Summary
In questo articolo vengono descritti i protocolli utilizzati per produrre una nuova piattaforma di distribuzione di vaccini, "polybubbles", per consentire il rilascio ritardato di burst. Poliesters tra cui politolico-acido co-glicolico) e policaprolactone sono stati utilizzati per formare i polibubbles e piccole molecole e antigene sono stati utilizzati come carico.
Abstract
Le strategie di erogazione dei vaccini che possono limitare l'esposizione del carico al solvente organico, consentendo al contempo nuovi profili di rilascio, sono cruciali per migliorare la copertura delle vaccinazioni in tutto il mondo. Qui, viene introdotta una nuova piattaforma di rilascio di fumpoli iniettabile, curabile e ritardata, chiamata polibolle. Il carico è stato iniettato in polibolo a base di poliestere che si sono formati in una soluzione aques basata sul 10% di carboxymethycellulose. Questo documento include protocolli per mantenere la forma sferica dei polibololi e ottimizzare il posizionamento e la ritenzione del carico per massimizzare la quantità di carico all'interno dei polibololi. Per garantire la sicurezza, il contenuto di solventi clorurato all'interno dei polibolcchi è stato analizzato utilizzando l'analisi dell'attivazione dei neutroni. Studi di rilascio sono stati condotti con piccole molecole come carico all'interno del polibolo per confermare il rilascio di scoppio ritardato. Per mostrare ulteriormente il potenziale di consegna on-demand del carico, i nanorod d'oro sono stati mescolati all'interno del guscio polimero per consentire l'attivazione laser nel vicino infrarosso.
Introduction
La copertura immunitaria limitata comporta la morte di 3 milioni di persone specificamente causate da malattie prevenibili convaccino 1. Condizioni di stoccaggio e trasporto inadeguate portano allo stoccaggio dei vaccini funzionali e contribuiscono così a ridurre l'immunizzazione globale. Inoltre, la vaccinazione incompleta dovuta al non aderire ai programmi vaccinale richiesti provoca anche una copertura vaccinale limitata, in particolare nei paesi in via disviluppo 2. Sono necessarie visite multiple al personale medico entro il periodo raccomandato per ricevere colpi di richiamo, limitando così la percentuale di popolazione con vaccinazione completa. Pertanto, è necessario sviluppare nuove strategie per la fornitura controllata di vaccini per aggirare queste sfide.
Gli attuali sforzi per sviluppare tecnologie di consegna dei vaccini includono sistemi polimerici basati sull'emulsione3,4. Tuttavia, il carico è spesso esposto a una maggiore quantità di solvente organico che può potenzialmente causare aggregazione e denaturazione, in particolare nel contesto del carico a base diproteine 5,6. Abbiamo sviluppato una nuova piattaforma di consegna di vaccini, "polibolle", che può potenzialmente ospitare più vano di carico riducendo al minimo il volume di carico che è esposto al solvente7. Ad esempio, nella nostra piattaforma di polibolletta core-shell, una tasca di carico di diametro 0,38 mm (SEM) viene iniettata al centro di un polibubble da 1 mm. In questo caso, la superficie del carico esposta al solvente organico sarebbe di circa 0,453 mm2. Dopo aver considerato la densità di imballaggio delle sfere (microparticelle) all'interno di una sfera (deposito di carico), il volume effettivo di microparticelle (10 m di diametro) che potrebbero essere contenute nel deposito è di 0,17 mm3. Il volume di una microparticella è 5,24x10-8 mm3 e quindi il numero di particelle microparticelle che possono adattarsi al deposito è di 3,2x10particelle. Se ogni microparticella ha 20 sacche di carico (a seguito di doppia emulsione) di diametro di 0,25 m, la superficie del carico esposta al solvente organico è di 1274 mm2. Il deposito di merci all'interno della polibolletta avrebbe quindi una superficie di 2800 volte inferiore esposta al solvente organico rispetto a quella del carico organico esposto a solventi in microparticelle. La nostra piattaforma a base di poliestere può quindi ridurre potenzialmente la quantità di carico esposta al solvente organico che altrimenti può causare l'aggregazione e l'instabilità del carico.
