Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

إنتاج الأشعة تحت الحمراء القريبة الحساسة، منصة تسليم لقاح كور شل

Published: October 20, 2020 doi: 10.3791/60569
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, Texas A&M University

Summary

توضح هذه المقالة البروتوكولات المستخدمة لإنتاج منصة جديدة لتوصيل اللقاح، "polybubbles"، لتمكين إطلاق انفجار متأخر. واستخدمت البوليسترات بما في ذلك بولي (حمض اللاكتيك شارك الجليكوليك) والبولي كابرولكتون لتشكيل polybubbles والجزيئات الصغيرة والمستضدات واستخدمت كبضائع.

Abstract

إن استراتيجيات إيصال اللقاحات التي يمكن أن تحد من تعرض البضائع للمذيبات العضوية مع تمكين الملامح الجديدة للإطلاق هي ذات أهمية حاسمة لتحسين تغطية التمنيع في جميع أنحاء العالم. هنا ، يتم تقديم رواية قابلة للحقن ، والأشعة فوق البنفسجية ، curt وتأخر إطلاق انفجار تمكين منصة توصيل اللقاح تسمى polybubbles. تم حقن البضائع في البولي بوببلس القائم على البوليستر التي تشكلت في 10٪ carboxymethycellulose - القائم على محلول مائي. تتضمن هذه الورقة بروتوكولات للحفاظ على الشكل الكروي للبولي بوبلز وتحسين وضع البضائع والاحتفاظ بها لزيادة كمية البضائع داخل polybubbles. ولضمان السلامة، تم تحليل محتوى المذيبات المكلورة داخل البولي بوبل باستخدام تحليل تنشيط النيوترونات. وأجريت دراسات الإفراج مع جزيئات صغيرة والبضائع داخل polybubble لتأكيد تأخر إطلاق انفجار. وللمزيد من إظهار إمكانية تسليم البضائع عند الطلب، كانت ألياف النانو مزجت داخل قشرة البوليمر لتمكين التنشيط بالليزر القريب من الأشعة تحت الحمراء.

Introduction

ويؤدي تغطية التحصين المحدودة إلى وفاة 3 ملايين شخص بسبب الأمراض التي يمكن الوقاية منها باللقاحاتتحديداً 1. وتؤدي ظروف التخزين والنقل غير الملائمة إلى هدر اللقاحات الوظيفية، وبالتالي تسهم في خفض التحصين العالمي. وبالإضافة إلى ذلك، فإن عدم اكتمال التطعيم بسبب عدم الالتزام بجداول اللقاحات المطلوبة يتسبب أيضاً في تغطية محدودة باللقاحات، وتحديداً في البلدان النامية2. ويلزم القيام بزيارات متعددة للعاملين الطبيين خلال الفترة الموصى بها لتلقي الجرعات المعززة، مما يحد من النسبة المئوية للسكان الذين يحصلون على التطعيم الكامل. ومن ثم، هناك حاجة إلى وضع استراتيجيات جديدة لتقديم اللقاحات الخاضعة للرقابة للتغلب على هذه التحديات.

وتشمل الجهود الحالية نحو تطوير تكنولوجيات إيصال اللقاحات النظم البوليمرية المستحلب3،4. ومع ذلك، غالباً ما تتعرض البضائع إلى كمية أكبر من المذيبات العضوية التي يمكن أن تسبب تراكم وdenaturation، وتحديدا في سياق البضائع القائمة على البروتين5،6. لقد قمنا بتطوير منصة جديدة لتوصيل اللقاح ، "polybubbles" ، التي يمكن أن تضم مقصورات شحن متعددة مع تقليل حجم البضائع التي تتعرض للمذيبات7. على سبيل المثال، في منصة القذيفة الأساسية متعددة الزهاء، يتم حقن جيب شحن قطره 0.38 مم (SEM) في وسط بولي بوبل 1 مم. وفي هذه الحالة، فإن مساحة سطح البضائع المعرضة لمذيب عضوي ستكون حوالي 0.453 مم2. بعد النظر في كثافة التعبئة من المجالات (الجسيمات الدقيقة) داخل المجال (مستودع البضائع)، والحجم الفعلي للجسيمات الدقيقة (10 ميكرومتر في القطر) التي يمكن أن يصلح في مستودع 0.17 مم3. حجم الجسيمات الدقيقة واحد هو 5.24x10-8 ملم3، وبالتالي فإن عدد الجسيمات الدقيقة التي يمكن أن تناسب المستودع هو ~ 3.2x106 الجسيمات. إذا كان كل الجسيمات الدقيقة لديها 20 جيب البضائع (نتيجة مستحلب مزدوج) من 0.25 ميكرومتر القطر، ثم مساحة السطح من البضائع المعرضة للمذيبات العضوية هو 1274 مم2. مستودع البضائع داخل polybubble وبالتالي سيكون لها ~ 2800-fold أقل مساحة السطح المعرضة للمذيبات العضوية مقارنة مع تلك التي من البضائع العضوية المذيبات المعرضة في الجسيمات الدقيقة. وبالتالي يمكن أن تقلل من منصة البوليستر لدينا كمية البضائع المعرضة للمذيبات العضوية التي يمكن أن تسبب خلاف ذلك تجميع البضائع وعدم الاستقرار.

