på grund af manglende overholdelse af de krævede vaccineplaner også begrænset vaccinedækning, specielt iudviklingslandene 2. Flere besøg hos medicinsk personale er påkrævet inden for den anbefalede periode for at modtage booster skud, hvilket begrænser procentdelen af befolkningen med fuldstændig vaccination. Der er derfor behov for at udvikle nye strategier for kontrolleret vaccinelevering for at omgå disse udfordringer.
Den nuværende indsats for at udvikle vaccineleveringsteknologier omfatter emulsionsbaserede polymeresystemer 3,4. Lasten udsættes dog ofte for større mængder organisk opløsningsmiddel, som potentielt kan forårsage aggregering og denaturering, navnlig i forbindelse med proteinbaseret last5,6. Vi har udviklet en ny vaccine levering platform, "polybubbles", der potentielt kan huse flere lastrum og samtidig minimere mængden af last, der er udsat for opløsningsmiddel7. For eksempel, i vores polybubble core-shell platform, en lastlomme med diameter 0,38 mm (SEM) injiceres i midten af en 1 mm polybubble. I dette tilfælde vil overfladearealet af last, der udsættes for organisk opløsningsmiddel, være ca. 0,453 mm2. Efter at have overvejet pakningstætheden af kugler (mikropartikler) i en kugle (fragtdepot) er den faktiske mængde mikropartikler (10 μm i diameter), der kan være i depotet, 0,17 mm3. Volumenet af en mikropartikel er 5,24x10-8 mm3 og dermed antallet af partikler mikropartikler, der kan passe depotet er ~ 3,2x106 partikler. Hvis hver mikropartikel har 20 lastlommer (som følge af dobbeltemulsion) med en diameter på 0,25 μm, er overfladearealet for last, der udsættes for organisk opløsningsmiddel, 1274 mm2. Lastdepotet i polyboblen ville således have ~ 2800 gange mindre overfladeareal udsat for organisk opløsningsmiddel sammenlignet med organisk opløsningsmiddel-eksponeret last i mikropartikler. Vores polyesterbaserede platform kan således potentielt reducere mængden af last, der udsættes for organisk opløsningsmiddel, hvilket ellers kan forårsage lastsammenlægning og ustabilitet.
Polybobler dannes baseret på faseseparationsprincippet, hvor polyesteren i organisk fase sprøjtes ind i en vandig opløsning, hvilket resulterer i en sfærisk boble. Last i den vandige fase kan derefter injiceres i midten af polyboble. Et andet lastrum kan potentielt opnås inden for polybubble ved at blande en anden last med polymer skallen. Den polyboble på dette tidspunkt vil være formbart og vil derefter blive helbredt for at resultere i en solid polybobble struktur med last i midten. Sfæriske polybobler blev valgt frem for andre geometriske former for at øge lastkapaciteten i polybobble og samtidig minimere polyboblens samlede størrelse. Polybobler med last i midten blev valgt for at demonstrere forsinket burst frigivelse. Polybober blev også indarbejdet med nær infrarød (NIR) - følsomme (dvs. theranostic-aktiverende) agent, nemlig guld nanorods (AuNR), at forårsage stigning i temperaturen af polybober. Denne effekt kan potentielt lette en hurtigere nedbrydning og kan anvendes til at kontrollere kinetik i fremtidige anvendelser. I dette papir beskriver vi vores tilgang til form og karakterisere polybubbles, for at opnå forsinket burst frigivelse fra polybobbles, og at indarbejde AuNR i polybubbles at forårsage NIR-aktivering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Polycaprolacyon triacrylat (PCLTA) syntese
- 3,2 ml 400 Da polycaprolacyon (PCL) triol tørres natten over ved 50 °C i en åben 200 ml rund bundkolbe og K2CO3 i et glashætteglas ved 90 °C.
- Triol blandes med 6,4 ml dichlormethan (DCM) og 4,246 g kaliumcarbonat (K2CO3)under argon.
- 2,72 ml acryloylchlorid blandes i 27,2 ml DCM og tilsættes dråbevis reaktionsblandingen i kolben over 5 min.
- Dæk reaktionsblandingen med aluminiumsfolie og lad den være uforstyrret ved stuetemperatur i 24 timer under argon.
- Efter 24 timer filtreres reaktionsblandingen med et filterpapir på en Buchner-tragt under vakuum for at kassere overskydende reagenser.
- Bundfald filtrat fra trin 1.5, der indeholder den endede polymer i diethylether i en 1:3 (vol/vol) og rotovape ved 30 °C for at fjerne diethyletheren.
