Summary
Dit artikel beschrijft de protocollen die worden gebruikt om een nieuw vaccin levering platform te produceren, "polybubbles," om vertraagde burst release mogelijk te maken. Polyesters, waaronder poly(melk-co-glycolzuur) en polycaprolactone werden gebruikt om de polybubbles te vormen en kleine moleculen en antigeen werden gebruikt als lading.
Abstract
Strategieën voor de afgifte van vaccins die de blootstelling van lading aan organisch oplosmiddel kunnen beperken en tegelijkertijd nieuwe releaseprofielen mogelijk maken, zijn cruciaal voor het verbeteren van de vaccinatiedekking wereldwijd. Hier wordt een nieuwe injecteerbare, ultraviolet-te genezen en vertraagde burst release- waardoor vaccin levering platform genaamd polybubbles geïntroduceerd. Lading werd geïnjecteerd in polybubbles op basis van polyester die werden gevormd in 10% carboxymethycellulose-gebaseerde wateroplossing. Dit papier bevat protocollen om de bolvormige vorm van de polybellen te behouden en de plaatsing en retentie van de lading te optimaliseren om de hoeveelheid lading binnen de polybubbles te maximaliseren. Om de veiligheid te garanderen, werd het gechloreerde oplosmiddelgehalte binnen de polybubbles geanalyseerd met behulp van neutronenactiveringsanalyse. Release studies werden uitgevoerd met kleine moleculen als lading in de polybubble om vertraagde burst release te bevestigen. Om het potentieel voor on-demand levering van de lading verder te laten zien, werden gouden nanorods gemengd in de polymeerschaal om nabij-infraroodlaseractivering mogelijk te maken.
Introduction
Beperkte vaccinatie dekking resulteert in de dood van 3 miljoen mensen specifiek veroorzaakt door vaccin-vermijdbare ziekten1. Ontoereikende opslag- en transportomstandigheden leiden tot verspilling van functionele vaccins en dragen zo bij tot een verminderde wereldwijde vaccinatie. Bovendien veroorzaakt onvolledige vaccinatie als gevolg van het niet naleven van de vereiste vaccinschema's ook een beperkte vaccinatiedekking, met name in ontwikkelingslanden2. Meerdere bezoeken aan medisch personeel zijn vereist binnen de aanbevolen periode voor het ontvangen van booster shots, waardoor het percentage van de bevolking met volledige vaccinatie te beperken. Daarom is er behoefte aan het ontwikkelen van nieuwe strategieën voor gecontroleerde vaccinlevering om deze uitdagingen te omzeilen.
De huidige inspanningen voor de ontwikkeling van technologieën voor de levering van vaccins omvatten polymere systemen op basis van emulsie3,4. Vracht wordt echter vaak blootgesteld aan een grotere hoeveelheid organisch oplosmiddel die aggregatie en denaturatie kan veroorzaken, met name in het kader van op eiwitten gebaseerde lading5,6. We hebben een nieuw platform voor de levering van vaccins ontwikkeld, "polybubbles", dat mogelijk meerdere laadcompartimenten kan huisvesten terwijl het volume van de lading die wordt blootgesteld aan oplosmiddel7minimaliseert. Bijvoorbeeld, in onze polybubble core-shell platform, een cargo zak van diameter 0,38 mm (SEM) wordt geïnjecteerd in het midden van een 1 mm polybubble. In dit geval zou de oppervlakte van lading die aan organisch oplosmiddel wordt blootgesteld ongeveer 0,453 mm2bedragen . Na het overwegen van de verpakkingsdichtheid van bollen (microdeeltjes) in een bol (vrachtdepot), bedraagt het werkelijke volume van microdeeltjes (10 μm in diameter) die in het depot passen 0,17 mm3. Het volume van een microdeeltje is 5.24x10-8 mm3 en dus het aantal deeltjes microdeeltjes die het depot passen is ~ 3.2x106 deeltjes. Als elk microdeeltje 20 laadzakken heeft (als gevolg van dubbele emulsie) met een diameter van 0,25 μm, bedraagt het oppervlak van lading dat aan organisch oplosmiddel is blootgesteld 1274 mm2. Cargo depot binnen de polybubble zou dus ~ 2800-voudige minder oppervlakte blootgesteld aan organische oplosmiddel in vergelijking met die van organische oplosmiddel blootgestelde lading in microdeeltjes. Ons op polyester gebaseerde platform kan zo de hoeveelheid lading die aan organisch oplosmiddel wordt blootgesteld, verminderen, wat anders ladingaggreggregatie en instabiliteit kan veroorzaken.