يتم تشكيل polybubbles على أساس مبدأ فصل المرحلة حيث يتم حقن البوليستر في المرحلة العضوية في محلول مائي مما يؤدي إلى فقاعة كروية. ويمكن بعد ذلك حقن البضائع في المرحلة مائي في وسط polybubble. ويمكن أن يكون من الممكن أن يتحقق آخر مقصورة الشحن داخل polybubble عن طريق خلط شحنة مختلفة مع قذيفة البوليمر. وسوف polybubble في هذه المرحلة تكون مرنة ، وسوف بعد ذلك الشفاء يؤدي إلى هيكل polybubble الصلبة مع البضائع في الوسط. تم اختيار polybubbles كروية على الأشكال الهندسية الأخرى لزيادة قدرة البضائع داخل polybubble مع التقليل من الحجم الكلي للبولي بوبل. تم اختيار polybubbles مع البضائع في المركز لإثبات تأخر إطلاق انفجار. وأدرجت أيضا polybubbles مع الأشعة تحت الحمراء القريبة (NIR)- حساسة (أي، ثيرانوستيك تمكين) عامل، وهي نانورود الذهب (AuNR)، للتسبب في زيادة في درجة حرارة polybubbles. ويمكن أن ييسر هذا التأثير التحلل بشكل أسرع ويمكن استخدامه للتحكم في الحركة في التطبيقات المستقبلية. في هذه الورقة، ونحن وصف نهجنا لتشكيل وتوصيف polybubbles، لتحقيق تأخر إطلاق انفجار من polybubbles، ودمج AuNR داخل polybubbles للتسبب NIR-التنشيط.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. بوليكبرولاكيوني ثلاثية الكريريلات (PCLTA) التوليف

  1. الجافة 3.2 مل من 400 Da polycaprolacyone (PCL) الثلاثي بين عشية وضحاها في 50 درجة مئوية في قارورة مفتوحة 200 مل أسفل جولة وK2CO3 في قارورة زجاجية في 90 درجة مئوية.
  2. اخلط الثلاثي مع 6.4 مل من ديكلوروميثان (DCM) و4.246 غرام من كربونات البوتاسيوم (K2CO3) تحت الأرجون.
  3. مزيج 2.72 مل من كلوريد الاكريلويل في 27.2 مل من DCM وإضافة dropwise إلى خليط رد فعل في قارورة أكثر من 5 دقائق.
  4. تغطية خليط التفاعل مع رقائق الألومنيوم وتركها دون عائق في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة تحت الأرجون.
  5. بعد 24 ساعة، قم بتصفية خليط التفاعل باستخدام ورقة تصفية على قمع Buchner تحت الفراغ لتجاهل الكواشف الزائدة.
  6. راسب filtrate من الخطوة 1.5 التي تحتوي على البوليمر endcapped في الأثير ديثيل في 1:3 (vol/vol) و rotovape في 30 درجة مئوية لإزالة الأثير ديثيل.

2. تشكيل polybubble

ملاحظة: حقن البوليمر في المياه deionized (DI) من شأنه أن يسبب polybubbles إلى الهجرة إلى الجزء السفلي من القارورة مما أدى إلى أسفل بالارض. استخدام 10٪ (wt/vol) carboxymethyl السليلوز (CMC) ملء الزجاج بدلا من ذلك قارورة لتجنب التسطيح polybubble.

  1. إعداد 10٪ (wt/ vol) CMC الحل في DI المياه.
  2. تعبئة 0.92 مل قارورة زجاجية مع 0.8 مل من 10٪ CMC باستخدام أنبوب نقل 1 مل.
  3. مزيج 1000 ملغ / مل من 14 كيلو Da PCL في DCM وتوليف PCLTA في 1:3 (vol/vol) لمجم 200 ميكرولتر أو إعداد 200 ميكرولتر من 1000 ملغ/مل من 5 كيلو بولي (حمض اللاكتيك المشترك الجليكوليك) diacrylate (PLGADA) في الكلوروفورم.
  4. مزيج من 2-هيدروكسي-4′-(2-هيدروكسيثوكسي)-2-ميثيل بروبيوفينون (فوتوينيتاتير) مع البوليمر (PLGADA أو PCL/PCLTA) في 0.005:1 (فول/فول).
  5. تحميل 200 ميكرولتر من خليط البوليمر في حقنة زجاجية 1 مل محمولة على مضخة حقنة متصلة بأنبوب الفولاذ المقاوم للصدأ الاستغناء مع قطر داخلي 0.016 بوصة.
  6. استخدام micromotor للسيطرة على الحركة إلى الأمام والخلف من أنبوب البوليمر لحقن البوليمر في 10٪ CMC في الزجاج القارورة لتشكيل polybubble.
  7. علاج polybubbles تحت الأشعة فوق البنفسجية (UV) في الطول الموجي 254 نانومتر لمدة 60 s في 2 W / cm2.
  8. فلاش تجميد polybubbles في النيتروجين السائل وlyophilize بين عشية وضحاها في 0.010 mBar فراغ وعند -85 درجة مئوية.
  9. فصل polybubbles من CMC المجففة باستخدام ملقط وغسل polybubbles مع DI المياه لإزالة أي CMC المتبقية. لاحظ أنه يمكن استخدام البوليمرات الأخرى على الأرجح مع تعديلات لتغيير حركية الإطلاق.

3. تعديل من متعدد بوبل قطر

  1. تعبئة 0.92 مل الزجاج القارورة مع 10٪ CMC باستخدام أنبوب نقل 1 مل.
  2. خلط PCL/PCLTA في 1:3 (فول / فول) مع 1000mg/mL 14kDa PCL وتوليف PCLTA. اخلطي المُتَرِّف الضوئي مع خليط البوليمر في 0.005:1 (vol/vol).
  3. قم بتحميل خليط البوليمر في حقنة زجاجية 1 مل مثبتة على مضخة حقنة متصلة بأنبوبة من الفولاذ المقاوم للصدأ بقطر داخلي 0.016 بوصة.
  4. استخدام micromotor للسيطرة على الحركة إلى الأمام والخلف من أنبوب البوليمر لحقن البوليمر في 10٪ CMC في الزجاج القارورة لتشكيل polybubble.
  5. للحصول على polybubbles بأطر مختلفة ، تختلف معدل الاستغناء من 0.0005 إلى 1 ميكرولتر / س.
  6. التقاط صور للقارورة مع polybubbles مع قطر متفاوتة.
  7. استخدام ImageJ لتحديد قطر polybubbles واستخدام حجم القارورة على نطاق.