I polibololi si formano in base al principio di separazione di fase in cui il poliestere in fase organica viene iniettato in una soluzione aques con conseguente bolla sferica. Il carico nella fase aques può quindi essere iniettato al centro della polibolletta. Un altro vano di carico può potenzialmente essere raggiunto all'interno del polibubble mescolando un carico diverso con il guscio polimero. La polibolletta in questa fase sarà malleabile e sarà quindi curata per tradurvi in una struttura in polibolletta solida con carico nel mezzo. I polibololi sferici sono stati scelti su altre forme geometriche per aumentare la capacità di carico all'interno del polibolo, riducendo al minimo le dimensioni complessive del polibolo. Polibololi con carico al centro sono stati scelti per dimostrare il rilascio ritardato burst. I polibololi sono stati incorporati anche con un agente sensibile all'infrarosso (NIR), cioè il nanorod d'oro (AuNR), per causare un aumento della temperatura dei polibololi. Questo effetto potrebbe potenzialmente facilitare una degradazione più rapida e potrebbe essere utilizzato per controllare la cinetica nelle applicazioni future. In questo articolo, descriviamo il nostro approccio per formare e caratterizzare i polibolcchi, per ottenere il rilascio ritardato di scoppio dai polibolcchi e per incorporare AuNR all'interno dei polibolo per causare l'attivazione del NIR.
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Protocol
1. Sintesi del triacrilato policaprolacyone (PCLTA)
- Asciugare 3,2 mL di 400 da policaprolacyone (PCL) triol durante la notte a 50 gradi centigradi in un flacone di fondo rotondo aperto di 200 mL e K2CO3 in una fiala di vetro a 90 gradi centigradi.
- Mescolare il tris con 6,4 mL di diclorometano (DCM) e 4,246 g di carbonato di potassio (K2CO3) sotto argon.
- Mescolare 2,72 mL di cloruro di acriloile in 27,2 mL di DCM e aggiungere dropwise alla miscela di reazione nel pallone oltre 5 min.
- Coprire la miscela di reazione con un foglio di alluminio e lasciarlo indisturbato a temperatura ambiente per 24 h sotto argon.
- Dopo 24 h, filtrare la miscela di reazione utilizzando una carta da filtro su un imbuto Buchner sotto vuoto per scartare i reagenti in eccesso.
- Precipitare filtrato dal punto 1.5 che contiene il polimero finito nell'etere dietile in un 1:3 (vol/vol) e rotovape a 30 gradi centigradi per rimuovere l'etere dietile.
2. Formazione del polibolo
NOTA: L'iniezione di polimero nell'acqua deionizzata (DI) causerebbe la migrazione dei polibollli verso il fondo della fiala con conseguente appiattimento del fondo. Utilizzare 10% (wt/vol) carboxymethyl cellulosa (CMC) riempire la fiala di vetro invece per evitare l'appiattimento polibubble.
- Preparare la soluzione CMC 10% (wt/vol) in acqua DI.
- Riempire una fiala di vetro da 0,92 mL con 0,8 mL del 10% CMC utilizzando un tubo di trasferimento da 1 mL.
- Mescolare 1000 mg/mL di 14 kDa PCL in DCM e sintetizzare PCLTA in un 1:3 (vol/vol) per un volume totale di 200 L o preparare 200 L di 1000 mg/mL di 5 kDa poli (acido lattico-coglico) diacrilato (AGGA) in cloroformio.
- Mescolare il 2-idrossi-4-(2-idrossiethoxy)-2-metilpropiophenone (fotoiniziatore) con la miscela polimero (PLGADA o PCL/PCLTA) in 0.005:1 (vol/vol).
- Caricare 200 L di miscela polimerica in una siringa di vetro da 1 mL montata su una pompa di siringa collegata a un tubo in acciaio inossidabile di erogazione con diametro interno di 0,016 pollici.
- Utilizzare un micromotore per controllare il movimento in avanti e all'indietro del tubo polimero per iniettare il polimero nel 10% CMC nella fiala di vetro per formare il polibolo.
- Curare i polibololi sotto ultravioletti (UV) a 254 nm di lunghezza d'onda per 60 s a 2 W/cm2.
- Il flash congela i polibololi in azoto liquido e liofilizzare durante la notte a 0,010 mBar vuoto e a -85 gradi centigradi.
- Separare i polibololi dalla CMC essiccata utilizzando le fopchine e lavare i polibololi con acqua DI per rimuovere qualsiasi CMC residuo. Si noti che altri polimeri possono essere utilizzati probabilmente con modifiche per alterare la cinetica di rilascio.
3. Modulazione del diametro della polibolletta
- Riempire una fiala di vetro da 0,92 mL con 10% CMC utilizzando un pipetto di trasferimento da 1 mL.
- Mescolare PCL/PCLTA in un 1:3 (vol/vol) con 1000mg/mL 14kDa PCL e sintetizzare PCLTA. Mescolare il fotoiniziatore con la miscela polimera in un 0.005:1 (vol/vol).
- Caricare la miscela polimerica in una siringa di vetro da 1 mL montata su una pompa di siringa collegata a un tubo in acciaio inossidabile di erogazione con un diametro interno di 0,016 pollici.