Polybubbles worden gevormd op basis van fasescheiding principe waarbij het polyester in organische fase wordt geïnjecteerd in een waterige oplossing wat resulteert in een bolvormige zeepbel. Lading in de waterige fase kan vervolgens worden geïnjecteerd in het midden van de polybubble. Een andere laadruimte kan mogelijk worden bereikt binnen de polybubble door het mengen van een andere lading met het polymeer shell. De polybubble in dit stadium zal kneedbaar zijn en zal dan worden genezen om te resulteren in een solide polybubble structuur met lading in het midden. Sferische polybellen werden gekozen boven andere geometrische vormen om de laadcapaciteit binnen de polybubble te verhogen en tegelijkertijd de totale grootte van de polybubble te minimaliseren. Polybubbles met lading in het centrum werden gekozen om vertraagde burst release aan te tonen. Polybubbles werden ook opgenomen met nabij-infrarood (NIR)- gevoelig (d.w.z. theranostisch inschakelend) middel, namelijk gouden nanorods (AuNR), om een stijging van de temperatuur van de polybubbles te veroorzaken. Dit effect kan mogelijk een snellere afbraak vergemakkelijken en kan worden gebruikt voor het beheersen van kinetiek in toekomstige toepassingen. In dit artikel beschrijven we onze benadering van het vormen en karakteriseren van polybubbles, om vertraagde burst release van de polybubbles te bereiken, en om AuNR op te nemen in de polybubbles om NIR-activering te veroorzaken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Polycaprolacyone triacrylaat (PCLTA) synthese
- Droog 's nachts bij 50 °C in een open ronde bodemkolf van 200 mL 3,2 mL van 400 Da polycaprolacyone (PCL) bij 50 °C in een open ronde bodemkolf van 200 mL en K2CO3 in een glazen flacon bij 90 °C.
- Meng het triol met 6,4 mL dichloormethaan (DCM) en 4.246 g kaliumcarbonaat (K2CO3) onder argon.
- Meng 2,72 mL acryloylchloride in 27,2 mL DCM en voeg druppelsgewijs toe aan het reactiemengsel in de kolf van meer dan 5 min.
- Bedek het reactiemengsel met aluminiumfolie en laat het 24 uur ongestoord bij kamertemperatuur onder argon.
- Na 24 uur filtert u het reactiemengsel met behulp van een filterpapier op een Buchner trechter onder vacuüm om overtollige reagentia weg te gooien.
- Neerslagfiltraat vanaf stap 1.5 dat het afgetopte polymeer in diethylether in een 1:3 (vol/vol) en rotovape bij 30 °C bevat om de diethyther te verwijderen.
2. Vorming van de polybubble
OPMERKING: Het injecteren van polymeer in het gedeïoniseerde (DI) water zou ervoor zorgen dat de polybubbles naar de bodem van de flacon migreren, wat resulteert in een afgeplatte bodem. Gebruik 10% (wt/vol) carboxymethyl cellulose (CMC) vul de glazen flacon in plaats daarvan om te voorkomen dat polybubble afvlakking.
- Bereid 10% (wt/vol) CMC oplossing in DI water.
- Vul een 0,92 mL glazen flacon met 0,8 mL van 10% CMC met behulp van een 1 mL transfer pipet.
- Meng 1000 mg/mL van 14 kDa PCL in DCM en synthetiseer PCLTA in een 1:3 (vol/vol) voor een totaal volume van 200 μL of bereid 200 μL van 1000 mg/mL van 5 kDa poly (melkzuur-co-glycolzuur) diacrylaat (PLGADA) in chloroform.
- Meng het mengsel van 2 hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenon (fotoinitiator) met het polymeer (PLGADA of PCL/PCLTA) mengsel in 0,005:1 (vol/vol).
- Laad 200 μL polymeermengsel in een 1 mL glasspuit gemonteerd op een spuitpomp die is aangesloten op een roestvrijstalen buis met een binnendiameter van 0,016 inch.
- Gebruik een micromotor om de voorwaartse en achterwaartse beweging van de polymeerbuis te controleren om polymeer in de 10% CMC in de glasfuit te injecteren om de polybubble te vormen.
- Genees de polybellen onder ultraviolet (UV) op 254 nm golflengte voor 60 s bij 2 W/cm2.
- Flash bevriest de polybellen in vloeibare stikstof en lyofieliseren 's nachts op 0,010 mBar vacuüm en bij -85 °C.
- Scheid de polybellen van de gedroogde CMC met behulp van tangen en was de polybubbles met DI water om eventuele resterende CMC te verwijderen. Merk op dat andere polymeren waarschijnlijk kunnen worden gebruikt met wijzigingen om de release kinetiek te veranderen.
3. Modulatie van polybubble diameter
- Vul een 0,92 mL glazen flacon met 10% CMC met behulp van een 1 mL transfer pipet.
- Meng PCL/PCLTA in een 1:3 (vol/vol) met 1000mg/mL 14kDa PCL en synthetiseer PCLTA. Meng de fotoinitiator met polymeermengsel in een 0.005:1 (vol/vol).
- Laad het polymeermengsel in een 1 mL glazen spuit gemonteerd op een spuitpomp die is aangesloten op een roestvrijstalen buis met een binnendiameter van 0,016 inch.
- Gebruik een micromotor om de voorwaartse en achterwaartse beweging van de polymeerbuis te controleren om polymeer in de 10% CMC in de glasfuit te injecteren om de polybubble te vormen.
- Voor het verkrijgen van polybubbles met verschillende diameters, variëren dispensing tarief van 0,0005 tot 1 μL/s.
- Maak foto's van de flacon met de polybubbles met een wisselende diameter.
- Gebruik ImageJ om de diameter van de polybellen te kwantificeren en gebruik de grootte van de flacon als schaal.