4. البضائع مركزة داخل polybubble

  1. تعديل لزوجة PCL/PCLTA باستخدام K2CO3:
    ملاحظة: لا يلزم تعديل لزوجة PLGADA باستخدام K2CO3 لأن لزوجة 5 كيلو اديا PLAGDA في 1000 ملغ/مل كافية لتمركز البضائع.
    1. أضف K2CO3 (التي تم عزلها بعد تفاعل PCLTA) إلى PCLTA بتركيزات متفاوتة بما في ذلك 0 ملغم/مل، 10 ملغم/مل، 20 ملغ/مل، 40 ملغم/مل، و60 ملغم/مل.
    2. قياس اللزوجة الديناميكية للحلول عن طريق تغيير معدل القص من 0 إلى 1000 1/s باستخدام اِلتيْر الرحَم.
    3. حقن البضائع يدويا في الوسط (راجع الخطوة 4.2 لإعداد خليط البضائع) من polybubbles التي تشكلت باستخدام PCL / PCLTA الحلول مع تركيزات مختلفة من2K CO3 (الخطوة 4.1.1). تحديد التركيز الأمثل من K2CO3 من خلال مراقبة الحل الذي من الخطوة 4.1.1 يمكن أن يؤدي إلى الاحتفاظ البضائع في الوسط.
  2. توسيط الحمولة (سبق أن أظهرت جدوى مع جزيئات صغيرة) مع CMC
    1. اخلط الحمولة مع 5٪ (wt/vol) CMC في الدوار بين عشية وضحاها لزيادة لزوجة البضائع.
    2. يدويا حقن 2 ميكرولتر من خليط البضائع في polybubble والمضي قدما مع الشفاء من الأشعة فوق البنفسجية في الطول الموجي 254 نانومتر لمدة 60 s في 2 W /cm2.
    3. فلاش تجميد polybubbles في النيتروجين السائل لمدة 30 s وlyophilize بين عشية وضحاها في 0.010 mBar فراغ وعند -85 درجة مئوية.
    4. فصل polybubbles من CMC المجففة باستخدام ملقط وغسلها مع DI المياه لإزالة أي CMC المتبقية.
    5. قطع polybubble في نصف وصورة النصفين باستخدام المجهر confocal لضمان أن البضائع تركزت (الرجوع إلى الخطوة 6 لالإثارة والانبعاثات الطول الموجي المستخدمة).

5- تركيبات الشحنات

ملاحظة: يمكن أن تضم تركيبة polybubble أنواع مختلفة من البضائع، بما في ذلك الجزيئات الصغيرة والبروتينات والأحماض النووية.

  1. استنادا إلى الدراسات السابقة، في حالة البضائع البروتين، واستخدام سواغ بما في ذلك البولي ايثيلين جلايكول (PEG)6، polyvinylpyrrolidone (PVP)، وغليكوبوليكمرات6 لتحسين استقرار البروتين أثناء صياغة polybubble.
  2. شكل polybubbles استناداً إلى البروتوكول في الخطوة 2.
  3. تحضير محلول مستضد بإضافة 17.11 غرام من تريهالوس إلى 625 ميكرولتر من فيروس نقص المناعة البشرية gp120/41 مستضد.
  4. حقن يدويا 1 ميكرولتر من محلول مستضد في منتصف polybubble.
  5. فتح polybubbles في أيام 0 و 7 و 14 و 21 ، وسجل الفلوريس من المستضد مع الإثارة والانبعاثات الطول الموجي 497 نانومتر و 520 نانومتر ، على التوالي.
  6. تحديد وظيفة المستضد باستخدام المقايسة المناعية المرتبطة بالانزيم (ELISA) واستخدام الحليب غير الدهني 5٪ كمخزن عازل للحجب.

6 - الإفراج عن البضائع

ملاحظة: يمكن استخدام جزيء صغير أو مستضد كنوع الحمولة

  1. جزيء صغير
    1. احتضان polybubbles مع acriflavine مركز في 400 ميكرولتر من الفوسفات المالحة العازلة (PBS) في 37 درجة مئوية، 50 درجة مئوية لبولي بوببلس PLGADA وعند 37 درجة مئوية، 50 درجة مئوية، 70 درجة مئوية لPCL / PCLTA polybubbles.
      ملاحظة: السبب الذي ونوصي بإجراء اختبار فوق درجات حرارة الجسم هو أ) محاكاة درجة الحرارة (50 درجة مئوية) التي يصل فيها البولي بوبل أثناء بالليزر على نانورود الذهب (AuNRs) داخل PCL وPLGA. و ب) تسريع عملية التحلل من PCL (50 درجة مئوية، 70 درجة مئوية).
    2. في كل نقطة زمنية، وجمع سراويل واستبدالها مع 400 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني جديد.
    3. استخدام قارئ لوحة لتحديد كثافة الفلوريسنس في عظمى جمعها.
      ملاحظة: استخدام ex/em من 416 نانومتر/514 نانومتر ل acriflavine.
  2. Antigen
    1. احتضان polybubbles مع محورها بولفين الألبومين المصل (BSA)-488 في 400 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني في 37 درجة مئوية، 50 درجة مئوية لبولي بوببلس PLGADA وعند 37 درجة مئوية، 50 درجة مئوية لPCL / PCLTA polybubbles.
    2. في كل نقطة زمنية، وجمع عظمى واستبدالها مع 400 μL برنامج تلفزيوني جديد.
    3. استخدام قارئ لوحة لتحديد كثافة الفلوريسنس في عظمى جمعها. استخدام السابقين / م من 497 نانومتر/520 نانومتر لBSA-488.
      ملاحظة: لا ينبغي إجراء دراسة الافراج عند 70 درجة مئوية لبولي بوبل PCL/PCLTA لتجنب تعريض المستضد لدرجة حرارة قصوى.