2. Dannelse af polybubble
BEMÆRK: Indsprøjtning polymer i deioniserede (DI) vand ville forårsage polybobler til at migrere til bunden af hætteglasset resulterer i fladtrykt bund. Brug 10% (wt/vol) carboxymethyl cellulose (CMC) fylde glashætteglasset i stedet for at undgå polybobble udfladning.
- Forbered 10% (wt/vol) CMC-opløsning i DI-vand.
- Fyld et 0,92 ml glashætteglas med 0,8 ml 10% CMC ved hjælp af et 1 ml overførselsrør.
- Bland 1000 mg/ml på 14 kDa PCL i DCM og syntetiser PCLTA i en 1:3 (vol/vol) for et samlet volumen på 200 μL, eller der tilberedes 200 μL på 1000 mg/ml 5 kDa poly (lactic-colycolicsyre) diakryl (PLGADA) i chlorformo.
- Bland 2-hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenon (fotoinitiator) med polymeren (PLGADA eller PCL/PCLTA) blandingen i 0,005:1 (vol/vol).
- Læg 200 μL polymerblanding i en 1 ml glassprøjte monteret på en sprøjtepumpe, der er forbundet til et dispenserings-rør i rustfrit stål med en indre diameter på 0,016 tommer.
- Brug en mikromotor til at styre den frem og tilbage bevægelse af polymerrøret til at injicere polymer i 10% CMC i glashætteglasset til at danne polyboble.
- Polybubbles under ultraviolet (UV) ved 254 nm bølgelængde i 60 s ved 2 W/cm2.
- Flash fryse polybobler i flydende nitrogen og lyophilize natten over ved 0.010 mBar vakuum og ved -85 °C.
- Adskiv polybomerne fra det tørrede CMC ved hjælp af snævler og vask polybobbles med DI vand for at fjerne eventuelle resterende CMC. Bemærk, at andre polymerer kan bruges sandsynligvis med ændringer for at ændre frigivelsen kinetik.
3. Graduering af polybobble diameter
- Fyld et 0,92 ml glashætteglas med 10% CMC ved hjælp af et 1 ml overførselsrør.
- Bland PCL/PCLTA i en 1:3 (vol/vol) med 1000mg/mL 14kDa PCL og syntetisere PCLTA. Bland fotoinitiatoren med polymerblandingen i en 0,005:1 (vol/vol).
- Indlæs polymerblandingen i en 1 ml glassprøjte monteret på en sprøjtepumpe, der er forbundet til et dispenseringsrør i rustfrit stål med en indre diameter på 0,016 tommer.
- Brug en mikromotor til at styre den frem og tilbage bevægelse af polymerrøret til at injicere polymer i 10% CMC i glashætteglasset til at danne polyboble.
- For at opnå polybubbles med forskellige diametre, variere dispensering sats fra 0,0005 til 1 μL / s.
- Tag billeder af hætteglasset med polybobbles med varierende diameter.
- Brug ImageJ til at kvantificere diameteren af polybobbles og bruge størrelsen af hætteglasset som skala.
4. Centrering last i polyboble
-
Graduering af PCL/PCLTA viskositet ved hjælp af K2CO3:
BEMÆRK: Viskositeten af PLGADA behøver ikke at blive ændret ved hjælp af K2CO3, fordi viskositeten på 5 kDa PLAGDA ved 1000 mg/ml er tilstrækkelig til centrering af lasten.- Der tilsættes K2CO3 (som blev isoleret efter PCLTA-reaktionen) til PCLTA i varierende koncentrationer, herunder 0 mg/ml, 10 mg/ml, 20 mg/ml, 40 mg/ml og 60 mg/ml.
- Mål løsningernes dynamiske viskositet ved at ændre forskydningshastigheden fra 0 til 1000 1/s ved hjælp af reometri.
- Indsprøjt forsigtigt lasten i midten (se trin 4.2 for at forberede lastblandingen) af de polybober, der blev dannet ved hjælp af PCL/PCLTA-opløsningerne med forskellige koncentrationer af K2CO3 (trin 4.1.1). Den optimale koncentration af K2CO3 bestemmes ved at observere, hvilken opløsning fra trin 4.1.1 der kan resultere i opbevaring af lasten i midten.
-
Centrering af lasten (allerede vist gennemførlighed med små molekyler) med CMC
- Bland lasten med 5% (wt/ vol) CMC i en rotator natten over for at øge viskositeten af lasten.
- Sprøjt manuelt 2 μL lastblanding i polyboblen og fortsæt med UV-hærdning ved 254 nm bølgelængde i 60 s ved 2 W/cm2.
- Flash fryse polybobler i flydende nitrogen i 30 s og lyophilize natten over ved 0.010 mBar vakuum og ved -85 °C.
- Adskiv polybobbles fra den tørrede CMC ved hjælp af snævler og vask med DI vand for at fjerne eventuelle resterende CMC.
- Skær polybubble i halve og billede halvdele ved hjælp af konfokale mikroskopi for at sikre, at lasten er centreret (se trin 6 for excitation og emission bølgelængder anvendes).
5. Fragtformulering
BEMÆRK: Polybubble formulering kan huse forskellige lasttyper, herunder små molekyler, proteiner og nukleinsyrer.
- Baseret på tidligere undersøgelser, i tilfælde af protein last, bruge hjælpestoffer, herunder polyethylenglycol (PEG)6,polyvinylpyrolidon (PVP), og glykopolymerer6 til at forbedre stabiliteten af protein under polybobble formulering.
- Form polybobler baseret på protokollen i trin 2.
- Antigenopløsningen klargørs ved at tilsætte 17,11 g trehalose til 625 μL HIV gp120/41-antigen.
- Indsprøjtning manuelt 1 μL antigenopløsning midt i polyboblen.
- Åbn polybobler på dag 0, 7, 14 og 21, og skab fluorescensen af antigen med excitation og emissionsbølgelængder 497 nm og 520 nm.
- Antigenets funktionalitet bestemmes ved hjælp af enzymrelateret immunosorbentanalyse (ELISA), og brug 5 % ikke-fedtfri mælk som blokerende buffer.
6. Frigivelse af gods
BEMÆRK: Lille molekyle eller antigen kan anvendes som lasttype
-
Lille molekyle
- Inkuber polybubbles med centreret acriflavine i 400 μL fosfat buffer saltvand (PBS) ved 37 °C, 50 °C for PLGADA polybobbles og ved 37 °C, 50 °C, 70 °C for PCL/PCLTA polybobbles.
BEMÆRK: Grunden til, at vi anbefaler at teste over kropstemperaturer, er at a) simulere den temperatur (50 °C), ved hvilken polyboblen når, mens de laserer guldnanorodene (AuNRs) inden for PCL og PLGA; b) fremskynde nedbrydningsprocessen af PCL (50 °C, 70 °C). - På hvert tidspunkt indsamles supernatanterne, og den udskiftes med 400 μL frisk PBS.
- Brug en pladelæser til at kvantificere fluorescensintensiteten i de opsamme supernatanter.
BEMÆRK: Brug ex/em på 416 nm/514 nm til acriflavine.
- Inkuber polybubbles med centreret acriflavine i 400 μL fosfat buffer saltvand (PBS) ved 37 °C, 50 °C for PLGADA polybobbles og ved 37 °C, 50 °C, 70 °C for PCL/PCLTA polybobbles.
-
Antigen
- Der inkuberes polybobler med centreret kvægalbuminserum (BSA)-488 i 400 μL PBS ved 37 °C, 50 °C for PLGADA-polybobler og ved 37 °C 50 °C for PCL/PCLTA polybobbles.
- På hvert tidspunkt indsamles supernatanterne, og den udskiftes med 400 μL frisk PBS.
- Brug en pladelæser til at kvantificere fluorescensintensiteten i de opsamme supernatanter. Brug ex/em på 497 nm/520 nm til BSA-488.
BEMÆRK: Der bør ikke udføres en undersøgelse ved 70 °C til PCL/PCLTA-polybobler for at undgå at udsætte antigenet for ekstrem temperatur.
7. Toksicitet
-
Kvantificering af klorindholdet i polybobler ved hjælp af neutronaktiveringsanalyse (NAA)
- Brug polybobler, der var lyophilized for 2, 4, 6, 20 og 24 h for denne undersøgelse på 0.010 mBar vakuum og ved -85 °C.
- 5-9 mg polybobler måles, og de sættes på LDPE-bestrålingshætteglas.
- Der skal udarbejdes en 1000 g/ml klorkalibreringsopløsning fra det nationale institut for standarder og teknologi (NIST)-sporbar kalibreringsopløsning.
- Brug 1- megawatt Triga-reaktor til at udføre neutronbestråling på hver prøve med neutronfluencehastighed på 9,1 ×10 12 /cm20 for 600 s.
- Polybobler overføres til ubestrålede hætteglas.
- Brug HPGe-detektoren til at opnå gammastrålespektre i 500 s efter 360 s henfaldsintervaller.
- Brug NAA software fra canberra Industries til at analysere dataene.
-
Kvantificering af klorindhold, der frigives fra polybobler ved hjælp af NAA
- Inkuber polybubbles, der blev fryset natten over (ved 0,010 mBar vakuum og ved -85 °C) i 400 μL PBS ved 37 °C.
- Saml supernatanterne i uge 1, 2 og 3 efter inkubation.
- Supernatanter analyseres for klorindhold ved hjælp af NAA ved hjælp af den samme metode som beskrevet ovenfor i trin 7.1.
8. AuNR Syntese af Kittler, S., et al.8
- Der tilberedning af AuNR-såning ved blanding af 250 μL 10 mM chlorauricsyre (HAuCl4), 7,5 ml 100 mM cetrimoniumbromid (CTAB) og 600 μL 10 mM iskold natriumvalnathydrid (NaBH4).
- Vækstopløsning tilberedes ved blanding af 40 ml 100 mM CTAB, 1,7 ml 10 mM HAuCl4,250 μL sølvnitrat (AgNO3) og 270 μL 17,6 mg/ml ascorbinsyre i et rør.
- Bland kraftigt 420 μL frøopløsning med vækstopløsningen ved 1200 omdr./min. i 1 min. Lad derefter blandingen uforstyrret til at reagere i 16 timer.
- De overskydende reagenser fjernes fra blandingen ved centrifugering ved 8000 × g i 10 min. og supernatanten kasseres.
9. Hydrophobicization af AuNRs af Soliman, M.G., et al.9
- PH på 1,5 ml syntetiseret CTAB-stabiliserede AuNR'er justeres til 10 ved hjælp af 1 mM natriumhydroxid (NaOH).
- Rør opløsningen med 0,1 ml 0,3 mM methyleret PEG (mPEG) thiol ved 400 omdr./min. natten over.
- Pegylated AuNRs med 0,4 M dodecylamin (DDA) i chloroform ved 500 rpm i 4 dage.
- Pipet det øverste organiske lag, der indeholder hydrofobetiske AuNR'er, ud og opbevares ved 4 °C indtil fremtidig brug.
10. NIR-aktivering af polybobler
- Polymeropløsningen (PLGADA eller PCL/PCLTA) blandes med hydrofobede AuNR'er i en 1:9 (vol/vol).
- Tilføj fotoinitiator til polymer-AuNR blandingen i en 0,005:1 (vol / vol).
- Polybomer dannes ved at indsprøjte polymer-AuNR-blandingen i et 0,92 ml glasglas med 10% CMC (wt/vol) (se trin 2).
- Polybubbles ved 254 nm bølgelængde i 60 s ved 2 W/cm2.
- Flash fryse i flydende nitrogen i 30 s og lyophilize natten over ved 0.010 mBarvakuum og ved -85 °C.
- Adskiv de tørrede polybobler ved hjælp af sniver og vask med DI vand for at fjerne eventuelle resterende CMC.
- Polybomerne inkuberes i 400 μL PBS ved 37 °C.
- Aktiver polybobbles ved hjælp af 801 nm NIR laser på 8A i 5 min hver mandag, onsdag og fredag.
- Tag fremadrettede infrarøde (FLIR) billeder af polyboble før og efter laser aktivering for at opnå temperaturværdier.
- Beregn temperaturforskelle mellem før og efter laseraktivering baseret på temperaturværdierne fra FLIR-billederne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Polybobler var i udstrakt grad karakteriseret ved hjælp af SEM og NAA. Cargo blev med succes centreret til at resultere i en forsinket burst frigivelse. Polybobbles blev også med succes laser-aktiveret på grund af tilstedeværelsen af AuNRs inden for polybobler.
Polybubble karakterisering
Polybobbles injiceres i en vandig opløsning uden CMC resulterede i en flad polybubble på grund af deres kontakt med bunden afglashætteglasset( Figur 1A, B). Delvis udfladning blev observeret, da 5% CMC-baseret vandig opløsning blev anvendt i stedet for DI-vand (Figur 1C). Efterfølgende resulterede 10% CMC-baseret vandig opløsning i glashætteglasset i, at polybubble blev suspenderet i opløsningen og dermed en vellykket vedligeholdelse af polyboblets(figur 1D).
Cargo centrering
Lastindsprøjtning i polyboblen uden CMC resulterede i lækage, der ikke forårsagede lastfastholdelse i polyboblet (figur 3). For at imødegå denne udfordring blev der anvendt to metoder: 1) PCLTA's viskositet blev med succes forøget ved hjælp af K2CO3, der blev isoleret efter endcapping PCL triol med triacrylate (Figur 2), og 2) viskositeten af lasten blev med succes øget efter blanding af lasten med 5% CMC (Figur 3, Figur 4). Viskositeten af PLGADA polybubbles var tilstrækkelige til at lette centrering af lasten og blev derfor ikke moduleret ved hjælp af K2CO3.
Antigenfunktionalitet
HIV gp120/41 antigen blev blandet med og uden trehalose før injektion i polybobble (Figur 5). Bindende virkning af antistof til antigenet (betegnes som funktionalitet) med og uden trehalose blev observeret at have nogen statistisk signifikant forskel.
Udgivelsesundersøgelser uden laseraktivering
Der blev observeret forsinkede burst-udslip i PLGADA-polybubbles med acriflavin i midten på henholdsvis dag 19 og 5 for polybobler inkuberet ved henholdsvis 37 °C (figur 6A) og 50 °C ( figur6B). Der blev også observeret forsinkede burst-udslip i PCL/PCLTA-polybubble med acriflavin i midten på henholdsvis dag 160 og 60 for polybobler inkuberet ved henholdsvis 50 °C (figur 7A) og 70 °C ( figur7B). Disse frigivelse undersøgelser blev udført i mangel af laser-aktiverelige AuNRs.
In vitro laser aktivering af polybobler
Polybobbles med AuNRs i skallen blev med succes laseraktiveret flere gange i PLGADA polybubbles (Figur 8A) og PCL / PCLTA polybobler (Figur 8B). Temperaturændringer fra før og efter laseraktivering var henholdsvis 10 ± 1 °C og 5 ± 1 °C i PCL/PCLTA polybobbles med højere og lavere AuNR-koncentration i skallen. Temperaturændringer observeret før og efter laseraktivering var henholdsvis 11 ± 2 °C og 6 ± 1 °C i PLGADA-polybobler med højere og lavere AuNR-koncentration i skallen.
Figur 1: Opretholdelse af polybomens sfæriske. SEM-billeder af (A) 14 kDa PCL/300 Da PCLTA fladtrykt polybubble på grund af kontakt med polybom med bunden af glashætteglasset; bB) 14 kDa PCL/300 Da PCLTA polybubble fra toppen, som ikke var i kontakt med glasbunden c) PCL/PCLTA polybubbles med mindre grad af udfladning, når de injiceres i en 5% CMC-opløsning sammenlignet med DI-vandopløsning, hvilket medfører dannelse af halvkuglelignende form ved hætteglassets kontaktpunkt dD) polyboble, der ikke nåede bunden af glashætteglasset, når det blev injiceret i en 10% CMC-opløsning, således at den sfæriske form kunne opretholdes. Alle de angivne skalastænger er 500 μm. Dette tal er blevet ændret fra Lee et al.7. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Graduering af PCLTA viskositet. Koncentrationen af K2CO3 blev øget fra 0 til 80 mg/ml i PCLTA, og der blev observeret dynamisk viskositet, som steg proportionalt med koncentrationen af K2CO3. Dette tal er blevet ændret fra Arun Kumar et al10. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Fragtindsprøjtning i polyboblen med og uden CMC. Top panel viser billeder udvundet fra videoen af last lækage under injektion i mangel af CMC. Nederste panel viser rammer udvundet fra videoen af lasten opbevaring i polyboble i overværelse af 5% CMC. Dette tal er blevet ændret fra Lee et al.7. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Centreret last. Fluorescerende mikroskop billeder af (A) PCL / PCLTA polybom med centreret last, (B) PCL / PCLTA polybom med last i skallen og centreret ikke-fluorescerende farvestof. Dette tal er blevet ændret fra Arun Kumar et al10. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Antigenfunktionalitet med trehalose. Funktionaliteten af HIV gp120/41 med og uden trehalose i polyboblet blev analyseret ved hjælp af ELISA. Et antistofs bindingseffektivitet til proteinet betragtes generelt som en indikator for proteinets funktionalitet. Når vi diskuterer antigenets funktionalitet i denne undersøgelse, agter vi, at det betyder, at det hjælper antistofferne, der binder det relevante protein (som er en indikator for proteinfunktionalitet). Der blev ikke observeret nogen statistisk signifikans mellem de to grupper. Konfidensintervaller angives med dækkende og stiplede linjer. Dette tal er blevet ændret fra Lee et al.7. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Forsinket burst frigivelse fra PLGADA polybubbles. Frigivelsesundersøgelser, der viser forsinkede burst-udslip fra PLGADA-polybubbles med acriflavine i midten ved (A) 37 °C, (B) 50 °C. Fast linje angiver den monterede kurve, der er opnået baseret på datapunkterne. Dette tal er blevet ændret fra Arun Kumar et al10. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: Forsinket burst-frigivelse fra PCL/PCLTA-polybobler. Frigivelsesundersøgelser, der viser forsinkede burst-udslip fra PCL/PCLTA polybubbles med acriflavine i midten ved (A) 50 °C, (B) 70 °C. Dette tal er blevet ændret fra Arun Kumar et al10. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8: NIR laseraktivering af polybobler. Temperaturændring observeret før og efter NIR laseraktivering i (A)PLGADA polybubbles,(B)PCL/PCLTA polybubbles med højere og lavere koncentration af AuNRs i polymerskallen. Denne temperaturstigning kan udnyttes til potentielt at fremskynde polymer nedbrydningen, der fører til tidligere frigivelse af lasten. Dette tal er blevet ændret fra Arun Kumar et al10. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nuværende teknologier og udfordringer
Emulsion-baserede mikro- og nanopartikler har været almindeligt anvendt som narkotika levering luftfartsselskaber. Selv om frigivelse kinetik af lasten fra disse enheder er blevet grundigt undersøgt, kontrollerende burst frigivelse kinetik har været en stor udfordring11. Lastens alsidighed og funktionalitet er også begrænset i emulsionsbaserede systemer på grund af lastens eksponering for overskydende vandige og organiske opløsningsmidler. Proteinbaseret fragt er ofte ikke forenelig med mikro- og nanopartikler på grund af muligheden for denaturering og sammenlægning12. Ud over laststabilitet er lastkinetik særlig vigtig i forbindelse med vacciner på grund af behovet for boosterskud, der fører til serokonversion. Tidligere bestræbelser på at løse disse udfordringer i forbindelse med vaccinelevering har ikke været tilstrækkelig vellykket, da begrebet vaccinesystemer til enkelt injektion har eksisteret i et par årtier og endnu ikke er blevet klinisk oversat.
Vores polybobble vaccine levering platform kan potentielt overvinde de udfordringer med øget eksponering af last til organisk opløsningsmiddel ved at minimere den udsatte last volumen. Denne teknologi kan potentielt rumme mindst to lastrum: last i skallen og last i midten. Polybobler med centreret last kan bruges til at styre burst frigivelse af lasten og samtidig være kompatibel med forskellige lasttyper, herunder små molekyler og antigen. I denne undersøgelse brugte vi polyestere med varierende nedbrydningstider, PLGADA (kortere nedbrydningstid) og PCL/PCLTA (længere nedbrydningstid), da polymerbærere og acriflavine (lille molekyle) som lasttype til at demonstrere forsinket burst-frigivelse. I de følgende afsnit beskriver vi de afgørende trin i formning af polybobler, der er i stand til at muliggøre både forsinket burst release og NIR-aktivering, især til fremtidige on-demand leveringsprogrammer.
Cargo centrering inden for polybubble
Cargo centrering var en af de betydelige udfordringer, der blev mødt under formuleringen af polybobler. Umiddelbart efter injektion, ville lasten migrere til overfladen og lasten lommen ville blive stabiliseret uden at sprænge i vandige 10% CMC løsning. Polybobbles med sådanne off-centreret last kan resultere i tidligere frigivelse på grund af den ikke-ensartede tykkelse af polymeren omkring lasten. Modulering af polymerens viskositet og lasten var således afgørende for at løse problemer i forbindelse med lastcentrering. Viskositeten af lasten blev øget ved at blande lastopløsningen med 5% CMC. For at øge polymerens viskositet kunne polymerens molekylvægt være blevet ændret. Men, stigende molekylvægt ofte resulterer i langsommere polymer nedbrydning dermed forårsager yderligere forsinkelse i lasten frigivelse. Polymerens viskositet blev således ændret ved at øge koncentrationen af polymeren. Højere koncentration (1000 mg/ml) var tilstrækkelig til at øge viskositeten af PLGADA. Viskositeten af PCL/PCLTA var imidlertid ikke tilstrækkelig til at opbevare lasten i midten. K2CO3, der blev isoleret efter PCLTA's endcapping-reaktion, blev således anvendt til at øge viskositeten af PCLTA.
Ny forsinket udgivelse
Forsinket burst frigivelse blev observeret fra frigivelse undersøgelser udført ved hjælp af polybobler med centreret last. Lille molekyle (acriflavine) blev brugt som centreret last i polybubbles at studere frigivelse profil. Unikke frigivelsesprofiler blev observeret baseret på den polyester, der blev anvendt på grund af forskellen i polymerens nedbrydningstid. Burst frigivelse blev observeret tidligere i PLGADA polybobler sammenlignet med PCL / PCLTA polybobler. Tidlig frigivelse af fragt blev observeret i PLGADA polybobler, fordi PLGA nedbrydes hurtigere sammenlignet med PCL13. Efter en vellykket graduering af frigivelse kinetik med to typer af polyester, vi yderligere ønskede at ingeniør polybubble at potentielt muliggøre on-demand frigivelse af lasten.
NIR-aktivering af polybobler
On-demand frigivelse af lasten med hensyn til timingen af patienternes behov har været udfordrende at opnå ved hjælp af de nuværende leveringsstrategier14. Vi hypotesen om, at fremskynde lasten frigivelse on-demand kunne være muligt ved at fremskynde polymer nedbrydning gennem brug af NIR-følsomme (dvs. theranostic-aktiverende) agenter. AuNRs er blevet grundigt undersøgt for deres evne til at blive aktiveret ved hjælp af NIR laser, der kan rejse få centimeter gennem huden15. CTAB-stabiliserede AuNRs blev således udarbejdet på grundlag af protokollen af Kittler, S, et al. og blev hydrofobiseret baseret på de metoder, der blev offentliggjort af Solimon, M.G., et al. Polybobbles med hydrofobede AuNRs i skallen blev derefter bestrålet med NIR laser på ønskede tidspunkter i 5 min at observere temperaturændring. Temperaturer før og efter laser blev målt baseret på FLIR billeder. Hærdet polymer shell hjalp med at bevare formen af AuNRs under laser aktivering dermed muliggøre flere NIR aktiveringer af polybobler. Dette er en interessant observation, fordi der i tidligere litteratur, AuNRs har ofte været kendt for at miste deres stang-lignende form (afgørende for NIR aktivering) på grund af laser aktivering16. Den vellykkede laser-aktivering af polybobler med AuNRs kunne bane vejen for at kontrollere on-demand frigivelse af lasten i den næste generation af polybobler.
Betydning og fremtidige applikationer
Resultaterne fra denne undersøgelse viser således, at polybobler har potentiale til at blive brugt som en ny vaccineleveringsplatform. Forberedelse af polybober beskrevet i dette papir vil yderligere gøre det muligt for andre forskere at bruge polybober som en levering platform for andre terapeutiske anvendelser. For eksempel, ud over vaccine levering, polybobler kan også potentielt bruges til levering synergistiske terapeutiske midler med varierende frigivelse kinetik. Desuden, polybobler er lavet af polyester, der er biologisk nedbrydelige og har været anvendt i mange FDA-godkendt medicinsk udstyr. Vi validerede yderligere sikkerheden af polybobler ved at vise, at klor, der frigives fra polybobler, ligger inden for de sikkerhedsniveauer, der anbefales af EPA17. Således har vores nye, injicerbare, UV-helbredelige polybubble platform potentiale til at blive brugt som en sikker og effektiv lægemiddellevering platform for en række forskellige lasttyper.
Begrænsninger af denne teknologi
Polybubble-platformensteknologien kan bruges som en vaccineleveringsplatform, der potentielt muliggør kontrolleret frigivelse. Vores undersøgelser fremhæver alsidigheden af denne platform i stand til at levere forskellige lasttyper, herunder antigener og små molekyler. Men en af de nuværende begrænsninger ved denne teknologi er, at lasten i øjeblikket injiceres manuelt. Til skaleringsformål er vi i øjeblikket ved at udvikle en automatiseret platform, der vil muliggøre injektion (dvs. som et array) af gods i polyboblet og vil potentielt bidrage til at afhjælpe bekymringerne vedrørende oversætteligheden af denne teknologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Dr. Bryan E. Tomlin tilknyttet elementært analyselaboratorium inden for kemiafdelingen hos TAMU, der hjalp med neutronaktiveringsanalysen (NAA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Step Ultra Tetramethylbezidine (TMB)-Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Substrate Solution | Thermo scientific | 34028 | |
| 2-Hydroxy-2-methylpropiophenone | TCI AMERICA | H0991 | |
| 450 nm Stop Solution for TMB Substrate | Abcam | ab17152 | |
| Acryloyl chloride | Sigma Aldrich | A24109-100G | |
| Acriflavine | Chem-Impex International | 22916 | |
| Anhydrous ethyl ether | Fisher Chemical | E138-500 | |
| Anti-HIV1 gp120 antibody conjugated to horseradish peroxidase (HRP) | |||
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher BioReagents | BP9700100 | |
| BSA-CF488 dye conjugates | Invitrogen | A13100 | |
| Bromosalicylic acid | Acros Organics | AC162142500 | |
| Carboxymethylcellulose (CMC) | Millipore Sigma | 80502-040 | |
| Centrimonium bromide (CTAB) | MP Biomedicals | ICN19400480 | |
| Chloroform | Fisher Chemical | C2984 | |
| Coating buffer | Abcam | ab210899 | |
| Dichloromethane (DCM) | Sigma Aldrich | 270997-1L | |
| Diethyl ether | Fisher Chemical | E1384 | |
| Dodeacyl Amine | Acros Organics | AC117665000 | |
| Doxorubicin hydrochloride | Fisher BioReagents | BP251610 | |
| L-ascorbic acid | Acros Organics | A61 100 | |
| Legato 100 Syringe Pump | KD Scientific | 14 831 212 | |
| mPEG thiol | Laysan Bio | NC0702454 | |
| Nonfat dry milk | Andwin Scientific | NC9022655 | |
| Potassium carbonate | Acros Organics | AC424081000 | |
| Phosphate saline buffer | Fisher BioReagents | BP3991 | |
| (Poly(caprolactone) | Sigma Aldrich | 440744-250G | |
| (Poly(caprolactone) triol | Acros Organics | AC190730250 | |
| Poly (lactic-co-glycolic acid) diacrylate | CMTec | 280050 | |
| Potassium carbonate | Acros Organics | AC424081000 | |
| Recombinant HIV1 gp120 + gp41 protein | Abcam | ab49054 | |
| Silver nitrate | Acros Organics | S181 25 | |
| Sodium borohydride | Fisher Chemical | S678 10 | |
| Tetrachloroauric acid | Fisher Chemical | G54 1 | |
| Trehalose | Acros Organics | NC9022655 | |
| Triethyl amine | Acros Organics | AC157910010 |
References
- World Health Organization. Global Immunization: Worldwide Disease Incidence. , Children's Hospital of Philadelphia. https://www.chop.edu/centers-programs/vaccine-education-center/global-immunization/diseases-and-vaccines-world-view (2018).
- Paul, A., Bera, M., Gupta, P., Singh, N. D. P. o-Hydroxycinnamate for sequential photouncaging of two different functional groups and its application in releasing cosmeceuticals. Organic and Biomolecular Chemistry. 17 (33), 7689-7693 (2019).
- Kumari, A., Yadav, S. K., Yadav, S. C. Biodegradable polymeric nanoparticles based drug delivery systems. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 75 (1), 1-18 (2010).
- Dai, C., Wang, B., Zhao, H. Microencapsulation peptide and protein drugs delivery system. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 41 (2-3), 117-120 (2005).
- Souery, W. N., et al. Controlling and quantifying the stability of amino acid-based cargo within polymeric delivery systems. Journal of Control Release. 300, 102-113 (2019).
- Wang, W. Advanced protein formulations. Protein Science. 24 (7), 1031-1039 (2015).
- Lee, J., et al. An ultraviolet-curable, core-shell vaccine formed via phase separation. Journal of Biomedical Materials Research Part A. , (2019).
- Kittler, S., Hickey, S. G., Wolff, T., Eychmüller, A. Easy and Fast Phase Transfer of CTAB Stabilised Gold Nanoparticles from Water to Organic Phase. Zeitschrift für Physikalische Chemie. 229, 235 (2015).
- Soliman, M. G., Pelaz, B., Parak, W. J., del Pino, P. Phase Transfer and Polymer Coating Methods toward Improving the Stability of Metallic Nanoparticles for Biological Applications. Chemistry of Materials. 27 (3), 990-997 (2015).
- Arun Kumar, S., Good, J., Hendrix, D., Yoo, E., Kim, D., Deo, K. A., Jhan, Y. Y., Gaharwar, A. K., Bishop, C. J. Nanoengineered Light-Activatable Polybubbles for On?Demand Therapeutic Delivery. Adv. Funct. Mater. , 2003579 (2020).
- Wuthrich, P., Ng, S. Y., Fritzinger, B. K., Roskos, K. V., Heller, J. Pulsatile and delayed release of lysozyme from ointment-like poly(ortho esters). Journal of Controlled Release. 21 (1), 191-200 (1992).
- Wang, W. Instability, stabilization, and formulation of liquid protein pharmaceuticals. International Journal of Pharmaceutics. 185 (2), 129-188 (1999).
- Wong, D. Y., Hollister, S. J., Krebsbach, P. H., Nosrat, C. Poly(epsilon-caprolactone) and poly (L-lactic-co-glycolic acid) degradable polymer sponges attenuate astrocyte response and lesion growth in acute traumatic brain injury. Tissue Engineering. 13 (10), 2515-2523 (2007).
- Davoodi, P., et al. Drug delivery systems for programmed and on-demand release. Advanced Drug Delivery Reviews. 132, 104-138 (2018).
- Huang, Y. C., Lei, K. F., Liaw, J. W., Tsai, S. W. The influence of laser intensity activated plasmonic gold nanoparticle-generated photothermal effects on cellular morphology and viability: a real-time, long-term tracking and monitoring system. Photochemical and Photobiological Sciences. 18 (6), 1419-1429 (2019).
- Link, S., Burda, C., Nikoobakht, B., El-Sayed, M. A. Laser-Induced Shape Changes of Colloidal Gold Nanorods Using Femtosecond and Nanosecond Laser Pulses. The Journal of Physical Chemistry B. 104 (26), 6152-6163 (2000).
- U.S. Environmental Protection Agency. Chlorine. , https://www.epa.gov/sites/production/files/2016-09/documents/chlorine.pdf (2000).