- Utilizzare un micromotore per controllare il movimento in avanti e all'indietro del tubo polimero per iniettare il polimero nel 10% CMC nella fiala di vetro per formare il polibolo.
- Per ottenere polibolle con vari diametri, variare la velocità di erogazione da 0,0005 a 1 L/s.
- Scatta immagini della fiala con i polibolcchi di diametro variabile.
- Utilizzare ImageJ per quantificare il diametro dei polibolcchi e utilizzare le dimensioni della fiala come scala.
4. Centrare il carico all'interno di polibolle
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Modulazione della viscosità PCL/PCLTA utilizzando K2CO3:
NOTA: La viscosità di PLGADA non deve essere modificata utilizzando K2CO3 perché la viscosità di 5 kDa PLAGDA a 1000 mg/mL è sufficiente per centrare il carico.- Aggiungere K2CO3 (che è stato isolato dopo la reazione PCLTA) al PCLTA a concentrazioni variabili tra cui 0 mg/mL, 10 mg/mL, 20 mg/mL, 40 mg/mL e 60 mg/mL.
- Misurare le viscosità dinamiche delle soluzioni modificando la velocità di taglio da 0 a 1000 1/s utilizzando la rieometria.
- Iniettare manualmente il carico al centro (fare riferimento al punto 4.2 per preparare la miscela di carico) dei polibololi che si sono formati utilizzando le soluzioni PCL/PCLTA con diverse concentrazioni di K2CO3 (punto 4.1.1). Determinare la concentrazione ottimale di K2CO3 osservando quale soluzione del punto 4.1.1 può provocare il mantenimento del carico nel mezzo.
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Centramento del carico (già dimostrato fattibilità con piccole molecole) con CMC
- Mescolare il carico con 5% (wt/vol) CMC in un rotatore durante la notte per aumentare la viscosità del carico.
- Iniettare manualmente 2 L della miscela di carico nel polibubble e procedere con la poligozza UV a 254 nm di lunghezza d'onda per 60 s a 2 W/cm2.
- Il flash congela i polibololi in azoto liquido per 30 s e liophilize durante la notte a 0,010 mBar vuoto e a -85 gradi centigradi.
- Separare i polibololi dalla CMC essiccata utilizzando le finzioni e lavare con acqua DI per rimuovere qualsiasi CMC residuo.
- Tagliare la polibolletta a metà e le metà utilizzando la microscopia confocale per garantire che il carico sia centrato (fare riferimento al punto 6 per le lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione utilizzate).
5. Formulazione del carico
NOTA: La formulazione di polibolle può ospitare vari tipi di carico, tra cui piccole molecole, proteine e acidi nucleici.
- Sulla base di studi precedenti, nel caso del carico proteico, utilizzare escipienti tra cui polietilene glicole (PEG)6, polivinylpyrrolidone (PVP) e glicopolimeri6 per migliorare la stabilità delle proteine durante la formulazione polibubble.
- Formare polibollli in base al protocollo nel passaggio 2.
- Preparare la soluzione antigene aggiungendo 17,11 g di trehalose a 625 l di antigene HIV gp120/41.
- Iniettare manualmente 1 L di soluzione antigene al centro del polibolo.
- Aprire le polibolle nei giorni 0, 7, 14 e 21 e registrare la fluorescenza dell'antigene con lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione rispettivamente 497 nm e 520 nm.
- Determinare la funzionalità dell'antigene utilizzando l'analisi immunosorsient collegata agli enzimi (ELISA) e utilizzare il 5% di latte non grasso come tampone di blocco.
6. Rilascio del carico
NOTA: Piccole molecole o antigeni possono essere utilizzati come tipo di carico
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Piccola molecola
- Polibololi incubati con acriflavine centrato in 400 L di salina tampone di fosfato (PBS) a 37 gradi centigradi, 50 gradi centigradi per i polibubble PLGADA e a 37 gradi centigradi, 50 gradi centigradi, 70 gradi centigradi per i polibubble PCL/PCLTA.
NOTA: Il motivo per cui si consiglia di testare al di sopra delle temperature del corpo è a) simulare la temperatura (50 gradi centigradi) alla quale il polibubble raggiunge mentre si laser per i nanorod d'oro (AuNRs) all'interno di PCL e PLGA; e b) accelerare il processo di degradazione della PCL (50 gradi centigradi, 70 gradi centigradi). - In ogni momento, raccogliere i supernatanti e sostituirli con 400 L di PBS fresco.
- Utilizzare un lettore di la tavoletta per quantificare le intensità di fluorescenza nei supernatanti raccolti.
NOTA: utilizzare ex/em di 416 nm/514 nm per acriflavine.
- Polibololi incubati con acriflavine centrato in 400 L di salina tampone di fosfato (PBS) a 37 gradi centigradi, 50 gradi centigradi per i polibubble PLGADA e a 37 gradi centigradi, 50 gradi centigradi, 70 gradi centigradi per i polibubble PCL/PCLTA.
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Antigene
- Polibololi incubati con siero di albumina bovina centrato (BSA)-488 in 400 L di PBS a 37 gradi centigradi, 50 gradi per i polibubble PLGADA e a 37 gradi centigradi, 50 gradi centigradi per i polibollli PCL/PCLTA.
- In ogni momento, raccogliere i supernatanti e sostituirli con 400 PBS freschi.
- Utilizzare un lettore di la tavoletta per quantificare le intensità di fluorescenza nei supernatanti raccolti. Utilizzare ex/em di 497 nm/520 nm per BSA-488.
NOTA: lo studio del rilascio a 70 gradi centigradi per i polibolcchi PCL/PCLTA non deve essere condotto per evitare di esporre l'antigene a temperature estreme.
7. Tossicità
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Quantificare il contenuto di cloro nei polibololi utilizzando l'analisi di attivazione neutroni (NAA)
- Utilizzare polibololi che sono stati liofilizzati per 2, 4, 6, 20 e 24 h per questo studio a 0,010 mBar vuoto e a -85 gradi centigradi.
- Misurare 5-9 mg di polibolcchi e posizionarli su fiale di irradiazione LDPE.
- Preparare 1000 g/mL di soluzione di taratura del cloro dall'Istituto nazionale di standard e tecnologia (NIST) soluzione di calibrazione tracciabile.
- Utilizzare il reattore Triga da 1 megawatt per effettuare irradiazioni di neutroni su ciascun campione a una velocità di fluenza neutrone di 9,1 ×10 12 /cm2per 600 s.
- Trasferire le polibolle in fiale non errate.
- Utilizzare il rilevatore HPGe per ottenere spettri a raggi gamma per 500 s dopo intervalli di decadimento di 360 s.
- Utilizzare il software NAA di canberra Industries per analizzare i dati.
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Quantificare il contenuto di cloro rilasciato dai poliboloni utilizzando NAA
- Polibololi incubati che sono stati lyophilized durante la notte (a 0,010 mBar vuoto e a -85 gradi centigradi) in 400 L di PBS a 37 gradi centigradi.
- Raccogliere i supernatanti nelle settimane 1, 2 e 3 dopo l'incubazione.
- Analizzare i supernatanti per il contenuto di cloro utilizzando NAA utilizzando lo stesso metodo descritto in precedenza nel passaggio 7.1.
8. Sintesi AuNR di Kittler, S., et al.8
- Preparare la soluzione di semina AuNR mescolando 250 L di acido cloroaurico da 10 mM (HAuCl4), 7,5 mL di bromuro di cetrimonium da 100 mM (CTAB) e 600 l di 10 mM di boroidride di sodio freddo freddo (NaBH4).
- Preparare la soluzione di crescita mescolando 40 mL di CTAB 100 mM, 1,7 mL di 10 mM HAuCl4, 250 l di nitrato d'argento (AgNO3) e 270 l di acido ascorbico da 17,6 mg/mL in un tubo.
- Mescolare vigorosamente 420 L di soluzione di seme con la soluzione di crescita a 1200 rpm per 1 min. Quindi lasciare la miscela indisturbata per reagire per 16 h.
- Togliere i reagenti in eccesso dalla miscela centrifugando a 8000 × g per 10 min e scartare il supernante.
9. Idrofobicizzazione degli AuNRs di Soliman, M.G., etal.
- Regolare il pH di 1,5 mL degli AuNR sintetizzati stabilizzati CTAB a 10 utilizzando 1 mM di idrossido di sodio (NaOH).
- Mescolare la soluzione con 0,1 mL di 0,3 mM di tioloto metilato (mPEG) a 400 giri/min durante la notte.
- Mescolare gli AuNR PEGylated con 0,4 M dodecylamine (DDA) in cloroformio a 500 giri/min per 4 giorni.
- Pipettare lo strato organico superiore contenente AuNR idrofobicizzati e conservare a 4 gradi centigradi fino all'uso futuro.
10. Attivazione NIR di polibolle
- Mescolare la soluzione polimerica (PLGADA o PCL/PCLTA) con AuNR idrofobicizzati in un 1:9 (vol/vol).
- Aggiungere il fotoiniziatore alla miscela polimero-AuNR in un 0.005:1 (vol/vol).
- Formare polibololi iniettando la miscela polimero-AuNR in una fiala di vetro da 0,92 mL con 10% CMC (wt/vol) (fare riferimento al punto 2).
- Curare i polibololi a 254 nm di lunghezza d'onda per 60 s a 2 W/cm2.
- Congelamento del flash in azoto liquido per 30 s e liofilizzazione durante la notte a 0,010 mBar vuoto e a -85 gradi centigradi.
- Separare le polibolecche secche utilizzando le fopchine e lavare con acqua DI per rimuovere qualsiasi CMC residuo.
- Incubare le polibolelle in 400 L di PBS a 37 gradi centigradi.
- Attivare i polibololi utilizzando il laser NIR a 801 nm a 8A per 5 min ogni lunedì, mercoledì e venerdì.
- Scatta immagini a infrarossi (FLIR) lungimirative del polibolo prima e dopo l'attivazione del laser per ottenere i valori di temperatura.
- Calcolare le differenze di temperatura tra l'attivazione prima e dopo l'attivazione laser in base ai valori di temperatura delle immagini FLIR.
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Representative Results
I polibololi sono stati ampiamente caratterizzati utilizzando SEM e NAA. Cargo è stato centrato con successo per provocare un rilascio burst ritardato. I polibololi sono stati attivati con successo anche al laser a causa della presenza di AuNR all'interno dei polibololi.
Caratterizzazione polybubble
Polibololi iniettati in una soluzione aques senza CMC hanno provocato una polibolletta appiattita a causa del loro contatto con il fondo della fiala di vetro (Figura 1A,B). L'appiattimento parziale è stato osservato quando è stata utilizzata una soluzione acquosa basata sul 5% di CMC al posto dell'acqua DI (Figura 1C). Successivamente, la soluzione aques basata sul 10% CMC nella fiala di vetro ha comportato la sospensione della polibolletta nella soluzione e quindi una corretta manutenzione della sfericità del polibubble (Figura 1D).
Centramento del carico
L'iniezione di carico nella polibolletta in assenza di CMC ha provocato perdite che non hanno causato alcuna ritenzione di carico all'interno della polibolletta (Figura 3). Per contrastare questa sfida, sono stati utilizzati due approcci: 1) la viscosità del PCLTA è stata aumentata con successo utilizzando K2CO3 che è stato isolato dopo l'endcapping TRIOl PCL con triacrilate (Figura 2) e 2) viscosità del carico è stato aumentato con successo dopo aver mescolato il carico con 5% CMC (Figura 3, Figura 4). La viscosità delle polibolle PLGADA era sufficiente a facilitare la centraggio del carico e quindi non è stata modulata utilizzando K2CO3.
Funzionalità antigene
L'antigene HIV gp120/41 è stato mescolato con e senza trehalose prima di iniettarsi nella polibolletta (Figura 5). L'efficienza legante dell'anticorpo all'antigene (definito come funzionalità) con e senza trehalose non ha alcuna differenza statisticamente significativa.
Rilasciare studi senza attivazione laser
I rilasci di burst ritardati sono stati osservati nei polibolcchi PLGADA con acriflavine nel mezzo nei giorni 19 e 5 per i polibolcchi incubati rispettivamente a 37 gradi centigradi(Figura 6A) e 50 gradi centigradi (Figura 6B). I rilasci a raffica ritardati sono stati osservati anche nei polibolcchi PCL/PCLTA con acriflavine nel mezzo nei giorni 160 e 60 per i polibolcchi incubati rispettivamente a 50 gradi centigradi(Figura 7A) e 70 gradi centigradi(Figura 7B). Questi studi di rilascio sono stati condotti in assenza di AuNR laser-activabili.
Attivazione laser in vitro di polibolle
I polibololi con AuNRs nel guscio sono stati attivati con successo più volte nei polibollli PLGADA (Figura 8A) e nei polibollli PCL/PCLTA (Figura 8B). Le variazioni di temperatura da prima e dopo l'attivazione del laser sono state rispettivamente di 10 ± 1oC e 5 ± 1 gradi centigradi nei polibollli PCL/PCLTA con concentrazione AuNR superiore e inferiore nel guscio. Le variazioni di temperatura osservate prima e dopo l'attivazione del laser sono state rispettivamente di 11 ± 2 gradi centigradi e 6 ± 1 gradi centigradi nei polibollli PLGADA con concentrazione AuNR superiore e inferiore nel guscio.
Figura 1: Mantenimento della sfericità delle polibolle. Immagini SEM di (A) 14 kDa PCL/300 Da PCLTA polibolo appiattito a causa del contatto di polibolle con il fondo della fiala di vetro; (B) 14 kDa PCL/300 Da PCLTA polibubble dall'alto che non era in contatto con il fondo di vetro; (C) i polibololi PCL/PCLTA con minore grado di appiattimento quando iniettati in una soluzione CMC del 5% rispetto alla soluzione di acqua DI, causando la formazione di forma simile all'emisfero nel punto di contatto con la fiala; (D) polibolletta che non ha raggiunto il fondo della fiala di vetro quando iniettato in una soluzione CMC 10%, consentendo la forma sferica da mantenere. Tutte le barre di scala indicate sono di 500 m. Questa cifra è stata modificata da Lee et al.7. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Modulazione della viscosità PCLTA. La concentrazione di K2CO3 è stata aumentata da 0 a 80 mg/mL nel PCLTA e la viscosità dinamica è stata osservata per aumentare proporzionalmente con la concentrazione di K2CO3. Questa cifra è stata modificata da Arun Kumar et al10. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Iniezione di carico nel polibubble con e senza CMC. Il pannello superiore mostra i fotogrammi estratti dal video della perdita di carico durante l'iniezione in assenza di CMC. Il pannello inferiore mostra i fotogrammi estratti dal video della ritenzione del carico all'interno del polibolo in presenza del 5% di CMC. Questa cifra è stata modificata da Lee et al.7. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: carico centrato. Immagini al microscopio fluorescente di (A) polibubble PCL/PCLTA con carico centrato, (B) polibubble PCL/PCLTA con carico nel guscio e colorante non fluorescente centrato. Questa cifra è stata modificata da Arun Kumar et al10. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Funzionalità antigene con trehalose. La funzionalità di HIV gp120/41 con e senza trehalose all'interno del polibolo è stata analizzata utilizzando ELISA. L'efficienza legante di un anticorpo alla proteina è generalmente considerata come un indicatore per la funzionalità della proteina. Quando discutiamo della funzionalità dell'antigene in questo studio, intendiamo che intendiamo che aiuti gli anticorpi che legano la proteina di interesse (che è un indicatore per la funzionalità delle proteine). Non è stata osservata alcuna rilevanza statistica tra i due gruppi. Gli intervalli di confidenza sono indicati da linee solide e tratteggiate. Questa cifra è stata modificata da Lee et al.7. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: rilascio burst ritardato da polibolcchi PLGADA. Studi di rilascio che mostrano rilasci di burst ritardati da polibolle PLGADA con acriflavine nel mezzo a (A) 37 gradi centigradi, (B) 50 gradi centigradi. Linea continua indica la curva adattata ottenuta in base ai punti dati. Questa cifra è stata modificata da Arun Kumar et al10. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: rilascio burst ritardato da polibolcchi PCL/PCLTA. Studi di rilascio che mostrano rilasci a raffica ritardati da polibolcchi PCL/PCLTA con acriflavine nel mezzo a (A) 50 gradi centigradi, (B) 70 gradi centigradi. Questa cifra è stata modificata da Arun Kumar et al10. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8: attivazione laser NIR di polibolle. Variazione della temperatura osservata prima e dopo l'attivazione laser NIR in (A) polibolle PLGADA, (B) polibolette PCL/PCLTA con maggiore e minore concentrazione di AuNR nel guscio polimero. Questo aumento della temperatura potrebbe essere sfruttato per accelerare potenzialmente la degradazione del polimero che porta al rilascio anticipato del carico. Questa cifra è stata modificata da Arun Kumar et al10. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Tecnologie e sfide attuali
Micro- e nanoparticelle a base di emulsione sono stati comunemente utilizzati come portatori di consegna di farmaci. Anche se la cinetica del rilascio del carico da questi dispositivi è stata ampiamente studiata, il controllo della cinetica del rilascio a raffica è stata una grande sfida11. La versatilità e la funzionalità del carico sono limitate anche nei sistemi basati sull'emulsione a causa dell'esposizione del carico ai solventi aques e organici in eccesso. Il carico a base proteico spesso non è compatibile con micro e nanoparticelle a causa della possibilità di denaturazione del carico e di aggregazione12. Oltre alla stabilità del carico, la cinetica del carico è particolarmente importante nel contesto dei vaccini a causa della necessità di colpi di richiamo che portano alla sieroconversione. I precedenti sforzi per affrontare queste sfide nella fornitura di vaccini non hanno avuto sufficientemente successo, poiché la nozione di sistemi di vaccino a iniezione singola esiste da un paio di decenni e non è ancora stata tradotta clinicamente.
La nostra piattaforma di erogazione di vaccini in polibolo può potenzialmente superare le sfide con una maggiore esposizione del carico al solvente organico riducendo al minimo il volume di carico esposto. Questa tecnologia può potenzialmente ospitare almeno due compartimenti di carico: il carico nel guscio e il carico al centro. Polibololi con carico centrato possono essere utilizzati per controllare il rilascio burst del carico pur essendo compatibili con diversi tipi di carico, tra cui piccole molecole e antigene. In questo studio, abbiamo usato poliester con tempi di degradazione variabili, PLGADA (tempo di degradazione più breve) e PCL/PCLTA (tempo di degradazione più lungo), come vettori di polimeri e acriflavine (piccola molecola) come tipo di carico per dimostrare il rilascio ritardato dello scoppio. Nelle sezioni seguenti vengono descritti i passaggi cruciali per la formazione di polibolle in grado di consentire sia il rilascio a burst ritardato che l'attivazione NIR, in particolare per le future applicazioni di distribuzione su richiesta.
Centramento del carico all'interno del polibubble
La centravanti del carico è stata una delle sfide significative che si sono incontrate durante la formulazione dei polibololi. Immediatamente dopo l'iniezione, il carico migrava verso la superficie e la tasca del carico sarebbe stata stabilizzata senza scoppiare nella soluzione CMC del 10%. Polibololi con tale carico off-centered può provocare il rilascio anticipato a causa dello spessore non uniforme del polimero che circonda il carico. La modifica della viscosità del polimero e del carico è stata quindi fondamentale per risolvere i problemi legati alla centraggio del carico. La viscosità del carico è stata aumentata mescolando la soluzione di carico con il 5% di CMC. Per aumentare la viscosità del polimero, il peso molecolare del polimero potrebbe essere stato modificato. Tuttavia, l'aumento del peso molecolare spesso si traduce in una degradazione dei polimeri più lenta, causando così un ulteriore ritardo nel rilascio del carico. La viscosità del polimero è stata così modificata aumentando la concentrazione del polimero. Una maggiore concentrazione (1000 mg/mL) era sufficiente per aumentare la viscosità di PLGADA. Tuttavia, la viscosità della PCL/PCLTA non era adeguata per trattenere il carico nel mezzo. Così, K2CO3 che è stato isolato dopo la reazione di finecapping di PCLTA è stato utilizzato per aumentare la viscosità di PCLTA.
Nuovo rilascio ritardato
Il rilascio ritardato di burst è stato osservato dagli studi di rilascio condotti utilizzando i polibolcchi con carico centrato. Piccola molecola (acriflavine) è stata utilizzata come carico centrato nei polibolcchi per studiare il profilo di rilascio. Sono stati osservati profili di rilascio unici in base al poliestere utilizzato a causa della differenza nel tempo di degradazione dei polimeri. Il rilascio a burst è stato osservato in precedenza nei polibollli PLGADA rispetto a quello dei polibololi PCL/PCLTA. Il rilascio precoce del carico è stato osservato nei polibollli PLGADA perché PLGA si degrada più velocemente rispetto al PCL13. Dopo aver modulato con successo la cinetica di rilascio con due tipi di poliester, abbiamo inoltre voluto progettare la polibolga per consentire potenzialmente il rilascio on-demand del carico.
Attivazione NIR di polibololi
Il rilascio on-demand del carico rispetto alla tempistica delle esigenze dei pazienti è stato difficile da raggiungere utilizzando le attuali strategie di consegna14. Abbiamo ipotizzato che accelerare il rilascio del carico su richiesta potrebbe essere possibile accelerando la degradazione dei polimeri attraverso l'uso di agenti sensibili al NIR (cioè l'abilitazione del suolo). AuNRs sono stati ampiamente studiati per la loro capacità di essere attivato utilizzando laser NIR che può viaggiare pochi centimetri attraverso la pelle15. Gli AuNR stabilizzati dal CTAB sono stati così preparati sulla base del protocollo di Kittler, S, et al. e sono stati idrofobicizzati sulla base dei metodi pubblicati da Solimon, M.G., et al. Polibololi con AuNR idrofobicizzati nel guscio sono stati poi irradiati con laser NIR nei punti di tempo desiderati per 5 minuti per osservare il cambiamento di temperatura. Le temperature prima e dopo il laser sono state misurate in base alle immagini FLIR. Il guscio polimero curato ha contribuito a preservare la forma degli AuNR durante l'attivazione laser, consentendo così molteplici attivazioni NIR di polibolecchi. Questa è un'osservazione interessante perché nella letteratura precedente, gli AuNR sono stati spesso conosciuti per perdere la loro forma simile a una canna (cruciale per l'attivazione NIR) a causa dell'attivazione laser16. Il successo dell'attivazione laser dei polibolcchi con AuNR potrebbe spianare la strada al controllo del rilascio on-demand del carico nella prossima generazione di polibolle.
Significato e applicazioni future
I risultati ottenuti da questo studio mostrano quindi che le polibolle hanno il potenziale per essere utilizzate come nuova piattaforma di consegna di vaccini. La preparazione delle polibolle descritte in questo documento consentirà inoltre ad altri ricercatori di utilizzare i polibolcchi come piattaforma di consegna per altre applicazioni terapeutiche. Ad esempio, oltre alla consegna del vaccino, i polibololi possono anche essere potenzialmente utilizzati per fornire agenti terapeutici sinergici con diversa cinetica di rilascio. Inoltre, polibolle sono fatte di poliesters che sono biodegradabili e sono stati utilizzati in molti dispositivi medici approvati dalla FDA. Abbiamo inoltre convalidato la sicurezza delle polibolle dimostrando che il cloro rilasciato dalle polibolle è ben all'interno dei livelli di sicurezza raccomandati dall'EPA17. Così, la nostra nuova piattaforma in polibubble iniettabile e curabile UV ha il potenziale per essere utilizzata come piattaforma di consegna di farmaci sicura ed efficace per una varietà di tipi di carico.
Limitazioni di questa tecnologia
La tecnologia della piattaforma polibolletta può essere utilizzata come piattaforma di fornitura di vaccini che potenzialmente consente il rilascio controllato. I nostri studi evidenziano la versatilità di questa piattaforma in grado di fornire diversi tipi di carico, tra cui antigeni e piccole molecole. Tuttavia, una delle attuali limitazioni di questa tecnologia è che il carico è attualmente iniettato manualmente. Per scopi di scalabilità, stiamo attualmente utilizzando una piattaforma automatizzata che consentirà l'iniezione (cioè, come array) di carico all'interno del polibubble e potenzialmente aiuterà ad alleviare le preoccupazioni riguardanti la traslattabilità di questa tecnologia.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare il Dr. Bryan E. Tomlin affiliato con il laboratorio di analisi elementale all'interno del dipartimento di chimica di TAMU che ha assistito con l'analisi di attivazione neutroni (NAA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Step Ultra Tetramethylbezidine (TMB)-Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Substrate Solution | Thermo scientific | 34028 | |
| 2-Hydroxy-2-methylpropiophenone | TCI AMERICA | H0991 | |
| 450 nm Stop Solution for TMB Substrate | Abcam | ab17152 | |
| Acryloyl chloride | Sigma Aldrich | A24109-100G | |
| Acriflavine | Chem-Impex International | 22916 | |
| Anhydrous ethyl ether | Fisher Chemical | E138-500 | |
| Anti-HIV1 gp120 antibody conjugated to horseradish peroxidase (HRP) | |||
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher BioReagents | BP9700100 | |
| BSA-CF488 dye conjugates | Invitrogen | A13100 | |
| Bromosalicylic acid | Acros Organics | AC162142500 | |
| Carboxymethylcellulose (CMC) | Millipore Sigma | 80502-040 | |
| Centrimonium bromide (CTAB) | MP Biomedicals | ICN19400480 | |
| Chloroform | Fisher Chemical | C2984 | |
| Coating buffer | Abcam | ab210899 | |
| Dichloromethane (DCM) | Sigma Aldrich | 270997-1L | |
| Diethyl ether | Fisher Chemical | E1384 | |
| Dodeacyl Amine | Acros Organics | AC117665000 | |
| Doxorubicin hydrochloride | Fisher BioReagents | BP251610 | |
| L-ascorbic acid | Acros Organics | A61 100 | |
| Legato 100 Syringe Pump | KD Scientific | 14 831 212 | |
| mPEG thiol | Laysan Bio | NC0702454 | |
| Nonfat dry milk | Andwin Scientific | NC9022655 | |
| Potassium carbonate | Acros Organics | AC424081000 | |
| Phosphate saline buffer | Fisher BioReagents | BP3991 | |
| (Poly(caprolactone) | Sigma Aldrich | 440744-250G | |
| (Poly(caprolactone) triol | Acros Organics | AC190730250 | |
| Poly (lactic-co-glycolic acid) diacrylate | CMTec | 280050 | |
| Potassium carbonate | Acros Organics | AC424081000 | |
| Recombinant HIV1 gp120 + gp41 protein | Abcam | ab49054 | |
| Silver nitrate | Acros Organics | S181 25 | |
| Sodium borohydride | Fisher Chemical | S678 10 | |
| Tetrachloroauric acid | Fisher Chemical | G54 1 | |
| Trehalose | Acros Organics | NC9022655 | |
| Triethyl amine | Acros Organics | AC157910010 |
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