7- السمية

  1. قياس محتوى الكلور في polybubbles باستخدام تحليل تنشيط النيوترون (NAA)
    1. استخدام polybubbles التي تم lyophilized ل 2، 4، 6، 20، و 24 h لهذه الدراسة في 0.010 mBar فراغ وعند -85 درجة مئوية.
    2. قياس 5-9 ملغ من polybubbles ووضعها على قارورة الإشعاع LDPE.
    3. إعداد 1000 غرام / مل من محلول معايرة الكلور من المعهد الوطني للمعايير والتكنولوجيا (NIST) - حل المعايرة التي يمكن تتبعها.
    4. استخدام 1- ميغاوات مفاعل تريغا لتنفيذ الإشعاعات النيوترونية على كل عينة بمعدل فلونس نيوتروني قدره 9.1 ×10 12 /سم2·s ل 600 s.
    5. نقل polybubbles إلى قنينات غير المشعة.
    6. استخدم كاشف HPGe للحصول على أطياف أشعة غاما لمدة 500 s بعد فواصل تحلل 360 s.
    7. استخدام برنامج NAA من قبل كانبيرا للصناعات لتحليل البيانات.
  2. تحديد كمية محتوى الكلور الصادر من polybubbles باستخدام NAA
    1. احتضان polybubbles التي تم التجميل بين عشية وضحاها (في 0.010 مل 0 فراغ في 85 درجة مئوية) في 400 μL من برنامج تلفزيوني في 37 درجة مئوية.
    2. جمع اادفع في الأسابيع 1 و 2 و 3 بعد الحضانة.
    3. تحليل المواد الفائقة لمحتوى الكلور باستخدام NAA باستخدام نفس الأسلوب كما هو موضح أعلاه في الخطوة 7.1.

8. أو إنر التوليف من قبل كيتلر، S.، وآخرون8

  1. تحضير محلول البذر AuNR عن طريق خلط 250 ميكرولتر من 10 mM حمض الكلوروواريك (HAuCl4)،7.5 مل من 100 M 100 بروميد التريتيمونيوم (CTAB)، و 600 ميكرولتر من 10 mM الجليد البارد بوروهيدريد (NaBH4).
  2. تحضير حل النمو عن طريق خلط 40 مل من 100 mM CTAB، 1.7 مل من 10 مل HAuCl4،250 μL من نترات الفضة (AgNO3)،و 270 μL من 17.6 ملغ / مل حمض الاسكوربيك إلى أنبوب.
  3. مزيج بقوة 420 ميكرولتر من حل البذور مع حل النمو في 1200 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة. ثم اترك الخليط دون عائق ليتفاعل لمدة 16 ساعة.
  4. إزالة الكواشف الزائدة من الخليط عن طريق الطرد المركزي في 8000 × غرام لمدة 10 دقيقة والتخلص من supernatant.

9 - إضفاء التحلل من الفلوروفيك على الـ AuNRs من قبل سليمان، و M.G.، وآخرون9

  1. ضبط درجة حَسّة 1.5 مل من الـ CTAB-استقرت في الـ 10 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم 1 mM (NaOH).
  2. حرك الحل مع 0.1 مل من 0.3 mM الميثيليد PEG (mPEG) thiol في 400 دورة في الدقيقة بين عشية وضحاها.
  3. مزيج PEGylated AuNRs مع 0.4 M دوديسيلامين (DDA) في الكلوروفورم في 500 دورة في الدقيقة لمدة 4 أيام.
  4. Pipet خارج الطبقة العضوية العلوية التي تحتوي على AuNRs hydrophobicized وتخزينها في 4 درجة مئوية حتى الاستخدام في المستقبل.

10. NIR تفعيل polybubbles

  1. اخلطي البوليمر (PLGADA أو PCL/PCLTA) مع محلول AuNRs المضروب في 1:9 (vol/vol).
  2. إضافة الضوئيات إلى البوليمر-أورار خليط في 0.005:1 (vol/vol).
  3. شكل polybubbles عن طريق حقن خليط البوليمر-أورار في 0.92 مل قارورة زجاجية مع 10٪ CMC (wt/vol) (الرجوع إلى الخطوة 2).
  4. علاج polybubbles في 254 نانومتر الطول الموجي لمدة 60 s في 2 W / cm2.
  5. فلاش تجميد في النيتروجين السائل لمدة 30 s وlyophilize بين عشية وضحاها في 0.010 mBar فراغ وعند -85 درجة مئوية.
  6. فصل polybubbles المجففة باستخدام ملقط وغسلها مع DI المياه لإزالة أي CMC المتبقية.
  7. احتضان polybubbles في 400 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني في 37 درجة مئوية.
  8. تفعيل polybubbles باستخدام 801 نانومتر NIR الليزر في 8A لمدة 5 دقائق كل يوم اثنين والأربى والجمعة.
  9. اتخاذ الأشعة تحت الحمراء التطلعية (FLIR) صور من polybubble قبل وبعد تنشيط الليزر للحصول على قيم درجة الحرارة.
  10. حساب الاختلافات في درجة الحرارة بين قبل وبعد تنشيط الليزر على أساس قيم درجة الحرارة من الصور FLIR.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وتتميز polybubbles على نطاق واسع باستخدام SEM وNAA. تم تمركز البضائع بنجاح لنتيجة في إطلاق انفجار تأخر. كما تم تنشيط بوليسات متعددة بنجاح بالليزر بسبب وجود AuNRs داخل polybubbles.

