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Biology

近赤外感受性コアシェルワクチンデリバリープラットフォームの製造

doi: 10.3791/60569 Published: October 20, 2020

Summary

この記事では、遅延バースト放出を可能にするために新しいワクチンデリバリープラットフォーム「ポリバブル」を製造するために使用されるプロトコルについて説明します。ポリバブルを形成するためにポリ(乳酸コグリコール酸)やポリカプロラクチンを含むポリエステルを用い、小分子と抗原を貨物として使用した。

Abstract

新しいリリースプロファイルを可能にしながら、有機溶媒への貨物の暴露を制限することができるワクチンの配達戦略は、世界中の予防接種カバレッジを改善するために重要です。ここでは、ポリバブルと呼ばれる新規注射可能な、紫外線硬化性および遅延バースト放出を可能にするワクチン送達プラットフォームが導入される。貨物は、10%カルボキシメチセルロース系水溶液で形成されたポリエステル系ポリバブルに注入された。本論文には、ポリバブルの球形を維持し、貨物の配置と保持を最適化して、ポリバブル内の貨物の量を最大化するためのプロトコルが含まれています。安全性を確保するため、ポリバブル内の塩素系溶媒含有量を中性子活性化解析を用いて分析した。放出試験は、遅延バースト放出を確認するために、ポリバブル内の貨物として低分子で行われた。さらに、貨物のオンデマンド配信の可能性を示すために、金ナノロッドをポリマーシェル内に混合し、近赤外レーザー活性化を可能にした。

Introduction

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限定的な予防接種の適用範囲は、ワクチン予防可能な疾患によって特に引き起こされる300万人の死亡をもたらす1.不十分な保管および輸送条件は、機能性ワクチンの浪費につながり、したがって、世界的な予防接種の減少に貢献する。さらに、必要なワクチンスケジュールに従わないための不完全なワクチン接種も、特に発展途上国ではワクチンの適用範囲が限られているブースターショットを受けるには、推奨期間内に医療従事者への複数回の訪問が必要であり、完全なワクチン接種を伴う人口の割合を制限します。したがって、これらの課題を回避するために、制御されたワクチンの送達のための新しい戦略を開発する必要があります。

ワクチンデリバリー技術の開発に向けた現在の取り組みとしては、エマルジョン系ポリマー系33,44が挙げられる。しかし、貨物は、多くの場合、凝集や変性を引き起こす可能性のある有機溶媒の量が多く、特にタンパク質ベースの貨物55,66の文脈で。我々は、溶媒7にさらされる貨物の量を最小限に抑えながら、潜在的に複数の貨物室を収容することができる新しいワクチンデリバリープラットフォーム「ポリバブル」を開発しました。例えば、当社のポリバブルコアシェルプラットフォームでは、直径0.38mm(SEM)の1つの貨物ポケットが1mmポリバブルの中央に注入されます。この場合、有機溶剤に曝露される貨物の表面積は約0.453mm22となる。球体(貨物庫)内の球体(微粒子)の充填密度を考慮した結果、デポに収まる可能性のある実際の微粒子(直径10μm)は0.17mm3です3。1個の微粒子の体積は5.24x10-8mm3であり、したがって、デポに収まる粒子の微粒子の数は〜3.2x106粒子である。-8 3 6各微粒子に直径0.25μmの20個のカーゴポケット(ダブルエマルジョンの結果)がある場合、有機溶媒に曝露される貨物の表面積は1274mm2である。2したがって、ポリバブル内の貨物庫は、微粒子中の有機溶剤暴露貨物と比較して、有機溶媒にさらされた表面積が約2800倍少なくなります。当社のポリエステルベースのプラットフォームは、有機溶剤にさらされた貨物の量を減らす可能性があり、そうでなければ貨物の集約や不安定性を引き起こす可能性があります。