4. Centreren van lading binnen polybubble
-
Modulatie van pcl/PCLTA viscositeit met K2CO3:
OPMERKING: De viscositeit van PLGADA hoeft niet te worden gewijzigd met K2CO3 omdat de viscositeit van 5 kDa PLAGDA bij 1000 mg/mL voldoende is om de lading te centreren.- Voeg K2CO3 (dat na de PCLTA-reactie geïsoleerd was) toe aan de PCLTA bij verschillende concentraties, waaronder 0 mg/mL, 10 mg/mL, 20 mg/mL, 40 mg/mL en 60 mg/mL.
- Meet de dynamische viscositeiten van de oplossingen door de schuifsnelheid te wijzigen van 0 naar 1000 1/s met behulp van rheomemetrie.
- Injecteer de lading handmatig in het midden (zie stap 4.2 om het vrachtmengsel voor te bereiden) van de polybellen die zijn gevormd met behulp van de PCL/PCLTA-oplossingen met verschillende concentraties K2CO3 (stap 4.1.1). Bepaal de optimale concentratie van K2CO3 door te observeren welke oplossing vanaf stap 4.1.1 kan leiden tot het vasthouden van de lading in het midden.
-
Centreren van de lading (reeds getoonde haalbaarheid met kleine moleculen) met CMC
- Meng de lading met 5% (wt/vol) CMC in een rotator 's nachts om de viscositeit van de lading te verhogen.
- Injecteer handmatig 2 μL vrachtmengsel in de polybubble en ga verder met UV-uitharding op 254 nm golflengte voor 60 s bij 2 W/cm2.
- Flash bevriest de polybubbles in vloeibare stikstof voor 30 s en lyofieliseren 's nachts op 0,010 mBar vacuüm en bij -85 °C.
- Scheid de polybellen van de gedroogde CMC met tangen en was met DI-water om eventuele resterende CMC te verwijderen.
- Snijd de polybubble in de helft en beeld de helften met behulp van confocale microscopie om ervoor te zorgen dat de lading is gecentreerd (verwijzen naar stap 6 voor excitatie en emissie golflengten gebruikt).
5. Vrachtformulering
OPMERKING: Polybubble formulering kan huisvesten verschillende soorten lading, waaronder kleine moleculen, eiwitten, en nucleïnezuren.
- Gebruik op basis van eerdere studies, in het geval van eiwitlading, excipiënten, waaronder polyethyleenglycol (PEG)6,polyvinylpyrrolidone (PVP) en glycopolymeren6 om de stabiliteit van eiwitten tijdens polybubbleformulering te verbeteren.
- Vorm polybubbles op basis van het protocol in stap 2.
- Bereid de antigeenoplossing voor door 17,11 g trehalose toe te voegen aan 625 μL HIV-gp120/41-antigeen.
- Injecteer handmatig 1 μL antigeenoplossing in het midden van de polybubble.
- Open polybellen op dag 0, 7, 14 en 21 en noteer de fluorescentie van antigeen met excitatie en emissiegolflengten respectievelijk 497 nm en 520 nm.
- Bepaal de functionaliteit van het antigeen met behulp van enzymgebonden immunosorbenttest (ELISA) en gebruik 5% vetvrije melk als blokkeringsbuffer.
6. Vrijgave van lading
LET OP: Klein molecuul of antigeen kan worden gebruikt als het ladingstype
-
Klein molecuul
- Incubate polybubbles with centered acriflavine in 400 μL fosfaatbuffer zout (PBS) bij 37 °C, 50 °C voor PLGADA polybubbles en bij 37 °C, 50 °C, 70 °C voor PCL/PCLTA polybubbles.
OPMERKING: De reden waarom we aanraden om boven lichaamstemperaturen te testen, is om a) de temperatuur (50 °C) te simuleren waarbij de polybubble reikt tijdens het laseren van de gouden nanorods (AuNRs) binnen PCL en PLGA; b) het afbraakproces van PCL (50 °C, 70 °C) versnellen. - Verzamel op elk moment de supernatants en vervang ze door 400 μL verse PBS.
- Gebruik een plaatlezer om de fluorescentieintensiteiten in de verzamelde supernatants te kwantificeren.
LET OP: Gebruik ex/em van 416 nm/514 nm voor acriflavine.
- Incubate polybubbles with centered acriflavine in 400 μL fosfaatbuffer zout (PBS) bij 37 °C, 50 °C voor PLGADA polybubbles en bij 37 °C, 50 °C, 70 °C voor PCL/PCLTA polybubbles.
-
Antigeen
- Incubate polybubbles with centered bovine albumin serum (BSA)-488 in 400 μL pbs at 37 °C, 50 °C for PLGA polybubbles and at 37 °C, 50 °C for PCL/PCLTA polybubbles.
- Verzamel op elk moment de supernatants en vervang ze door 400 μL verse PBS.
- Gebruik een plaatlezer om de fluorescentieintensiteiten in de verzamelde supernatants te kwantificeren. Gebruik ex/em van 497 nm/520 nm voor BSA-488.
OPMERKING: Releasestudie bij 70 °C voor PCL/PCLTA-polybubbles mag niet worden uitgevoerd om te voorkomen dat het antigeen wordt blootgesteld aan extreme temperatuur.
7. Toxiciteit
-
Kwantificeren van chloorgehalte in polybellen met behulp van neutronenactiveringsanalyse (NAA)
- Gebruik polybubbles die lyofiel zijn gemaakt voor 2, 4, 6, 20 en 24 uur voor deze studie op 0.010 mBar vacuüm en bij -85 °C.
- Meet 5-9 mg polybellen en plaats ze op LDPE-bestralingsflinry's.
- Bereid 1000 g/mL chloorkalibratieoplossing voor van het National Institute of Standards and Technology (NIST)-traceerbare kalibratieoplossing.
- Gebruik de Triga-reactor van 1 megawatt om neutronenbestralingen uit te voeren op elk monster bij neutronenfluentiesnelheid van 9,1 ×10 12 /cm2·s voor 600 s.
- Breng de polybellen over op niet-bestraalde flesjes.
- Gebruik HPGe detector om gamma-ray spectra te verkrijgen voor 500 s na 360 s verval intervallen.
- Gebruik NAA-software van canberra Industries om de gegevens te analyseren.
-
Kwantificeren van chloorgehalte vrijgegeven van polybubbles met behulp van NAA
- Incubeer polybellen die 's nachts lyofiel werden gelyofilitiseerd (bij 0,010 mBarvacuüm en bij -85 °C) in 400 μL PBS bij 37 °C.
- Verzamel de supernatants op week 1, 2 en 3 na incubatie.
- Analyseer de supernatants op chloorgehalte met behulp van NAA met behulp van dezelfde methode als hierboven beschreven in stap 7.1.
8. AuNR Synthese door Kittler, S., et al.8
- Bereid AuNR-zaaioplossing voor door 250 μL chlorauriczuur (HAuCl4),7,5 mL van 100 mM cetrimoniumbromiide (CTAB) en 600 μL van 10 mM ijskoud natriumbouride (NaBH4) te mengen.
- Bereid De groeioplossing voor door 40 mL van 100 mM CTAB, 1,7 mL van 10 mM HAuCl4, 250 μL zilvernitraat (AgNO3)en 270 μL van 17,6 mg/mL ascorbinezuur aan een buis te mengen.
- Meng krachtig 420 μL zaadoplossing met de groeioplossing bij 1200 tpm gedurende 1 min. Laat het mengsel vervolgens 16 uur ongestoord reageren.
- Verwijder de overtollige reagentia uit het mengsel door 8000 × g gedurende 10 minuten te centrifugeren en gooi het supernatant weg.
9. Hydrofobicization of AuNRs by Soliman, M.G., et al.9
- Pas de pH van 1,5 mL gesynthetiseerde CTAB-gestabiliseerde AuNRs aan op 10 met behulp van 1 mM natriumhydroxide (NaOH).
- Roer de oplossing met 0,1 mL van 0,3 mM gemethyleerde PEG (mPEG) thiol bij 400 rpm 's nachts.
- Meng PEGylated AuNRs met 0,4 M dodecylamine (DDA) in chloroform bij 500 rpm gedurende 4 dagen.
- Pipet uit de bovenste organische laag met hydrofobe AuNRs en bewaar op 4 °C tot toekomstig gebruik.
10. NIR-activering van polybellen
- Meng de polymeeroplossing (PLGADA of PCL/PCLTA) met hydrofobe AuNRs in een 1:9 (vol/vol).
- Voeg fotoinitiator toe aan het polymeer-AuNR mengsel in een 0.005:1 (vol/vol).
- Vorm polybellen door het polymeer-AuNR mengsel te injecteren in een 0,92 mL glazen flacon met 10% CMC (wt/vol) (zie stap 2).
- Cureer de polybubbles op 254 nm golflengte voor 60 s bij 2 W/cm2.
- Flash vries in vloeibare stikstof voor 30 s en lyofieliseren 's nachts op 0,010 mBar vacuüm en bij -85 °C.
- Scheid de gedroogde polybellen met tangen en was met DI-water om eventuele resterende CMC te verwijderen.
- Broed de polybellen in 400 μL PBS bij 37 °C.
- Activeer de polybubbles met behulp van 801 nm NIR laser op 8A gedurende 5 minuten elke maandag, woensdag en vrijdag.
- Neem toekomstgerichte infrarood (FLIR) beelden van de polybubble voor en na laseractivering om temperatuurwaarden te verkrijgen.
- Bereken temperatuurverschillen tussen voor en na laseractivering op basis van de temperatuurwaarden van de FLIR-afbeeldingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Polybubbles werden uitgebreid gekenmerkt met behulp van SEM en NAA. Cargo werd met succes gecentreerd om te resulteren in een vertraagde burst release. Polybubbles werden ook met succes laser-geactiveerd vanwege de aanwezigheid van AuNRs binnen de polybubbles.
Polybubble karakterisering
Polybubbles geïnjecteerd in een waterige oplossing zonder CMC resulteerde in een afgeplatte polybubble als gevolg van hun contact met de onderkant van de glazen flacon (Figuur 1A,B). Gedeeltelijke afvlakking werd waargenomen toen 5% cmc-gebaseerde waterige oplossing werd gebruikt in plaats van DI-water (figuur 1C). Vervolgens resulteerde 10% cmc-gebaseerde waterige oplossing in de glazen flacon in polybubble in de oplossing en dus succesvol onderhoud van de bolletje van de polybubble (figuur 1D).
