Summary
Denna artikel beskriver de protokoll som används för att producera en ny vaccin leverans plattform, "polybubbles," för att möjliggöra fördröjd burst release. Polyesters inklusive poly(mjölksyra-co-glykolsyra) och polycaprolactone användes för att bilda polybubbles och små molekyler och antigen användes som last.
Abstract
Vaccin leveransstrategier som kan begränsa exponeringen av last till organiskt lösningsmedel samtidigt som nya release profiler är avgörande för att förbättra immunisering täckning över hela världen. Här introduceras en ny injicerbar, ultraviolett och fördröjd burst release- möjliggörande vaccinleveransplattform som kallas polybubblor. Cargo injicerades i polyesterbaserade polybubblor som bildades i 10% karboxymethycellulosa -baserad vattenlösning. Detta papper innehåller protokoll för att upprätthålla sfärisk form av polybubblor och optimera lastplacering och retention för att maximera mängden last inom polybubbles. För att garantera säkerheten analyserades klorerade lösningsmedel innehåll inom polybubbles med hjälp av neutron aktivering analys. Release studier genomfördes med små molekyler som last inom polybubble att bekräfta fördröjd burst release. För att ytterligare visa potentialen för on-demand leverans av lasten, guld nanorods blandades inom polymerskalet för att möjliggöra nära infraröd laseraktivering.
Introduction
Begränsad immunisering täckning resulterar i döden av 3 miljoner människor som särskilt orsakas av vaccin-förebyggas sjukdomar1. Otillräckliga lagrings- och transportförhållanden leder till att funktionella vacciner förser sig och bidrar därmed till minskad global immunisering. Dessutom orsakar ofullständig vaccination på grund av att inte följa de erforderliga vaccinschemana också begränsad vaccintäckning, särskilt i utvecklingsländer2. Flera besök hos medicinsk personal krävs inom den rekommenderade perioden för mottagning av booster skott, vilket begränsar andelen av befolkningen med fullständig vaccination. Därför finns det ett behov av att utveckla nya strategier för kontrollerad vaccinleverans för att kringgå dessa utmaningar.
De nuvarande insatserna för att utveckla vaccinleveransteknik omfattar emulsionsbaserade polymera system3,4. Lasten utsätts dock ofta för större mängd organiskt lösningsmedel som potentiellt kan orsaka aggregering och denaturering, närmare bestämt i samband med proteinbaserad last5,6. Vi har utvecklat en ny vaccin leverans plattform, "polybubbles", som potentiellt kan hysa flera lastutrymmen samtidigt minimera volymen av last som är utsatt för lösningsmedel7. Till exempel, i vår polybubble kärna-skal plattform, en lastficka med diameter 0,38 mm (SEM) injiceras i mitten av en 1 mm polybubble. I detta fall skulle ytan på last som exponeras för organiskt lösningsmedel vara cirka 0,453 mm2. Efter att ha beaktat den förpackningstäthet av sfärer (mikropartiklar) inom en sfär (lastdepå), är den faktiska volymen av mikropartiklar (10 μm i diameter) som skulle kunna få plats i depån 0,17 mm3. Volymen på en mikropartikel är 5.24x10-8 mm3 och därmed antal partiklar mikropartiklar som kan passa depån är ~ 3.2x106 partiklar. Om varje mikropartikel har 20 lastfickor (till följd av dubbelemulsion) på 0,25 μm diameter, då är ytan på last som utsätts för organiskt lösningsmedel 1274 mm2. Lastdepå inom polybubblet skulle alltså ha ~2800-faldig mindre yta som exponeras för organiskt lösningsmedel jämfört med den hos organiskt lösningsmedelsexponerad last i mikropartiklar. Vår polyesterbaserade plattform kan därmed potentiellt minska mängden last som exponeras för organiskt lösningsmedel vilket annars kan orsaka lastaggregering och instabilitet.
Polybubbles bildas baserat på fasseparering princip där polyester i organisk fas injiceras i en vattenlösning som resulterar i en sfärisk bubbla. Last i vattenfasen kan sedan injiceras i mitten av polybubble. Ett annat lastutrymme kan potentiellt uppnås inom polybubblet genom att blanda en annan last med polymerskalet. Den polybubble i detta skede kommer att vara formbara och kommer sedan att botas för att resultera i en solid polybubble struktur med last i mitten. Sfäriska polybubbles valdes framför andra geometriska former för att öka lastkapaciteten inom polybubblet samtidigt som polybubblets totala storlek minimerades. Polybubbles med last i centrum valdes för att visa fördröjd burst release. Polybubbles införlivades också med nära infraröd (NIR)- känslig (dvs. theranostic-möjliggörande) agent, nämligen guld nanorods (AuNR), att orsaka ökning av temperaturen i polybubbles. Denna effekt skulle potentiellt kunna underlätta snabbare nedbrytning och kan användas för att kontrollera kinetik i framtida tillämpningar. I detta dokument beskriver vi vår strategi för att bilda och karakterisera polybubbles, för att uppnå fördröjd burst release från polybubbles, och att införliva AuNR inom polybubbles att orsaka NIR-aktivering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Polycaprolacyone triakrylat (PCLTA) syntes
- Torka 3,2 mL av 400 Da polycaprolacyone (PCL) triol över natten vid 50 °C i en öppen 200 mL rund bottenkolv och K2CO3 i en glasflaska vid 90 °C.
- Blanda triolen med 6,4 mL diklormetan (DCM) och 4,246 g kaliumkarbonat (K2CO3) under argon.
- Blanda 2,72 mL akrylloylklorid i 27,2 ml DCM och tillsätt droppvis till reaktionsblandningen i kolven över 5 min.
- Täck reaktionsblandningen med aluminiumfolie och låt den ostört stå kvar i rumstemperatur i 24 h under argon.
- Efter 24 h, filtrera reaktionsblandningen med hjälp av ett filterpapper på en Buchnertratt under vakuum för att kassera överskottsreagenser.
- Fäll ut filtratet från steg 1.5 som innehåller den endcapped polymeren i diethyleter i en 1:3 (vol/vol) och rotovape vid 30 °C för att avlägsna den endthyleter.
2. Bildningen av polybubblet
OBS: Injicera polymer i dejoniserat (DI) vatten skulle orsaka polybubbles att migrera till botten av injektionsflaskan resulterar i tillplattad botten. Använd 10% (wt/vol) karboximetylcellulosa (CMC) fylla glasflaskan istället för att undvika polybubble tillplattad.
- Förbered 10% (wt/vol) CMC-lösning i DI-vatten.
- Fyll en 0,92 mL glasflaska med 0,8 mL på 10 % CMC med hjälp av en 1 mL överföringspip.
- Blanda 1000 mg/mL på 14 kDa PCL i DCM och syntetisera PCLTA i en 1:3 (vol/vol) för en total volym på 200 μL eller preparera 200 μL på 1000 mg/mL av 5 kDa poly (mjölksyra-ko-glykolsyra) diacrylate (PLGADA) i kloroform.
- Blanda 2-hydroxi-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-metylpropiofenon (fotoinitiator) med polymeren (PLGADA eller PCL/PCLTA) blandningen i 0.005:1 (vol/vol).
- Ladda 200 μL polymerblandning till en 1 mL-glasspruta monterad på en sprutpump som är ansluten till ett dispenseringsrör i rostfritt stål med en innerdiameter på 0,016 tum.
- Använd en mikromotor för att styra framåt och bakåt rörelse av polymerröret att injicera polymer i 10% CMC i glasflaskan för att bilda polybubble.
- Bota polybubblorna under ultraviolett (UV) vid 254 nm våglängd för 60 s vid 2 W/cm2.
- Flash frysa polybubblorna i flytande kväve och lyophilize över natten vid 0.010 mBar vakuum och vid -85 °C.
- Separera polybubblorna från den torkade CMC:en med hjälp av forceps och tvätta polybubblorna med DI-vatten för att avlägsna eventuell kvarvarande CMC. Observera att andra polymerer kan användas sannolikt med ändringar för att ändra frisättningskinetiken.
3. Modulering av polybubblediameter
- Fyll en 0,92 mL glasflaska med 10% CMC med hjälp av en 1 mL överföringspip.
- Blanda PCL/ PCLTA i en 1:3 (vol/ vol) med 1000mg/mL 14kDa PCL och syntetisera PCLTA. Blanda fotoinitiatorn med polymerblandning i en 0.005:1 (vol/vol).
- Ladda polymerblandningen i en 1 mL-spruta i glas som är monterad på en sprutpump som är ansluten till ett dispenseringsrör i rostfritt stål med en innerdiameter på 0,016 tum.
- Använd en mikromotor för att styra framåt och bakåt rörelse av polymerröret att injicera polymer i 10% CMC i glasflaskan för att bilda polybubble.
- För att erhålla polybubblor med olika diametrar, variera dispenseringsgraden från 0,0005 till 1 μL/s.
- Ta bilder av injektionsflaskan med polybubblorna med varierande diameter.
- Använd ImageJ för att kvantifiera diametern på polybubblorna och använd storleken på injektionsflaskan som skala.
4. Centrering last inom polybubble
-
Modulering av PCL/PCLTA viskositet med hjälp av K2CO3:
OBS: Viskositeten hos PLGADA behöver inte modifieras med hjälp av K2CO3 eftersom viskositeten på 5 kDa PDER vid 1000 mg/mL räcker för centrering av lasten.- Lägg till K2CO3 (som isolerades efter PCLTA-reaktionen) till PCLTA vid varierande koncentrationer inklusive 0 mg/mL, 10 mg/mL, 20 mg/mL, 40 mg/mL och 60 mg/mL.
- Mät lösningarnas dynamiska viskositeter genom att ändra skjuvhastigheten från 0 till 1000 1/s med hjälp av rheometri.
- Spruta in lasten manuellt i mitten (se steg 4.2 för att förbereda lastblandningen) av de polybubblor som bildades med hjälp av PCL/PCLTA-lösningarna med olika koncentrationer av K2CO3 (steg 4.1.1). Bestäm den optimala koncentrationen av K2CO3 genom att observera vilken lösning från steg 4.1.1 som kan resultera i kvarhållande av lasten i mitten.
-
Centrering av lasten (redan visat genomförbarhet med små molekyler) med CMC
- Blanda lasten med 5% (wt/vol) CMC i en rotator över natten för att öka viskositeten hos lasten.
- Spruta in 2 μL lastblandning manuellt i polybubblet och fortsätt med UV-härdning vid 254 nm våglängd i 60 s vid 2 W/cm2.
- Flash frysa polybubbles i flytande kväve för 30 s och lyophilize över natten vid 0.010 mBar vakuum och vid -85 °C.
- Separera polybubblorna från den torkade CMC:en med hjälp av forceps och tvätta med DI-vatten för att avlägsna eventuell kvarvarande CMC.
- Skär polybubblet på mitten och avbilda halvorna med hjälp av konfokalmikroskopi för att säkerställa att lasten är centrerad (se steg 6 för excitering och utsläppsvåglängder som används).
5. Cargo Formulering
OBS: Polybubble formulering kan hysa olika lasttyper, inklusive små molekyler, proteiner, och nukleinsyror.
- Baserat på tidigare studier, när det gäller proteinlast, använd hjälpämnen inklusive polyetylenglykol (PEG)6, polyvinylpyrrolidon (PVP), och glyopol6 för att förbättra stabiliteten hos protein under polybubble formulering.
- Bilda polybubbles baserat på protokollet i steg 2.
- Bered antigenlösningen genom att tillsätta 17,11 g trehalos till 625 μL hiv gp120/41 antigen.
- Spruta in manuellt 1 μL antigenlösning mitt i polybubblet.
- Öppna polybubblor på dag 0, 7, 14 och 21, och registrera fluorescensen av antigen med excitation och emissionsvåglängder 497 nm och 520 nm, respektive.
- Bestäm antigenens funktionalitet med hjälp av enzymlänkad immunosorbentanalys (ELISA) och använd 5 % fettfri mjölk som blockerande buffert.
6. Frisläppande av last
OBS: Liten molekyl eller antigen kan användas som lasttyp
-
Liten molekyl
- Inkubera polybubblor med centrerad acriflavine i 400 μL av fosfatbufferin (PBS) vid 37 °C, 50 °C för PLGADA polybubblor och vid 37 °C, 50 °C, 70 °C för PCL/PCLTA polybubbles.
OBS: Anledningen till att vi rekommenderar provning över kroppstemperaturer är att a) simulera temperaturen (50 °C) vid vilken polybubblet når medan laserning guld nanoroderna (AuNRs) inom PCL och PLGA; och b) påskynda nedbrytningsprocessen av PCL (50 °C, 70 °C). - Vid varje tidpunkt, samla supernatanterna och ersätt med 400 μL färsk PBS.
- Använd en tallriksläsare för att kvantifiera fluorescensintensiteterna i de insamlade supernatanterna.
OBS: Använd ex/em på 416 nm/514 nm för acriflavine.
- Inkubera polybubblor med centrerad acriflavine i 400 μL av fosfatbufferin (PBS) vid 37 °C, 50 °C för PLGADA polybubblor och vid 37 °C, 50 °C, 70 °C för PCL/PCLTA polybubbles.
-
Antigen
- Inkubera polybubbles med centrerad bovint albumin serum (BSA)-488 i 400 μL av PBS vid 37 °C, 50 °C för PLGADA polybubbles och vid 37 °C, 50 °C för PCL/PCLTA polybubbles.
- Vid varje tidpunkt, samla supernatanterna och ersätt med 400 μL färsk PBS.
- Använd en tallriksläsare för att kvantifiera fluorescensintensiteterna i de insamlade supernatanterna. Använd ex/em på 497 nm/520 nm för BSA-488.
OBS: Släppstudie vid 70 °C för PCL/PCLTA-polybubbles ska inte genomföras för att undvika att utsätta antigenet för extrem temperatur.
7. Toxicitet
-
Kvantifiering av klorhalt i polybubblor med hjälp av analys av neutronaktivering (NAA)
- Använd polybubbles som var lyophilized för 2, 4, 6, 20, och 24 h för denna studie vid 0.010 mBar vakuum och vid -85 °C .
- Mät 5-9 mg polybubbles och placera dem på LDPE-bestrålningsdylaler.
- Förbered 1000 g/mL klorkalibreringslösning från National Institute of Standards and Technology (NIST)-spårbar kalibreringslösning.
- Använd 1- megawatts Triga reaktor för att utföra neutronbestrålningar på varje prov vid neutronfluenshastighet på 9,1 × 1012 /cm2·s för 600 s.
- Överför polybubblorna till obestrålade injektionsflaska.
- Använd HPGe-detektor för att erhålla gammablixtspektra för 500 s efter 360 s sönderfallsintervall.
- Använd NAA programvara av canberra Industries för att analysera data.
-
Kvantifiera klorhalt frigörs från polybubbles med hjälp av NAA
- Inkubera polybubblor som var lyophilized över natten (vid 0.010 mBar vakuum och vid -85 °C) i 400 μL pbs vid 37 °C.
- Samla supernatanterna vid vecka 1, 2, och 3 efter inkubation.
- Analysera supernatanterna för klorhalt med NAA med samma metod som beskrivs ovan i steg 7.1.
8. AuNR Syntes av Kittler, S., et al.8
- Bered AuNR-såddlösning genom att blanda 250 μL av 10 mM kloreljinsyra (HAuCl4), 7,5 mL på 100 mM cetrimoniumbromid (CTAB), och 600 μL av 10 mM iskall natrium borohydrid (NaBH4).
- Förbered Tillväxtlösning genom att blanda 40 mL av 100 mM CTAB, 1,7 mL på 10 mM HAuCl4, 250 μL silvernitrat (AgNO3), och 270 μL på 17,6 mg/mL askorbinsyra till ett rör.
- Blanda 420 μL utsädeslösning kraftigt med tillväxtlösningen vid 1200 rpm i 1 min. Lämna sedan blandningen ostörd att reagera i 16 h.
- Avlägsna överskottsreagenserna från blandningen genom att centrifugera vid 8000 × g i 10 min och kassera supernatanten.
9. Hydrofobicisering av AuNRs av Soliman, M.G., et al.9
- Justera pH på 1,5 mL syntetiserade CTAB-stabiliserade AuNRs till 10 med hjälp av 1 mM natriumhydroxid (NaOH).
- Rör om lösningen med 0,1 mL 0,3 mM metylerad PEG (mPEG) tiolen vid 400 varv/min över natten.
- Blanda PEGylated AuNRs med 0,4 M dodecylamine (DDA) i kloroform vid 500 rpm i 4 dagar.
- Pipet ut det översta organiska lagret som innehåller hydrofobiciserade AuNRs och förvara på 4 °C fram till framtida användning.
10. NIR-aktivering av polybubbar
- Blanda polymeren (PLGADA eller PCL/PCLTA) lösningen med hydrofobiciserade AuNRs i en 1:9 (vol/vol).
- Lägg till fotoinitiator till polymer-AuNR-blandningen i en 0.005:1 (vol/vol).
- Bilda polybubblor genom att injicera polymer-AuNR-blandningen i en 0,92 mL glasflaska med 10 % CMC (wt/vol) (se steg 2).
- Bota polybubblorna vid 254 nm våglängd för 60 s vid 2 W/cm2.
- Flash frysa i flytande kväve för 30 s och lyophilize över natten vid 0.010 mBar vakuum och vid -85 °C.
- Separera de torkade polybubblorna med hjälp av forceps och tvätta med DI-vatten för att avlägsna eventuell kvarvarande CMC.
- Inkubera polybubblorna i 400 μL PBS vid 37 °C.
- Aktivera polybubblorna med hjälp av 801 nm NIR-laser vid 8A i 5 min varje måndag, onsdag och fredag.
- Ta framåtsytande infraröda (FLIR) bilder av polybubble före och efter laseraktivering för att erhålla temperaturvärden.
- Beräkna temperaturskillnader mellan före och efter laseraktivering baserat på temperaturvärdena från FLIR-bilderna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Polybubbles var omfattande karakteriseras med hjälp av SEM och NAA. Cargo var framgångsrikt centrerad för att resultera i en fördröjd burst release. Polybubbles var också framgångsrikt laser-aktiverad på grund av förekomsten av AuNRs inom polybubbles.
Polybubble karakterisering
Polybubblor som injicerades i en vattenlösning utan CMC resulterade i en tillplattad polybubble på grund av deras kontakt med glasflaskans botten (Figur 1A,B). Delvis tillplattning observerades när 5% CMC-baserad vattenlösning användes i stället för DI-vatten (Figur 1C). Därefter resulterade 10% CMC-baserad vattenlösning i glasflaskan i polybubblet suspenderas i lösningen och därmed framgångsrikt underhåll av sfärikitet av polybubblet (Figur 1D).
Centrering av last
Lastinsprutning i polybubblet i frånvaro av CMC resulterade i läckage som inte orsakade någon kvarhållning av last inom polybubblet (figur 3). För att motverka denna utmaning, två tillvägagångssätt användes: 1) viskositet pclta var framgångsrikt ökat med hjälp av K2CO3 som var isolerade efter endcapping PCL triol med triacrylate ( Figur 2 ), och2)viskositet av lasten var framgångsrikt ökat efter blandning av lasten med 5% CMC (Figur 3, Figur 4). Viskositeten hos PLGADA-polybubblorna var tillräckliga för att underlätta centrering av lasten och var därmed inte modulerad med hjälp av K2CO3.
Antigen funktionalitet
HIV-gp120/41 antigen blandades med och utan trehalos innan man injicerade i polybubblet (Figur 5). Bindande effektivitet av antikropp till antigenet (benämns som funktionalitet) med och utan trehalose observerades för att ha någon statistiskt signifikant skillnad.
Släpp studier utan laseraktivering
Fördröjda burst-utgåvor observerades i PLGADA polybubbles med acriflavine i mitten på dag 19 och 5 för polybubblor inkuberade vid 37 °C (figur 6A) respektive 50 °C (Figur 6B). Fördröjda burst-utgåvor observerades också i PCL/PCLTA polybubbles med acriflavine i mitten på dag 160 och 60 för polybubblor inkuberade vid 50 °C (Figur 7A) och 70 °C (Figur 7B), respektive. Dessa release studier genomfördes i avsaknad av laser-aktiveras AuNRs.
In vitro-laseraktivering av polybubblor
Polybubbles med AuNRs i skalet var framgångsrikt laser aktiveras flera gånger i PLGADA polybubbles (Figur 8A) och PCL / PCLTA polybubbles (Figur 8B). Temperaturförändringar från före och efter laseraktivering var 10 ± 1 °C och 5 ± 1 °C i PCL/PCLTA polybubbles med högre respektive lägre AuNR-koncentration i skalet. Temperaturförändringar som observerades före och efter laseraktivering var 11 ± 2 °C respektive 6 ± 1 °C i PLGADA-polybubbar med högre respektive lägre AuNR-koncentration i skalet.
Bild 1: Bibehållande av sfärikitet av polybubblor. SEM-bilder av (A) 14 kDa PCL/300 Da PCLTA tillplattad polybubble på grund av att polybubblets kontakt med glasflaskans botten; (B) 14 kDa PCL/300 Da PCLTA polybubble från toppen som inte var i kontakt med glasbotten; (C)polybubblorna PCL/PCLTA med mindre grad av tillplattning när de injiceras i en 5- procentig CMC-lösning jämfört med DI-vattenlösning, vilket orsakar bildningen av halvklotsliknande form vid kontaktpunkten med injektionsflaskan, (D) polybubble som inte nådde botten av glasflaskan när den injicerades i en 10% CMC-lösning, vilket gjorde det möjligt att bevara den sfäriska formen. Alla av de skalstreck som anges är 500 μm. Denna siffra har modifierats från Lee et al.7. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 2: Modulering av PCLTA-viskositet. Koncentrationen av K2CO3 höjdes från 0 till 80 mg/mL i PCLTA och dynamisk viskositet observerades för att öka proportionellt med koncentrationen K2CO3. Denna siffra har ändrats från Arun Kumar et al10. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 3: Lastinjektion i polybubblet med och utan CMC. Övre panelen visar ramar extraherade från video av lastläckage under injektion i avsaknad av CMC. Bottenpanelen visar ramar extraherade från videon av lastens retention inom polybubblet i närvaro av 5% CMC. Denna siffra har modifierats från Lee et al.7. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 4: Centrerad last. Fluorescerande mikroskop bilder av (A) PCL/PCLTA polybubble med centrerad last, (B) PCL/PCLTA polybubble med last i skalet och centrerad icke-fluorescerande färgämne. Denna siffra har ändrats från Arun Kumar et al10. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 5: Antigenfunktionalitet med trehalos. Funktionalitet av HIV gp120/41 med och utan trehalose inom polybubble analyserades med hjälp av ELISA. En antikropps bindningseffektivitet mot proteinet betraktas i allmänhet som en indikator för proteinets funktionalitet. När vi diskuterar antigens funktionalitet i denna studie, avser vi att det ska betyda att det hjälper de antikroppar som binder proteinet av intresse (vilket är en indikator för proteinfunktionalitet). Ingen statistisk signifikans observerades mellan de två grupperna. Konfidensintervall anges med heldragna och prickade linjer. Denna siffra har modifierats från Lee et al.7. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 6: Fördröjd burst release från PLGADA polybubbles. Release studier som visar fördröjd burst utsläpp från PLGADA polybubbles med acriflavine i mitten vid (A) 37 °C, (B) 50 °C. Heldragen linje anger den monterade kurvan som erhålls utifrån datapunkterna. Denna siffra har ändrats från Arun Kumar et al10. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 7: Fördröjd burst release från PCL/PCLTA polybubbles. Releasestudier som visar fördröjda burst-utgåvor från PCL/PCLTA polybubbles med acriflavine i mitten vid (A) 50 °C, (B) 70 °C. Denna siffra har ändrats från Arun Kumar et al10. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 8: NIR-laseraktivering av polybubblor. Temperaturförändring observerad före och efter NIR-laseraktivering i (A) PLGADA polybubbles, (B) PCL/PCLTA polybubbles med högre och lägre koncentration av AuNRs i polymerskalet. Denna temperaturökning skulle kunna utnyttjas för att eventuellt påskynda polymernedbrytningen som leder till tidigare utsläpp av lasten. Denna siffra har ändrats från Arun Kumar et al10. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nuvarande teknik och utmaningar
Emulsionsbaserade mikro- och nanopartiklar har ofta använts som läkemedelsbärare. Även om release kinetik av lasten från dessa enheter har studerats ingående, kontrollera burst release kinetik har varit en stor utmaning11. Lastens mångsidighet och funktionalitet är också begränsad i emulsionsbaserade system på grund av exponeringen av last för överskott av vattenhaltiga och organiska lösningsmedel. Proteinbaserad last är ofta inte kompatibla med mikro- och nanopartiklar på grund av möjligheten till lastdeaturering och aggregering12. Förutom laststabilitet är lastkinetik särskilt viktigt i samband med vacciner på grund av behovet av boosterskott som leder till serokonversion. Tidigare insatser för att ta itu med dessa utmaningar i vaccin leverans har inte varit tillräckligt framgångsrika, eftersom begreppet single injection vaccin system har funnits i ett par decennier och har ännu inte kliniskt översatts.
Vår plattform för leverans av polybubblevaccin kan potentiellt övervinna utmaningarna med ökad exponering av last för organiskt lösningsmedel genom att minimera den exponerade lastvolymen. Denna teknik kan potentiellt rymma minst två lastutrymmen: last i skalet och last i centrum. Polybubbles med centrerad last kan användas för att kontrollera burst release av lasten samtidigt som den är kompatibel med olika lasttyper, inklusive små molekyler och antigen. I denna studie använde vi polyester med varierande nedbrytningstider, PLGADA (kortare nedbrytningstid) och PCL/PCLTA (längre nedbrytningstid), som polymerbärarna och acriflavine (liten molekyl) som lasttyp för att påvisa fördröjd burst release. I följande avsnitt beskriver vi de avgörande stegen i att bilda polybubblor som kan möjliggöra både fördröjd burst release och NIR-aktivering, särskilt för framtida on-demand-leveransapplikationer.
Cargo centrering inom polybubble
Cargo centrering var en av de betydande utmaningar som påträffades under formuleringen av polybubbles. Omedelbart efter injektionen skulle last migrera till ytan och lastfickan skulle stabiliseras utan att brista i den vattenhaltiga 10% CMC-lösningen. Polybubblor med sådan off-centrerad last kan resultera i tidigare utsläpp på grund av den icke-enhetliga tjockleken på polymeren som omger lasten. Modulerande av polymerens viskositet och lasten var således avgörande för att lösa frågor som rör lastcentrering. Viskositeten hos lasten ökades genom att lastlösningen blandades med 5% CMC. För att öka polymerens viskositet kunde polymerens molekylvikt ha modifierats. Men ökande molekylvikt ofta resulterar i långsammare polymer nedbrytning vilket orsakar ytterligare fördröjning i last utsläpp. Polymerens viskositet modifierades således genom att öka koncentrationen av polymeren. Högre koncentration (1000 mg/mL) var tillräcklig för att öka viskositeten hos PLGADA. Viskositeten hos PCL/PCLTA var dock inte tillräcklig för att behålla lasten i mitten. K2CO3 som isolerades efter endcapping-reaktionen av PCLTA användes således för att öka viskositeten hos PCLTA.
Roman fördröjd release
Fördröjd burst release observerades från release studier som utförts med hjälp av polybubbles med centrerad last. Liten molekyl (acriflavine) användes som centrerad last i polybubblesna för att studera releaseprofilen. Unika releaseprofiler observerades baserat på den polyester som användes på grund av skillnaden i nedbrytningstiden för polymererna. Burst release observerades tidigare i PLGADA polybubbles jämfört med den för PCL/ PCLTA polybubbles. Tidig last release observerades i PLGADA polybubbles eftersom PLGA försämras snabbare jämfört med PCL13. Vid framgångsrik modulering av frisättningskinetik med två typer av polyester, ville vi vidare att konstruera polybubblet för att potentiellt möjliggöra frisättning av lasten på begäran.
NIR-aktivering av polybubbles
On-demand release av lasten med avseende på tidpunkten för patienternas behov har varit en utmaning att uppnå med hjälp av nuvarande leveransstrategier14. Vi hypotesen att påskynda lasten utsläpp på begäran skulle kunna vara möjligt genom att påskynda polymernedbrytning genom användning av NIR- känsliga (dvs. theranostic-möjliggörande) agenter. AuNRs har studerats ingående för sin förmåga att aktiveras med hjälp av NIR laser som kan resa några centimeter genom huden15. CTAB-stabiliserade AuNRs var således beredd baserat på protokollet av Kittler, S, et al. och var hydrofobicized på de metoder som publiceras av Solimon, M.G., et al. Polybubbles med hydrofobicized AuNRs i skalet var sedan bestrålas med NIR laser vid önskad tidpunkt punkter för 5 min att observera temperaturförändring. Temperaturer före och efter laser mättes baserat på FLIR-bilderna. Härdad polymer skal hjälpte till att bevara formen på AuNRs under laseraktiveringen vilket möjliggör flera NIR-aktiveringar av polybubblor. Detta är en intressant iakttagelse eftersom det i tidigare litteratur, AuNRs har ofta varit kända för att förlora sin stav-liknande form (avgörande för NIR aktivering) på grund avlaseraktivering 16. Den framgångsrika laseraktiveringen av polybubblorna med AuNRs kan bana väg för att kontrollera på begäran frisättning av lasten i nästa generation av polybubbles.
Signifikans och framtida tillämpningar
De resultat som erhållits från denna studie visar alltså att polybubblor har potential att användas som en ny vaccinleveransplattform. Beredning av polybubbles som beskrivs i detta dokument kommer att ytterligare göra det möjligt för andra forskare att använda polybubblor som en leveransplattform för andra terapeutiska tillämpningar. Till exempel, förutom vaccin leverans, polybubbles kan också potentiellt användas för att leverera synergistiska terapeutiska medel med varierande release kinetik. Vidare, polybubbles är gjorda av polyester som är biologiskt nedbrytbara och har använts i många FDA-godkända medicintekniska produkter. Vi validerade ytterligare säkerheten för polybubbles genom att visa att klor som frigörs från polybubblor ligger väl inom de säkerhetsnivåer som rekommenderas av EPA17. Således har vår nya, injicerbara, UV-härdbara polybubble plattform potential att användas som en säker och effektiv drug delivery plattform för en mängd olika lasttyper.
Begränsningar av denna teknik
Polybubble-plattformens teknik kan användas som en vaccinleveransplattform som potentiellt möjliggör kontrollerad frisättning. Våra studier belyser mångsidigheten hos denna plattform som kan leverera olika lasttyper, inklusive antigener och små molekyler. En av de nuvarande begränsningarna med denna teknik är dock att lasten för närvarande injiceras manuellt. För skalning ändamål, vi är för närvarande engineering en automatiserad plattform som kommer att möjliggöra injektion (dvs. som en array) av last inom polybubble och kommer potentiellt att bidra till att lindra oron för översättningsbarhet av denna teknik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författare har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi vill tacka Dr Bryan E. Tomlin anslutna till elementära analys labbet inom institutionen för kemi vid TAMU som bistod med neutronaktivering analys (NAA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Step Ultra Tetramethylbezidine (TMB)-Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Substrate Solution | Thermo scientific | 34028 | |
| 2-Hydroxy-2-methylpropiophenone | TCI AMERICA | H0991 | |
| 450 nm Stop Solution for TMB Substrate | Abcam | ab17152 | |
| Acryloyl chloride | Sigma Aldrich | A24109-100G | |
| Acriflavine | Chem-Impex International | 22916 | |
| Anhydrous ethyl ether | Fisher Chemical | E138-500 | |
| Anti-HIV1 gp120 antibody conjugated to horseradish peroxidase (HRP) | |||
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher BioReagents | BP9700100 | |
| BSA-CF488 dye conjugates | Invitrogen | A13100 | |
| Bromosalicylic acid | Acros Organics | AC162142500 | |
| Carboxymethylcellulose (CMC) | Millipore Sigma | 80502-040 | |
| Centrimonium bromide (CTAB) | MP Biomedicals | ICN19400480 | |
| Chloroform | Fisher Chemical | C2984 | |
| Coating buffer | Abcam | ab210899 | |
| Dichloromethane (DCM) | Sigma Aldrich | 270997-1L | |
| Diethyl ether | Fisher Chemical | E1384 | |
| Dodeacyl Amine | Acros Organics | AC117665000 | |
| Doxorubicin hydrochloride | Fisher BioReagents | BP251610 | |
| L-ascorbic acid | Acros Organics | A61 100 | |
| Legato 100 Syringe Pump | KD Scientific | 14 831 212 | |
| mPEG thiol | Laysan Bio | NC0702454 | |
| Nonfat dry milk | Andwin Scientific | NC9022655 | |
| Potassium carbonate | Acros Organics | AC424081000 | |
| Phosphate saline buffer | Fisher BioReagents | BP3991 | |
| (Poly(caprolactone) | Sigma Aldrich | 440744-250G | |
| (Poly(caprolactone) triol | Acros Organics | AC190730250 | |
| Poly (lactic-co-glycolic acid) diacrylate | CMTec | 280050 | |
| Potassium carbonate | Acros Organics | AC424081000 | |
| Recombinant HIV1 gp120 + gp41 protein | Abcam | ab49054 | |
| Silver nitrate | Acros Organics | S181 25 | |
| Sodium borohydride | Fisher Chemical | S678 10 | |
| Tetrachloroauric acid | Fisher Chemical | G54 1 | |
| Trehalose | Acros Organics | NC9022655 | |
| Triethyl amine | Acros Organics | AC157910010 |
References
- World Health Organization. Global Immunization: Worldwide Disease Incidence. , Children's Hospital of Philadelphia. https://www.chop.edu/centers-programs/vaccine-education-center/global-immunization/diseases-and-vaccines-world-view (2018).
- Paul, A., Bera, M., Gupta, P., Singh, N. D. P. o-Hydroxycinnamate for sequential photouncaging of two different functional groups and its application in releasing cosmeceuticals. Organic and Biomolecular Chemistry. 17 (33), 7689-7693 (2019).
- Kumari, A., Yadav, S. K., Yadav, S. C. Biodegradable polymeric nanoparticles based drug delivery systems. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 75 (1), 1-18 (2010).
- Dai, C., Wang, B., Zhao, H. Microencapsulation peptide and protein drugs delivery system. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 41 (2-3), 117-120 (2005).
- Souery, W. N., et al. Controlling and quantifying the stability of amino acid-based cargo within polymeric delivery systems. Journal of Control Release. 300, 102-113 (2019).
- Wang, W. Advanced protein formulations. Protein Science. 24 (7), 1031-1039 (2015).
- Lee, J., et al. An ultraviolet-curable, core-shell vaccine formed via phase separation. Journal of Biomedical Materials Research Part A. , (2019).
- Kittler, S., Hickey, S. G., Wolff, T., Eychmüller, A. Easy and Fast Phase Transfer of CTAB Stabilised Gold Nanoparticles from Water to Organic Phase. Zeitschrift für Physikalische Chemie. 229, 235 (2015).
- Soliman, M. G., Pelaz, B., Parak, W. J., del Pino, P. Phase Transfer and Polymer Coating Methods toward Improving the Stability of Metallic Nanoparticles for Biological Applications. Chemistry of Materials. 27 (3), 990-997 (2015).
- Arun Kumar, S., Good, J., Hendrix, D., Yoo, E., Kim, D., Deo, K. A., Jhan, Y. Y., Gaharwar, A. K., Bishop, C. J. Nanoengineered Light-Activatable Polybubbles for On?Demand Therapeutic Delivery. Adv. Funct. Mater. , 2003579 (2020).
- Wuthrich, P., Ng, S. Y., Fritzinger, B. K., Roskos, K. V., Heller, J. Pulsatile and delayed release of lysozyme from ointment-like poly(ortho esters). Journal of Controlled Release. 21 (1), 191-200 (1992).
- Wang, W. Instability, stabilization, and formulation of liquid protein pharmaceuticals. International Journal of Pharmaceutics. 185 (2), 129-188 (1999).
- Wong, D. Y., Hollister, S. J., Krebsbach, P. H., Nosrat, C. Poly(epsilon-caprolactone) and poly (L-lactic-co-glycolic acid) degradable polymer sponges attenuate astrocyte response and lesion growth in acute traumatic brain injury. Tissue Engineering. 13 (10), 2515-2523 (2007).
- Davoodi, P., et al. Drug delivery systems for programmed and on-demand release. Advanced Drug Delivery Reviews. 132, 104-138 (2018).
- Huang, Y. C., Lei, K. F., Liaw, J. W., Tsai, S. W. The influence of laser intensity activated plasmonic gold nanoparticle-generated photothermal effects on cellular morphology and viability: a real-time, long-term tracking and monitoring system. Photochemical and Photobiological Sciences. 18 (6), 1419-1429 (2019).
- Link, S., Burda, C., Nikoobakht, B., El-Sayed, M. A. Laser-Induced Shape Changes of Colloidal Gold Nanorods Using Femtosecond and Nanosecond Laser Pulses. The Journal of Physical Chemistry B. 104 (26), 6152-6163 (2000).
- U.S. Environmental Protection Agency. Chlorine. , https://www.epa.gov/sites/production/files/2016-09/documents/chlorine.pdf (2000).