توصيف polybubble
أدى polybubbles حقنها في محلول مائي دون CMC في بولبوبل بالارض بسبب ملامستها مع الجزء السفلي من الزجاج القارورة (الشكل 1A, B). لوحظ التسطيح الجزئي عندما تم استخدام محلول مائي قائم على CMC 5٪ بدلاً من ماء DI(الشكل 1C). في وقت لاحق، 10٪ حل مائي CMC في الزجاج الزجاج أدى إلى polybubble علقت في الحل، وبالتالي الصيانة الناجحة للتجميل من polybubble(الشكل 1D).

تركز البضائع
البضائع حقن في polybubble في غياب CMC أدى إلى تسرب مما تسبب في عدم الاحتفاظ البضائع داخل polybubble (الشكل 3). ولمواجهة هذا التحدي، تم استخدام نهجين: 1) تم بنجاح زيادة لزوجة PCLTA باستخدام K2CO3 الذي تم عزله بعد إنهاء PCL triol مع ترياكريلات(الشكل 2) ، و 2) تم زيادة لزوجة البضائع بنجاح بعد خلط البضائع مع 5٪ CMC (الشكل 3، الشكل 4). اللزوجة من polybubbles PLGADA كانت كافية لتسهيل تمركز البضائع وبالتالي لم يتم تعديل باستخدام K2CO3.

وظيفة المستضد
تم خلط فيروس نقص المناعة البشرية gp120/41 مستضد مع وبدون تريهالوس قبل حقنه في polybubble(الشكل 5). لوحظت كفاءة الربط للجسم المضاد للمستضد (الذي يطلق عليه وظيفة) مع وبدون تريهالوس أنه ليس هناك فرق مهم إحصائياً.

دراسات الإصدار بدون تنشيط الليزر
وقد لوحظت إصدارات انفجار تأخر في بوليبوببل PLGADA مع acriflavine في منتصف في أيام 19 و 5 لبولي بوبلز المحتضنة في 37 درجة مئوية(الشكل 6A) و 50 درجة مئوية(الشكل 6B) على التوالي. كما لوحظت إطلاقات انفجار تأخر في بوليبوببلات PCL/PCLTA مع acriflavine في منتصف في أيام 160 و 60 لبولي بوبليز المحتضنة في 50 درجة مئوية (الشكل 7A) و 70 درجة مئوية(الشكل 7B) على التوالي. وقد أجريت هذه الدراسات الإفراج في غياب الـ AuNRs القابلة للتفعيذ بالليزر.

في المختبر تنشيط الليزر من polybubbles
Polybubbles مع AuNRs في قذيفة تم تنشيطها بنجاح الليزر عدة مرات في polybubbles PLGADA (الشكل 8A) وPCL / PCLTA polybubbles (الشكل 8B). وكانت التغيرات في درجة الحرارة من قبل وبعد تنشيط الليزر 10 ± 1 °C و 5 ± 1 °C في بوليبوببل PCL/PCLTA مع تركيز أعلى وأقل في القذيفة، على التوالي. وكانت التغيرات في درجة الحرارة لوحظ قبل وبعد تنشيط الليزر 11 ± 2 درجة مئوية و 6 ± 1 درجة مئوية في بوليبوببل PLGADA مع تركيز أعلى وأقل AUNR في وعاء، على التوالي.

Figure 1
الشكل 1: الحفاظ على كروية من polybubbles. صور SEM من (A) 14 كيلو Da PCL/300 Da PCLTA بالارض polybubble بسبب ملامسة polybubble مع الجزء السفلي من الزجاج القارورة؛ (ب) 14 كيلو Da PCL/300 Da PCLTA polybubble من أعلى لم يكن على اتصال مع القاع الزجاجي؛ (C) بوليبوببل PCL/PCLTA مع درجة أقل من التسطيح عند حقنها في محلول CMC 5% مقارنة بمحلول DI المائي، مما تسبب في تشكيل شكل يشبه نصف الكرة عند نقطة الاتصال مع القارورة؛ (D)polybubble التي لم تصل إلى الجزء السفلي من الزجاج قارورة عند حقنها في حل CMC 10٪ ، مما يسمح للشكل كروية للحفاظ على. جميع أشرطة المقياس المشار إليها هي 500 ميكرومتر. وقد تم تعديل هذا الرقم من لي وآخرون7. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: تعديل لزوجة PCLTA. وقد زيد تركيز3 CO2K 0 إلى 80 ملغ/مل في PCLTA ولوحظ أن اللزوجة الديناميكية تزداد بالتناسب مع تركيز K2CO3. وقد تم تعديل هذا الرقم من أرون كومار وآخرون10. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: حقن البضائع في polybubble مع وبدون CMC. لوحة أعلى يظهر الإطارات المستخرجة من شريط فيديو لتسرب البضائع أثناء الحقن في غياب CMC. لوحة أسفل يظهر الإطارات المستخرجة من الفيديو من احتجاز البضائع داخل polybubble في وجود 5٪ CMC. وقد تم تعديل هذا الرقم من لي وآخرون7. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: البضائع المركزة.. صور المجهر الفلورسنت من (A) PCL / PCLTA polybubble مع البضائع المركزة، (B) PCL / PCLTA polybubble مع البضائع في قذيفة وصبغة غير الفلورسنت المركزة. وقد تم تعديل هذا الرقم من أرون كومار وآخرون10. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: وظيفة المستضد مع تريهالوس. تم تحليل وظيفة من فيروس نقص المناعة البشرية gp120/41 مع وبدون تريهالوس داخل polybubble باستخدام ELISA. تعتبر الكفاءة الملزمة للجسم المضاد للبروتين بشكل عام مؤشرًا لوظائف البروتين. عندما نناقش وظيفة المستضد في هذه الدراسة، ونحن نعتزم أن يعني أنه يساعد الأجسام المضادة ربط البروتين من الفائدة (وهو مؤشر لوظائف البروتين). ولم يلاحظ أي دلالة إحصائية بين المجموعتين. يتم الإشارة إلى فواصل الثقة بواسطة خطوط صلبة ومنقطة. وقد تم تعديل هذا الرقم من لي وآخرون7. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: تأخر إطلاق سراح انفجار من polybubbles PLGADA. دراسات الافراج عن يظهر تأخر إطلاقات انفجار من polybubbles PLGADA مع acriflavine في الوسط في (A) 37 درجة مئوية ، (B) 50 درجة مئوية. يشير الخط الصلب إلى المنحنى المجهز الذي تم الحصول عليه استنادًا إلى نقاط البيانات. وقد تم تعديل هذا الرقم من أرون كومار وآخرون10. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7: تأخر إطلاق الإنفجار من بوليبوببلات PCL/PCLTA. دراسات الافراج عن يظهر تأخر إطلاقات انفجار من بوليبوبات PCL/PCLTA مع acriflavine في الوسط عند (A) 50 درجة مئوية ، (B) 70 درجة مئوية.  وقد تم تعديل هذا الرقم من أرون كومار وآخرون10. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 8
الشكل 8: NIR تفعيل الليزر من polybubbles. تغير درجة الحرارة لوحظ قبل وبعد تنشيط الليزر NIR في (A) PLGADA polybubbles ، (B) PCL / PCLTA polybubbles مع تركيز أعلى وأقل من AuNRs في قذيفة البوليمر. ويمكن الاستفادة من هذه الزيادة في درجة الحرارة للتعجيل المحتمل في تدهور البوليمر مما يؤدي إلى إطلاق البضائع في وقت مبكر. وقد تم تعديل هذا الرقم من أرون كومار وآخرون10. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