Vracht centreren
Ladinginjectie in de polybubble bij afwezigheid van CMC resulteerde in lekkage waardoor geen lading in de polybubble (figuur 3) werd bewaard. Om deze uitdaging tegen te gaan, werden twee benaderingen gebruikt: 1) viscositeit van PCLTA werd met succes verhoogd met behulp van K2CO3 dat werd geïsoleerd na endcapping PCL triol met triacrylaat (Figuur 2), en 2) viscositeit van de lading werd met succes verhoogd na het mengen van de lading met 5% CMC (Figuur 3, Figuur 4). Viscositeit van de PLGADA polybubbles waren voldoende om de centrering van de lading te vergemakkelijken en werd dus niet gemoduleerd met K2CO3.
Antigeenfunctionaliteit
Hiv-huisarts120/41-antigeen werd gemengd met en zonder trehalose alvorens in de polybubble te injecteren (figuur 5). De bindende efficiëntie van antilichaam tegen het antigeen (aangeduid als functionaliteit) met en zonder trehalose werd waargenomen dat het statistisch significant verschil had.
Studies vrijgeven zonder laseractivering
Op dag 19 en 5 werden vertraagde uitbarstingen waargenomen bij PLGADA-polybubbles met acriflavine in het midden op respectievelijk dag 19 en 5 voor polybubbles die bij respectievelijk 37 °C (figuur 6A) en 50 °C (figuur 6B) werden geïncubeerd. Vertraagde burst releases werden ook waargenomen in PCL / PCLTA polybubbles met acriflavine in het midden op dagen 160 en 60 voor polybubbles geïncubeerd bij 50 °C (Figuur 7A) en 70 °C (Figuur 7B), respectievelijk. Deze release studies werden uitgevoerd in de afwezigheid van laser-activatable AuNRs.
In vitro laseractivering van polybubbles
Polybubbles met AuNRs in de schaal werden met succes meerdere keren geactiveerd in PLGADA polybubbles(figuur 8A) en PCL/PCLTA polybubbles (figuur 8B). Temperatuurveranderingen van vóór en na laseractivering waren respectievelijk 10 ± 1 °C en 5 ± 1 °C in PCL/PCLTA-polybubbles met een hogere en lagere AuNR-concentratie in de schaal. De temperatuurveranderingen die voor en na laseractivering werden waargenomen, waren respectievelijk 11 ± 2 °C en 6 ± 1 °C bij PLGADA-polybellen met een hogere en lagere AuNR-concentratie in de schaal.
Figuur 1: Behoud van de sfericiteit van polybubbles. SEM-afbeeldingen van (A) 14 kDa PCL/300 Da PCLTA afgeplatte polybubble als gevolg van het contact van polybubble met de onderkant van de glazen flacon; (B) 14 kDa PCL/300 Da PCLTA polybubble van de bovenkant die niet in contact was met de glazen bodem; (C) de PCL/PCLTA-polybellen met mindere mate van afvlakking wanneer het wordt geïnjecteerd in een 5% CMC-oplossing in vergelijking met di-wateroplossing, waardoor de vorming van hemisferische vorm op het punt van contact met de flacon wordt veroorzaakt; (D) polybubble die de bodem van de glazen flacon niet bereikte toen het in een 10% CMC-oplossing werd geïnjecteerd, waardoor de bolvormige vorm kan worden gehandhaafd. Alle aangegeven schaalbalken zijn 500 μm. Dit cijfer is gewijzigd van Lee et al.7. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Modulatie van pclta viscositeit. De concentratie K2CO3 werd verhoogd van 0 naar 80 mg/mL in PCLTA en de dynamische viscositeit werd waargenomen om proportioneel te stijgen met de concentratie K2CO3. Dit cijfer is gewijzigd van Arun Kumar etal. 10. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Ladinginjectie in de polybubble met en zonder CMC. Bovenste paneel toont frames uit de video van lading lekkage tijdens de injectie in de afwezigheid van CMC. Onderste paneel toont frames uit de video van lading retentie binnen de polybubble in aanwezigheid van 5% CMC. Dit cijfer is gewijzigd van Lee et al.7. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Gecentreerde lading. Fluorescerende microscoop beelden van (A) PCL / PCLTA polybubble met gecentreerde lading, (B) PCL / PCLTA polybubble met lading in de schaal en gecentreerd niet-fluorescerende kleurstof. Dit cijfer is gewijzigd van Arun Kumar etal. 10. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Antigeenfunctionaliteit met trehalose. De functionaliteit van HIV gp120/41 met en zonder trehalose binnen de polybubble werd geanalyseerd met behulp van ELISA. De bindende efficiëntie van een antilichaam tegen het eiwit wordt over het algemeen beschouwd als een indicator voor de functionaliteit van het eiwit. Wanneer we de functionaliteit van antigeen in deze studie bespreken, zijn we van plan om te betekenen dat het de antilichamen ondersteunt die het eiwit van belang binden (wat een indicator is voor eiwitfunctionaliteit). Tussen de twee groepen werd geen statistische significantie waargenomen. Betrouwbaarheidsintervallen worden aangegeven door vaste en gestippelde lijnen. Dit cijfer is gewijzigd van Lee et al.7. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: Vertraagde uitbarsting van PLGADA polybubbles. Releasestudies waaruit blijkt dat PLGADA-polybubbles met acriflavine in het midden bij (A) 37 °C, (B) 50 °C. Vaste lijn geeft de gemonteerde curve verkregen op basis van de gegevens punten. Dit cijfer is gewijzigd van Arun Kumar etal. 10. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 7: Vertraagde burst release van PCL / PCLTA polybubbles. Releasestudies waaruit blijkt dat er vertragingen vrijkomen bij PCL/PCLTA-polybubbles met acriflavine in het midden bij (A) 50 °C,(B) 70 °C. Dit cijfer is gewijzigd van Arun Kumar etal. 10. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 8: NIR-laseractivering van polybubbles. Temperatuurverandering waargenomen voor en na NIR laseractivering in (A) PLGADA polybubbles, (B) PCL/PCLTA polybubbles met hogere en lagere concentratie aunrs in de polymeerschaal. Deze temperatuurstijging kan worden benut om de aantasting van het polymeer mogelijk te versnellen, wat leidt tot een eerdere afgifte van de lading. Dit cijfer is gewijzigd van Arun Kumar etal. 10. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Huidige technologieën en uitdagingen
Emulsie-gebaseerde micro- en nanodeeltjes zijn vaak gebruikt als drug levering dragers. Hoewel de release kinetiek van de lading van deze apparaten zijn uitgebreid bestudeerd, het regelen van burst release kinetiek is een grote uitdaging11. De veelzijdigheid en functionaliteit van de lading zijn ook beperkt in emulsiesystemen als gevolg van de blootstelling van lading aan overtollige waterige en organische oplosmiddelen. Op eiwitten gebaseerde lading is vaak niet compatibel met micro- en nanodeeltjes vanwege de mogelijkheid van ladingverzadiging en aggregatie12. Naast de stabiliteit van de lading is ladingkinetiek vooral belangrijk in de context van vaccins vanwege de behoefte aan boostershots die leiden tot seroconversie. Eerdere inspanningen om deze uitdagingen op het gebied van de afgifte van vaccins aan te pakken, zijn onvoldoende succesvol geweest, aangezien het begrip vaccinsystemen met één injectie al een paar decennia bestaat en nog niet klinisch is vertaald.
Ons polybubble-vaccinleveringsplatform kan de uitdagingen mogelijk overwinnen met een verhoogde blootstelling van lading aan organisch oplosmiddel door het blootgestelde vrachtvolume te minimaliseren. Deze technologie is mogelijk geschikt voor ten minste twee laadruimtes: lading in de schaal en lading in het centrum. Polybubbles met gecentreerde lading kunnen worden gebruikt om de burst-release van de lading te controleren, terwijl ze compatibel zijn met verschillende ladingtypen, waaronder kleine moleculen en antigeen. In deze studie gebruikten we polyesters met verschillende afbraaktijden, PLGADA (kortere afbraaktijd) en PCL/PCLTA (langere afbraaktijd), als de polymeerdragers en acriflavine (klein molecuul) als het vrachttype om vertraagde burst-release aan te tonen. In de volgende secties beschrijven we de cruciale stappen in het vormen van polybubbles die zowel vertraagde burst release als NIR-activering mogelijk kunnen maken, vooral voor toekomstige on-demand leveringstoepassingen.
Vracht centreren binnen de polybubble
Cargo centering was een van de belangrijke uitdagingen die werd ondervonden tijdens de formulering van de polybubbles. Onmiddellijk na de injectie zou de lading migreren naar het oppervlak en de lading zak zou worden gestabiliseerd zonder barsten in de waterige 10% CMC oplossing. Polybubbles met dergelijke off-centered lading kan resulteren in een eerdere release als gevolg van de niet-uniforme dikte van het polymeer rond de lading. Het moduleren van de viscositeit van het polymeer en de lading was dus cruciaal bij het oplossen van problemen in verband met de centruminrichting van de lading. De viscositeit van de lading werd verhoogd door de ladingsoplossing te mengen met 5% CMC. Om de viscositeit van het polymeer te verhogen, had het molecuulgewicht van het polymeer kunnen worden gewijzigd. Echter, het verhogen van moleculair gewicht resulteert vaak in een tragere polymeer afbraak waardoor verdere vertraging in de lading release. De viscositeit van het polymeer werd dus gewijzigd door de concentratie van het polymeer te verhogen. Een hogere concentratie (1000 mg/mL) was voldoende om de viscositeit van PLGADA te verhogen. De viscositeit van PCL/PCLTA was echter niet voldoende om de lading in het midden te houden. Zo werd K2CO3 dat geïsoleerd werd na de endcapping reactie van PCLTA gebruikt om de viscositeit van PCLTA te verhogen.
Nieuwe vertraagde release
Vertraagde burst release werd waargenomen van de release studies uitgevoerd met behulp van de polybubbles met gecentreerde lading. Kleine molecule (acriflavine) werd gebruikt als gecentreerde lading in de polybubbles om het releaseprofiel te bestuderen. Unieke afgifteprofielen werden waargenomen op basis van het polyester dat werd gebruikt vanwege het verschil in de afbraaktijd van de polymeren. Burst release werd eerder waargenomen in PLGADA polybubbles in vergelijking met die van PCL / PCLTA polybubbles. Vroege lading release werd waargenomen in PLGADA polybubbles omdat PLGA degradeert sneller in vergelijking met PCL13. Na succesvolle modulatie van release kinetiek met twee soorten polyesters, wilden we verder de polybubble engineeren om mogelijk on-demand release van de lading mogelijk te maken.
NIR-activering van polybellen
On-demand release van de lading met betrekking tot de timing van de behoeften van de patiënten is een uitdaging om te bereiken met behulp van de huidige leveringsstrategieën14. We veronderstelden dat het versnellen van de lading release on-demand mogelijk zou kunnen zijn door het versnellen van de polymeer afbraak door het gebruik van NIR-gevoelige (dat wil zeggen, theranostische-enabling) agenten. AuNRs zijn uitgebreid onderzocht voor hun vermogen om te worden geactiveerd met behulp van NIR laser die kan reizen enkele centimeters door de huid15. CTAB-gestabiliseerde AuNRs werden dus opgesteld op basis van het protocol van Kittler, S, et al. en werden gehydrofbiciseerd op basis van de methoden gepubliceerd door Solimon, M.G., et al. Polybubbles met hydrofobe AuNRs in de schaal werden vervolgens bestraald met NIR laser op de gewenste tijdstippen gedurende 5 minuten om temperatuurverandering waar te nemen. Temperaturen voor en na de laser werden gemeten op basis van de FLIR-beelden. Uitgeharde polymeerschaal hielp de vorm van AuNRs tijdens de laseractivering te behouden, waardoor meerdere NIR-activeringen van polybubbles mogelijk werden. Dit is een interessante observatie omdat in eerdere literatuur, AuNRs zijn vaak bekend om hun staaf-achtige vorm te verliezen (cruciaal voor NIR activering) als gevolg van laser activering16. De succesvolle laser-activering van de polybubbles met AuNRs zou de weg kunnen effenen om on-demand release van de lading in de volgende generatie van polybubbles controle.
Betekenis en toekomstige toepassingen
De resultaten van deze studie tonen dus aan dat polybubbles het potentieel hebben om te worden gebruikt als een nieuw vaccin leveringsplatform. De voorbereiding van polybubbles beschreven in dit document zal andere onderzoekers verder in staat stellen om polybubbles te gebruiken als een leveringsplatform voor andere therapeutische toepassingen. Bijvoorbeeld, in aanvulling op de levering van vaccin, polybubbles kan ook potentieel worden gebruikt om de levering van synergetische therapeutische middelen met verschillende release kinetiek. Bovendien, polybubbles zijn gemaakt van polyesters die biologisch afbreekbaar zijn en zijn gebruikt in veel FDA-goedgekeurde medische hulpmiddelen. We hebben de veiligheid van polybellen verder gevalideerd door aan te tonen dat het chloor dat vrijkomt uit polybellen ruim binnen de door de EPA17aanbevolen veiligheidsniveaus ligt. Zo heeft ons nieuwe, injecteerbare UV-geneesbare polybubble platform het potentieel om te worden gebruikt als een veilig en effectief drug delivery platform voor een verscheidenheid aan ladingtypes.
Beperkingen van deze technologie
De polybubble platform technologie kan worden gebruikt als een vaccin levering platform potentieel waardoor gecontroleerde release. Onze studies benadrukken de veelzijdigheid van dit platform dat in staat is om verschillende ladingstypes te leveren, waaronder antigenen en kleine moleculen. Een van de huidige beperkingen van deze technologie is echter dat de lading momenteel handmatig wordt geïnjecteerd. Voor schaaldoeleinden zijn we momenteel bezig met het ontwikkelen van een geautomatiseerd platform dat injectie (d.w.z. als een array) van lading binnen de polybubble mogelijk maakt en mogelijk zal helpen de zorgen over de vertaalbaarheid van deze technologie te verlichten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We willen dr. Bryan E. Tomlin bedanken die verbonden is aan het elemental analysis lab binnen de afdeling chemie van TAMU die assisteerde bij de neutronenactiveringsanalyse (NAA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Step Ultra Tetramethylbezidine (TMB)-Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Substrate Solution | Thermo scientific | 34028 | |
| 2-Hydroxy-2-methylpropiophenone | TCI AMERICA | H0991 | |
| 450 nm Stop Solution for TMB Substrate | Abcam | ab17152 | |
| Acryloyl chloride | Sigma Aldrich | A24109-100G | |
| Acriflavine | Chem-Impex International | 22916 | |
| Anhydrous ethyl ether | Fisher Chemical | E138-500 | |
| Anti-HIV1 gp120 antibody conjugated to horseradish peroxidase (HRP) | |||
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher BioReagents | BP9700100 | |
| BSA-CF488 dye conjugates | Invitrogen | A13100 | |
| Bromosalicylic acid | Acros Organics | AC162142500 | |
| Carboxymethylcellulose (CMC) | Millipore Sigma | 80502-040 | |
| Centrimonium bromide (CTAB) | MP Biomedicals | ICN19400480 | |
| Chloroform | Fisher Chemical | C2984 | |
| Coating buffer | Abcam | ab210899 | |
| Dichloromethane (DCM) | Sigma Aldrich | 270997-1L | |
| Diethyl ether | Fisher Chemical | E1384 | |
| Dodeacyl Amine | Acros Organics | AC117665000 | |
| Doxorubicin hydrochloride | Fisher BioReagents | BP251610 | |
| L-ascorbic acid | Acros Organics | A61 100 | |
| Legato 100 Syringe Pump | KD Scientific | 14 831 212 | |
| mPEG thiol | Laysan Bio | NC0702454 | |
| Nonfat dry milk | Andwin Scientific | NC9022655 | |
| Potassium carbonate | Acros Organics | AC424081000 | |
| Phosphate saline buffer | Fisher BioReagents | BP3991 | |
| (Poly(caprolactone) | Sigma Aldrich | 440744-250G | |
| (Poly(caprolactone) triol | Acros Organics | AC190730250 | |
| Poly (lactic-co-glycolic acid) diacrylate | CMTec | 280050 | |
| Potassium carbonate | Acros Organics | AC424081000 | |
| Recombinant HIV1 gp120 + gp41 protein | Abcam | ab49054 | |
| Silver nitrate | Acros Organics | S181 25 | |
| Sodium borohydride | Fisher Chemical | S678 10 | |
| Tetrachloroauric acid | Fisher Chemical | G54 1 | |
| Trehalose | Acros Organics | NC9022655 | |
| Triethyl amine | Acros Organics | AC157910010 |
References
- World Health Organization. Global Immunization: Worldwide Disease Incidence. , Children's Hospital of Philadelphia. https://www.chop.edu/centers-programs/vaccine-education-center/global-immunization/diseases-and-vaccines-world-view (2018).
- Paul, A., Bera, M., Gupta, P., Singh, N. D. P. o-Hydroxycinnamate for sequential photouncaging of two different functional groups and its application in releasing cosmeceuticals. Organic and Biomolecular Chemistry. 17 (33), 7689-7693 (2019).
- Kumari, A., Yadav, S. K., Yadav, S. C. Biodegradable polymeric nanoparticles based drug delivery systems. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 75 (1), 1-18 (2010).
- Dai, C., Wang, B., Zhao, H. Microencapsulation peptide and protein drugs delivery system. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 41 (2-3), 117-120 (2005).
- Souery, W. N., et al. Controlling and quantifying the stability of amino acid-based cargo within polymeric delivery systems. Journal of Control Release. 300, 102-113 (2019).
- Wang, W. Advanced protein formulations. Protein Science. 24 (7), 1031-1039 (2015).
- Lee, J., et al. An ultraviolet-curable, core-shell vaccine formed via phase separation. Journal of Biomedical Materials Research Part A. , (2019).
- Kittler, S., Hickey, S. G., Wolff, T., Eychmüller, A. Easy and Fast Phase Transfer of CTAB Stabilised Gold Nanoparticles from Water to Organic Phase. Zeitschrift für Physikalische Chemie. 229, 235 (2015).
- Soliman, M. G., Pelaz, B., Parak, W. J., del Pino, P. Phase Transfer and Polymer Coating Methods toward Improving the Stability of Metallic Nanoparticles for Biological Applications. Chemistry of Materials. 27 (3), 990-997 (2015).
- Arun Kumar, S., Good, J., Hendrix, D., Yoo, E., Kim, D., Deo, K. A., Jhan, Y. Y., Gaharwar, A. K., Bishop, C. J. Nanoengineered Light-Activatable Polybubbles for On?Demand Therapeutic Delivery. Adv. Funct. Mater. , 2003579 (2020).
- Wuthrich, P., Ng, S. Y., Fritzinger, B. K., Roskos, K. V., Heller, J. Pulsatile and delayed release of lysozyme from ointment-like poly(ortho esters). Journal of Controlled Release. 21 (1), 191-200 (1992).
- Wang, W. Instability, stabilization, and formulation of liquid protein pharmaceuticals. International Journal of Pharmaceutics. 185 (2), 129-188 (1999).
- Wong, D. Y., Hollister, S. J., Krebsbach, P. H., Nosrat, C. Poly(epsilon-caprolactone) and poly (L-lactic-co-glycolic acid) degradable polymer sponges attenuate astrocyte response and lesion growth in acute traumatic brain injury. Tissue Engineering. 13 (10), 2515-2523 (2007).
- Davoodi, P., et al. Drug delivery systems for programmed and on-demand release. Advanced Drug Delivery Reviews. 132, 104-138 (2018).
- Huang, Y. C., Lei, K. F., Liaw, J. W., Tsai, S. W. The influence of laser intensity activated plasmonic gold nanoparticle-generated photothermal effects on cellular morphology and viability: a real-time, long-term tracking and monitoring system. Photochemical and Photobiological Sciences. 18 (6), 1419-1429 (2019).
- Link, S., Burda, C., Nikoobakht, B., El-Sayed, M. A. Laser-Induced Shape Changes of Colloidal Gold Nanorods Using Femtosecond and Nanosecond Laser Pulses. The Journal of Physical Chemistry B. 104 (26), 6152-6163 (2000).
- U.S. Environmental Protection Agency. Chlorine. , https://www.epa.gov/sites/production/files/2016-09/documents/chlorine.pdf (2000).