ポリバブルは、有機相のポリエステルを水溶液に注入して球状の気泡を生じる相分離原理に基づいて形成される。水相の貨物は、ポリバブルの中心に注入することができます。別の貨物室は、ポリマーシェルと異なる貨物を混合することによって、ポリバブル内で達成される可能性があります。この段階でのポリバブルは可鍛性になり、その後、真ん中に貨物を持つ固体ポリバブル構造をもたらすように硬化されます。球状のポリバブルは、ポリバブルの全体的なサイズを最小限に抑えながら、ポリバブル内の貨物容量を増加させるために、他の幾何学的形状よりも選択されました。中央に貨物を持つポリバブルは、遅延バーストリリースを実証するために選択されました。ポリバブルはまた、近赤外(NIR)-感受性(すなわち、熱刺激性有効)剤、すなわち金ナノロッド(AuNR)と組み込まれ、ポリバブルの温度上昇を引き起こす。この効果は、より速い劣化を促進する可能性があり、将来のアプリケーションでキネティクスを制御するために使用される可能性があります。本論文では、ポリバブルを形成し、特徴づけ、ポリバブルからの遅延バースト放出を達成し、ポリバブル内にAuNRを組み込んでNIR活性化を引き起こすアプローチについて述べた。

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Protocol

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1. ポリカプロラシロントリアクリル(PCLTA)合成

  1. 400ダポリカプロラシロン(PCL)の3.2mLを、オープン200mLラウンドボトムフラスコで50°Cで一晩乾燥し、90°CのガラスバイアルでK2CO3を乾燥させた。
  2. トリオールをジクロロメタン(DCM)6.4 mL、炭酸カリウム4.246g(K2CO3)をアル2ゴン下で混ぜます。
  3. 27.2 mLのDCMに2.72mLの塩化アクリルを混ぜ、5分以上フラスコ中の反応混合物に滴下します。
  4. 反応混合物をアルミホイルで覆い、アルゴンの下で24時間室温で乱さないままにしておきます。
  5. 24時間後、真空下でブフナー漏斗上のフィルターペーパーを用いて反応混合物を濾過し、過剰な試薬を廃棄する。
  6. ジエチルエーテルの末端ポリマーを1:3(vol/vol)に含むステップ1.5からの濾液を沈殿させ、30°Cでロトバペを除去し、ジエチルエーテルを除去した。

2. ポリバブルの形成

注:脱イオン(DI)水にポリマーを注入すると、ポリバブルがバイアルの底に移動し、底部が平坦化されます。ポリバブルの平坦化を避けるために、代わりに10%(wt/vol)カルボキシメチルセルロース(CMC)を使用してガラスバイアルを充填してください。

  1. DI水に10%(重量/体積)CMC溶液を調製します。
  2. 1 mL のトランスファーパイプを使用して 0.8 mL の 10% CMC で 0.92 mL ガラスバイアルを充填します。
  3. 1000 mg/mLの14 kDa PCLをDCMに混合し、PCLTAを1:3(vol/vol)で合成して全容量2000μLで5kDaポリ(乳酸コグリコール酸)の2000mg/mLを調製し、クロホルムでジウリル(PLGADA)を調製します。
  4. 2-ヒドロキシ-4'(2-ヒドロキシエトキシ)-2-メチルプロピオフェノン(光基質刺激体)を0.005:1(vol/vol)のポリマー(PLGADAまたはPCL/PCLTA)混合物と混ぜます。
  5. 200 μL のポリマー混合物を、内径 0.016 インチの分配ステンレス鋼管に接続されたシリンジポンプに取り付けられた 1 mL ガラスシリンジに積み込みます。
  6. マイクロモーターを使用してポリマーチューブの前進と後方の動きを制御し、ポリマーをガラスバイアル内の10%CMCに注入してポリバブルを形成します。
  7. 2 W/cm 2で60 sの254 nm波長で紫外線(UV)下で2ポリバブルを治す。
  8. フラッシュは液体窒素中のポリバブルを凍結し、0.010 mBar真空で-85 °Cで一晩凍結乾燥します。
  9. ポリバブルを鉗子で乾燥したCMCから分離し、残留CMCを除去するためにDI水でポリバブルを洗浄する。なお、他のポリマーは、放出動態を改変する改変を伴って使用される可能性が高い。

3. ポリバブル径の変調

  1. 1 mL のトランスファーパイプを使用して、0.92 mL ガラスバイアルに 10% CMC を充填します。
  2. PCL/PCLTAを1:3(vol/vol)に1000mg/mL 14kDa PCLと混ぜ合わせ、PCLTAを合成します。0.005:1 (vol/vol) で重合体混合物とフォトイチエーターを混合します。
  3. ポリマー混合物を、0.016インチの内径の分配ステンレス鋼管に接続されたシリンジポンプに取り付けられた1mLガラスシリンジにロードします。
  4. マイクロモーターを使用してポリマーチューブの前進と後方の動きを制御し、ポリマーをガラスバイアル内の10%CMCに注入してポリバブルを形成します。
  5. さまざまな直径のポリバブルを得るためには、0.0005から1 μL/sの範囲の分配率を変える。
  6. 様々な直径を持つポリバブルとバイアルの画像を撮ります。
  7. ImageJ を使用してポリバブルの直径を定量化し、バイアルのサイズをスケールとして使用します。

4. ポリバブル内の貨物をセンタリング

  1. K2CO3を用いたPCL/PCLTA粘度の変調:
    注:PLGADAの粘度は、1000 mg/mLで5 kDa PLAGDAの粘度が貨物をセンタリングするのに十分であるため、K2CO3を使用して変更する必要はありません。
    1. 0 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL、40 mg/mL、および60 mg/mLを含む様々な濃度で、PCLTAにK2CO3(PCLTA反応後に単離された)を加えます。
    2. レオメトリーを使用してせん断速度を0から1000 1/sに変更して、溶液の動的粘度を測定します。
    3. K2CO3の異なる濃度のPCL/PCLTA溶液を使用して形成されたポリバブルの途中で貨物を手動で注入します(ステップ4.1.1)。ステップ4.1.1からどの溶液が貨物の中央に保持をもたらすかを観察することによって、K2CO3の最適な濃度を決定する。
  2. CMCを使用した貨物の中心(既に小分子での実現可能性を示している)
    1. 貨物の粘度を上げるために、一晩、回転器で5%(wt/vol)CMCと貨物を混合します。
    2. 手動でポリバブルに2μLの貨物混合物を注入し、2 W/cm2で60 sの254 nm波長でUV硬化を進めます。
    3. フラッシュは、液体窒素中のポリバブルを30sのために凍結し、0.010 mBar真空で-85°Cで一晩凍結乾燥します。
    4. ポリバブルを鉗子で乾燥したCMCから分離し、任意の残留CMCを除去するためにDI水で洗浄する。
    5. ポリバブルを半分に切り、コンフォーカル顕微鏡を使用して半分を画像化して貨物が中央に配置されるようにします(励起波長と発光波長を使用する場合はステップ6を参照)。

5. 貨物製剤

注:ポリバブル製剤は、小分子、タンパク質、核酸を含む様々な貨物タイプを収容することができます。

  1. これまでの研究に基づき、タンパク質貨物の場合、ポリエチレングリコール(PEG)6、ポリビニルピ6ロリドン(PVP)、および糖ポリマー6を含む賦形剤を使用して、ポリバブル製剤中のタンパク質の安定性を向上させる。
  2. ステップ 2 のプロトコルに基づいてポリバブルを形成します。
  3. 17.11 gのトレハロースを625 μLのHIV gp120/41抗原に添加して、抗原溶液を調製します。
  4. ポリバブルの中央に1μLの抗原溶液を手動で注入します。
  5. 0日目、7日目、14日目、21日目にポリバブルを開き、励起波長と発光波長497nm、520nmの抗原の蛍光をそれぞれ記録する。
  6. 酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を用いて抗原の機能を決定し、5%ノンファットミルクをブロッキングバッファーとして使用します。

