Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Производство ближнего инфракрасного чувствительного, Core-Shell платформа доставки вакцин

doi: 10.3791/60569 Published: October 20, 2020

Summary

В этой статье описаны протоколы, используемые для производства новой платформы доставки вакцин, "polybubbles", чтобы предотвратить задержку релиза взрыва. Полиэфиры, включая поли (молочно-когликолевая кислота) и поликарлактор, использовались для формирования полипубблов, а в качестве груза использовались небольшие молекулы и антиген.

Abstract

Стратегии доставки вакцин, которые могут ограничить воздействие груза органическим растворителем, позволяя при этом новые профили выпуска, имеют решающее значение для улучшения охвата иммунизацией во всем мире. Здесь вводится новая инъекционной, ультрафиолетово-излечимая и отсроченный взрыв, позволяющая платформу доставки вакцины под названием polybubbles. Груз вводили в полиэфирные полипублы, которые образовались в 10% карбоксиметицеллюлозы на основе аквеозного раствора. Этот документ включает в себя протоколы для поддержания сферической формы полигубблов и оптимизации размещения и удержания груза, чтобы максимизировать количество груза в полигублах. Для обеспечения безопасности с помощью анализа нейтронной активации анализировался содержание хлорированного растворителя в полиббле. Выпуск исследования были проведены с небольшими молекулами в качестве груза в полибюбл, чтобы подтвердить задержку выброса взрыва. Чтобы еще больше продемонстрировать потенциал для доставки груза по требованию, золотые нанороды были смешаны в полимерной оболочке, чтобы обеспечить ближнее инфракрасное лазерное активацию.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Ограниченный охват иммунизацией приводит к смерти 3 миллионов человек, специально вызванных болезнями, предотвратимыми с помощью вакцин1. Неадекватные условия хранения и транспортировки приводят к потере функциональных вакцин и тем самым способствуют сокращению глобальной иммунизации. Кроме того, неполная вакцинация из-за несоблюдения требуемых графиков вакцинации также вызывает ограниченный охват вакцинацией, особенно в развивающихся странах2. В течение рекомендованного периода для получения уколов требуется несколько визитов к медицинскому персоналу, что ограничивает процент населения полной вакцинацией. Поэтому необходимо разработать новые стратегии контролируемой доставки вакцин для преодоления этих проблем.

Текущие усилия по разработке технологий доставки вакцин включают эмульсионные полимерныесистемы 3,,4. Тем не менее, груз часто подвергается большему количеству органических растворителей, которые потенциально могут вызвать агрегацию и денатурацию, особенно в контекстебелкового груза 5,,6. Мы разработали новую платформу доставки вакцин, "polybubbles", которые потенциально могут в доме несколько грузовых отсеков при минимизации объема груза, который подвергаетсярастворителя 7. Например, на нашей платформе polybubble core-shell в центре полиббля вводится один грузовой карман диаметром 0,38 мм (SEM). В этом случае площадь поверхности груза, подвергаемого воздействию органического растворителя, составит примерно 0,453 мм2. После рассмотрения плотности упаковки сфер (микрочастиц) в сфере (грузовом депо), фактический объем микрочастиц (10 мкм в диаметре), которые могли бы поместиться в депо составляет 0,17 мм3. Объем одной микрочастицы составляет 5,24х10-8 мм 3 и, таким образом, количество микрочастиц частиц, которые могут поместиться депо составляет 3,2x106 частиц. Если каждая микрочастица имеет 20 грузовых карманов (в результате двойной эмульсии) диаметром 0,25 мкм, то площадь поверхности груза, подвергаемого воздействию органического растворителя, составляет 1274мм 2. Таким образом, грузовое депо в полигубле имеет в 2800 раз меньше площади поверхности, подверженной воздействию органического растворителя, по сравнению с органическим растворителем, подвергаемого воздействию грузов в микрочастицах. Таким образом, наша платформа на основе полиэстеров потенциально может уменьшить количество грузов, подверженных воздействию органического растворителя, что в противном случае может привести к агрегации и нестабильности грузов.

Полибублы образуются на основе принципа фазового разделения, при котором полиэстер в органической фазе вводится в аковый раствор, что приводит к сферическому пузырю. Груз в aqueous фазе можно впрыснуть в центр polybubble. Другой грузовой отсек потенциально может быть достигнут в полибюбл, смешивая другой груз с полимерной оболочкой. Полибуббл на данном этапе будет податливым, а затем будет вылечен, чтобы привести к твердой структуре полипуббл с грузом в середине. Сферические полигублы были выбраны помимо других геометрических форм для увеличения грузоподъемности в полибюбле при минимизации общего размера полигубля. Полибуббли с грузом в центре были выбраны, чтобы продемонстрировать задержку релиза взрыва. Polybubbles были также включены с ближнего инфракрасного (NIR) - чувствительный (т.е., theranostic-поддержки) агент, а именно золотые нанороды (AuNR), чтобы вызвать повышение температуры полипублей. Этот эффект потенциально может способствовать более быстрой деградации и может быть использован для контроля кинетики в будущих приложениях. В этой статье мы описываем наш подход к формированию и характеристике полигубблов, для достижения задержки выброса всплеска из полигублов, а также для включения AuNR в полибузы, чтобы вызвать NIR-активацию.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Синтез поликапролакиона триакрилата (PCLTA)