التكنولوجيات والتحديات الحالية
يشيع استخدام الجسيمات الدقيقة والنانوية القائمة على المستحلب كناقلات توصيل المخدرات. على الرغم من أن حركية الإفراج عن البضائع من هذه الأجهزة قد درست على نطاق واسع، والسيطرة على حركية إطلاق انفجار كان تحديا كبيرا11. كما أن براعة الشحن ومدى قدرتها الوظيفية محدودان في النظم القائمة على المستحلب بسبب تعرض البضائع للمذيبات الزائدة المائعة والعضوية. البضائع القائمة على البروتين غالبا ما تكون غير متوافقة مع الجسيمات الدقيقة والنانوية بسبب إمكانية التككر البضائع وتجميع12. وبالإضافة إلى استقرار البضائع، تكتسي حركية البضائع أهمية خاصة في سياق اللقاحات نظراً للحاجة إلى الجرعات المعززة التي تؤدي إلى تحويل المصل. ولم تنجح الجهود السابقة للتصدي لهذه التحديات في مجال إيصال اللقاحات بما فيه الكفاية، حيث أن فكرة أنظمة لقاح الحقن الواحد موجودة منذ عقدين ولم تترجم بعد سريرياً.

يمكن لمنصة توصيل اللقاحات متعددة البوبات لدينا التغلب على التحديات مع زيادة تعرض البضائع للمذيبات العضوية من خلال تقليل حجم البضائع المكشوفة. ويمكن لهذه التكنولوجيا أن تستوعب على الأقل اثنين من مقصورات البضائع: البضائع في قذيفة والبضائع في المركز. Polybubbles مع البضائع المركزة يمكن استخدامها للسيطرة على إطلاق انفجار من البضائع في حين يجري متوافق مع أنواع مختلفة من البضائع، بما في ذلك جزيئات صغيرة ومضاد. في هذه الدراسة، استخدمنا البوليسترات مع أوقات تدهور متفاوتة، PLGADA (أقصر وقت تدهور) و PCL/PCLTA (وقت أطول تدهور)، كما ناقلات البوليمر و acriflavine (جزيء صغير) كنوع البضائع لإثبات تأخر إطلاق انفجار. في الأقسام التالية، نُصف الخطوات الحاسمة في تشكيل polybubbles القادرة على تمكين كل من إطلاق الإنفجار المتأخر وتفعيل NIR، خاصة بالنسبة لتطبيقات التسليم المستقبلية عند الطلب.

البضائع تتمحور داخل polybubble
وكان تركز البضائع أحد التحديات الكبيرة التي واجهت أثناء صياغة polybubbles. مباشرة بعد الحقن، والبضائع سوف تهاجر إلى السطح وجيب البضائع سوف تستقر دون انفجار في محلول CMC مائي 10٪. Polybubbles مع هذه البضائع off-محورها يمكن أن يؤدي إلى الإفراج في وقت سابق بسبب سمك غير موحدة من البوليمر المحيطة البضائع. وهكذا كان تعديل لزوجة البوليمر والبضائع أمرا حاسما في حل المسائل المتعلقة بالتمركز في البضائع. تم زيادة اللزوجة من البضائع عن طريق خلط حل البضائع مع 5٪ CMC. لزيادة لزوجة البوليمر، كان من الممكن تعديل الوزن الجزيئي للبوليمر. ومع ذلك، فإن زيادة الوزن الجزيئي غالباً ما يؤدي إلى تدهور أبطأ للبوليمرات مما يتسبب في مزيد من التأخير في إطلاق البضائع. وبالتالي تم تعديل لزوجة البوليمر عن طريق زيادة تركيز البوليمر. وكان التركيز العالي (1000 ملغ/مل) كافياً لزيادة لزوجة PLGADA. غير أن لزوجة PCL/PCLTA غير كافية للاحتفاظ بالبضائع في الوسط. وهكذا، K2CO3 التي تم عزلها بعد رد فعل endcapping PCLTA تم استخدامها لزيادة لزوجة PCLTA.