6. 貨物の解放

注:小分子や抗原は、貨物タイプとして使用することができます

  1. 小分子
    1. 37°Cのリン酸緩衝塩(PBS)の400 μL、PLGADAポリバブルの場合は50°C、PCL/PCLTAポリバブルでは37°C、50°C、70°Cでアクリフラビンを中心としたポリバブルをインキュベートします。
      注: 体温以上のテストを推奨する理由は、pCL および PLGA 内で金ナノロッド (AuNRs) をレーザー加工しながらポリバブルが到達する温度 (50 °C) をシミュレートすることです。そしてb)PCL(50°C、70°C)の分解プロセスを加速する。
    2. 各時点で上清を収集し、400 μLの新鮮なPBSに交換します。
    3. プレートリーダーを使用して、収集した上清の蛍光強度を定量化します。
      注: アクリフラビンには 416 nm/514 nm の ex/em を使用してください。
  2. 抗原
    1. 37°CでPBSの400 μL、PLGADAポリバブルの場合は50°C、PCL/PCLTAポリバブルでは50°Cで、シウシアルブミン血清(BSA)-488を中心としたインキュベートポリバブル。
    2. 各時点で上清を収集し、400 μLの新鮮なPBSに交換してください。
    3. プレートリーダーを使用して、収集した上清の蛍光強度を定量化します。BSA-488 には 497 nm/520 nm の ex/em を使用してください。
      注:PCL/PCLTAポリバブルの70°Cでの放出試験は、極端な温度に抗原を暴露しないように行われるべきではありません。

7. 毒性

  1. 中性子活性化解析(NAA)を用いたポリバブル中の塩素含有量の定量
    1. 0.010 mBar真空および-85°Cでのこの研究のために2、4、6、20、および24時間凍結乾燥したポリバブルを使用してください。
    2. ポリバブルの5〜9mgを測定し、LDPE照射バイアルに置きます。
    3. 国立標準技術研究所(NIST)の追跡可能な校正ソリューションから、1000 g/mLの塩素校正液を準備します。
    4. 1メガワットのトリガ原子炉を使用して、中性子フルエンス率9.1×1012 /cm2·sで600sの中性子蛍光率で各サンプルに中性子照射を行います。
    5. ポリバブルを照射されていないバイアルに移します。
    6. HPGe検出器を使用して、360 sの減衰間隔の後に500 sのガンマ線スペクトルを得る。
    7. データを分析するには、キャンベラインダストリーズのNAAソフトウェアを使用します。
  2. NAAを用いてポリバブルから放出される塩素含有量の定量化
    1. 一晩凍結乾燥させたインキュベートポリバブル(0.010 mBar真空で-85°Cで)、PBSの400 μLで37°Cで。
    2. インキュベーション後の週 1、2、および 3 で上清を収集します。
    3. ステップ7.1で前述と同じ方法を使用してNAAを使用して塩素含有量の上清を分析します。

8. キットラーによるAuNR合成, S., 他.8.

  1. 250 μLの10 mMクロロアウリン酸(HAuCl 4)、7.54mLの100 mMセトリモニウム臭化物(CTAB)、および600 μLの10mM氷冷ナトリウムホウドリド(NaBH4)を混合してオーNRシード液を調製する。
  2. 40 mLの100 mM CTAB、10 mM HAuCl4の1.7 mL、硝酸銀250μL(AgNO3)、17.6mg/mLアスコルビン酸270 μLをチューブに混合して成長液を調製します。
  3. 420 μLのシード溶液を1200 rpmの成長溶液と1分間激しく混合します。その後、混合物を乱さずに16時間反応させたままにしておきます。
  4. 8000×gで10分間遠心して混合物から余分な試薬gを取り除き、上清を捨てます。

9. ソリマンによるAuNRsの疎水化化,M.G.,他9

  1. 1 mM水酸化ナトリウム(NaOH)を使用して、合成されたCTAB安定化AuNRsのpHを10に調整します。
  2. 0.3 mM メチル化 PEG (mPEG) チオールを一晩で 0.1 mL で攪拌します。
  3. PEGylated AuNRsを0.4 Mのドデシルアミン(DDA)とクロロホルムで500rpmで4日間混ぜます。
  4. 疎水化AuNRsを含む上の有機層をパイプアウトし、将来の使用まで4°Cで保存します。

10. ポリバブルのNIR活性化

  1. ポリマー(PLGADAまたはPCL/PCLTA)溶液を疎水化オーナーと1:9(vol/vol)で混ぜます。
  2. 0.005:1 (vol/vol) でポリマー-AuNR混合物にフォトイチエーターを追加します。
  3. ポリバブルを形成し、ポリマー-AuNR混合物を10%CMC(wt/vol)で0.92 mLガラスバイアルに注入します(ステップ2参照)。
  4. 2 W/cm 2で60 sの254 nm波長で2ポリバブルを治す。
  5. フラッシュは液体窒素中で30sで凍結し、0.010 mBar真空で-85°Cで一晩凍結乾燥します。
  6. 乾燥したポリバブルを鉗子で分離し、任意の残留CMCを除去するためにDI水で洗浄します。
  7. 37°CでPBSの400 μLでポリバブルをインキュベートします。
  8. 毎週月曜日、水曜日、金曜日に8Aで8Aでポリバブルを5分間アクティブにします。
  9. レーザー活性化の前後にポリバブルの前方赤外線(FLIR)画像を撮り、温度値を取得します。
  10. FLIR画像の温度値に基づいて、レーザー活性化前と後の温度差を計算します。

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Representative Results

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ポリバブルは、SEMおよびNAAを用いて広範囲に特徴付けられていた。貨物は、バーストリリースの遅延を引き起こすために中央に配置されました。ポリバブルもポリバブル内にAuNRsが存在するため、レーザー活性化に成功しました。

ポリバブルの特徴付け
CMCを使用しない水溶液に注入されたポリバブルは、ガラスバイアルの底部と接触するため、ポリバブルが平坦化した結果となった(図1A,B)。DI水の代わりに5%CMC系水溶液を用いた場合に部分平坦化が観察された(1C)。その後、ガラスバイアル中の10%CMC系水溶液が、ポリバブルが溶液中に懸濁され、ポリバブルの球形維持に成功した(1D)。

カーゴセンタリング
CMCが存在しない場合のポリバブルへの貨物注入は、漏れをもたらし、ポリバブル内の貨物の保持を引き起こさなかった(図3)。この課題に対抗するために、2つのアプローチが使用されました:1)トライアクリレートでPCLトリオールをエンドキャッピングした後に単離したK2CO3を使用してPCLTAFigure 2の粘度を正常に増加させ、2)貨物の粘度を5%CMCと混合した後に正常に増加しました(図3、図4)。PLGADAポリバブルの粘度は、貨物のセンタリングを容易にするのに十分であったため、K2CO3を使用して変調されなかった。

抗原機能
HIV gp120/41抗原は、ポリバブルに注入する前にトレハロースの有無を混合した(図5)。トレハロースの有無にかかわらず抗原に対する抗体の結合効率(機能性と呼ばれる)は、統計的に有意な差を有さないと観察された。

レーザー活性化のないリリース研究
37°C(図6A)および50°C(6B)でインキュベートされたポリバブルについて、19日目と5日目にアクリFigure 6フラビンを含むPLGADAポリバブルで遅延バースト放出が観察された。遅延バースト放出は、50°C(図7A)および70°C(図7B)でインキュベートされたポリバブルの160日目および60日目の真ん中にアクリフラビンを有するPCL/PCLTAポリバブルにおいても観察された。これらの放出試験は、レーザー活性化可能なAuNRsがない場合に行われた。

ポリバブルのインビトロレーザー活性化
シェル内のAuNRsを有するポリバブルは、PLGADAポリバブル(図8A)およびPCL/PCLTAポリバブル(図8B)において複数回レーザー活性化に成功した。レーザー活性化前後の温度変化は、それぞれ10±1°C、5±1°CのPCL/PCLTAポリバブルで、シェル内のAuNR濃度が高く、より低い。レーザー活性化前後に観察された温度変化は、それぞれ11±2°C、6±1°CのPLGADAポリバブルで、シェル内のAuNR濃度が高く、より低い。

Figure 1
図1:ポリバブルの球形を維持する。SEM画像(A)14 kDa PCL/300 Da PCLTA平坦化ポリバブルは、ガラスバイアルの底部とのポリバブルの接触による;(B) ガラス底部に接触していなかった上から14 kDa PCL/300 Da PCLTAポリバブル;(C) DI水溶液と比較して5%CMC溶液に注入した場合の平坦化の程度が少ないPCL/PCLTAポリバブルは、バイアルと接触する時点で半球状の形状の形成を引き起こす;(D)10%CMC溶液に注入した際にガラスバイアルの底部に到達しなかったポリバブルは、球形を維持することを可能にする。D示されたすべてのスケールバーは500 μmです。この図は、Leeら7から変更されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:PCLTA粘度の変調。K2CO33濃度は、PCLTAにおいて0から80mg/mLに増加し、動的粘度がK2CO3の濃度に比例して増加3することが観察された。この図はアルン・クマールら10から修正された。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:CMCの有無にかかわらず、ポリバブルへの貨物注入。 トップパネルはCMCの不在の注入の間に貨物漏出のビデオから抽出されたフレームを示す。下部パネルは、5%CMCの存在下でポリバブル内の貨物保持のビデオから抽出されたフレームを示しています。この図は、Leeら7から変更されています。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図4:中央貨物.(A)中央貨物を有するPCL/PCLTAポリバブル、シェル内の貨物と中心非蛍光色素を有するPCL/PCLTAポリバブルの蛍光顕微鏡画像。この図はアルン・クマールら10から修正された。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 5
図5:トレハロースを用いる抗原機能 ポリバブル内のトレハロースを有する、および無しにHIV gp120/41の機能性をELISAを用いて解析した。抗体のタンパク質への結合効率は、一般にタンパク質の機能性の指標と見なされます。この研究で抗原の機能性について議論する際には、目的のタンパク質(タンパク質機能の指標)を結合する抗体を助けることを意図しています。2つのグループ間には統計的有意性は認められない。信頼区間は、実線と点線で示されます。この図は、Leeら7から変更されています。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 6
図 6: PLGADA ポリバブルからの遅延バースト放出.(A)37°C、(B)50°Cで真ん中にアクリフラAビンを有するPLGADAポリBバブルからの遅延バースト放出を示すリリース研究。 実線は、データ点に基づいて取得された適合曲線を示します。この図はアルン・クマールら10から修正された。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 7
図 7: PCL/PCLTA ポリバブルからの遅延バースト放出.(A)50°C、(B)70°Cで、真ん中にアクリフラビンをA有するPCL/PCLTABポリバブルからの遅延バースト放出を示すリリース研究。 この図はアルン・クマールら10から修正された。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 8
図8: ポリバブルのNIRレーザー活性化.NIRレーザー活性化前後の温度変化は、ポリマーシェル内のAuNRの濃度が高く、より低い(A)PLGADAポリバブル、(B)PCL/PCLTAポリバブルで観察された。Bこの温度上昇は、ポリマー劣化を促進するために活用され、貨物の早期放出につながる可能性があります。この図はアルン・クマールら10から修正された。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

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Discussion

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現在の技術と課題
エマルジョンベースのマイクロおよびナノ粒子は、一般的に薬物送達担体として使用されてきました。これらの装置からの貨物の放出動態は広範囲に研究されているが、バースト放出動態の制御は大きな課題であった11.貨物の多様性と機能性は、過剰な水性および有機溶媒への貨物の暴露のためにエマルジョンベースのシステムでも制限されています。タンパク質ベースの貨物は、多くの場合、貨物の変性および凝集の可能性のためにマイクロおよびナノ粒子と互換性がありません12.貨物の安定性に加えて、貨物の動態は、セロコンバージョンにつながるブースターショットの必要性のためにワクチンの文脈で特に重要です。ワクチンデリバリーにおけるこれらの課題に対処するためのこれまでの取り組みは、単一注射ワクチンシステムの概念が数十年前から行われ、まだ臨床的に翻訳されていないため、十分に成功していません。

当社のポリバブルワクチンデリバリープラットフォームは、露出した貨物量を最小限に抑えることで、有機溶剤への貨物の暴露を増やすことで、潜在的に課題を克服することができます。この技術は、シェル内の貨物と中央の貨物という少なくとも2つの貨物室を収容できる可能性があります。貨物を中心としたポリバブルは、小分子や抗原を含むさまざまな貨物タイプに対応しながら、貨物のバースト放出を制御するために使用することができます。本研究では、さまざまな分解時間、PLGADA(より短い分解時間)およびPCL/PCLTA(より長い分解時間)を持つポリエステルを貨物タイプとして使用し、遅延バースト放出を実証した。以降のセクションでは、特に将来のオンデマンド配信アプリケーションで、遅延バーストリリースとNIRアクティベーションの両方を可能にするポリバブルを形成する上で重要なステップについて説明します。

ポリバブル内を中心とした貨物
貨物センタリングは、ポリバブルの配合中に遭遇した重要な課題の1つでした。注入直後に貨物は表面に移動し、貨物ポケットは水性の10%CMC溶液に破裂することなく安定するであろう。このようなオフセンター貨物を持つポリバブルは、貨物を取り巻くポリマーの不均一な厚さのために早期リリースをもたらす可能性があります。したがって、重合体と貨物の粘度を調整することは、貨物センタリングに関連する問題を解決する上で非常に重要でした。貨物の粘度は、5%CMCとの貨物溶液を混合することによって増加した。ポリマーの粘度を高めるために、ポリマーの分子量が改変された可能性がある。しかし、分子量を上げるとポリマー分解が遅くなる場合が多く、貨物放出がさらに遅くなる。このようにポリマーの粘度は、ポリマーの濃度を高めることによって改変した。より高濃度(1000mg/mL)はPLGADAの粘度を高めるのに十分であった。しかし、PCL/PCLTAの粘度は、途中で貨物を保持するのに十分ではありませんでした。これにより、PCLTA3のエンドキャッピング反応後に単離したK2CO3を用いて、PCLTAの粘度を増加させた。

新しい遅延リリース
遅延バースト放出は、中心貨物を有するポリバブルを用いて行われたリリース試験から観察された。低分子(アクリフラビン)は、放出プロファイルを研究するためにポリバブル中の中心貨物として使用された。ポリマーの分解時間の差により使用されるポリエステルに基づいてユニークな放出プロファイルが観察された。PCL/PCLTAポリバブルと比較してPLGADAポリバブルではバースト放出が早期に観察された。PLGAはPCL13と比較して速く劣化するので、PLGADAポリバブルでは早期に貨物の放出が観察された。2種類のポリエステルによるリリースキネティクスの変調に成功した際、我々はさらに、貨物のオンデマンドリリースを可能にするためにポリバブルを設計したいと考えました。

ポリバブルのNIR活性化
患者のニーズのタイミングに関する貨物のオンデマンドリリースは、現在の配信戦略14を使用して達成するために挑戦されています。我々は、NIR-感受性(すなわち、テラノスティックを可能にする)剤を使用することによってポリマー分解を加速することによって、オンデマンドで貨物の放出を促進することができると仮定した。AuNRsは、皮膚15を通って数センチメートルを移動することができるNIRレーザーを使用して活性化する能力のために広く研究されている。CTAB安定化AuNRsは、このようにキットラー、S、他の人によってプロトコルに基づいて調製され、ソリモン、M.G.らによって公表された方法に基づいて疎水化された。その後、シェル内に疎水化AuNRを有するポリバブルを、所望の時点で5分間NIRレーザーを照射し、温度変化を観察した。レーザー前後の温度はFLIR画像に基づいて測定した。硬化ポリマーシェルは、レーザー活性化中にAuNRの形状を維持するのに役立ち、ポリバブルの複数のNIR活性化を可能にしました。以前の文献では、AuNRsはレーザー活性化16のために棒状の形状(NIR活性化にとって重要)を失うことがしばしば知られているため、これは興味深い観察です。AuNRsを使用したポリバブルのレーザー活性化が成功すれば、次世代のポリバブルにおける貨物のオンデマンドリリースを制御する道が開かれることができる。

意義と将来の応用
この研究から得られた結果は、ポリバブルが新しいワクチン送達プラットフォームとして使用される可能性があることを示している。本論文に記載されたポリバブルの調製は、他の研究者が他の治療用途のデリバリープラットフォームとしてポリバブルを使用することをさらに可能にする。例えば、ワクチンの送達に加えて、ポリバブルは、放出動態の変化を伴う相乗的な治療剤を送達するために潜在的に使用することができる。さらに、ポリバブルは、生分解性であり、多くのFDA承認医療機器で使用されているポリエステルで作られています。我々はさらに、ポリバブルから放出される塩素がEPA17によって推奨される安全レベル内であることを示すことによって、ポリバブルの安全性を検証した。したがって、当社の新しい、注射可能な、UV硬化性ポリバブルプラットフォームは、さまざまな貨物タイプのための安全で効果的な薬物送達プラットフォームとして使用される可能性を秘めています。

この技術の限界
ポリバブルプラットフォーム技術は、制御放出を可能にする可能性のあるワクチンデリバリープラットフォームとして使用できます。我々の研究は、抗原および小分子を含むさまざまな貨物タイプを提供することができるこのプラットフォームの多様性を強調する。しかし、この技術の現在の制限の1つは、貨物が現在手動で注入されていることです。スケーリングを目的として、我々は現在、ポリバブル内の貨物の注入(配列として)を可能にする自動化されたプラットフォームを設計しており、この技術の翻訳可能性に関する懸念を軽減するのに役立つ可能性があります。

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Disclosures

著者は開示するものは何もありません。

Acknowledgments

中性子活性化解析(NAA)を支援したTAMUの化学部門の元素分析ラボに所属するブライアン・E・トムリン博士に感謝します。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-Step Ultra Tetramethylbezidine (TMB)-Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Substrate Solution Thermo scientific 34028
2-Hydroxy-2-methylpropiophenone TCI AMERICA H0991
450 nm Stop Solution for TMB Substrate Abcam ab17152
Acryloyl chloride Sigma Aldrich A24109-100G
Acriflavine Chem-Impex International 22916
Anhydrous ethyl ether Fisher Chemical E138-500
Anti-HIV1 gp120 antibody conjugated to horseradish peroxidase (HRP)
Bovine serum albumin (BSA) Fisher BioReagents BP9700100
BSA-CF488 dye conjugates Invitrogen A13100
Bromosalicylic acid Acros Organics AC162142500
Carboxymethylcellulose (CMC) Millipore Sigma 80502-040
Centrimonium bromide (CTAB) MP Biomedicals ICN19400480
Chloroform Fisher Chemical C2984
Coating buffer Abcam ab210899
Dichloromethane (DCM) Sigma Aldrich 270997-1L
Diethyl ether Fisher Chemical E1384
Dodeacyl Amine Acros Organics AC117665000
Doxorubicin hydrochloride Fisher BioReagents BP251610
L-ascorbic acid Acros Organics A61 100
Legato 100 Syringe Pump KD Scientific 14 831 212
mPEG thiol Laysan Bio NC0702454
Nonfat dry milk Andwin Scientific NC9022655
Potassium carbonate Acros Organics AC424081000
Phosphate saline buffer Fisher BioReagents BP3991
(Poly(caprolactone) Sigma Aldrich 440744-250G
(Poly(caprolactone) triol Acros Organics AC190730250
Poly (lactic-co-glycolic acid) diacrylate CMTec 280050
Potassium carbonate Acros Organics AC424081000
Recombinant HIV1 gp120 + gp41 protein Abcam ab49054
Silver nitrate Acros Organics S181 25
Sodium borohydride Fisher Chemical S678 10
Tetrachloroauric acid Fisher Chemical G54 1
Trehalose Acros Organics NC9022655
Triethyl amine Acros Organics AC157910010

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References

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近赤外感受性コアシェルワクチンデリバリープラットフォームの製造
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Arun Kumar, S., Lee, J., Bishop, C. J. Production of Near-Infrared Sensitive, Core-Shell Vaccine Delivery Platform. J. Vis. Exp. (164), e60569, doi:10.3791/60569 (2020).More

Arun Kumar, S., Lee, J., Bishop, C. J. Production of Near-Infrared Sensitive, Core-Shell Vaccine Delivery Platform. J. Vis. Exp. (164), e60569, doi:10.3791/60569 (2020).

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