  1. Сухой 3,2 мл 400 Da polycaprolacyone (PCL) триол ночь на 50 градусов по Цельсию в открытой 200 мл круглой нижней колбы и K2CO3 в стеклянном флаконе при 90 градусов по Цельсию.
  2. Смешайте триол с 6,4 мл дихлорметана (DCM) и 4,246 г карбоната калия (K2CO3) под аргон.
  3. Смешайте 2,72 мл хлорида акрилового хлорида в 27,2 мл DCM и добавьте dropwise к реакционной смеси в колбе более 5 мин.
  4. Обложка реакционной смеси с алюминиевой фольгой и оставить его нетронутым при комнатной температуре в течение 24 ч под аргоном.
  5. После 24 ч, фильтр реакционной смеси с помощью фильтровальной бумаги на воронку Buchner под вакуумом, чтобы отбросить избыточные реагенты.
  6. Осадок фильтрата из шага 1.5, который содержит endcapped полимера в диэтил эфира в 1:3 (vol/vol) и rotovape при 30 градусов по Цельсию, чтобы удалить диэтил эфира.

2. Формирование полигуббл

ПРИМЕЧАНИЕ: Инъекционный полимер в деионизированной (DI) воде приведет к тому, что полифублы мигрируют на дно флакона, что приведет к уплощенему дну. Используйте 10% (wt/vol) карбоксиметил целлюлозы (CMC) заполнить стеклянный флакон вместо того, чтобы избежать уплощения поликубл.

  1. Подготовка 10% (wt/vol) CMC раствор в воде DI.
  2. Заполните стеклянный флакон 0,92 мл с 0,8 мл 10% CMC с помощью 1 мл передачи трубы.
  3. Смешайте 1000 мг/мл 14 кДа PCL в DCM и синтезировать PCLTA в 1:3 (vol/vol) для общего объема 200 л или подготовить 200 л 1000 мг/мл 5 кДа поли (молочно-когликолевая кислота) диакрилат (PLGADA) в хлороформе.
  4. Смешайте смесь 2-гидрокси-4"-(2-гидроксиэтокси)-2-метилпропиофенон (фотоинициатор) с полимером (PLGADA или PCL/PCLTA) смесью в 0.005:1 (vol/vol).
  5. Загрузите 200 мкл полимерной смеси в стеклянный шприц 1 мл, установленный на шприц-насосе, который соединен с дозаторной трубкой из нержавеющей стали с внутренним диаметром 0,016 дюйма.
  6. Используйте микромотор для управления движением вперед и назад полимерной трубки, чтобы ввести полимер в 10% CMC в стеклянном флаконе, чтобы сформировать полипуббл.
  7. Лечить полигублы под ультрафиолетовым (УФ) на 254 нм длины волны для 60 с при 2 Вт / см2.
  8. Вспышка заморозить polybubbles в жидком азоте и лиофилизируют на ночь на 0,010 мбар вакуума и при -85 градусов по Цельсию.
  9. Отделяйте полигублы от высушенного CMC с помощью типсов и мыть полигубблы с водой DI, чтобы удалить любые остаточные CMC. Обратите внимание, что другие полимеры могут быть использованы, вероятно, с изменениями, чтобы изменить релиз кинетики.

3. Модуляция диаметра полипубля

  1. Заполните стеклянный флакон 0,92 мл с 10% CMC с помощью трубы передачи 1 мл.
  2. Смешайте PCL/PCLTA в 1:3 (vol/vol) с 1000 мг/мл 14kDa PCL и синтезировать PCLTA. Смешайте фотоинициатор с полимерной смесью в 0.005:1 (vol/vol).
  3. Загрузите полимерную смесь в стеклянный шприц 1 мл, установленный на шприц-насосе, который соединен с дозаторной трубкой из нержавеющей стали с внутренним диаметром 0,016 дюйма.
  4. Используйте микромотор для управления движением вперед и назад полимерной трубки, чтобы ввести полимер в 10% CMC в стеклянном флаконе, чтобы сформировать полипуббл.
  5. Для получения полигубблов различных диаметров, варьировать скорость дозирования от 0,0005 до 1 йл/с.
  6. Сделайе снимки флакона с полибубблами разного диаметра.
  7. Используйте ImageJ для количественной оценки диаметра полигублов и использования размера флакона в качестве шкалы.

4. Центрирование грузов в пределах полигуббл

  1. Модуляция вязкости PCL/PCLTA с использованием K2CO3:
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вязкость PLGADA не должна быть изменена с помощью K2CO3, потому что вязкость 5 kDa PLAGDA при 1000 мг/мл достаточна для центраирования груза.
    1. Добавьте K2CO3 (который был выделен после реакции PCLTA) к PCLTA в различных концентрациях, включая 0 мг/мл, 10 мг/мл, 20 мг/мл, 40 мг/мл и 60 мг/мл.
    2. Измерьте динамическую вязкость растворов, изменив скорость стрижки с 0 до 1000 1/с с помощью реометрии.
    3. Вручную впрыскивайте груз в середину (обратитесь к шагу 4.2 для подготовки грузовой смеси) из полигубблов, которые были сформированы с использованием решений PCL/PCLTA с различными концентрациями K2CO3 (шаг 4.1.1). Определите оптимальную концентрацию K2CO3, наблюдая, какое решение из шага 4.1.1 может привести к удержанию груза в середине.
  2. Центрирование груза (уже показанная осуществимость с небольшими молекулами) с CMC
    1. Смешайте груз с 5% (wt/vol) CMC в ротаторе на ночь, чтобы увеличить вязкость груза.
    2. Вручную введите 2 МКЛ грузовой смеси в полигуббл и приступить к УФ-лечения на 254 нм длины волны для 60 с при 2 Вт /см 2.
    3. Вспышка заморозить polybubbles в жидком азоте в течение 30 с и лиофилизовать ночь на 0,010 мБар вакуума и при -85 градусов по Цельсию.
    4. Отделяйте полигублы от высушенного CMC с помощью типсов и мыть водой DI, чтобы удалить остатки CMC.
    5. Разрежьте полибуббл пополам и изображение половинки с помощью конфокальные микроскопии, чтобы гарантировать, что груз по центру (ссылка на шаг 6 для возбуждения и выбросов длин волн используется).

5. Формула груза

ПРИМЕЧАНИЕ: В формуле Polybubble могут быть различные типы грузов, включая небольшие молекулы, белки и нуклеиновые кислоты.

  1. Основываясь на предыдущих исследованиях, в случае белковых грузов, используйте excipients в том числеполиэтиленгликоль(PEG) 6 , поливинилпирролидон (PVP), игликополимеры 6 для повышения стабильности белка во время полибубл формулировки.
  2. Форма полигублов на основе протокола в шаге 2.
  3. Приготовьте антигенный раствор, добавив 17,11 г трегалозы в 625 мл антигена ВИЧ gp120/41.
  4. Вручную ввит 1 МКЛ антигенового раствора в середине полиббл.
  5. Откройте полигублы в дни 0, 7, 14 и 21, и записывают флуоресценцию антигена с возбуждением и выбросами длин волн 497 нм и 520 нм, соответственно.
  6. Определите функциональность антигена, используя связанный с ферментами иммуносорбентный анализ (ELISA) и используйте 5% обезжиренного молока в качестве блокирующего буфера.

6. Выпуск грузов

ПРИМЕЧАНИЕ: Малая молекула или антиген могут быть использованы в качестве грузового типа

  1. Маленькая молекула
    1. Инкубировать поликубблы с центром acriflavine в 400 йл фосфатного буфера солевого раствора (PBS) при 37 градусов по Цельсию, 50 градусов по PLGADA polybubbles и при 37 C, 50 КК, 70 C для PCL / PCLTA polybubbles.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Причина, по которой мы рекомендуем тестирование выше температуры тела является а) имитировать температуру (50 градусов по Цельсию), при которой полигуббл достигает во время лазерирования золотых нанородов (AuNRs) в PCL и PLGA; и б) ускорить процесс деградации ПХЛ (50 градусов по Цельсию, 70 градусов по Цельсию).
    2. В каждый момент времени, собирать supernatants и заменить 400 йл свежего PBS.
    3. Используйте считыватель пластин для количественной оценки интенсивности флуоресценции в собранных супернатантах.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте ex/em 416 nm/514 nm для acriflavine.
  2. Антигена
    1. Инкубировать поликубблы с центром бычьего альбумин сыворотки (BSA)-488 в 400 йл PBS при 37 градусов по Цельсию, 50 градусов по PLGADA polybubbles и при 37 градусов по Цельсию, 50 кк для PCL / PCLTA polybubbles.
    2. В каждой точке времени, собирать supernatants и заменить 400 йл свежих PBS.
    3. Используйте считыватель пластин для количественной оценки интенсивности флуоресценции в собранных супернатантах. Используйте ex/em 497 nm/520 nm для BSA-488.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Исследование выпуска при температуре 70 градусов по Цельсию для полибблей PCL/PCLTA не должно проводиться, чтобы избежать разоблачения антигена до экстремальной температуры.

7. Токсичность

  1. Количественная оценка содержания хлора в полигублах с использованием анализа нейтронной активации (NAA)
    1. Используйте полибублы, которые были лиофилизированы для 2, 4, 6, 20 и 24 ч для этого исследования в вакууме 0.010 mBar и при -85 C.
    2. Измерьте 5-9 мг полигублов и поместите их на флаконы облучения LDPE.
    3. Приготовьте 1000 г/мл раствора калибровки хлора из национального института стандартов и технологий (NIST) - отслеживаемого калибровочного раствора.
    4. Используйте 1-мегаваттный реактор Triga для проведения нейтронных облучений на каждом образце при скорости нейтронной беглости 9,1 ×10 12 /см 2на 600 с.
    5. Перенесите полигублы на необлученые флаконы.
    6. Используйте детектор HPGe для получения гамма-спектров для 500 с после 360 с интервалов распада.
    7. Используйте программное обеспечение NAA от canberra Industries для анализа данных.
  2. Количественная оценка содержания хлора, высвобождаемого из полигублов с использованием NAA
    1. Инкубировать полибублы, которые были лиофилизированы в одночасье (при вакууме 0,010 мбара и при -85 градусов по Цельсию) в 400 МКЛ PBS при 37 градусов по Цельсию.
    2. Соберите супернатанты на неделях 1, 2 и 3 после инкубации.
    3. Проанализируйте супернатанты на содержание хлора с помощью NAA с помощью того же метода, что описано выше в шаге 7.1.

8. AuNR Синтез Киттлер, S., и др.8

  1. Приготовьте раствор для посева AuNR, смешивая 250 л хлороауновой кислоты 10 мМ (HAuCl4),7,5 мл бромистого цетримония 100 мМ (CTAB) и 600 л 10 мл 10 мл ледяного борогидрида натрия натрия (NaBH4).
  2. Подготовьте раствор роста, смешивая 40 мл 100 мл CTAB, 1,7 мл 10 мл HAuCl4,250 л нитрата серебра (AgNO3)и 270 л аскорбиновой кислоты 17,6 мг/мл в трубку.
  3. Энергично смешайте 420 мл семенного раствора с раствором роста при 1200 об/мин в течение 1 мин. Затем оставьте смесь спокойно реагировать на 16 ч.
  4. Удалите излишки реагентов из смеси путем центрифугирования при 8000 × в течение 10 минут и отбросьте супернатант.

9. Гидрофобизация AUNRs Солиман, М.Г., и др.9

  1. Отрегулируйте рН 1,5 мл синтезированных стабилизированных АТБ 10 с использованием гидроксида натрия 1 мМ (NaOH).
  2. Перемешать раствор с 0,1 мл 0,3 мМм метилированного ПЕГ (mPEG) тиола при 400 об/мин на ночь.
  3. Смешайте PEGylated AuNRs с 0,4 M додедиламин (DDA) в хлороформ при 500 об/мин в течение 4 дней.
  4. Pipet из верхнего органического слоя, содержащего гидрофобных AUNRs и хранить при 4 градусов по Цельсию до будущего использования.

10. NIR-активация полигубблов

  1. Смешайте раствор полимера (PLGADA или PCL/PCLTA) с гидрофобными auNRs в 1:9 (vol/vol).
  2. Добавить фотоинициатор в смесь полимер-AuNR в 0.005:1 (vol/vol).
  3. Форма polybubbles путем впрыскивания полимера-AuNR смеси в 0,92 мл стеклянный флакон с 10% CMC (wt/vol) (ссылка на шаг 2).
  4. Лечить полигублы на 254 нм длины волны для 60 с при 2 Вт / см2.
  5. Вспышка заморозить в жидком азоте на 30 с и лиофилизовать на ночь при 0,010 мбар вакуума и при -85 градусов по Цельсию.
  6. Отделить сушеные полигузы с помощью типсов и мыть водой DI, чтобы удалить остатки CMC.
  7. Инкубировать полигублы в 400 МКЛ PBS при 37 градусов по Цельсию.
  8. Активировать полигублы с помощью 801 нм NIR лазера на 8A в течение 5 минут каждый понедельник, среду и пятницу.
  9. Возьмите перспективные инфракрасные (FLIR) изображения полибюбл до и после лазерной активации для получения температурных значений.
  10. Рассчитайте температурные различия между до и после лазерной активации на основе температурных значений на снимках FLIR.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Polybubbles были широко охарактеризованы с помощью SEM и NAA. Груз был успешно центрирован, чтобы привести к задержке релиза взрыва. Polybubbles были также успешно лазерной активации из-за присутствия AUNRs в полигублов.