إصدار تأخر الرواية
ولوحظ تأخر إطلاق الانفجار من دراسات الإفراج التي أجريت باستخدام polybubbles مع البضائع تركزت. تم استخدام جزيء صغير (acriflavine) كما البضائع تركزت في polybubbles لدراسة الملف الشخصي الإفراج. وقد لوحظت ملامح الإطلاق الفريدة استناداً إلى البوليستر المستخدم بسبب الاختلاف في وقت التحلل في البوليمرات. وقد لوحظ إطلاق انفجار في وقت سابق في بولي بوبل PLGADA مقارنة مع ذلك من PCL / PCLTA polybubbles. وقد لوحظ الإفراج عن البضائع في وقت مبكر في polybubbles PLGADA لأن PLGA يتحلل أسرع مقارنة PCL13. عند التعديل الناجح لحركيات الإطلاق مع نوعين من البوليسترات ، أردنا كذلك هندسة polybubble لتمكين الافراج عن البضائع عند الطلب.

NIR تفعيل polybubbles
عند الطلب الإفراج عن البضائع فيما يتعلق توقيت احتياجات المرضى كان تحديا لتحقيق استخدام استراتيجيات التسليم الحالية14. افترضنا أن تسريع إطلاق البضائع عند الطلب يمكن أن يكون ممكناً عن طريق تسريع تدهور البوليمر من خلال استخدام عوامل حساسة لـ NIR (أي تمكين الثيرانوستيك). وقد تم دراسة AuNRs على نطاق واسع لقدرتها على أن تكون نشطة باستخدام الليزر NIR التي يمكن أن تقطع بضعة سنتيمترات من خلال الجلد15. وهكذا تم إعداد AuNRs المستقرة من قبل CTAB بناءً على البروتوكول بواسطة Kittler و S وآخرون، وتم اَدَرها بالماء على أساس الطرق التي نشرتها Solimon, M.G. وآخرون. ثم تم إشعاع polybubbles مع AuNRs مسعور في قذيفة مع الليزر NIR في النقاط الزمنية المطلوبة لمدة 5 دقائق لمراقبة تغير درجة الحرارة. تم قياس درجات الحرارة قبل وبعد الليزر بناء على صور FLIR. ساعد شل البوليمر المعالجة في الحفاظ على شكل AuNRs أثناء تنشيط الليزر مما مكن من تنشيط NIR متعددة من polybubbles. هذه هي ملاحظة مثيرة للاهتمام لأنه في الأدب السابق ، كان من المعروف في كثير من الأحيان AuNRs لتفقد شكلها مثل قضيب (حاسمة لتفعيل NIR) بسبب تنشيط الليزر16. يمكن أن يمهد تنشيط الليزر الناجح للبولي بوبل مع AuNRs الطريق للتحكم في إطلاق البضائع حسب الطلب في الجيل القادم من polybubbles.

الأهمية والتطبيقات المستقبلية
وهكذا تظهر النتائج التي تم الحصول عليها من هذه الدراسة أن الوباءات المتعددة لديها القدرة على استخدامها كمنصة جديدة لتوصيل اللقاح. كما أن إعداد الـ polybubbles الموصوف في هذه الورقة سوف يمكّن الباحثين الآخرين من استخدام الـ polybubbles كمنصة تسليم للتطبيقات العلاجية الأخرى. فعلى سبيل المثال، بالإضافة إلى توصيل اللقاح، يمكن أيضاً استخدام الـ polybubbles في توصيل عوامل علاجية تآزرية مع حركية إطلاق مختلفة. وعلاوة على ذلك، مصنوعة من البولي بوبل البوليسترات التي هي قابلة للتحلل، وقد استخدمت في العديد من الأجهزة الطبية التي وافقت عليها ادارة الاغذية والعقاقير. كما قمنا بالتحقق من سلامة polybubbles من خلال إظهار أن الكلور الذي يطلق من polybubbles هي في حدود مستويات السلامة التي أوصت بها وكالة حماية البيئة17. وهكذا، لدينا رواية، عن طريق الحقن، للأشعة فوق البنفسجية للشفاء منصة polybubble لديه القدرة على استخدامها كمنصة آمنة وفعالة لتسليم المخدرات لمجموعة متنوعة من أنواع البضائع.

قيود هذه التكنولوجيا
ويمكن استخدام تكنولوجيا منصة البولي بوبل كمنصة لإيصال اللقاح التي يحتمل أن تمكن من الافراج عن النفايات الخاضعة للرقابة. تسلط دراساتنا الضوء على تعدد استخدامات هذه المنصة القادرة على تقديم أنواع مختلفة من البضائع، بما في ذلك المستضدات والجزيئات الصغيرة. غير أن أحد القيود الحالية لهذه التكنولوجيا هو أن الحمولة تُحقن يدويا في الوقت الراهن. لأغراض التحجيم، نقوم حالياً بهندسة منصة آلية من شأنها أن تمكن من حقن (أي كصفيف) من البضائع داخل البولي بوبل، ومن المحتمل أن تساعد في تخفيف المخاوف المتعلقة بإمكانية ترجمة هذه التكنولوجيا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

نود أن نشكر الدكتور بريان E. توملين التابعة لمختبر التحليل عنصري داخل قسم الكيمياء في TAMU الذي ساعد في تحليل تنشيط النيوترونات (NAA).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-Step Ultra Tetramethylbezidine (TMB)-Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Substrate Solution Thermo scientific 34028
2-Hydroxy-2-methylpropiophenone TCI AMERICA H0991
450 nm Stop Solution for TMB Substrate Abcam ab17152
Acryloyl chloride Sigma Aldrich A24109-100G
Acriflavine Chem-Impex International 22916
Anhydrous ethyl ether Fisher Chemical E138-500
Anti-HIV1 gp120 antibody conjugated to horseradish peroxidase (HRP)
Bovine serum albumin (BSA) Fisher BioReagents BP9700100
BSA-CF488 dye conjugates Invitrogen A13100
Bromosalicylic acid Acros Organics AC162142500
Carboxymethylcellulose (CMC) Millipore Sigma 80502-040
Centrimonium bromide (CTAB) MP Biomedicals ICN19400480
Chloroform Fisher Chemical C2984
Coating buffer Abcam ab210899
Dichloromethane (DCM) Sigma Aldrich 270997-1L
Diethyl ether Fisher Chemical E1384
Dodeacyl Amine Acros Organics AC117665000
Doxorubicin hydrochloride Fisher BioReagents BP251610
L-ascorbic acid Acros Organics A61 100
Legato 100 Syringe Pump KD Scientific 14 831 212
mPEG thiol Laysan Bio NC0702454
Nonfat dry milk Andwin Scientific NC9022655
Potassium carbonate Acros Organics AC424081000
Phosphate saline buffer Fisher BioReagents BP3991
(Poly(caprolactone) Sigma Aldrich 440744-250G
(Poly(caprolactone) triol Acros Organics AC190730250
Poly (lactic-co-glycolic acid) diacrylate CMTec 280050
Potassium carbonate Acros Organics AC424081000
Recombinant HIV1 gp120 + gp41 protein Abcam ab49054
Silver nitrate Acros Organics S181 25
Sodium borohydride Fisher Chemical S678 10
Tetrachloroauric acid Fisher Chemical G54 1
Trehalose Acros Organics NC9022655
Triethyl amine Acros Organics AC157910010

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. World Health Organization. Global Immunization: Worldwide Disease Incidence. , Children's Hospital of Philadelphia. https://www.chop.edu/centers-programs/vaccine-education-center/global-immunization/diseases-and-vaccines-world-view (2018).
  2. Paul, A., Bera, M., Gupta, P., Singh, N. D. P. o-Hydroxycinnamate for sequential photouncaging of two different functional groups and its application in releasing cosmeceuticals. Organic and Biomolecular Chemistry. 17 (33), 7689-7693 (2019).
  3. Kumari, A., Yadav, S. K., Yadav, S. C. Biodegradable polymeric nanoparticles based drug delivery systems. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 75 (1), 1-18 (2010).
  4. Dai, C., Wang, B., Zhao, H. Microencapsulation peptide and protein drugs delivery system. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 41 (2-3), 117-120 (2005).
  5. Souery, W. N., et al. Controlling and quantifying the stability of amino acid-based cargo within polymeric delivery systems. Journal of Control Release. 300, 102-113 (2019).
  6. Wang, W. Advanced protein formulations. Protein Science. 24 (7), 1031-1039 (2015).
  7. Lee, J., et al. An ultraviolet-curable, core-shell vaccine formed via phase separation. Journal of Biomedical Materials Research Part A. , (2019).
  8. Kittler, S., Hickey, S. G., Wolff, T., Eychmüller, A. Easy and Fast Phase Transfer of CTAB Stabilised Gold Nanoparticles from Water to Organic Phase. Zeitschrift für Physikalische Chemie. 229, 235 (2015).
  9. Soliman, M. G., Pelaz, B., Parak, W. J., del Pino, P. Phase Transfer and Polymer Coating Methods toward Improving the Stability of Metallic Nanoparticles for Biological Applications. Chemistry of Materials. 27 (3), 990-997 (2015).
  10. Arun Kumar, S., Good, J., Hendrix, D., Yoo, E., Kim, D., Deo, K. A., Jhan, Y. Y., Gaharwar, A. K., Bishop, C. J. Nanoengineered Light-Activatable Polybubbles for On?Demand Therapeutic Delivery. Adv. Funct. Mater. , 2003579 (2020).
  11. Wuthrich, P., Ng, S. Y., Fritzinger, B. K., Roskos, K. V., Heller, J. Pulsatile and delayed release of lysozyme from ointment-like poly(ortho esters). Journal of Controlled Release. 21 (1), 191-200 (1992).
  12. Wang, W. Instability, stabilization, and formulation of liquid protein pharmaceuticals. International Journal of Pharmaceutics. 185 (2), 129-188 (1999).
  13. Wong, D. Y., Hollister, S. J., Krebsbach, P. H., Nosrat, C. Poly(epsilon-caprolactone) and poly (L-lactic-co-glycolic acid) degradable polymer sponges attenuate astrocyte response and lesion growth in acute traumatic brain injury. Tissue Engineering. 13 (10), 2515-2523 (2007).
  14. Davoodi, P., et al. Drug delivery systems for programmed and on-demand release. Advanced Drug Delivery Reviews. 132, 104-138 (2018).
  15. Huang, Y. C., Lei, K. F., Liaw, J. W., Tsai, S. W. The influence of laser intensity activated plasmonic gold nanoparticle-generated photothermal effects on cellular morphology and viability: a real-time, long-term tracking and monitoring system. Photochemical and Photobiological Sciences. 18 (6), 1419-1429 (2019).
  16. Link, S., Burda, C., Nikoobakht, B., El-Sayed, M. A. Laser-Induced Shape Changes of Colloidal Gold Nanorods Using Femtosecond and Nanosecond Laser Pulses. The Journal of Physical Chemistry B. 104 (26), 6152-6163 (2000).
  17. U.S. Environmental Protection Agency. Chlorine. , https://www.epa.gov/sites/production/files/2016-09/documents/chlorine.pdf (2000).

Tags

علم الأحياء، الإصدار 164، لقاح حقنة واحدة، polybubble، مستودع البوليمر، الأمراض المعدية، NIR الحساسة، تأخر انفجار
إنتاج الأشعة تحت الحمراء القريبة الحساسة، منصة تسليم لقاح كور شل
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Arun Kumar, S., Lee, J., Bishop, C.… More

Arun Kumar, S., Lee, J., Bishop, C. J. Production of Near-Infrared Sensitive, Core-Shell Vaccine Delivery Platform. J. Vis. Exp. (164), e60569, doi:10.3791/60569 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter