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Biology

Produção de plataforma de entrega de vacinas de vacinação de infravermelho próximo e infravermelho

Published: October 20, 2020 doi: 10.3791/60569
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, Texas A&M University

Summary

Este artigo descreve os protocolos usados para produzir uma nova plataforma de entrega de vacinas, "polibolhas", para permitir a liberação de estouro atrasada. Poliésteres incluindo poli (ácido láctico-coglicólico) e policaprolactona foram usados para formar os polibolhas e pequenas moléculas e antígenos foram usados como carga.

Abstract

Estratégias de entrega de vacinas que podem limitar a exposição da carga a solventes orgânicos, ao mesmo tempo em que permitem novos perfis de liberação, são cruciais para melhorar a cobertura vacinal em todo o mundo. Aqui, uma nova plataforma de liberação de vacinas injetável, ultravioleta e retardada, que permite a entrega de vacinas chamada polibolhas, é introduzida. A carga foi injetada em polibolhas à base de poliéster que foram formadas em uma solução aquosa baseada em carboxymethycellulose de 10%. Este artigo inclui protocolos para manter a forma esférica dos polibolhas e otimizar a colocação e retenção de carga para maximizar a quantidade de carga dentro dos polibolhas. Para garantir a segurança, o teor de solventes clorados dentro dos polibolhas foi analisado por meio da análise de ativação de nêutrons. Os estudos de liberação foram realizados com pequenas moléculas como carga dentro do polibole para confirmar a liberação retardada da explosão. Para mostrar ainda mais o potencial de entrega sob demanda da carga, nanorods de ouro foram misturados dentro da concha de polímero para permitir a ativação a laser quase infravermelha.

Introduction

A cobertura vacinal limitada resulta na morte de 3 milhões de pessoas especificamente causadas por doenças preveníveis por vacinas1. Condições inadequadas de armazenamento e transporte levam ao desperdício de vacinas funcionais e, portanto, contribuem para a redução da imunização global. Além disso, a vacinação incompleta por não aderir aos calendários vacinais necessários também causa cobertura vacinal limitada, especificamente nos países em desenvolvimento2. São necessárias múltiplas visitas ao pessoal médico dentro do período recomendado para o recebimento de vacinas de reforço, limitando assim o percentual da população com vacinação completa. Por isso, é necessário desenvolver novas estratégias para a entrega controlada de vacinas para contornar esses desafios.

Os esforços atuais para o desenvolvimento de tecnologias de entrega de vacinas incluem sistemas poliméricos baseados em emulsão3,,4. No entanto, a carga é frequentemente exposta a uma maior quantidade de solvente orgânico que pode potencialmente causar agregação e desnaturação, especificamente no contexto da carga à base deproteínas 5,6. Desenvolvemos uma nova plataforma de entrega de vacinas, "polibolhas", que pode potencialmente abrigar vários compartimentos de carga, minimizando o volume de carga que está exposta ao solvente7. Por exemplo, em nossa plataforma de concha-núcleo de polibole, um bolsão de carga de diâmetro de 0,38 mm (SEM) é injetado no centro de um polibole de 1 mm. Neste caso, a superfície da carga exposta ao solvente orgânico seria de aproximadamente 0,453 mm2. Depois de considerar a densidade de embalagem de esferas (micropartículas) dentro de uma esfera (depósito de carga), o volume real de micropartículas (10 μm de diâmetro) que poderia caber no depósito é de 0,17 mm3. O volume de uma micropartícula é de 5,24x10-8 mm3 e, portanto, o número de partículas micropartículas que podem se encaixar no depósito é ~3.2x106 partículas. Se cada micropartícula tiver 20 bolsões de carga (como resultado de dupla emulsão) de 0,25 μm de diâmetro, então a área superficial de carga exposta ao solvente orgânico é de 1274 mm2. O depósito de carga dentro do polibole teria, portanto, ~2800 vezes menos área de superfície exposta a solvente orgânico em comparação com a carga orgânica exposta a solventes em micropartículas. Nossa plataforma baseada em poliéster pode, assim, reduzir potencialmente a quantidade de carga exposta a solvente orgânico que pode causar agregação e instabilidade de carga.

Os polibolhas são formados com base no princípio da separação de fases onde o poliéster em fase orgânica é injetado em uma solução aquosa resultando em uma bolha esférica. A carga na fase aquosa pode então ser injetada no centro do polibole. Outro compartimento de carga pode potencialmente ser alcançado dentro do polibole misturando uma carga diferente com a concha do polímero. O polibole nesta fase será maleável e, em seguida, será curado para resultar em uma estrutura de polibole sólida com carga no meio. Polibolhas esféricas foram escolhidas em vez de outras formas geométricas para aumentar a capacidade de carga dentro do polibole, minimizando o tamanho geral do polibole. Polibolhas com carga no centro foram escolhidas para demonstrar a liberação de rajadas atrasadas. Os polibolhas também foram incorporados com o agente quase infravermelho (NIR) sensível (ou seja, teranostico-habilitador), ou seja, nanorods de ouro (AuNR), para causar aumento na temperatura das polibolhas. Esse efeito poderia potencialmente facilitar a degradação mais rápida e poderia ser usado para controlar cinéticas em aplicações futuras. Neste artigo, descrevemos nossa abordagem de formar e caracterizar polibolhas, para alcançar a liberação de estouro retardada dos polibolhas, e incorporar AuNR dentro dos polibubbles para causar ativação de NIR.

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Protocol

1. Síntese de triacrilato de policalicona (PCLTA)

  1. Seque 3,2 mL de 400 Do polycaprolacyone (PCL) triol durante a noite a 50 °C em um frasco traseiro redondo aberto de 200 mL e K2CO3 em um frasco de vidro a 90 °C.
  2. Misture o triol com 6,4 mL de diclorometano (DCM) e 4,246 g de carbonato de potássio (K2CO3) sob argônio.
  3. Misture 2,72 mL de cloreto de acriloyl em 27,2 mL de DCM e adicione dropwise à mistura de reação no frasco acima de 5 min.
  4. Cubra a mistura de reação com papel alumínio e deixe-a intacta à temperatura ambiente por 24 h sob argônio.
  5. Após 24 horas, filtre a mistura de reação usando um papel filtro em um funil Buchner sob vácuo para descartar o excesso de reagentes.
  6. Filtragem precipitada a partir da etapa 1.5 que contém o polímero endcapped em éter dietil em um 1:3 (vol/vol) e rotovape a 30 °C para remover o éter dietil.

2. Formação do polibole

NOTA: Injetar polímero na água desionizada (DI) faria com que os polibolhas migrassem para o fundo do frasco, resultando em fundo achatado. Use 10% (wt/vol) celulose carboximetil (CMC) encha o frasco de vidro para evitar o achatamento do polibole.

  1. Prepare a solução CMC de 10% (wt/vol) em água DI.
  2. Encha um frasco de vidro de 0,92 mL com 0,8 mL de 10% CMC usando uma tubulação de transferência de 1 mL.
  3. Misture 1000 mg/mL de 14 kDa PCL em DCM e sintetize PCLTA em um 1:3 (vol/vol) para um volume total de 200 μL ou prepare 200 μL de 1000 mg/mL de 5 kDa poly (ácido lactico-coglicólico) dialílate (PLGADA) em clorofórmio.
  4. Misture a mistura 2-hidroxi-4′-(2-hidroxietoxi)-2-metilpropiofenona (fotoinitiador) com a mistura de polímero (PLGADA ou PCL/PCLTA) em 0,005:1 (vol/vol).
  5. Carregue 200 μL de mistura de polímero em uma seringa de vidro de 1 mL montada em uma bomba de seringa que está conectada a um tubo de aço inoxidável de distribuição com um diâmetro interno de 0,016 polegadas.
  6. Use um micromotor para controlar o movimento dianteiro e para trás do tubo de polímero para injetar polímero no frasco de 10% CMC no frasco de vidro para formar o polibole.
  7. Cure os polibolhas sob ultravioleta (UV) a 254 nm de comprimento de onda para 60 s a 2 W/cm2.
  8. O flash congele as polibolhas em nitrogênio líquido e liofilize durante a noite a vácuo de 0,010 mBar e a -85 °C.
  9. Separe os polibolhas do CMC seco usando fórceps e lave as polibolhas com água DI para remover qualquer CMC residual. Observe que outros polímeros podem ser usados provavelmente com modificações para alterar a cinética de liberação.

3. Modulação do diâmetro do polibole

  1. Encha um frasco de vidro de 0,92 mL com 10% cmc usando uma tubulação de transferência de 1 mL.
  2. Misture PCL/PCLTA em um 1:3 (vol/vol) com 1000mg/mL 14kDa PCL e sintetize PCLTA. Misture o fotoinitiador com a mistura de polímero em 0,005:1 (vol/vol).
  3. Carregue a mistura de polímero em uma seringa de vidro de 1 mL montada em uma bomba de seringa que está conectada a um tubo de aço inoxidável de distribuição com um diâmetro interno de 0,016 polegadas.
  4. Use um micromotor para controlar o movimento dianteiro e para trás do tubo de polímero para injetar polímero no frasco de 10% CMC no frasco de vidro para formar o polibole.
  5. Para obter polibolhas com vários diâmetros, variando a taxa de distribuição de 0,0005 a 1 μL/s.
  6. Tire imagens do frasco com os polibolhas com diâmetro variado.
  7. Use ImageJ para quantificar o diâmetro dos polibolhas e usar o tamanho do frasco como escala.

4. Centralizando a carga dentro do polibole

  1. Modulação da viscosidade PCL/PCLTA utilizando K2CO3:
    NOTA: A viscosidade do PLGADA não precisa ser modificada usando K2CO3 porque a viscosidade de 5 kDa PLAGDA a 1000 mg/mL é suficiente para centralizar a carga.
    1. Adicione K2CO3 (que foi isolado após a reação do PCLTA) à PCLTA em concentrações variadas, incluindo 0 mg/mL, 10 mg/mL, 20 mg/mL, 40 mg/mL e 60 mg/mL.
    2. Meça as viscosidades dinâmicas das soluções alterando a taxa de corte de 0 para 1000 1/s usando reometria.
    3. Injete manualmente a carga no meio (consulte a etapa 4.2 para preparar a mistura de carga) dos poliboles que foram formados utilizando as soluções PCL/PCLTA com diferentes concentrações de K2CO3 (etapa 4.1.1). Determine a concentração ideal de K2CO3 observando qual solução da etapa 4.1.1 pode resultar na retenção da carga no meio.
  2. Centralizar a carga (já demonstrada viabilidade com pequenas moléculas) com CMC
    1. Misture a carga com 5% (wt/vol) CMC em um rotador durante a noite para aumentar a viscosidade da carga.
    2. Injete manualmente 2 μL de mistura de carga no polibole e proceda com a cura uv a 254 nm comprimento de onda para 60 s a 2 W/cm2.
    3. O flash congele as polibolhas em nitrogênio líquido para 30 s e liofilize durante a noite a vácuo de 0,010 mBar e a -85 °C.
    4. Separe os polibolhas do CMC seco usando fórceps e lave com água DI para remover qualquer CMC residual.
    5. Corte o polibole ao meio e imagem as metades usando microscopia confocal para garantir que a carga esteja centrada (consulte a etapa 6 para excitação e comprimentos de onda de emissão utilizados).

5. Formulação de Carga

NOTA: A formulação de polibolhas pode abrigar vários tipos de carga, incluindo pequenas moléculas, proteínas e ácidos nucleicos.

  1. Com base em estudos anteriores, no caso da carga proteica, utilizam excipientes incluindo polietileno glicol (PEG)6, polivinylpyrrolidone (PVP) e glycopolímeros6 para melhorar a estabilidade da proteína durante a formulação de poliboco.
  2. Formar polibolhas com base no protocolo na etapa 2.
  3. Prepare a solução de antígeno adicionando 17,11 g de trehalose a 625 μL de antígeno HIV gp120/41.
  4. Injete manualmente 1 μL de solução de antígeno no meio da polibole.
  5. Abra os polibolhas nos dias 0, 7, 14 e 21, e regise a fluorescência do antígeno com comprimentos de onda de excitação e emissão de 497 nm e 520 nm, respectivamente.
  6. Determine a funcionalidade do antígeno usando o ensaio imunosorbente ligado à enzima (ELISA) e use 5% de leite sem gordura como tampão de bloqueio.

6. Liberação de carga

NOTA: Molécula pequena ou antígeno pode ser usado como o tipo de carga

  1. Molécula pequena
    1. Incubar polibolhas com acriflavina centrada em 400 μL de soro fisiológico tampão fosfato (PBS) a 37 °C, 50 °C para poliboles PLGADA e a 37 °C, 50 °C, 70 °C para polibobbles PCL/PCLTA.
      NOTA: A razão pela qual recomendamos testar acima das temperaturas do corpo é a) simular a temperatura (50 °C) na qual o polibole atinge ao laser os nanorods de ouro (AuNRs) dentro de PCL e PLGA; e b) acelerar o processo de degradação da PCL (50 °C, 70 °C).
    2. Em cada ponto de tempo, colete os supernantes e substitua por 400 μL de PBS fresco.
    3. Use um leitor de placas para quantificar as intensidades de fluorescência nos supernantes coletados.
      NOTA: Use ex/em de 416 nm/514 nm para acriflavina.
  2. Antígeno
    1. Incubar polibolhas com soro de albumina bovina centrado (BSA)-488 em 400 μL de PBS a 37 °C, 50 °C para poliboles PLGADA e a 37 °C, 50 °C para poliboles PCL/PCLTA.
    2. Em cada ponto de tempo, colete os supernantes e substitua por PBS fresco de 400 μL.
    3. Use um leitor de placas para quantificar as intensidades de fluorescência nos supernantes coletados. Use ex/em de 497 nm/520 nm para BSA-488.
      NOTA: O estudo de liberação a 70 °C para polibolhas PCL/PCLTA não deve ser realizado para evitar expor o antígeno a temperatura extrema.

7. Toxicidade

  1. Quantificando o teor de cloro em polibolhas usando a análise de ativação de nêutrons (NAA)
    1. Use polibolhas que foram liofilizadas para 2, 4, 6, 20 e 24 h para este estudo a vácuo de 0,010 mBar e a -85 °C.
    2. Meça 5-9 mg de polibolhas e coloque-as em frascos de irradiação LDPE.
    3. Prepare 1000 g/mL de solução de calibração de cloro do Instituto Nacional de Padrões e Tecnologia (NIST) solução de calibração rastreável.
    4. Use 1-megawatts reator Triga para realizar irradiações de nêutrons em cada amostra a uma taxa de fluência de nêutrons de 9,1 × 1012 /cm2·s para 600 s.
    5. Transfira os polibolhas para frascos unirradiados.
    6. Use o detector HPGe para obter espectros de raios gama para 500 s após intervalos de decomposição de 360 s.
    7. Use o software NAA pelas Indústrias Canberra para analisar os dados.
  2. Quantificando o teor de cloro liberado de polibolhas usando NAA
    1. Incubar polibolhas que foram liofilizadas durante a noite (a 0,010 mBar vácuo e a -85 °C) em 400 μL de PBS a 37 °C.
    2. Colete os supernantes nas semanas 1, 2 e 3 após a incubação.
    3. Analise os supernantes para teor de cloro usando NAA usando o mesmo método descrito acima na etapa 7.1.

8. Síntese AuNR por Kittler, S., et al.8

  1. Prepare a solução de sementes AuNR misturando 250 μL de ácido cloroaurico de 10 mM (HAuCl4), 7,5 mL de brometo de cetrimonium de 100 mM (CTAB) e 600 μL de boroidido de sódio frio de 10 mM (NaBH4).
  2. Prepare a solução de crescimento misturando 40 mL de 100 mM CTAB, 1,7 mL de 10 mM HAuCl4, 250 μL de nitrato de prata (AgNO3),e 270 μL de ácido ascórbico de 17,6 mg/mL a um tubo.
  3. Misture vigorosamente 420 μL de solução de sementes com a solução de crescimento a 1200 rpm por 1 min. Em seguida, deixe a mistura imperturbável para reagir por 16 h.
  4. Remova o excesso de reagentes da mistura centrifugando a 8000 × g por 10 min e descarte o supernasce.

9. Hidroofobização de AuNRs por Soliman, M.G., et al.9

  1. Ajuste o pH de 1,5 mL de AuNRs estabilizados ctab sintetizados para 10 usando hidróxido de sódio de 1 mM (NaOH).
  2. Mexa a solução com 0,1 mL de 0,3 mM de tido PEG metilado (mPEG) a 400 rpm durante a noite.
  3. Misture AuNRs LCslilated com 0,4 M de dodecylamina (DDA) em clorofórmio a 500 rpm por 4 dias.
  4. Encanar a camada orgânica superior contendo AuNRs hidrofóbicas e armazenar a 4 °C até o uso futuro.

10. Ativação nir de polibolhas

  1. Misture a solução de polímero (PLGADA ou PCL/PCLTA) com AuNRs hidrofóbicas em um 1:9 (vol/vol).
  2. Adicione fotoinitiador à mistura polímero-AuNR em um 0,005:1 (vol/vol).
  3. Formar polibolhas injetando a mistura polímero-AuNR em um frasco de vidro de 0,92 mL com 10% CMC (wt/vol) (consulte o passo 2).
  4. Cure os polibolhas a 254 nm de comprimento de onda para 60 s a 2 W/cm2.
  5. O flash congele em nitrogênio líquido para 30 s e liofilize durante a noite a 0,010 mBar vácuo e a -85 °C.
  6. Separe os polibolhas secas usando fórceps e lave com água DI para remover qualquer CMC residual.
  7. Incubar as polibolhas em 400 μL de PBS a 37 °C.
  8. Ative as polibolhas usando laser NIR de 801 nm a 8A por 5 minutos todas as segundas, quartas e sextas-feiras.
  9. Pegue imagens infravermelhas prospectivas (FLIR) do polibole antes e depois da ativação do laser para obter valores de temperatura.
  10. Calcule as diferenças de temperatura entre antes e depois da ativação do laser com base nos valores de temperatura das imagens FLIR.

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Representative Results

Os polibolhas foram amplamente caracterizados por MEIO DE SEM e NAA. A carga foi centrada com sucesso para resultar em uma liberação de explosão atrasada. Os polibolhas também foram ativados com sucesso a laser devido à presença de AuNRs dentro dos polibolhas.

Caracterização de poliboles
Os polibolhas injetados em uma solução aquosa sem CMC resultaram em um polibole achatado devido ao seu contato com a parte inferior do frasco de vidro(Figura 1A,B). O achatamento parcial foi observado quando a solução aquosa baseada em CMC de 5% foi utilizada no lugar de água DI (Figura 1C). Posteriormente, a solução aquosa baseada em CMC no frasco de vidro resultou na suspensão da polibole na solução e, assim, a manutenção bem sucedida da esferocrata do polibole(Figura 1D).

Centralção de cargas
A injeção de carga no polibole na ausência de CMC resultou em vazamento, não causando retenção de carga dentro do polibole(Figura 3). Para combater esse desafio, foram utilizadas duas abordagens: 1) a viscosidade do PCLTA foi aumentada com sucesso utilizando-se o K2CO3 isolado após o endcapping de triol pcl com triacrilato(Figura 2), e 2) a viscosidade da carga foi aumentada com sucesso após a mistura da carga com 5% cmc(Figura 3, Figura 4). A viscosidade dos polibolhas PLGADA foram suficientes para facilitar o centro da carga e, portanto, não foi modulada utilizando K2CO3.

Funcionalidade de antígeno
O antígeno HIV gp120/41 foi misturado com e sem trehalose antes de injetar no polibole(Figura 5). A eficiência vinculante do anticorpo ao antígeno (denominado como funcionalidade) com e sem trehalose não foi observada como diferença estatisticamente significativa.

Estudos de liberação sem ativação a laser
Foram observadas liberações de rajadas em polibolhas PLGADA com acriflavina no meio nos dias 19 e 5 para polibolhas incubadas a 37 °C(Figura 6A) e 50 °C(Figura 6B),respectivamente. Liberações de rajadas também foram observadas em polibolhas PCL/PCLTA com acriflavina no meio nos dias 160 e 60 para polibolhas incubadas a 50 °C (Figura 7A) e 70 °C(Figura 7B),respectivamente. Estes estudos de liberação foram realizados na ausência de AuNRs ativados a laser.

Ativação a laser in vitro de polibolhas
Os polibolhas com AuNRs na concha foram ativados com sucesso a laser várias vezes em polibolhas PLGADA(Figura 8A) e polibolhas PCL/PCLTA(Figura 8B). As mudanças de temperatura de antes e depois da ativação do laser foram de 10 ± 1 °C e 5 ± 1 °C em poliboles PCL/PCLTA com maior e menor concentração de AuNR na casca, respectivamente. As alterações de temperatura observadas antes e depois da ativação do laser foram de 11 ± 2 °C e 6 ± 1 °C em poliboles PLGADA com maior e menor concentração de AuNR na concha, respectivamente.

Figure 1
Figura 1: Manutenção da esferonicalidade dos polibolhas. Imagens SEM de (A) 14 kDa PCL/300 Da PCLTA achatada polibole devido ao contato de polibubble com a parte inferior do frasco de vidro; (B) 14 kDa PCL/300 Da PCLTA polibubble a partir da parte superior que não estava em contato com o fundo de vidro; (C) o poliboles PCL/PCLTA com menor grau de achatamento quando injetado em uma solução de 5% CMC em comparação com a solução de água DI, causando a formação de forma semelhante ao hemisfério no ponto de contato com o frasco; (D) polibaça que não atingiu a parte inferior do frasco de vidro quando injetado em uma solução de 10% CMC, permitindo que a forma esférica seja mantida. Todas as barras de escala indicadas são de 500 μm. Este número foi modificado de Lee et al.7. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Modulação da viscosidade pclta. A concentração de K2CO3 foi aumentada de 0 para 80 mg/mL em PCLTA e observou-se viscosidade dinâmica para aumentar proporcionalmente com a concentração de K2CO3. Este número foi modificado a partir de Arun Kumar et al10. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Injeção de carga no polibole com e sem CMC. O painel superior mostra quadros extraídos do vídeo de vazamento de carga durante a injeção na ausência de CMC. O painel inferior mostra quadros extraídos do vídeo de retenção de carga dentro do polibole na presença de 5% cmc. Este número foi modificado de Lee et al.7. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Carga centrada.. Imagens de microscópio fluorescente de(A) polibole PCL/PCLTA com carga centrada,(B) polibole PCL/PCLTA com carga no shell e corante não fluorescente centrado. Este número foi modificado a partir de Arun Kumar et al10. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Funcionalidade de antígeno com trehalose. A funcionalidade do HIV gp120/41 com e sem trehalose dentro do polibole foi analisada utilizando-se ELISA. A eficiência vinculante de um anticorpo à proteína é geralmente considerada como um indicador para a funcionalidade da proteína. Quando discutimos a funcionalidade do antígeno neste estudo, pretendemos que isso atrate os anticorpos que vinculam a proteína de interesse (que é um indicador para a funcionalidade da proteína). Não foi observada significância estatística entre os dois grupos. Os intervalos de confiança são indicados por linhas sólidas e pontilhadas. Este número foi modificado de Lee et al.7. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: Liberação de estouro atrasada de polibolhas PLGADA. Estudos de liberação de liberação de rajadas atrasadas de polibolhas PLGADA com acriflavina no meio a (A) 37 °C, (B) 50 °C. A linha sólida indica a curva encaixada obtida com base nos pontos de dados. Este número foi modificado a partir de Arun Kumar et al10. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: Liberação de estouro atrasada de polibolhas PCL/PCLTA. Estudos de liberação de lançamentos de rajadas atrasadas de polibolhas PCL/PCLTA com acriflavina no meio a (A) 50 °C, (B) 70 °C.  Este número foi modificado a partir de Arun Kumar et al10. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 8
Figura 8: Ativação a laser NIR de polibolhas. Mudança de temperatura observada antes e depois da ativação do laser NIR em(A) polibolhas PLGADA,(B) poliboles PCL/PCLTA com maior e menor concentração de AuNRs na concha do polímero. Esse aumento de temperatura poderia ser aproveitado para potencialmente acelerar a degradação do polímero levando à liberação anterior da carga. Este número foi modificado a partir de Arun Kumar et al10. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Tecnologias e desafios atuais
Micro e nanopartículas baseadas em emulsão têm sido comumente usadas como portadores de medicamentos. Embora a cinética de liberação da carga desses dispositivos tenha sido extensivamente estudada, controlar a cinética de liberação de rajadas tem sido um grande desafio11. A versatilidade e funcionalidade da carga também é limitada em sistemas baseados em emulsão devido à exposição da carga a solventes aquosos e orgânicos em excesso. A carga à base de proteínas muitas vezes não é compatível com micropartículas e nanopartículas devido à possibilidade de desnaturação e agregação de carga12. Além da estabilidade da carga, a cinética da carga é especialmente importante no contexto das vacinas devido à necessidade de vacinas de reforço que levem à soroconversão. Os esforços anteriores para enfrentar esses desafios na entrega de vacinas não foram suficientemente bem sucedidos, uma vez que a noção de sistemas de vacina de injeção única existe há algumas décadas e ainda não foi traduzida clinicamente.

Nossa plataforma de entrega de vacinas de polibolagem pode potencialmente superar os desafios com o aumento da exposição da carga a solventes orgânicos, minimizando o volume de carga exposto. Esta tecnologia pode potencialmente acomodar pelo menos dois compartimentos de carga: carga no casco e carga no centro. Polibolhas com carga centrada podem ser usadas para controlar a liberação de explosão da carga, sendo compatíveis com diferentes tipos de carga, incluindo pequenas moléculas e antígeno. Neste estudo, foram utilizados poliésteres com tempos variados de degradação, PLGADA (menor tempo de degradação) e PCL/PCLTA (maior tempo de degradação), como os portadores de polímeros e acriflavina (molécula pequena) como o tipo de carga para demonstrar a liberação de rajadas atrasadas. Nas seções a seguir, descrevemos os passos cruciais na formação de polibolhas capazes de permitir tanto a liberação de estouro atrasada quanto a ativação do NIR, especialmente para futuros aplicativos de entrega sob demanda.

Centro de carga dentro do polibole
O centro de cargas foi um dos desafios significativos que foram encontrados durante a formulação dos polibolhas. Imediatamente após a injeção, a carga migraria para a superfície e o bolso da carga seria estabilizado sem estourar na solução aquosa de 10% cmc. Polibolhas com cargas tão fora do centro podem resultar em liberação anterior devido à espessura não uniforme do polímero em torno da carga. A modulação da viscosidade do polímero e da carga foi, portanto, crucial na resolução de questões relacionadas ao centro da carga. A viscosidade da carga foi aumentada pela mistura da solução de carga com 5% de CMC. Para aumentar a viscosidade do polímero, o peso molecular do polímero poderia ter sido modificado. No entanto, o aumento do peso molecular muitas vezes resulta em uma degradação mais lenta do polímero, causando ainda mais atraso na liberação de carga. A viscosidade do polímero foi assim modificada aumentando a concentração do polímero. A maior concentração (1000 mg/mL) foi suficiente para aumentar a viscosidade do PLGADA. No entanto, a viscosidade do PCL/PCLTA não foi adequada para reter a carga no meio. Assim, k2CO3 que foi isolado após a reação endcapping de PCLTA foi usado para aumentar a viscosidade do PCLTA.

Lançamento atrasado da novela
A liberação retardada do estouro foi observada a partir dos estudos de liberação realizados utilizando-se os polibolhas com carga centrada. A molécula pequena (acriflavina) foi utilizada como carga centrada nos polibolhas para estudar o perfil de liberação. Perfis de liberação únicos foram observados com base no poliéster utilizado devido à diferença no tempo de degradação dos polímeros. A liberação de rajadas foi observada anteriormente em polibolhas PLGADA em comparação com a de polibolhas PCL/PCLTA. A liberação antecipada de carga foi observada em polibolhas PLGADA porque o PLGA se degrada mais rapidamente em comparação com o PCL13. Após a modulação bem sucedida da cinética de liberação com dois tipos de poliésteres, queríamos ainda projetar o polibole para potencialmente permitir a liberação sob demanda da carga.

Ativação nir de polibolhas
A liberação sob demanda da carga em relação ao tempo das necessidades dos pacientes tem sido desafiadora para conseguir utilizando as estratégias de entrega atuais14. Temos a hipótese de que acelerar a liberação de carga sob demanda poderia ser possível acelerando a degradação do polímero através do uso de agentes sensíveis ao NIR (ou seja, teranostic-enabling). Os AuNRs foram extensivamente estudados por sua capacidade de serem ativados usando laser NIR que pode viajar poucos centímetros através da pele15. As AuNRs estabilizadas pelo CTAB foram assim preparadas com base no protocolo de Kittler, S, et al. e foram hidrofóbicas com base nos métodos publicados por Solimon, M.G., et al. As polibagens com AuNRs hidrofobicizadas na concha foram então irradiadas com laser NIR nos pontos de tempo desejados por 5 minutos para observar a mudança de temperatura. As temperaturas antes e depois do laser foram medidas com base nas imagens FLIR. A concha de polímero curado ajudou a preservar a forma de AuNRs durante a ativação do laser, permitindo assim múltiplas ativações de NIR de polibolhas. Esta é uma observação interessante porque na literatura anterior, os AuNRs são muitas vezes conhecidos por perder sua forma semelhante a uma haste (crucial para a ativação do NIR) devido à ativação a laser16. A ativação a laser bem sucedida dos polibolhas com AuNRs poderia abrir caminho para controlar a liberação sob demanda da carga na próxima geração de polibolhas.

Significado e aplicações futuras
Os resultados obtidos neste estudo mostram, assim, que os polibolhas têm potencial para serem utilizados como uma nova plataforma de entrega de vacinas. A preparação de polibolhas descritas neste artigo permitirá ainda que outros pesquisadores usem polibolhas como plataforma de entrega para outras aplicações terapêuticas. Por exemplo, além da entrega de vacinas, os polibolhas também podem ser potencialmente usados para a entrega de agentes terapêuticos sinérgicos com cinética de liberação variada. Além disso, os polibolhas são feitos de poliésteres que são biodegradáveis e têm sido usados em muitos dispositivos médicos aprovados pela FDA. Validamos ainda a segurança dos polibolhas, mostrando que o cloro liberado dos polibolhas está bem dentro dos níveis de segurança recomendados pela EPA17. Assim, nossa nova plataforma de polibole injetável e curável UV tem o potencial de ser usada como uma plataforma segura e eficaz de entrega de medicamentos para uma variedade de tipos de carga.

Limitações dessa tecnologia
A tecnologia da plataforma de polibolagem pode ser usada como uma plataforma de entrega de vacinas potencialmente permitindo a liberação controlada. Nossos estudos destacam a versatilidade desta plataforma capaz de fornecer diferentes tipos de carga, incluindo antígenos e pequenas moléculas. No entanto, uma das limitações atuais dessa tecnologia é que a carga está sendo injetada manualmente. Para fins de dimensionamento, estamos atualmente projetando uma plataforma automatizada que permitirá a injeção (ou seja, como uma matriz) de carga dentro do polibole e potencialmente ajudará a aliviar as preocupações em relação à tradução dessa tecnologia.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Gostaríamos de agradecer ao Dr. Bryan E. Tomlin afiliado ao laboratório de análise elementar dentro do departamento de química da TAMU que ajudou na análise de ativação de nêutrons (NAA).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-Step Ultra Tetramethylbezidine (TMB)-Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Substrate Solution Thermo scientific 34028
2-Hydroxy-2-methylpropiophenone TCI AMERICA H0991
450 nm Stop Solution for TMB Substrate Abcam ab17152
Acryloyl chloride Sigma Aldrich A24109-100G
Acriflavine Chem-Impex International 22916
Anhydrous ethyl ether Fisher Chemical E138-500
Anti-HIV1 gp120 antibody conjugated to horseradish peroxidase (HRP)
Bovine serum albumin (BSA) Fisher BioReagents BP9700100
BSA-CF488 dye conjugates Invitrogen A13100
Bromosalicylic acid Acros Organics AC162142500
Carboxymethylcellulose (CMC) Millipore Sigma 80502-040
Centrimonium bromide (CTAB) MP Biomedicals ICN19400480
Chloroform Fisher Chemical C2984
Coating buffer Abcam ab210899
Dichloromethane (DCM) Sigma Aldrich 270997-1L
Diethyl ether Fisher Chemical E1384
Dodeacyl Amine Acros Organics AC117665000
Doxorubicin hydrochloride Fisher BioReagents BP251610
L-ascorbic acid Acros Organics A61 100
Legato 100 Syringe Pump KD Scientific 14 831 212
mPEG thiol Laysan Bio NC0702454
Nonfat dry milk Andwin Scientific NC9022655
Potassium carbonate Acros Organics AC424081000
Phosphate saline buffer Fisher BioReagents BP3991
(Poly(caprolactone) Sigma Aldrich 440744-250G
(Poly(caprolactone) triol Acros Organics AC190730250
Poly (lactic-co-glycolic acid) diacrylate CMTec 280050
Potassium carbonate Acros Organics AC424081000
Recombinant HIV1 gp120 + gp41 protein Abcam ab49054
Silver nitrate Acros Organics S181 25
Sodium borohydride Fisher Chemical S678 10
Tetrachloroauric acid Fisher Chemical G54 1
Trehalose Acros Organics NC9022655
Triethyl amine Acros Organics AC157910010

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References

  1. World Health Organization. Global Immunization: Worldwide Disease Incidence. , Children's Hospital of Philadelphia. https://www.chop.edu/centers-programs/vaccine-education-center/global-immunization/diseases-and-vaccines-world-view (2018).
  2. Paul, A., Bera, M., Gupta, P., Singh, N. D. P. o-Hydroxycinnamate for sequential photouncaging of two different functional groups and its application in releasing cosmeceuticals. Organic and Biomolecular Chemistry. 17 (33), 7689-7693 (2019).
  3. Kumari, A., Yadav, S. K., Yadav, S. C. Biodegradable polymeric nanoparticles based drug delivery systems. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 75 (1), 1-18 (2010).
  4. Dai, C., Wang, B., Zhao, H. Microencapsulation peptide and protein drugs delivery system. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 41 (2-3), 117-120 (2005).
  5. Souery, W. N., et al. Controlling and quantifying the stability of amino acid-based cargo within polymeric delivery systems. Journal of Control Release. 300, 102-113 (2019).
  6. Wang, W. Advanced protein formulations. Protein Science. 24 (7), 1031-1039 (2015).
  7. Lee, J., et al. An ultraviolet-curable, core-shell vaccine formed via phase separation. Journal of Biomedical Materials Research Part A. , (2019).
  8. Kittler, S., Hickey, S. G., Wolff, T., Eychmüller, A. Easy and Fast Phase Transfer of CTAB Stabilised Gold Nanoparticles from Water to Organic Phase. Zeitschrift für Physikalische Chemie. 229, 235 (2015).
  9. Soliman, M. G., Pelaz, B., Parak, W. J., del Pino, P. Phase Transfer and Polymer Coating Methods toward Improving the Stability of Metallic Nanoparticles for Biological Applications. Chemistry of Materials. 27 (3), 990-997 (2015).
  10. Arun Kumar, S., Good, J., Hendrix, D., Yoo, E., Kim, D., Deo, K. A., Jhan, Y. Y., Gaharwar, A. K., Bishop, C. J. Nanoengineered Light-Activatable Polybubbles for On?Demand Therapeutic Delivery. Adv. Funct. Mater. , 2003579 (2020).
  11. Wuthrich, P., Ng, S. Y., Fritzinger, B. K., Roskos, K. V., Heller, J. Pulsatile and delayed release of lysozyme from ointment-like poly(ortho esters). Journal of Controlled Release. 21 (1), 191-200 (1992).
  12. Wang, W. Instability, stabilization, and formulation of liquid protein pharmaceuticals. International Journal of Pharmaceutics. 185 (2), 129-188 (1999).
  13. Wong, D. Y., Hollister, S. J., Krebsbach, P. H., Nosrat, C. Poly(epsilon-caprolactone) and poly (L-lactic-co-glycolic acid) degradable polymer sponges attenuate astrocyte response and lesion growth in acute traumatic brain injury. Tissue Engineering. 13 (10), 2515-2523 (2007).
  14. Davoodi, P., et al. Drug delivery systems for programmed and on-demand release. Advanced Drug Delivery Reviews. 132, 104-138 (2018).
  15. Huang, Y. C., Lei, K. F., Liaw, J. W., Tsai, S. W. The influence of laser intensity activated plasmonic gold nanoparticle-generated photothermal effects on cellular morphology and viability: a real-time, long-term tracking and monitoring system. Photochemical and Photobiological Sciences. 18 (6), 1419-1429 (2019).
  16. Link, S., Burda, C., Nikoobakht, B., El-Sayed, M. A. Laser-Induced Shape Changes of Colloidal Gold Nanorods Using Femtosecond and Nanosecond Laser Pulses. The Journal of Physical Chemistry B. 104 (26), 6152-6163 (2000).
  17. U.S. Environmental Protection Agency. Chlorine. , https://www.epa.gov/sites/production/files/2016-09/documents/chlorine.pdf (2000).

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Biologia Edição 164 vacina de injeção única polibolagem depósito de polímeros doenças infecciosas sensíveis ao NIR explosão retardada
Produção de plataforma de entrega de vacinas de vacinação de infravermelho próximo e infravermelho
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Arun Kumar, S., Lee, J., Bishop, C. J. Production of Near-Infrared Sensitive, Core-Shell Vaccine Delivery Platform. J. Vis. Exp. (164), e60569, doi:10.3791/60569 (2020).

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