Характеристика Полигоббл
Polybubbles вводили в aqueous раствор без CMC привело к сплющенный полипуббл из-за их контакта с нижней части стеклянного флакона (Рисунок 1A, B). Частичное уплощение наблюдалось, когда 5% CMC основе aqueous раствор был использован вместо воды DI(рисунок 1C). Впоследствии, 10% CMC основе aqueous раствора в стеклянном флаконе привело к polybubble приостановлено в растворе и, таким образом, успешное поддержание сферичности полибуббл (Рисунок 1D).

Грузовое центрирование
Инъекции груза в полигуббл в отсутствие CMC привели к утечке, не вызывая удержания груза в полибубле(рисунок 3). Для противодействия этой проблеме были использованы два подхода: 1) вязкость PCLTA была успешно увеличенас помощьюK 2 CO3, который был изолирован после endcapping PCL триол с триакрилатом (рисунок 2), и 2) вязкость груза была успешно увеличена после смешивания груза с 5% CMC (Рисунок 3, Рисунок 4). Вязкости полибюблов PLGADA было достаточно для облегчения центрирования груза и, таким образом, не модулировался с помощью K2CO3.

Функциональность антигена
Антиген ВИЧ gp120/41 смешивали с трегалозой и без нее перед введением в полигуббл(рисунок 5). Было отмечено, что связывающая эффективность антитела с антигеном (термином функциональность) с трегалозой и без нее не имеет статистически значимой разницы.

Выпуск исследований без лазерной активации
Задержки взрыв релизы наблюдались в PLGADA polybubbles с acriflavine в середине дня 19 и 5 для полипублов инкубируется при 37 C (Рисунок 6A) и 50 КК (Рисунок 6B), соответственно. Задержки релиза взрыва были также отмечены в PCL / PCLTA polybubbles с acriflavine в середине дня 160 и 60 для полипубблов инкубируется при 50 C (Рисунок 7A) и 70 C (Рисунок 7B), соответственно. Эти исследования выпуска были проведены в отсутствие лазерной активации AUNRs.

Лазерная активация полибубблов in vitro
Polybubbles с AuNRs в оболочке были успешно лазер активирован несколько раз в PLGADA polybubbles(рисунок 8A) и PCL / PCLTA polybubbles (Рисунок 8B). Изменения температуры до и после лазерной активации были 10 ± 1 КК и 5 ± 1 кк в ПХЛ / PCLTA polybubbles с более высокой и низкой концентрацией AuNR в оболочке, соответственно. Изменения температуры, наблюдаемые до и после лазерной активации, были 11 ± 2 градусов по Цельсию и 6 ± 1 градус по Цельсию в полибулях PLGADA с более высокой и низкой концентрацией AuNR в оболочке, соответственно.

Figure 1
Рисунок 1: Поддержание сферичности полигубблов. SEM изображения (A) 14 kDa PCL/300 Da PCLTA сплющенный полипуббл из-за контакта полипубл с нижней части стеклянного флакона; (B) 14 kDa PCL/300 Da PCLTA полиббл сверху, который не был в контакте со стеклянным дном; (C) PL/ PCLTA polybubbles с меньшей степенью уплощения при введении в 5% CMC решение по сравнению с DI водный раствор, вызывая образование полушария, как форма в точке соприкосновения с флаконом; (D) polybubble, которые не достигли нижней части стеклянного флакона при введении в 10% CMC раствор, что позволяет сферической формы, которые будут поддерживаться. Все указанные полосы шкалы 500 мкм. Эта цифра была изменена с Ли и др.7. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Модуляция вязкости PCLTA. Концентрация K2CO3 была увеличена с 0 до 80 мг/мл в PCLTA и динамическая вязкость наблюдалась для увеличения пропорционально концентрации K2CO3. Эта цифра была изменена с Арун Кумар идр. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Грузовые инъекции в полибуббл с и без CMC. Верхняя панель показывает кадры, извлеченные из видео утечки груза во время инъекции в отсутствие CMC. Нижняя панель показывает кадры, извлеченные из видео удержания груза в полибюбле в присутствии 5% CMC. Эта цифра была изменена с Ли и др.7. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: Центрированныйгруз. Флуоресцентный микроскоп изображения (A) PCL / PCLTA полипуббл с центромгруза,( B ) PCL / PCLTA polybubble с грузом в оболочке и в центре нефлуоресцентного красителя. Эта цифра была изменена с Арун Кумар идр. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 5
Рисунок 5: Антигенная функциональность с трегалозой. Функциональность ВИЧ gp120/41 с трегалозой и без нее в полибубле была проанализирована с помощью ELISA. Связывающая эффективность антитела к белку обычно рассматривается как показатель функциональности белка. Когда мы обсуждаем функциональность антигена в этом исследовании, мы намерены это означает, что он помогает антителам связывания белка интереса (который является показателем функциональности белка). Статистической значимости между этими двумя группами не наблюдалось. Интервалы доверия указываются твердыми и пунктирными линиями. Эта цифра была изменена с Ли и др.7. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 6
Рисунок 6: Задержка взрыва релиз от PLGADA polybubbles. Выпуск исследований, показывающих задержку взрыв релизы от PLGADA polybubbles с акрифлавином в середине при ()37 градусов по Цельсию, (B) 50 градусов по Цельсию. Твердая линия указывает установленную кривую, полученную на основе точек данных. Эта цифра была изменена с Арун Кумар идр. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 7
Рисунок 7: Задержка взрыва релиз от PCL / PCLTA polybubbles. Выпуск исследований, показывающих задержку взрыв релизы от PCL / PCLTA polybubbles с acriflavine в середине при (A) 50 C, (B) 70 C.  Эта цифра была изменена с Арун Кумар идр. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 8
Рисунок 8: NIR лазерная активация полигубблов. Изменение температуры наблюдается до и после активации лазера NIR в (A) PLGADA polybubbles, (B) PCL/PCLTA polybubbles с более высокой и низкой концентрацией AuNRs в полимерной оболочке. Такое повышение температуры может быть использовано для потенциального ускорения деградации полимеров, что приведет к более раннему выпуску груза. Эта цифра была изменена с Арун Кумар идр. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Современные технологии и вызовы
Микро- и наночастицы на основе эмульсии широко используются в качестве носителей лекарств. Хотя релиз кинетики груза из этих устройств были тщательно изучены, контроль выброса всплеска кинетики была серьезной проблемой11. Универсальность и функциональность грузов также ограничены в системах на основе эмульсии из-за воздействия груза на избыток аквозных и органических растворителей. Белковые грузы часто не совместимы с микро- и наночастицами из-за возможности денатурации груза и агрегации12. В дополнение к стабильности груза, грузовая кинетика особенно важна в контексте вакцин из-за необходимости бустерных выстрелов, ведущих к сероконверсии. Предыдущие усилия по решению этих проблем в области доставки вакцин не были достаточно успешными, поскольку понятие системы одной инъекционной вакцины было вокруг в течение нескольких десятилетий и до сих пор клинически не переведено.

Наша платформа доставки полибуббл вакцины потенциально может преодолеть проблемы с увеличением воздействия груза на органический растворитель, минимизируя объем открытых грузов. Эта технология потенциально может вместить по крайней мере два грузовых отсека: груз в оболочке и груз в центре. Полибубблы с по центру груза могут быть использованы для управления взрывом релиз груза в то время как совместимы с различными типами грузов, в том числе малых молекул и антигена. В этом исследовании мы использовали полиэфиры с разным временем деградации, PLGADA (короткое время деградации) и PCL/PCLTA (более длительное время деградации), как полимерные носители и acriflavine (малая молекула) в качестве типа груза, чтобы продемонстрировать задержку выброса взрыва. В следующих разделах мы описываем важнейшие шаги в формировании полигубблов, которые способны обеспечить как задержку выпуска взрыва, так и активацию NIR, особенно для будущих приложений доставки по требованию.

Грузовое центрирование в полигубле
Грузовое центрирование было одной из значительных проблем, с которыми сталкивались при разработке полигубблов. Сразу же после инъекции груз мигрирует на поверхность, а грузовой карман стабилизируется, не врывшись в 10% CMC-раствор. Полибубблы с таким нецентрированным грузом могут привести к более раннему выпуску из-за не однородной толщины полимера, окружающего груз. Таким образом, модуляция вязкости полимера и груза имеет решающее значение для решения вопросов, связанных с центром грузовых перевозок. Вязкость груза была увеличена за счет смешивания грузового раствора с 5% CMC. Для повышения вязкости полимера можно было модифицировать молекулярный вес полимера. Однако увеличение молекулярного веса часто приводит к замедлению деградации полимеров, что приводит к дальнейшей задержке выпуска грузов. Таким образом, вязкость полимера была изменена за счет увеличения концентрации полимера. Более высокая концентрация (1000 мг/мл) была достаточной для повышения вязкости PLGADA. Однако вязкость PCL/PCLTA была недостаточной для удержания груза в середине. Таким образом, K2CO3, который был изолирован после эндкаппинг реакции PCLTA был использован для увеличения вязкости PCLTA.

Роман задержки релиза
Задержка с взрывом была отмечена в результате исследований, проведенных с использованием полигубблов с центром груза. Малая молекула (acriflavine) была использована как центрированный груз в polybubbles для того чтобы изучить профиль отпуска. Уникальные профили выпуска наблюдались на основе полиэстер, используемый из-за разницы во времени деградации полимеров. Взрыв релиз наблюдался ранее в PLGADA polybubbles по сравнению с PCL / PCLTA polybubbles. Ранний выпуск грузов наблюдался в plGADA polybubbles, потому что PLGA ухудшается быстрее по сравнению с PCL13. После успешной модуляции кинетической высвобождения с двумя типами полиэстеров, мы также хотели, чтобы инженер polybubble потенциально позволяют по требованию выпуска груза.

NIR-активация полигубблов
Освобождение груза по требованию в отношении сроков потребностей пациентов было сложной задачей для достижения с использованием текущих стратегий доставки14. Мы предположили, что ускорение высвобождения груза по требованию возможно за счет ускорения деградации полимеров за счет использования чувствительных к НИР (т.е. агентов, способствующих разработке полимеров). AuNRs были широко изучены для их способности быть активированы с помощью лазера NIR, который может путешествовать несколько сантиметров через кожу15. Таким образом, стабилизированные СНР были подготовлены на основе протокола Киттлера, С и др. и гидрофобны на основе методов, опубликованных Солимоном, М.Г. и др. Polybubbles с гидрофобными AuNRs в оболочке были затем облучены лазером NIR в нужные точки времени в течение 5 минут, чтобы наблюдать изменение температуры. Температура до и после лазера измерялась на основе изображений FLIR. Вылеченная полимерная оболочка помогла сохранить форму AUNRs во время лазерной активации, что позволило несколько активаций NIR полигублов. Это интересное наблюдение, потому что в предыдущей литературе, AuNRs часто, как известно, теряют свою удилище, как форма (критическое значение для активации NIR) из-за лазернойактивации 16. Успешная лазерная активация полигубблов с помощью AUNRs может проложить путь к контролю за выпуском груза по требованию в следующем поколении полипубблов.

Значение и будущие приложения
Таким образом, результаты, полученные в результате этого исследования, показывают, что полибузы могут быть использованы в качестве новой платформы доставки вакцин. Подготовка полигубблов, описанных в настоящем документе, позволит другим исследователям использовать полибюблы в качестве платформы доставки для других терапевтических применений. Например, в дополнение к доставке вакцины, поликублы также могут быть потенциально использованы для доставки синергетических терапевтических агентов с различной кинетической высвобождения. Кроме того, полигублы изготовлены из полиэстеров, которые являются биоразлагаемыми и были использованы во многих FDA утвержденных медицинских устройств. Мы также подтвердили безопасность полипубблов, показав, что хлор, высыбленый из полигубблов, находится в пределах уровней безопасности, рекомендованных EPA17. Таким образом, наша новая, инъекционной, УФ-излечимая платформа polybubble имеет потенциал для использования в качестве безопасной и эффективной платформы доставки лекарств для различных типов грузов.

Ограничения этой технологии
Технология платформы polybubble может быть использована в качестве платформы доставки вакцин, потенциально позволяющей контролируемый выпуск. Наши исследования подчеркивают универсальность этой платформы, способной доставлять различные типы грузов, включая антигены и небольшие молекулы. Однако одно из нынешних ограничений этой технологии заключается в том, что груз в настоящее время впрыскивается вручную. Для целей масштабирования мы в настоящее время создаем автоматизированную платформу, которая позволит впрыскить (т.е. в качестве массива) груза в полигуббл и потенциально поможет облегчить проблемы, связанные с переводом этой технологии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Мы хотели бы поблагодарить д-ра Брайана Э. Томлина, связанного с лабораторией элементарного анализа в отделе химии ТАМУ, который помогал с анализом активации нейтронов (NAA).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-Step Ultra Tetramethylbezidine (TMB)-Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Substrate Solution Thermo scientific 34028
2-Hydroxy-2-methylpropiophenone TCI AMERICA H0991
450 nm Stop Solution for TMB Substrate Abcam ab17152
Acryloyl chloride Sigma Aldrich A24109-100G
Acriflavine Chem-Impex International 22916
Anhydrous ethyl ether Fisher Chemical E138-500
Anti-HIV1 gp120 antibody conjugated to horseradish peroxidase (HRP)
Bovine serum albumin (BSA) Fisher BioReagents BP9700100
BSA-CF488 dye conjugates Invitrogen A13100
Bromosalicylic acid Acros Organics AC162142500
Carboxymethylcellulose (CMC) Millipore Sigma 80502-040
Centrimonium bromide (CTAB) MP Biomedicals ICN19400480
Chloroform Fisher Chemical C2984
Coating buffer Abcam ab210899
Dichloromethane (DCM) Sigma Aldrich 270997-1L
Diethyl ether Fisher Chemical E1384
Dodeacyl Amine Acros Organics AC117665000
Doxorubicin hydrochloride Fisher BioReagents BP251610
L-ascorbic acid Acros Organics A61 100
Legato 100 Syringe Pump KD Scientific 14 831 212
mPEG thiol Laysan Bio NC0702454
Nonfat dry milk Andwin Scientific NC9022655
Potassium carbonate Acros Organics AC424081000
Phosphate saline buffer Fisher BioReagents BP3991
(Poly(caprolactone) Sigma Aldrich 440744-250G
(Poly(caprolactone) triol Acros Organics AC190730250
Poly (lactic-co-glycolic acid) diacrylate CMTec 280050
Potassium carbonate Acros Organics AC424081000
Recombinant HIV1 gp120 + gp41 protein Abcam ab49054
Silver nitrate Acros Organics S181 25
Sodium borohydride Fisher Chemical S678 10
Tetrachloroauric acid Fisher Chemical G54 1
Trehalose Acros Organics NC9022655
Triethyl amine Acros Organics AC157910010

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. World Health Organization. Global Immunization: Worldwide Disease Incidence. Children's Hospital of Philadelphia. https://www.chop.edu/centers-programs/vaccine-education-center/global-immunization/diseases-and-vaccines-world-view (2018).
  2. Paul, A., Bera, M., Gupta, P., Singh, N. D. P. o-Hydroxycinnamate for sequential photouncaging of two different functional groups and its application in releasing cosmeceuticals. Organic and Biomolecular Chemistry. 17, (33), 7689-7693 (2019).
  3. Kumari, A., Yadav, S. K., Yadav, S. C. Biodegradable polymeric nanoparticles based drug delivery systems. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 75, (1), 1-18 (2010).
  4. Dai, C., Wang, B., Zhao, H. Microencapsulation peptide and protein drugs delivery system. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 41, (2-3), 117-120 (2005).
  5. Souery, W. N., et al. Controlling and quantifying the stability of amino acid-based cargo within polymeric delivery systems. Journal of Control Release. 300, 102-113 (2019).
  6. Wang, W. Advanced protein formulations. Protein Science. 24, (7), 1031-1039 (2015).
  7. Lee, J., et al. An ultraviolet-curable, core-shell vaccine formed via phase separation. Journal of Biomedical Materials Research Part A. (2019).
  8. Kittler, S., Hickey, S. G., Wolff, T., Eychmüller, A. Easy and Fast Phase Transfer of CTAB Stabilised Gold Nanoparticles from Water to Organic Phase. Zeitschrift für Physikalische Chemie. 229, 235 (2015).
  9. Soliman, M. G., Pelaz, B., Parak, W. J., del Pino, P. Phase Transfer and Polymer Coating Methods toward Improving the Stability of Metallic Nanoparticles for Biological Applications. Chemistry of Materials. 27, (3), 990-997 (2015).
  10. Arun Kumar, S., Good, J., Hendrix, D., Yoo, E., Kim, D., Deo, K. A., Jhan, Y. Y., Gaharwar, A. K., Bishop, C. J. Nanoengineered Light-Activatable Polybubbles for On?Demand Therapeutic Delivery. Adv. Funct. Mater. 2003579 (2020).
  11. Wuthrich, P., Ng, S. Y., Fritzinger, B. K., Roskos, K. V., Heller, J. Pulsatile and delayed release of lysozyme from ointment-like poly(ortho esters). Journal of Controlled Release. 21, (1), 191-200 (1992).
  12. Wang, W. Instability, stabilization, and formulation of liquid protein pharmaceuticals. International Journal of Pharmaceutics. 185, (2), 129-188 (1999).
  13. Wong, D. Y., Hollister, S. J., Krebsbach, P. H., Nosrat, C. Poly(epsilon-caprolactone) and poly (L-lactic-co-glycolic acid) degradable polymer sponges attenuate astrocyte response and lesion growth in acute traumatic brain injury. Tissue Engineering. 13, (10), 2515-2523 (2007).
  14. Davoodi, P., et al. Drug delivery systems for programmed and on-demand release. Advanced Drug Delivery Reviews. 132, 104-138 (2018).
  15. Huang, Y. C., Lei, K. F., Liaw, J. W., Tsai, S. W. The influence of laser intensity activated plasmonic gold nanoparticle-generated photothermal effects on cellular morphology and viability: a real-time, long-term tracking and monitoring system. Photochemical and Photobiological Sciences. 18, (6), 1419-1429 (2019).
  16. Link, S., Burda, C., Nikoobakht, B., El-Sayed, M. A. Laser-Induced Shape Changes of Colloidal Gold Nanorods Using Femtosecond and Nanosecond Laser Pulses. The Journal of Physical Chemistry B. 104, (26), 6152-6163 (2000).
  17. U.S. Environmental Protection Agency. Chlorine. https://www.epa.gov/sites/production/files/2016-09/documents/chlorine.pdf (2000).
Производство ближнего инфракрасного чувствительного, Core-Shell платформа доставки вакцин
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Arun Kumar, S., Lee, J., Bishop, C. J. Production of Near-Infrared Sensitive, Core-Shell Vaccine Delivery Platform. J. Vis. Exp. (164), e60569, doi:10.3791/60569 (2020).More

Arun Kumar, S., Lee, J., Bishop, C. J. Production of Near-Infrared Sensitive, Core-Shell Vaccine Delivery Platform. J. Vis. Exp. (164), e60569, doi:10.3791/60569 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter