Summary
ここで提示するプロトコルは、ヒト胚性幹細胞の単細胞培養の生成とその後の神経前駆細胞への分化のためのプロトコルである。プロトコルは、シンプルで堅牢でスケーラブルで、薬物スクリーニングや再生医療用途に適しています。
Abstract
ヒト胚性幹細胞(hESC)のインビトロ分化は、生物学的および分子レベルの両方で人間の発達を研究する能力を転換し、再生用途に使用する細胞を提供しました。コロニー型培養を用いたhESC培養に対する標準的なアプローチは、未分化のhESCおよび胚体(EB)を維持し、異なる胚層への分化のためのロゼット形成は非効率的で時間がかかる。ここで紹介する単細胞培養法は、コロニー型培養物の代わりにhESCを用いた方法である。この方法により、コロニー型hESCに匹敵するレベルでのhESCマーカーの発現を含む、未分化hESCの特徴を維持することができます。さらに、このプロトコルは、1週間以内にNPCを産生する単一細胞型hESCからの神経前駆細胞(NPC)生成のための効率的な方法を提示する。これらの細胞は、いくつかのNPCマーカー遺伝子を高度に発現し、ドーパミン作動性ニューロンおよびアストロサイトを含む様々な神経細胞型に分化することができる。hESC用のこの単細胞培養システムは、これらのプロセスの分子機構、特定の疾患の研究、および創薬画面の調査に役立ちます。
Introduction
ヒト胚性幹細胞(hESC)は、3つの一次生殖層に分化する可能性を有し、その後、様々な多能性前駆細胞系統に分化する。これらの系統は、その後、人体内のすべての細胞タイプを生じる.in vitro hESC培養システムは、ヒト胚発生を研究する能力を変革し、これらのプロセスが生物学的および分子レベルでどのように調節されるかについての新しい洞察を得るための貴重なツールとして機能してきました。同様に、ヒト患者から単離された体細胞のリプログラミングから生じる人工多能性幹細胞(iPSC)の研究は、様々な疾患に対する新しい洞察を提供する。また、hESC由来の前駆細胞および分化細胞は、幹細胞治療および薬物スクリーニング1、2、3、4を含む研究に有用であり得る。
hESCは、広範な自己再生能力を有する多電位細胞である神経前駆細胞(NPC)に分化するように誘導することができる。続いて、これらの細胞は、ニューロン、アストロサイト、およびオリゴデンドロサイト5、6に分化することができる。NPCはまた、神経発達生物学と様々な神経疾患のインビトロ研究のための細胞システムを提供しています.しかしながら、hESCとNPCへのその分化を含む現在のコロニー型培養方法は非効率的であり、多くの場合、胚体(EB)およびロゼット形成5、7、8、9と同様に共培養を伴う。これらのプロトコルは、低い生存率と自発的な分化を示し、より時間がかかります。
ここで紹介する、容易にスケーラブルで、hESC10の高密度単一細胞型培養を使用する改良された堅牢な培養システムである。Roh-キナーゼ(ROCK)阻害剤の含有は、hESC10、11、12、13、14の単一細胞型培養中の生存効率を有意に高めることに寄与した。このカルチャシステムでは、hESC を簡単に保守および拡張できます。さらに、このプロトコルは、hESCの単一細胞型培養物からNPCを生成する効率的な方法を提示し、高純度NPCの産生を可能にする。
要約すると、hESCを用いた単一細胞型培養プロトコルは、NPCを含む様々な系統へのこれらの細胞の分化を研究する魅力的なモデルを提供する。このプロトコルは簡単にスケーラブルであり、したがって、再生療法や薬物スクリーニングを含む研究のための細胞を生成するのに適しています。
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Protocol
1. hESC認定基底膜マトリックスコーティングプレートの調製
- hESC認定基底膜マトリックス(材料表参照)溶液を少なくとも2~3時間または一晩でゆっくりと解凍し、ゲルの形成を避けます。
- 基底膜マトリックスコーティングプレートを調製するために、冷間DMEM/F12で希釈マトリックスを2%の最終濃度にする。よく混合し、希釈されたマトリックス溶液の1 mLで6ウェルプレートの各ウェルをコーティングします。
- 基底膜マトリックスコーティングプレートを室温(RT)で少なくとも3時間または4°Cの一晩でインキュベートする。
注:基底膜マトリックスを有するプレートは、マトリックス溶液が除去され、プレートが使用される前に、4°Cで1週間保存することができます。
2. コロニー型hESCの単細胞hESC培養への適応
- 基底膜マトリックス上で増殖したコロニー型H9(WA09)hESCのフィーダーフリー培養物を通過させ、ウェルから培地を吸引する(図1A)9。
- DPBSの1 mLで1xを洗浄します。ウェルあたり1mLのディスパーゼ溶液(1 U/mL)を加え、37°Cで20分間インキュベートします。
- ディスパーゼを取り除き、DMEM/F12の2 mLで細胞1xを穏やかに洗い、培地を取り除き、各プレートに2mLのDMEM/F12を加えます。
- ゆっくりと上下にピペットをしてコロニーを取り外し、15 mLチューブに移します。
- 370 x gで2分間ペレットを遠心分離し、培地を吸引する。
- 細胞ペレットを単一細胞に解離するには、2mLの細胞剥離溶液(1x濃度、材料表参照)を加え、37°Cで10分間インキュベートします。
- 370 x gで2分間の遠心分離細胞を取り外し、剥離溶液を除去する。
- 新鮮なmTeSR1ヒトESC培地を追加し、穏やかなピペット上下によって単一細胞に細胞を解解き分けます。
- コロニー型hESCを単一細胞型培養に適合させるには、10μM ROCK阻害剤を24時間含むmTeSR1の2mLの基底膜マトリックスコーティング6ウェルプレートの各ウェルに約1.5〜2.0 x 106 hESCをプレートする(図1A)。
- 24時間後、hESC培地をROCK阻害剤なしで新鮮なmTeSR1に交換し、hESCが3日間単一細胞型として成長できるようにします。毎日メディアを変更します。
- 4日目に、培養物が100%近いコンフルエンスに達したら、剥離溶液中の細胞を解離し、次いでステップ2.6に記載の方法で再プレートする。
注:ROCK阻害剤は、単一細胞型hESC培養の初期24時間の間に細胞生存率を向上させる。
3. 胚体形成と3つの生殖層への分化 (図2)
- EBを形成するには、最初の24時間の間に10μM ROCK阻害剤を用いてmTeSR1培地の3 mLで細胞を再サスペンドし、次に37°インキュベーターで60mmの低付着皿に一晩インキュベートして凝集を可能にする。
- 24時間後、小さなEBは15 mLチューブに移される。EBをチューブの底部に落ち着かせ、ピペットで媒体を軽く取り除きます。EB培地にEBを転写し(20%ノックアウト血清置換を補ったノックアウトDMEM、1xグルタミンサプリメント[材料表を参照]、1%NEAA[非必須アミノ酸;材料表]、および0.2%β-メルカプトエタノールを参照)、7日間低い付着皿で拡大することを可能にする。培地は、上述したように1日おきに変更することができます(図2A)。
- 7日目に、食器からEBを収集し、15 mLチューブに転送します。ピペットで媒体を軽く取り出し、ベース膜マトリックスコーティングされた6ウェルプレートにEBを移します。
- EBをプレートに取り付け、EB培地で12日間インキュベートし、その間に3つの胚芽層に分化させます(図2B)。1 日おきにメディアを変更します。
メモ:セルの凝集中に、低い添付ファイルの皿はEBの付属品を避けるのに役立つ。
4. 単一セル型hESCをNPCに差別化する (図 3)
- NPC分化を誘導するには、1mLの剥離溶液(1x)で単一細胞型hESCを解離し、37°Cで10分間インキュベートする。
- 370 x gで2分間細胞を遠心分離し、剥離溶液上清を除去する。DMEM/F12を1mL加え、穏やかなピペットで細胞を再サスペンドします。
- 10μM ROCK阻害剤を含有するmTeSR1の2mLにおける2x105細胞/ウェルの密度で基底膜マトリックスコーティングされた6ウェルプレート上のプレートセル。
- 24時間後、培養培地を1μMドルソモルフィンと5μM SB431542を補充した神経誘導培地(DMEMと1%B27からビタミンA)に交換します。
- 神経誘導の最初の4日間は1日おきに培地を交換し、その後7日目に合流に達するまで毎日を変更する(図3B)。
注:(1)ドルソモルフィンはALK2,3,6受容体を標的とすることによりBMP経路を阻害し、AMPKを阻害する;SB431542はALK5,7を標的とすることによりTGFβ/アクチビン経路の阻害剤である。(2) 同じプロトコルを別の ESC 回線(WA01)でテストし、WA0916と同様の結果をもたらしました。(3)我々は、一般的に基底膜マトリックスにマトリゲルを使用しています。しかし、細胞をゲルトレックス上で培養し、いくつかのNPCマーカーの発現によって示されるように非常によく似た結果を持つNPCに分化することができます(図4D,E)。マトリゲルと同じ方法でゲルトレックスを取り扱います(セクション1を参照)。
5. NPCの拡大と凍結保存
- 神経誘導の7日後、1mLの剥離溶液(1x)で細胞を解離し、37°Cで10分間インキュベートする。
- 370 x gで2分間細胞を遠心分離し、剥離溶液上清を除去する。NPC 膨張媒体を 1 mL 加え(材料表を参照)、穏やかなピペットによって細胞を再サスペンドします。
- 基底膜マトリックスコーティングされた6ウェルプレート上のNPC膨張培地の2mL中のプレート1x105細胞。
- 培養が90%近くに達すると、必要に応じて何度もNPCを通過する。最初の3~4回の通路では、細胞死を防ぐために、最初の24時間に10μM ROCK阻害剤を添加します。これらの通路の後、細胞はROCK阻害剤なしで通過および培養することができる。拡張中に 1 日おきにメディアを変更します。
- 培養が合流に達すると、凍結NPC。
- 凍結保存のために、37°Cで5分間剥離溶液(1x)の1mLで細胞を解離し、次いで370 x gで2分間遠心分離懸濁液を除去する。
- 細胞凍結溶液(材料表参照)を加え、1 x 106細胞/mLでNPCを解剖し、1mLのアリコートをクライオビアーに分配します。
- 凍結容器に凍結容器に入れ、-80°Cの冷凍庫に一晩保存します。
- 凍結膜を液体窒素に入します。
6. ポリL-オルニチン(PLO)およびラミニンコーティングプレートの調製
- PLO/ラミニンコーティングプレートを調製するには、PLO原液をPBSまたは水に希釈し、最終濃度10μg/mLにします。よく混ぜ、希釈されたPLO溶液の1 mLで6ウェルプレートの各ウェルをコーティングします。
- 少なくとも2時間、37°Cでインキュベートするか、4°Cで一晩インキュベートする。
- PBSでそれぞれをよく洗います。
- 冷たいPBSまたは水の希薄ラミニン原液を10μg/mLで希釈します。ラミニン溶液をよく混ぜます。PBSを取り外し、直ちにラミニン溶液1mLで各ウェルをコーティングします。プレートは4°Cに保ち、1週間以内に使用してください。PBSで洗浄し、すぐに培養培地を追加します。
メモ:PLO/ラミニンコーティングプレートを乾燥させないでください。
7. ドーパミン作動性ニューロンへのhESC由来NPCの分化 (図 6A)
- 約50%の密度でNPC膨張媒体中のPLO/ラミニンコーティングされた料理のプレートNPC。
- 24時間後、培地をDA1培地(2mMグルタミンサプリメントを含む神経バサバル培地、1x NEAA、1x B27、200ng/mL SHH、および100ng/mL FGF8)に変更し、1日おきに培地を変更する。
- 彼らが合流に達したときの通路文化。1 mLの剥離溶液(1x)で細胞を解離し、37°Cで10分間インキュベートする。
- 370 x gで2分間細胞を遠心分離し、剥離溶液上清を除去する。DA1培地を1mL加え、穏やかなピペットで細胞を再サスペンドします。
- プレート1 x 105細胞を2mLのDA1培地でPLO/ラミニンコーティング6ウェルプレートに記載。
- 10日後、DA2培地(2mMグルタミンサプリメントを含む神経バサガル培地、1x NEAA、1x B27、200μMアスコルビン酸、20ng/mL BDNF、および20 ng/mL GNDF)に変更し、さらに20日間1日おきに培地を変更する(図6A)。
メモ:DA2培地に新鮮なアスコルビン酸を毎日追加します。最初の14日以内に、分化した細胞は90%のコンフルエンスに達したときに渡されるべきですが、その後は渡す必要はありません。
8. ESC由来NPCをアストロサイトに分化する
- 約50%の密度でNPC膨張培地中のPLO/ラミニンコーティングプレート上のプレート神経前駆細胞。
- 24時間後、培地をアストロサイト培地(DMEM/F12培地を含む1:100 N2、1:100 B27、200ng/mL IGF、10ng/mLアクティビンA、10ng/mLヘレグリンβ-1、および8 ng/mL bFGF)に変更し、1日おきに培地を変更する。
- 彼らが合流に達したときの通路文化。1 mLの剥離溶液(1x)で細胞を解離し、37°Cで10分間インキュベートする。
- 370 x gで2分間細胞を遠心分離し、剥離溶液上清を除去する。1 mLのアストロサイト培地を追加し、穏やかなピペットによって細胞を再サスペンドします。
- PLO/ラミニンコーティングされた6ウェルディッシュ上のアストロサイト培地の2 mL中のプレート1 x 105細胞。
- 差別化を合計 5 ~ 6 週間継続できるようにします (図 6B)。
9. 免疫蛍光染色
- 上記の細胞タイプごとに35mmμ皿で培養する。培地を吸引し、1皿あたり4%PFA溶液の1 mLを加え、RTで20分間インキュベートします。
- PBSで2xを5分間洗う。
注:細胞が固定されると、アッセイプレートをパラフィルムで密閉し、4°Cで保存することができます。固定後1週間以内に抗体で染色する。 - 1皿あたり300μLのブロッキング溶液(PBSのヤギまたはロバ血清)を加え、RTで30~60分間インキュベートします。
- 料理2xをPBSで5分間洗います。
- 300 μLの一次抗体(表1)溶液(ブロッキング溶液で希釈)を加え、RTで1.5時間または4°Cで一晩インキュベートします。
- PBSで2xを10分間洗う。
- 300 μL の蛍光共役二次抗体 (表 1)をブロッキング溶液に加え、暗闇の中で1時間RTでインキュベートします。
- 細胞を2倍にPBSで10分間洗浄します。
- ハフスト染色液(PBSでは1μM最終濃度)を加えて核を染色します。暗闇の中の細胞をRTで5分間インキュベートします。
- 細胞1xをPBSで5分間洗浄し、500μLのPBSを加える。皿を暗闇の中に置き、共焦点顕微鏡で蛍光を観察します(図2B、図5C、図6A、図7B)。
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Representative Results
ここで提示する、hESCの単一細胞型培養の維持と拡大のための改良されたプロトコルと、神経前駆細胞への効率的な分化は、その後、様々な下流の神経系統に分化し、ドーパミン作動性ニューロンおよびアストロサイトを含む。
代表的な位相差画像は、コロニー型hESCを単一細胞型培養物に適応させる間、異なる工程で細胞形態を示す(図1A)。単細胞培養条件を通じて、適合したhESCを高密度に維持することができ、その後、コンフルエントに達すると容易かつ効率的にサブカルチャー化できることがわかった(図1A,B)。これらの細胞は、コロニー型hESCの典型的な細胞周期特性(すなわち、S相における細胞の短いG1位および高い割合)を保持した(図1C,D)。また、ESCマーカー(すなわち、OCT4、TRA 1-81、SOX2、およびNANOG)を、QRT-PCRおよび免疫染色分析で示されるコロニー型hESCのレベルに匹敵するレベルで発現した(図7、表2)。また、単細胞hESCは、内胚(SOX17発現)、中胚葉(SMA発現)、外胚葉(Tuj-1発現)の3つの生殖層すべてから細胞を含む胚体を形成できることが示された(図2)。
次に、NPCプロトコル(図3A)を用いて神経前駆細胞に単一細胞型hESCが効率的に分化することが実証された(図3A)。NPC の差別化は、シグネチャ NPC マーカー (SOX1、OTX2、ZIC1、および OTX1;図5A、表2)を免疫染色およびFACS分析により確認した。同じ分析では、細胞の90%以上がSOX1、PAX6、およびNCAMタンパク質に対して陽性に染色されたことも示された(図5B,C)。単細胞hESC由来NPCが様々な下流神経系統に分化する能力を調べるために、これらの細胞をドーパミン作動性ニューロンおよびアストロサイトに分化することを検討した。図6A,Bに示すように、単細胞hESC由来NPCは、特徴的な形態の出現および系統特異的ドーパミン作動マーカーの発現によって示されるドーパミン作動性ニューロンおよびアストロサイトに分化することができた(すなわち、TH;図6A)およびアストロサイトマーカー(すなわち、GFAPおよびS100B;図 6B) を図 6 に示します。
図1:コロニー型hESCを単一細胞型培養に適応させる。(A)2%基底膜マトリックスコーティングされた皿にめっきした後、異なる時間におけるH9 hESCの単一細胞培養物の代表的な位相コントラスト画像。低(左)と高い(右)倍率。トップパネル:コロニータイプhESCの代表的な画像。他のパネルは、単一細胞型hESCへの適応中に異なる時間における培養物の代表的な画像を示す。スケール バー = 200 μm。(B)H9 hESCの成長曲線は、単一細胞培養条件下で最初の24時間10μM ROCK阻害剤を有する2%基底膜マトリックスコーティングプレートでモニタリングした。(C,D)フローサイトメトリーによるコロニー型(C)及び単細胞型(D)H9hESCの細胞周期解析この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:適応した単一細胞型hESCを3つの生殖層にインビトロ分化する。(A)HESCの単一細胞型に由来する胚体(EB)の代表的な相画像。スケール バー = 100 μm。(B)3つの異なる生殖層マーカーの発現について分析した分化hESCの免疫蛍光画像:SOX17(内胚葉)、SMA(中胚葉)、およびTuj-1(外胚葉)。核をDAPIで染色した。スケール バー = 50 μm。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:直接分化による神経前駆細胞への単一細胞型hESCの分化(A) 神経前駆細胞(NPC)へのhESCの分化プロトコルの概略図hESCは、めっき後1日目にドルソモルフィン(DMH)およびSB431542(SB)で処理した。(B) 神経分化時の細胞形態の代表的な位相コントラスト画像スケール バー = 200 μm。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:異なる基底膜マトリックス産物に対するhESC培養。(A)マトリゲルまたはゲルトレックスで培養したhESCは、単一細胞培養に類似したNPCに成長・分化する能力を示した。細胞をNESTIN抗体で染色した。核をDAPIで染色した。スケール バー = 50 μm。(B)マトリゲルまたはゲルトレックスで培養したhESCは、NESTIN-およびPAX6陽性細胞の割合によって示されるNPCに分化する同様の可能性を示した。細胞はNPC分化の7日目にフローサイトメトリーにより分析した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 5: NPC マーカーの式(A)7日間の神経分化後、NPCマーカー遺伝子(すなわち、OTX1、OTX2、SOX1、およびZIC1)の発現をQRT-PCRにより分析した。値は GAPDH に正規化され、hESC の値に対して相対的に計算されました (p < 0.05)。(B)SOX1-、NESTIN-、SOX2-、およびNCAM陽性細胞の割合は、NPC分化の7日目のフローサイトメトリーによって決定した。(C)7日目のNPC分化で、細胞を神経マーカーSOX1、NESTIN、NCAM、OTX2、およびPAX6に対する抗体で染色した。核をDAPIで染色した。スケール バー = 100 μm。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:単一細胞型hESCに由来するNPCのドーパミン作動性ニューロンとアストロサイト分化(A)ドーパミン作動性ニューロンの代表的な位相コントラスト画像(トップパネル)。スケール バー = 100 μm。分化した細胞を、示すようにドーパミン作動性ニューロンマーカーTH(チロシンヒドロキシラーゼ)に対する抗体で染色した。核をDAPIで染色した。スケール バー = 50 μm。(B)アストロサイト(トップパネル)の代表的な位相コントラスト画像。スケール バー = 100 μm。分化した細胞を、アストロサイトマーカーGFAP(グリア線維性酸性タンパク質)およびS100-B(S100カルシウム結合タンパク質B)に対する抗体で染色した。核をDAPIで染色した。スケール バー = 50 μm。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 7: 単一セル型 hESC の特性評価(A)単一細胞型培養に適合したhESCを、QRT-PCRによるESCマーカー(すなわち、OCT4、NANOG、およびSOX2)の発現について分析した。値は GAPDH (p < 0.05) に正規化されました。(B)多能性マーカーOCT4、TRA-1-81、およびSSEA-1の発現のために染色されたhESCの免疫蛍光画像。核をDAPIで染色した。スケール バー = 50 μm。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 一次抗体 | 種 | 希釈 | カタログ番号 | 会社 |
| OCT4 | マウス | 1:1000 | sc-5279 | サンタクルス |
| TRA 1-81 | マウス | 1:500 | sc-21706 | サンタクルス |
| SSEA-1 | マウス | 1:500 | sc-21702 | サンタクルス |
| SOX1 | ヤギ | 1:500 | AF-3369 | 研究開発 |
| SOX2 | ウサギ | 1:1,000 | sc-20088 | サンタクルス |
| Sma | ウサギ | 1:500 | ab-5694 | アブタム |
| Tuj1 | マウス | 1:1000 | T8578 | シグマ |
| ネスティン | マウス | 1:1000 | ab-22035 | アブタム |
| OTX2 | マウス | 1:250 | ab-21990 | アブタム |
| hNCAM | マウス | 1:200 | sc-106 | サンタクルス |
| hPAX6 | マウス | 1:250 | 561664 | Bd |
| 番目 | マウス | 1:500 | T1299 | シグマ |
| S100b | マウス | 1:250 | ab4066 | アブタム |
| GFAP | ウサギ | 1:1,000 | ab7260 | アブタム |
| 二次抗体 | ||||
| アンチマウス | ヤギ | 1:1,000 | AF 488 または 647 | ライフテクノロジーズ |
| 抗ウサギ | ヤギ | 1:1,000 | AF 488 または 647 | ライフテクノロジーズ |
表1:免疫細胞化学およびFACS分析に用いられる抗体。
| プライマー名 | プライマー配列 | |
| OCT4 | F: GGAAGGTATTCAGCCAAACG | |
| R: CTCCAGGTGCCTCTCTCtCtCC | ||
| NANOG | F: GGTCCAGAACCAGA | |
| R: ATGGAAGGTTCAGTG | ||
| SOX1 | F: CCTTAGGTTCTCTCTCTTTTT | |
| R: カグクトガットCtCTCTCTCTCTCTCTCTTT | ||
| OTX1 | F: アガトカACCTGCCGGGTCT | |
| R: CGTGAATTGGACTGCTTT | ||
| OTX2 | F: TGGAAGCACTGTTGCCAAG | |
| R: タアACCACCTGCCTG | ||
| ZIC1 | F: AACCCCAAAAAGtCGTAAC | |
| R: TCCTCCCAGAAGCAGATGTGA | ||
| GAPDH | F: CCCATCACCTCCAGAG | |
| R: CTCTCCATGGGGTGGGAAGG | ||
表2:QRT-PCR解析で使用されるプライマーのリスト
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Discussion
様々な系統へのhESCの分化および十分な数の分化細胞の生成のためのスケーラブルで効率的な方法は、薬物スクリーニングおよび幹細胞治療のための重要な基準である。様々な単細胞通過方法が公表されており、細胞は生存を改善するためにROCK阻害剤または他の小分子の存在下で培養されるが、これらの培養方法の最終産物はコロニー型hESC17、18、19、20、21である。以前に公開された方法19、20、21、22に部分的に基づく単一セル ESC プロトコルは、単一セル型 hESC 培養を正常に生成および維持し、コロニー型 hESC 培養を防止します。高密度単一細胞めっき、多細胞会合、単層増殖、効率的なサブカルチャーが含まれる(図1)。後者は、hESCの単一細胞型培養の初期24時間の間にROCK阻害剤を添加することによって達成され、これは細胞生存期間17、18、19、20、21を改善する。このプロトコルは、より容易にスケーラブルであり、薬物スクリーニングおよび幹細胞における治療用途のためのこれらの細胞の拡張を可能にする。
さらに、単一細胞型hESCは、EBおよびロゼット形成23、24、25などの中間段階を使用せずにNPC系統(図3)に効率的に分化できることを実証する。単一細胞型hESCからの高い神経変換は、ALK阻害剤、ドルソモルフィン、およびSB431542 15、16、26による治療によるBMP/TGFβ/アクチビンシグナル伝達経路の阻害によって達成された。このプロトコルを使用すると、適応した単一細胞型hESCは、EBおよびロゼット形成を必要とせずにNPCに効率的に分化することができ(図5)、またはドーパミン作動性ニューロンおよびアストロサイトに分化するように誘導される(図6)。
要約すると、hESCの単一細胞型培養は、様々な系統に対する多段階分化を調節する分子機構を研究するための迅速かつ効率的なシステムを提供する。具体的には、このプロトコルは、NPCを利用し、アストロサイトやドーパミン作動性ニューロンなどの追加の神経系統へのその後の分化を記述した。このプロトコルは、基礎研究、薬物スクリーニング、再生医療への応用に適した前駆細胞および分化細胞のシンプルで堅牢でスケーラブルな生産のためのプラットフォームを提供します。
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Disclosures
著者は利益相反を宣言しない。
Acknowledgments
カール・D・ボルトナー博士(NIEHS)のFACS分析への協力に感謝します。この研究は、国立環境衛生科学研究所、国立衛生研究所Z01-ES-101585の村内研究プログラムによってAMJに支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm m-dishes | ibidi | 81156 | Cell culture dish |
| 6-well plates | Corning | 3516 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104-500 | Cell detachment solution |
| Activin A | R&D system | 338-AC-050 | |
| Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A4403 | |
| B27 supplement | Thermo Fisher | 17504044 | |
| B27 supplement (-Vit A) | Thermo Fisher | 12587010 | |
| BDNF | Applied Biological Materials | Z100065 | |
| bFGF | Peprotech | 100-18C | |
| Centrifuge | DAMON/ICE | 428-6759 | |
| CO2 incubator | Thermo Fisher | 4110 | |
| Corning hESC-qulified Matrix (Magrigel) | Corning | 354277 | Basement membrane matrix (used for most of the protocol here) |
| Cryostor CS 10 | Stemcell Technologies | 7930 | Cell freezing solution |
| Dispase | Stemcell Technologies | 7923 | |
| DMEM | Thermo Fisher | 10569-010 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher | 10565-018 | |
| Dorsomorphin | Tocris | 3093 | |
| EGF | Peprotech | AF-100-16A | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | SH3007003HI | |
| FGF8 | Applied Biological Materials | Z101705 | |
| GDNF | Applied Biological Materials | Z101057 | |
| Geltrex matrix | Thermo Fisher | A1569601 | Basement membrane matrix |
| GlutaMax | Thermo Fisher | 35050061 | Glutamine supplement, 100X |
| H9 (WA09) human embryonic stem cell line | WiCell | WA09 | |
| Heregulin b-1 | Peprotech | 100-3 | |
| IGF | Peprotech | 100-11 | |
| Knockout DMEM | Thermo Fisher | 10829018 | |
| Knockout Serum Replacement | Thermo Fisher | 10828028 | |
| Laminin | Sigma Aldrich | L2020 | |
| mTeSR1 | Stemcell Technologies | 85850 | hESC culture medium |
| N2 supplement | Thermo Fisher | 17502001 | |
| NEAA | Thermo Fisher | 11140050 | |
| Neurobasal | Thermo Fisher | 21103049 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma Aldrich | P3655 | |
| ROCK inhibitor | Tocris | 1254 | |
| SB431542 | Tocris | 1614 | |
| SHH | Applied Biological Materials | Z200617 | |
| Stemdiff Neural Progenitor medium | Stemcell Technologies | 5833 | NPC expansion medium |
References
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Rosler, E. S., et al. Long-term culture of human embryonic stem cells in feeder-free conditions. Developmental Dynamics. 229 (2), 259-274 (2004).
- Mallon, B. S., Park, K. Y., Chen, K. G., Hamilton, R. S., McKay, R. D. Toward xeno-free culture of human embryonic stem cells. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 38 (7), 1063-1075 (2006).
- Hoffman, L. M., Carpenter, M. K. Characterization and culture of human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 23 (6), 699-708 (2005).
- Yan, Y., et al. Efficient and rapid derivation of primitive neural stem cells and generation of brain subtype neurons from human pluripotent stem cells. Stem Cells Translational Medicine. 2 (11), 862-870 (2013).
- Goncalves, J. T., Schafer, S. T., Gage, F. H. Adult Neurogenesis in the Hippocampus: From Stem Cells to Behavior. Cell. 167 (4), 897-914 (2016).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- International Stem Cell Initiative. Characterization of human embryonic stem cell lines by the International Stem Cell Initiative. Nature Biotechnology. 25 (7), 803-816 (2007).
- Hartung, O., Huo, H., Daley, G. Q., Schlaeger, T. M. Clump passaging and expansion of human embryonic and induced pluripotent stem cells on mouse embryonic fibroblast feeder cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 14 (1), Chapter 1 Unit 1C 10 (2010).
- Chen, K. G., et al. Non-colony type monolayer culture of human embryonic stem cells. Stem Cell Research. 9 (3), 237-248 (2012).
- Chen, G., Hou, Z., Gulbranson, D. R., Thomson, J. A. Actin-myosin contractility is responsible for the reduced viability of dissociated human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 7 (2), 240-248 (2010).
- Li, X., Krawetz, R., Liu, S., Meng, G., Rancourt, D. E. ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells. Human Reproduction. 24 (3), 580-589 (2009).
- Ohgushi, M., et al. Molecular pathway and cell state responsible for dissociation-induced apoptosis in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7 (2), 225-239 (2010).
- Pakzad, M., et al. Presence of a ROCK inhibitor in extracellular matrix supports more undifferentiated growth of feeder-free human embryonic and induced pluripotent stem cells upon passaging. Stem Cell Reviews and Reports. 6 (1), 96-107 (2010).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
- Jeon, K., et al. GLIS3 Transcriptionally Activates WNT Genes to Promote Differentiation of Human Embryonic Stem Cells into Posterior Neural Progenitors. Stem Cells. 37 (2), 202-215 (2019).
- Emre, N., et al. The ROCK inhibitor Y-27632 improves recovery of human embryonic stem cells after fluorescence-activated cell sorting with multiple cell surface markers. PLoS ONE. 5 (8), e12148 (2010).
- Hanna, J., et al. Human embryonic stem cells with biological and epigenetic characteristics similar to those of mouse ESCs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (20), 9222-9227 (2010).
- Saha, K., et al. Surface-engineered substrates for improved human pluripotent stem cell culture under fully defined conditions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (46), 18714-18719 (2011).
- Tsutsui, H., et al. An optimized small molecule inhibitor cocktail supports long-term maintenance of human embryonic stem cells. Nature Communications. 2, 167 (2011).
- Xu, Y., et al. Revealing a core signaling regulatory mechanism for pluripotent stem cell survival and self-renewal by small molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (18), 8129-8134 (2010).
- Ungrin, M. D., Joshi, C., Nica, A., Bauwens, C., Zandstra, P. W. Reproducible, ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates. PLoS ONE. 3 (2), e1565 (2008).
- Kim, D. S., et al. Highly pure and expandable PSA-NCAM-positive neural precursors from human ESC and iPSC-derived neural rosettes. PLoS ONE. 7 (7), e39715 (2012).
- Sun, Y., Hu, J., Zhou, L., Pollard, S. M., Smith, A. Interplay between FGF2 and BMP controls the self-renewal, dormancy and differentiation of rat neural stem cells. Journal of Cell Science. 124 (Pt 11), 1867-1877 (2011).
- Zhou, J. M., Chu, J. X., Chen, X. J. An improved protocol that induces human embryonic stem cells to differentiate into neural cells in vitro. Cell Biology International. 32 (1), 80-85 (2008).
- Smith, J. R., et al. Inhibition of Activin/Nodal signaling promotes specification of human embryonic stem cells into neuroectoderm. Developmental Biology. 313 (1), 107-117 (2008).
