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एयर-लिक्विड इंटरफेस पर खेती मानव फेफड़ों की कोशिकाओं को उजागर करके हवाई कणों की तीव्र साँस लेना विषाक्तता का आकलन

Published: February 23, 2020 doi: 10.3791/60572
Automatic Translation
1, 2, 3, 2, 5, 3,4, 2, 2, 1, 3,4, 1,2
1Bundeswehr Institute of Pharmacology and Toxicology, 2Walther Straub Institute of Pharmacology and Toxicology, University of Munich, 3Cultex Laboratories GmbH, 4Cultex Technologies GmbH (formerly Cultex Laboratories GmbH), 5seh consulting + services

Summary

हम एयर-लिक्विड इंटरफेस (अली) में खेती की मानव फेफड़ों की कोशिकाओं को उजागर करके उनके तीव्र फेफड़े के साइटोटॉक्सिकता से संबंधित हवाई कणों की स्क्रीनिंग और निगरानी के लिए एक मजबूत, हस्तांतरणीय और भविष्य कहनेवाला इन विट्रो एक्सपोजर सिस्टम पेश करते हैं।

Abstract

यहां, हम एक विशेष रूप से डिजाइन मॉड्यूलर इन विट्रो एक्सपोजर सिस्टम पेश करते हैं जो अली में खेती की गई मानव फेफड़ों की कोशिकाओं के समरूप जोखिम को गैसों, कणों या जटिल वायुमंडल (जैसे, सिगरेट का धुआं) में सक्षम बनाता है, इस प्रकार यथार्थवादी शारीरिक प्रदान करता है मानव अल्वेलर क्षेत्र की एपिकल सतह का हवा में जोखिम। रैखिक एयरोसोल मार्गदर्शन के साथ अनुक्रमिक एक्सपोजर मॉडल के विपरीत, रेडियल प्रवाह प्रणाली का मॉड्यूलर डिजाइन कोशिकाओं के लिए परीक्षण वातावरण की निरंतर पीढ़ी और परिवहन के लिए सभी आवश्यकताओं को पूरा करता है, एक समरूप वितरण और जमाव कण और वातावरण को लगातार दूर करना। यह एक्सपोजर विधि मुख्य रूप से हवाई कणों के लिए कोशिकाओं के जोखिम के लिए डिज़ाइन की गई है, लेकिन एयरोसोल उत्पादन विधि और एक्सपोजर मॉड्यूल की सामग्री के आधार पर तरल एयरोसोल और अत्यधिक विषाक्त और आक्रामक गैसों के संपर्क में आड्ड किया जा सकता है .

हाल ही में पूरा सत्यापन अध्ययन के ढांचे के भीतर, यह एक्सपोजर सिस्टम हवाई कणों की तीव्र फेफड़े के साइटोटॉक्सिकता के गुणात्मक मूल्यांकन के लिए एक हस्तांतरणीय, प्रजनन योग्य और भविष्य कहनेवाला स्क्रीनिंग विधि के रूप में साबित हुआ था, जिससे संभावित रूप से पशु प्रयोगों को कम करना या प्रतिस्थापित करना जो आम तौर पर इस विषविज्ञानी आकलन प्रदान करेगा।

Introduction

जहरीले हवाई कणों का साँस लेना एक सार्वजनिक स्वास्थ्य चिंता का विषय है, जिससे दुनिया भर में स्वास्थ्य जोखिमों की एक भीड़ और सालाना कई लाखों मौतें1,2। जलवायु परिवर्तन, चल रहे औद्योगिक विकास और ऊर्जा, कृषि और उपभोक्ता उत्पादों की बढ़ती मांग ने पिछलेवर्षोंमें फेफड़े की बीमारियों को बढ़ाने में योगदान दिया है । उनकी तीव्र साँस लेना विषाक्तता के बारे में साँस लेने योग्य पदार्थों का ज्ञान और मूल्यांकन जोखिम मूल्यांकन और जोखिम प्रबंधन का आधार प्रदान करता है, लेकिन यह जानकारी अभी भी इनपदार्थोंकी एक विस्तृत श्रृंखला के लिए7,8की कमी है । २००६ के बाद से, यूरोपीय संघ के रासायनिक कानून पहुंच (पंजीकरण, मूल्यांकन, प्राधिकरण और रसायनों के प्रतिबंध) की आवश्यकता है कि पहले से ही मौजूदा और नए शुरू उत्पादों को बाजार पर रखा जा रहा से पहले साँस लेना मार्ग सहित एक विषविज्ञानी लक्षण वर्णन से गुजरना । इसलिए, रीच वैकल्पिक और पशु मुक्त तरीकों, "3आर" सिद्धांत (प्रतिस्थापन, शोधन और पशु प्रयोगों में कमी) के कार्यान्वयन और उपयुक्त इन विट्रो मॉडल9का उपयोग पर केंद्रित है। हाल के वर्षों में, कई अलग और पर्याप्त गैर पशु साँस लेना विषाक्तता परीक्षण मॉडल (जैसे, इन विट्रो सेल संस्कृतियों, फेफड़ों पर एक चिप मॉडल, सटीक कट फेफड़ों के स्लाइस (PCLS)) का आकलन करने के लिए हवाई कणों की तीव्र साँस लेना विषाक्तताकाआकलन करने के लिए विकसित किया गया है5,7,10,11। इन विट्रो सेल संस्कृति मॉडल के संदर्भ में, खेती की कोशिकाओं को जलमग्न परिस्थितियों में या अली(चित्रा 1)में उजागर किया जा सकता है। हालांकि, जलमग्न एक्सपोजर अध्ययनों की वैधता हवाई यौगिकों विशेष रूप से कणों की विषाक्तता के मूल्यांकन के संबंध में सीमित है । जलमग्न एक्सपोजर तकनीक वीवो स्थिति में मानव के अनुरूप नहीं है; कोशिकाओं को कवर करने वाला सेल कल्चर मीडियम फिजीको-रासायनिक गुणों को प्रभावित कर सकता है और इस प्रकार, एक परीक्षण पदार्थ के जहरीले गुण12,13। अली इन विट्रो साँस लेना मॉडल परीक्षण कणों के साथ कोशिका संस्कृति माध्यम के हस्तक्षेप के बिना परीक्षण पदार्थों के लिए कोशिकाओं के प्रत्यक्ष जोखिम की अनुमति है, इस प्रकार, जलमग्न जोखिम12,14की तुलना में उच्च शारीरिक और जैविक समानता के साथ मानव जोखिम नकल उतार ।

हालांकि, रीच जैसी नियामक प्रक्रियाओं के लिए, तीव्र साँस लेना विष विज्ञान के क्षेत्र में केवल पशु मॉडल उपलब्ध हैं, क्योंकि विट्रो विधियों में कोई विकल्प पर्याप्त रूप से मान्य नहीं किया गया है और आधिकारिक तौर पर अब तक14को स्वीकार नहीं किया गया है। इस उद्देश्य के लिए, परीक्षण मॉडल को परीक्षण वैधता15पर पशु परीक्षण के विकल्प के विकल्प के लिए यूरोपीय संघ संदर्भ प्रयोगशाला (EURL-ECVAM) सिद्धांतों की आवश्यकताओं के अनुसार मान्य किया जाना है ।

एक पूर्व पूर्व सत्यापन अध्ययन और हाल ही में पूरा सत्यापन अध्ययन सफलतापूर्वक CULTEX RFS जोखिम प्रणाली और इसकी हस्तांतरणीयता, स्थिरता, और प्रजननक्षमता 13के आवेदन क्षेत्र का प्रदर्शन किया । यह एक्सपोजर सिस्टम एक इन विट्रो सेल-आधारित एक्सपोजर सिस्टम है जो अपनी रेडियल एयरोसोल वितरण अवधारणा और कोशिकाओं16पर निरंतर प्रवाह में परीक्षण एयरोसोल के चालन के कारण अली में गैसों, कणों या जटिल वायुमंडल (जैसे, सिगरेट का धुआं) कोशिकाओं के समरूप जोखिम को सक्षम बनाता है। इस रेडियल फ्लो सिस्टम के मूल मॉड्यूल में इनलेट एडाप्टर, रेडियल एयरोसोल वितरण के साथ एयरोसोल गाइडिंग मॉड्यूल, नमूना और सॉकेट मॉड्यूल, और हैंड व्हील(चित्रा 2)के साथ लॉकिंग मॉड्यूल शामिल है। उत्पन्न कण इनलेट एडाप्टर और एयरोसोल मार्गदर्शक मॉड्यूल के माध्यम से कोशिकाओं तक पहुंचते हैं और सेल संस्कृति आवेषण पर जमा होते हैं, जो नमूना मॉड्यूल के तीन रेडियल व्यवस्थित एक्सपोजर कक्षों में स्थित होते हैं। एयरोसोल गाइडिंग मॉड्यूल के साथ - साथ सैंपलिंग मॉड्यूल को बाहरी पानी के स्नान17से जोड़कर गर्म किया जा सकता है ।

दोनों अध्ययनों के ढांचे के भीतर, A549 कोशिकाओं का उपयोग सभी एक्सपोजर प्रयोगों के लिए किया गया था। सेल लाइन A549 एक मानव अमर एपीथेलियल सेल लाइन है जो बहुत अच्छी तरह से विशेषता है और कई विषविज्ञानी अध्ययनों में टाइप II अल्वेलर एपिथेलियल कोशिकाओं के लिए इन विट्रो मॉडल के रूप में उपयोग किया गया है। कोशिकाओं को लैमेलर निकायों, सर्फेक्टेंट का उत्पादन और सूजन-प्रासंगिक कारकों की एक संख्या18द्वारा विशेषता है । वे अपने बलगम उत्पादन19के कारण ब्रोंकियल एपिथेलियल कोशिकाओं के गुण भी दिखाते हैं । इसके अलावा, वे अली में संस्कारित किया जा सकता है । यद्यपि इस सेल लाइन में सेल-सेल संपर्कों के निर्माण में कमी है, लेकिन इन कोशिकाओं की खेती बहुत अधिक सुविधाजनक है, कम लागत महंगी है और इसके प्राप्त परिणाम प्राथमिक कोशिकाओं20की तुलना में दाता-स्वतंत्र हैं।

A549 कोशिकाओं को 6-अच्छी तरह से सेल कल्चर आवेषण (पीईटी झिल्ली, 4.67 सेमी2,पोर आकार 0.4 मिमी) में वरीयता प्राप्त की गई थी, जिसमें 3.0 x 105 कोशिकाओं प्रति डालने का घनत्व था और जलमग्न परिस्थितियों में 24 घंटे के लिए खेती की गई थी। कोशिकाओं को तो तीन स्वतंत्र प्रयोगशालाओं में उजागर करने के लिए हवा साफ और तीन अलग जोखिम खुराक (25, ५०, और १०० μg/सेमी2)अली में 20 परीक्षण पदार्थों की । एक्सपोजर खुराक जमाव समय से सहसंबद्ध होती है जिसके परिणामस्वरूप क्रमशः 15, 30 या ६० मिन के बाद कोशिकाओं पर 25 μg/cm2,५० μg/cm2 और १०० μg/सेमी2 की लगातार कण दर होती है । जमा कणों, हालांकि, बयान के बाद नहीं धोया गया था, लेकिन 24 घंटे के लिए कोशिकाओं पर बने रहे । कणों के बयान समय इसलिए 15, 30 और ६० मिन थे, लेकिन कोशिकाओं के जोखिम कुल में 24 घंटे के लिए चली । परीक्षण पदार्थों की जमाव दर पिछले तरीकों के अनुसार प्रारंभिक प्रयोगों में निर्धारित की गई थी17.

विषाक्तता के एक संकेतक के रूप में सेल व्यवहार्यता एक सेल व्यवहार्यता परख का उपयोग कर कण बयान के बाद 24 घंटे का आकलन किया गया था । स्वच्छ वायु नियंत्रण की गुणवत्ता, एक्सपोजर प्रोटोकॉल के अनुकूलन और शोधन, अंतर और अंतर-प्रयोगशाला प्रजनन क्षमता और एक भविष्यवाणी मॉडल (पीएम) की स्थापना पर विशेष ध्यान केंद्रित किया गया था। पदार्थ है कि ५०% से नीचे सेल व्यवहार्यता की कमी के लिए नेतृत्व (प्रधानमंत्री ५०%) या 75% (पीएम 75%) तीन एक्सपोजर खुराकों में से किसी में एक तीव्र साँस लेना खतरा लागू करने के लिए माना जाता था। परिणाम तब वीवो डेटा में मौजूदा की तुलना में थे (ओईसीडी परीक्षण दिशानिर्देश (टीजी) 403 या टीजी 43621,22के अनुसार कम से कम एक विश्वसनीय अध्ययन के आधार पर, 83% की विशिष्टता और 88%23की संवेदनशीलता के साथ 85% का समग्र सामंजस्य होता है।

सेल व्यवहार्यता के माप के अलावा, साइटोकिन रिलीज जैसे अन्य अंत बिंदुओं, एलडीएच परख के माध्यम से सेल लाइसेट या झिल्ली अखंडता की जांच का मूल्यांकन किया जा सकता है लेकिन सत्यापन अध्ययन के लिए आवश्यक नहीं थे। इस प्रकार, एक्सपोजर सिस्टम (उदाहरण के लिए, CULTEX आरएफएस) परीक्षण किए गए हवाई कणों की तीव्र साँस लेना विषाक्तता के गुणात्मक मूल्यांकन के लिए एक भविष्य कहनेवाला स्क्रीनिंग प्रणाली के रूप में साबित हुआ, जो पशु परीक्षण के लिए एक आशाजनक वैकल्पिक विधि का प्रतिनिधित्व करता है। इस एक्सपोजर सिस्टम का उपयोग करके हवाई कणों के संपर्क प्रयोगों के लिए निम्नलिखित प्रोटोकॉल की सिफारिश की जाती है।

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Protocol

नोट: एक एक्सपोजर प्रयोग के प्रोटोकॉल में तीन दिनों की अवधि शामिल है।

1 दिन

1. सामान्य तैयारी और कोशिकाओं की खेती

नोट: मानव फेफड़ों adenocarcinoma एपिथेलियल सेल लाइन A549 जोखिम प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया गया था । कोशिकाओं को बाँझ परिस्थितियों में संभाला जाना चाहिए। अली में खेती के लिए उपयुक्त अन्य सेल लाइनों का उपयोग किया जा सकता है।

  1. विकास माध्यम (Dulbecco के न्यूनतम आवश्यक माध्यम (DMEM), 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 5 μg/mL gentamycin) और एक्सपोजर माध्यम (DMEM, 5 μg/mL gentamycin और 100 मीटर की एक अंतिम HEPES एकाग्रता के साथ पूरक के साथ पूरक तैयार करें) ।
  2. संस्कृति A549 कोशिकाओं के विकास के माध्यम में 37 डिग्री सेल्सियस पर एक आर्द्र वातावरण में 5% सीओ2युक्त .
  3. विभाजन से पहले 80-90% (हर 2-3 दिन) और 35 के पारित होने से पहले 80-90% का संगम तक विकास माध्यम के 14 मिलील में 75 सेमी2 (टी-75) के सेल कल्चर फ्लास्क में कोशिकाओं की खेती करें।
  4. निलंबन की मात्रा और सेल संस्कृति आवेषण की आवश्यक संख्या की गणना करें (स्वच्छ हवा और कण जोखिम के लिए इनक्यूबेटर नियंत्रण और सेल संस्कृति आवेषण के रूप में तीन सेल संस्कृति आवेषण) और सेल संस्कृति प्लेटें।
  5. कोशिकाओं के ट्राइप्सिनाइजेशन और सीडिंग से पहले, 6-अच्छी प्लेट के प्रत्येक कुएं में टेम्पर्ड ग्रोथ मीडियम का 2.5 मिलील जोड़ें। कोशिका संस्कृति आवेषण कोशिकाओं के बिना ध्यान से कुओं के अंदर रखें और हर सेल संस्कृति डालने के लिए 1 mL विकास माध्यम जोड़ें। इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2)में कम से कम 30 मिन के लिए 6-कूप प्लेटों को इनक्यूबेट करें।

2. कोशिकाओं का ट्रिप्सिनाइजेशन

  1. टेम्पो फॉस्फेट बफरेड लवकुश (पीबीएस) और विकास माध्यम 37 डिग्री सेल्सियस और ट्राइप्सिन/ईटीए (0.05%/ 0.02%) कमरे के तापमान पर समाधान।
  2. सेल संस्कृति फ्लास्क से सेल संस्कृति माध्यम Aspirate और पूर्व गर्म PBS के 8 mL के साथ ध्यान से कोशिकाओं को धोने ।
  3. पीबीएस निकालें, ट्राइप्सिन/EDTA के 2 mL जोड़ें (०.०५%/ 0.02%) कोशिकाओं का समाधान और अधिकतम 6 मिन के लिए इनक्यूबेटर में इनक्यूबेटर के लिए इनक्यूबेटर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर। माइक्रोस्कोप के तहत टुकड़ी प्रक्रिया को नियंत्रित करें।
  4. 8 mL पूर्व गर्म विकास माध्यम जोड़कर ट्राइप्सिन गतिविधि को बेअसर करें, फ्लास्क पर बग़ल में धीरे-धीरे टैप करके कोशिकाओं को अलग करें और कोशिकाओं को बार-बार पाइपिंग करके फिर से निलंबित करें।
  5. सेल निलंबन को 50 मीटर ट्यूब पर स्थानांतरित करें। आगे की प्रक्रिया के लिए सेल नंबर निर्धारित करें (उदाहरण के लिए, कोशिकाओं की सीडिंग, कोशिकाओं का मार्ग)।

3. सेल संख्या का निर्धारण

नोट: सेल एकाग्रता एक सेल काउंटर या गिनती कक्षों का उपयोग कर निर्धारित किया गया था ।

  1. आइसोटोनिक समाधान के 10 मिलील से भरे कप में सेल कल्चर सस्पेंशन के 100 माइक्रोन को पतला करें। कप को बिना झटकों के धीरे-धीरे झुकाएं।
  2. A549 कोशिकाओं के सेल-विशिष्ट माप मापदंडों के आधार पर व्यवहार्य कोशिकाओं/mL और सेल व्यवहार्यता की संख्या निर्धारित करें।

4. कोशिका संस्कृति आवेषण में माइक्रोपोरस झिल्ली पर कोशिकाओं की सीडिंग

नोट: एक्सपोजर सिस्टम विभिन्न आपूर्तिकर्ताओं और विभिन्न आकारों से वाणिज्यिक आवेषण के उपयोग को सक्षम करने के लिए विशेष एडाप्टर से लैस है। इन एक्सपोजर प्रयोगों के लिए, 6-अच्छी प्लेटें और इसी सेल कल्चर आवेषण का उपयोग किया गया था। सभी कार्य कदम बाँझ परिस्थितियों में किया जाना है ।

  1. बाँझ सेल संस्कृति की स्थिति (लैमिनार प्रवाह) के तहत पूर्व गर्म विकास माध्यम प्रदान करें।
  2. 3.0 x 105 कोशिकाओं/mL की कोशिका एकाग्रता के साथ सेल निलंबन की पर्याप्त उच्च मात्रा तैयार करें।
  3. 30 मिनट के लिए प्लेटों तड़के के बाद, सेल संस्कृति आवेषण और प्रत्येक सेल संस्कृति डालने में ३.० x १०५ कोशिकाओं/mL के घनत्व के साथ A549 कोशिकाओं के बीज 1 mL के भीतर मध्यम aspirate । कोमल कमाल द्वारा सेल निलंबन वितरित करें।
  4. सेल संस्कृति 24 घंटे (37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2)के लिए सेल निलंबन के साथ आवेषण इनक्यूबेट।

5. परीक्षण पदार्थों का दबाव

नोट: परीक्षण पदार्थ ों को पूरी तरह से नियंत्रणीय हाइड्रोलिक प्रेस का उपयोग करके पाउडर केक में दबाया गया था। प्रेस पैकेज 18 केएन का अधिकतम बल लागू कर सकता है, जिसे प्रेस पैकेज के वर्तमान तेल दबाव (बार में) के रूप में प्रदर्शित किया जाता है। अज्ञात परीक्षण पदार्थों की प्रेस स्थितियां (दबाव, दबाने का समय) प्रारंभिक परीक्षणों में स्थापित और विशेषता होनी चाहिए। एक पदार्थ के प्रेस गुणों के आधार पर, विभिन्न दबाने वाले मापदंडों और दबाने वाले प्लंजर के प्रकार का उपयोग किया जा सकता है।

सावधानी: विषाक्त या खतरनाक पदार्थों को दबाते समय सुरक्षात्मक उपकरण पहनें।

  1. प्रेस के सामने की ओर समय नियंत्रण के माध्यम से दबाने का समय निर्धारित करें।
  2. संकुचित हवा वाल्व पर संकुचित हवा की आपूर्ति खोलें। प्रेस के सामने की ओर या संकुचित हवा की आपूर्ति के संकुचित हवा वाल्व पर दबाव नियामक का उपयोग करलगभग 2 बार (सामने की ओर एक दबाव गेज द्वारा संकेत) के लिए संकुचित हवा दबाव सेट करें । दराज बाहर खींचो, प्रेस बटन दबाएं और डिजिटल दबाव स्विच पर दबाव दबाव पढ़ें ।
    1. सिर्फ दबाव नियामक पर दबाव पढ़ें अगर दबाव बहुत अधिक है या बहुत कम है ।
  3. पदार्थ कंटेनर विधानसभा और सुनिश्चित करें कि कांच सिलेंडर सही ढंग से केंद्रित है(अनुपूरक चित्रा 1)। पदार्थ कंटेनर को परीक्षण पदार्थ की एक छोटी मात्रा से भरें। पदार्थ कंटेनर में प्लंजर डालें और कंटेनर में पाउडर को समान रूप से वितरित करने के लिए इसे थोड़ा आगे और पीछे बदल दें।
  4. दराज में प्लंजर के साथ पदार्थ कंटेनर रखें और प्रेस बटन दबाएं। प्रेस का हाइड्रोलिक पिस्टन प्लंजर पर चलता है और सेट दबाने के समय के लिए परीक्षण पदार्थ पर दबाव डालती है। दराज खोलें और प्लंजर को हटा दें।
  5. चरण 5.3 और 5.4 दोहराएं जब तक पदार्थ कंटेनर कम से कम आधा भरा न हो।
  6. दबाने का काम पूरा होने के बाद, दराज से पदार्थ कंटेनर को हटा दें और ढीले और जमा कणों को हटाने के लिए इसे उल्टा कर दें।
  7. यदि पदार्थ कंटेनर को उसी दिन की आवश्यकता नहीं है, तो परीक्षण पदार्थ को सूखने या नमी को अवशोषित करने से रोकने के लिए पैराफिल्म के साथ पदार्थ कंटेनर को बंद करें।

दूसरा दिन

6. एक्सपोजर सिस्टम की असेंबली और परिधीय उपकरणों को जोड़ने

नोट: चित्रा 3, अनुपूरक चित्रा 2 और अनुपूरक चित्र ा 3में अधिक विस्तृत विचार प्रदान किया गया है । निर्माता के निर्देशों के अनुसार मॉड्यूल और एयरोसोल जनरेटर दोनों को इकट्ठा करें।

  1. एक ठोस और यहां तक कि सतह पर जोखिम प्रणाली प्लेस, पानी की आपूर्ति के साथ आगे का सामना करना पड़ रहा है । एयरोसोल जनरेटर और स्वच्छ हवा जोखिम के लिए मॉड्यूल से जुड़े तीन गर्दन की बोतल के साथ बड़े पैमाने पर प्रवाह नियंत्रकों कनेक्ट करें।
  2. फ्लो कंट्रोलर और वैक्यूम पंप को कनेक्ट करें। एयरोसोल गाइडिंग मॉड्यूल के अनुलग्नकों पर ट्यूब कनेक्टर के साथ प्रवाह नियंत्रकों से ट्यूबकनेक्ट करें। वैक्यूम पंप के साथ प्रवाह नियंत्रकों के दूसरी तरफ ट्यूबों कनेक्ट। सुनिश्चित करें कि प्रवाह नियंत्रकों के माध्यम से मॉड्यूल से वैक्यूम पंप तक जा रहा है।
  3. पानी के स्नान को हीटिंग वॉटर सप्लाई से जोड़ें। पानी की आपूर्ति एयरोसोल गाइडिंग मॉड्यूल पर पानी के स्नान से पानी के इनलेट तक जा रही है। नमूना मॉड्यूल के पानी के इनलेट के साथ एयरोसोल मार्गदर्शक मॉड्यूल के पानी के आउटलेट कनेक्ट करें। पानी स्नान करने के लिए नमूना मॉड्यूल के पानी के आउटलेट से एक कनेक्शन के साथ सर्कल बंद करो।
  4. एरोसोल जनरेटर को एक्सपोजर मॉड्यूल के करीब एलुट्रिएटर सहित रखें और बड़े माइक्रो फिल्टर के साथ एलुट्रिएटर और एक्सपोजर और क्लीन एयर मॉड्यूल की अतिरिक्त लाइनों को कनेक्ट करें, और छोटे माइक्रो फिल्टर (जैसे, एक्सपोजर कक्षों का सक्शन डिस्पोजेबल फिल्टर)। एलुट्रिएटर उत्पन्न कण वातावरण के लिए एक जलाशय के रूप में कार्य करता है और लगभग 7 माइक्रोन से बड़े कणों को बरकरार रखता है, जबकि छोटे कणों को एक्सपोजर मॉड्यूल में ले जाया जाता है।
  5. एयरोसोल उत्पादन को यूएसबी केबल और बिजली आपूर्ति बंदरगाह के लिए बिजली की आपूर्ति के माध्यम से एयरोसोल जनरेटर टॉप के यूएसबी बंदरगाह तक नियंत्रित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले कंप्यूटर को कनेक्ट करें। बिजली आपूर्ति इकाई के एसी पावर प्लग को सॉकेट (220-240 वी) से कनेक्ट करें।
  6. मध्यम आपूर्ति के लिए पाइप कनेक्ट करें और दो पंपों के साथ हटाने। मध्यम आपूर्ति के लिए पंप का उपयोग करने के बजाय, माध्यम को मैन्युअल रूप से भी भरा जा सकता है।

7. स्वच्छ हवा और कण जोखिम के लिए तैयारी

  1. वैक्यूम पंप, प्रवाह नियंत्रकों और पानी स्नान (37 डिग्री सेल्सियस) को कम से कम 30 00 की गर्म अवधि के लिए चालू करें।
  2. संकुचित हवा की आपूर्ति खोलें। एयरोसोल जनरेटर के लिए आपूर्ति लाइन के लिए 8 एल/मिन के लिए जन प्रवाह नियंत्रकों सेट और तीन गर्दन की बोतल के लिए आपूर्ति लाइन के लिए 3 L/min । द्रव्यमान प्रवाह नियंत्रकों के टैब बंद करें।
    नोट: ये मान परीक्षण पदार्थ की विशेषताओं के आधार पर भिन्न हो सकते हैं।
  3. मॉड्यूल प्रवाह (१.५ एल/मिन) और चैंबर सक्शन (30 mL/min) को विनियमित करने के लिए कंप्यूटर के माध्यम से प्रवाह नियंत्रकों को समायोजित करें ।

8. रेडियल फ्लो सिस्टम का लीकेज टेस्ट

नोट: रिसाव की जांच वैक्यूम के तहत और मॉड्यूल (एक्सपोजर और स्वच्छ वायु मॉड्यूल) दोनों के लिए की जानी चाहिए ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि मॉड्यूल को ठीक से फिर से इकट्ठा किया गया है।

  1. एयरोसोल गाइडिंग मॉड्यूल से इनलेट एडाप्टर और कंडेनसेट रिफ्लेक्टर निकालें। प्लग के साथ एयरोसोल मार्गदर्शक मॉड्यूल में तीन एयरोसोल फीडिंग बोर ों को बंद करें और डमी फ्लैप्स के साथ नमूना मॉड्यूल पर मध्यम आपूर्ति कनेक्शन।
  2. एयरोसोल गाइडिंग मॉड्यूल के ट्यूब कनेक्टर के साथ फिल्टर के बिना वैक्यूम लाइनों को कनेक्ट करें। हाथ के पहिए का उपयोग करके मॉड्यूल को बंद करें और प्रवाह नियंत्रकों के मूल्य को मापें। मानों को 5 mL/min से नीचे बंद करने के कुछ मिनट बाद कम होना चाहिए ।
  3. अभेद्यता की जांच के बाद, सभी प्लग और डमी फ्लैप को हटा दें, इनलेट एडाप्टर और कंडेनसेट रिफ्लेक्टर को एयरोसोल गाइडिंग मॉड्यूल में डालें और मध्यम आपूर्ति और हटाने के लिए पाइप कनेक्ट करें।

9. एयरोसोल जनरेशन

  1. कंप्यूटर और सॉफ्टवेयर(सप्लीमेंट्री फिगर 4)शुरू करें । कंप्यूटर के डेस्कटॉप पर एयरोसोल जनरेटर स्टार्ट बटन पर डबल क्लिक करके एयरोसोल जनरेटर सॉफ्टवेयर शुरू करें। एक संदेश खिड़की दिखाई देती है और पूछती है कि सेटिंग्स रीसेट की जानी चाहिए या नहीं। अगर उस दिन पहली बार सॉफ्टवेयर शुरू किया जाता है तो हां पर क्लिक करें। डिफ़ॉल्ट मूल्यों के लिए स्लाइड स्थिति और स्क्रैपर स्थिति के लिए मूल्यनिर्धारित करें। स्लाइड स्थिति और स्क्रैपर स्थिति या स्लाइड के लिए मूल्यों को रखने के लिए नहीं क्लिक करें प्रारंभिक स्थिति में नहीं है ।
  2. पाइप में एक पदार्थ स्क्रैपर पेंच, जो एयरोसोल जनरेटर शीर्ष के केंद्रीय उद्घाटन में स्थित है।
    नोट: प्रेस विशेषताओं के आधार पर, पदार्थ स्क्रैपर के विशिष्ट प्रकार का इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  3. यदि पदार्थ स्क्रैपर सबसे कम स्थिति में नहीं है तो बटन होमिंग मोड का उपयोग करें।
  4. पदार्थ स्क्रैपर पर दबाए गए परीक्षण सामग्री के साथ पदार्थ कंटेनर को उल्टा रखें। सुनिश्चित करें कि पदार्थ कंटेनर का गिलास सामने का सामना करता है। सुनिश्चित करें कि पदार्थ कंटेनर में दो छेद एयरोसोल जनरेटर शीर्ष के दो पिनों पर फिट बैठते हैं। पदार्थ कंटेनर के ऊपर स्लॉट में लॉकिंग प्लेट रखें और काले पेंच को कस लें।
  5. फीड (0.24 से 20 एमएम/घंटा) और रोटेशन (1 से 800 रेव्स/एच) के लिए मूल्यों को वांछित सेटिंग्स में बदलें। फीड वैल्यू या कैरियर गैस प्रवाह दर को बढ़ाकर या कम करके कण एकाग्रता को संशोधित किया जा सकता है।
  6. पदार्थ स्क्रैपर दबाया पदार्थ के पास है जब तक पदार्थ कंटेनर के साथ स्लाइड नीचे धक्का करने के लिए नीचे तीर का प्रयोग करें ।
  7. द्रव्यमान प्रवाह नियंत्रक के नल के साथ एयरोसोल जनरेटर के लिए संकुचित हवा की आपूर्ति खोलें और स्टार्ट बटन पर क्लिक करके एयरोसोल पीढ़ी शुरू करें। लंबे समय तक प्रतीक्षा समय से बचने के लिए फीड रेट को 15-20 मिमी/घंटा तक सेट करें ।
  8. एक छोटी टॉर्च (एलुट्रिएटर के ग्लास ट्यूब के पीछे नीचे से तैनात) के साथ ठीक धूल बादल को देख कर सही कण उत्पादन को नियंत्रित करें। जब पहला एयरोसोल वाष्प लगातार एलुट्रिएटर तक पहुंचता है और स्टॉप बटन पर क्लिक करता है तो फीड बैक के लिए मूल्य को वांछित सेटिंग्स में बदलें।

10. एक्सपोजर प्रयोग

  1. प्री-गर्म एक्सपोजर माध्यम के साथ मध्यम आपूर्ति शुरू करें और मॉड्यूल के खुले होने के दौरान डाउनपाइप को कवर किए जाने तक नमूना मॉड्यूल भरें। मध्यम पंप का उपयोग करें या माध्यम मैन्युअल रूप से भरें (25 mL प्रति व्यक्तिगत एक्सपोजर चैंबर)।
  2. एक्सपोजर मॉड्यूल में ब्लाइंड सेल कल्चर आवेषण (कोशिकाओं के बिना आवेषण) डालें। एक्सपोजर मीडियम को तब तक पंप करें जब तक डाउनपाइप मध्यम से ढके न हों और आवेषण के निचले हिस्से मध्यम के संपर्क में न हों।
  3. एयरोसोल जनरेटर शुरू करें, एक्सपोजर मॉड्यूल को बंद करें और एयरोसोल जनरेटर के एक्सपोजर मॉड्यूल आउटलेट से एक्सपोजर मॉड्यूल कनेक्ट करें। कणों की एक स्थिर पीढ़ी को सक्षम करने के लिए एक्सपोजर शुरू होने से पहले एयरोसोल जनरेटर को कम से कम 20-30 सीन का लीड समय दें।
  4. इनक्यूबेटर नियंत्रण और लीड समय के दौरान उजागर सेल संस्कृति आवेषण के लिए बाद की ऊष्मायन प्लेटें तैयार करें। प्रति अच्छी तरह से विकास माध्यम के 1.5 mL जोड़ें और इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2)में प्लेटों को इनक्यूबेट करें।
  5. लीड टाइम के बाद, एल्यूट्रिएटर के एक्सपोजर मॉड्यूल आउटलेट को रबर प्लग के साथ सील करें और ब्लाइंड आवेषण को हटा दें। डाउनपाइप माध्यम से कवर न होने तक एक्सपोजर माध्यम (पंप या मैन्युअल रूप से उपयोग करना) को फिर से भरें। अब, बड़े पैमाने पर प्रवाह नियंत्रक (3 एल/मिन) के नल के साथ स्वच्छ वायु मॉड्यूल के लिए संकुचित हवा की आपूर्ति भी खोलें
  6. एक ट्वीजर की मदद से 6-अच्छी प्लेटों से सेल कल्चर आवेषण निकालें। सेल संस्कृति से ध्यान से विकास माध्यम डालो आवेषण और aspirate गिराने और एक पिपेट का उपयोग कर अवशिष्ट तरल त्यागने से बंद आवेषण । दोनों मॉड्यूल, एक्सपोजर और स्वच्छ हवा मॉड्यूल के एक्सपोजर कक्षों में आवेषण रखें।
  7. मॉड्यूल बंद करें और एयरोसोल जनरेटर के एक्सपोजर मॉड्यूल आउटलेट और एक साथ वाहक गैस आपूर्ति के लिए स्वच्छ वायु मॉड्यूल से एक्सपोजर मॉड्यूल को जोड़कर एक्सपोजर प्रयोग शुरू करें।
    नोट: कण एकाग्रता को फ़ीड मूल्य, वाहक गैस प्रवाह दर या एक्सपोजर के समय को बढ़ाकर/कम करके संशोधित किया जा सकता है ।
  8. प्रयोग पूरा होने के बाद एक्सपोजर और स्वच्छ वायु मॉड्यूल को डिस्कनेक्ट करें और एक्सपोजर मॉड्यूल आउटलेट को सील करें।
  9. स्टॉप बटन पर क्लिक करके कंप्रेस्ड एयर सप्लाई और एयरोसोल जनरेटर बंद करें।
  10. एक्सपोजर और स्वच्छ वायु मॉड्यूल खोलें और एक ट्वीज़र का उपयोग करके तैयार पोस्ट-इन्क्यूबेशन प्लेटों में सेल कल्चर आवेषण स्थानांतरित करें। अली में 24 घंटे (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2)के लिए 6-कूप प्लेटों को इनक्यूबेट करें।
    नोट: यदि आगे एक्सपोजर प्रयोगों की योजना बनाई जाती है तो 10.5 -10.10 चरण दोहराएं।
  11. सेल संस्कृति आवेषण लिफ्ट, कि उजागर सेल संस्कृति आवेषण के रूप में एक ही शर्तों के तहत अली को इनक्यूबेटर नियंत्रण के रूप में उपयोग किया जाता है और उन्हें 24 घंटे (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2)अली में इनक्यूबेट के लिए इनक्यूबेट।
  12. पदार्थ कंटेनर को हटाने के लिए बटन होमिंग मोड का उपयोग करें। ऊपरी दाएं हाथ के कोने में एक्स पर क्लिक कर के एयरोसोल जनरेटर सॉफ्टवेयर बंद करें और कंप्यूटर बंद कर दें।
  13. सभी एक्सपोजर प्रयोगों के पूरा होने के बाद, एयरोसोल जनरेटर और दोनों एक्सपोजर मॉड्यूल को साफ करें। पैराफिल्म के साथ पदार्थ कंटेनर बंद करें यदि परीक्षण पदार्थ का अगले दिनों के भीतर आगे उपयोग किया जाएगा।

3 दिन

11. सेल व्यवहार्यता

नोट: सेल व्यवहार्यता WST-1 परख का उपयोग कर माइटोकॉन्ड्रियल गतिविधि को मापने के द्वारा कण जमाव के बाद 24 घंटे निर्धारित किया गया था । परख निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार किया गया था। सेल व्यवहार्यता अन्य सेल व्यवहार्यता परीक्षणों (जैसे, XTT) का उपयोग करके भी निर्धारित की जा सकती है।

  1. 37 डिग्री सेल्सियस पर गुस्सा विकास मध्यम और प्रकाश से संरक्षित WST-1 समाधान गल। प्रति अच्छी तरह से 2.5 मीटर विकास माध्यम के साथ नई 6-अच्छी प्लेटों की एक उपयुक्त संख्या तैयार करें और इनक्यूबेटर में प्लेटों को इनक्यूबेट करें।
  2. विकास माध्यम में डब्ल्यूएसटी-1 1:7 की पर्याप्त मात्रा को कमजोर करके डब्ल्यूएसटी-1 कमजोर पड़ने को तैयार करें
  3. नई तैयार 6-अच्छी तरह से प्लेटों में एक्सपोजर के बाद सेल कल्चर डालें 24 घंटे। प्रत्येक सेल संस्कृति डालने के लिए ताजा तैयार WST-1 समाधान के 1 mL जोड़ें। कोशिकाओं पर समाधान को समरूप रूप से वितरित करने के लिए प्लेटों को ध्यान से रॉक करें। सेल संस्कृति आवेषण के साथ 6 अच्छी तरह से प्लेटें इनक्यूबेट 1 घंटे (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2)के लिए।
  4. प्रत्येक 6-अच्छी तरह से 96-अच्छी प्लेट में त्रिपाल में अधिनेत के 100 माइक्रोन स्थानांतरित करें। माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करके 650 एनएम के संदर्भ तरंगदैर्ध्य के साथ 450 एनएम पर अवशोषण को मापें।

12. सांख्यिकी

  1. व्यक्तिगत इनक्यूबेटर नियंत्रण की सेल व्यवहार्यता को 100% तक सामान्य करें।
  2. व्यक्तिगत इनक्यूबेटर नियंत्रण के संबंध में उजागर कोशिकाओं की व्यवहार्यता व्यक्त करें। परीक्षण पदार्थों की साइटोटॉक्सिकिटी की तुलना संबंधित इनक्यूबेटर नियंत्रण ों से की गई थी और विषाक्तता के संकेतक के रूप में उपयोग किया जाता था।

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Representative Results

CULTEX RFS एक विशेष रूप से डिजाइन मॉड्यूलर इन विट्रो एक्सपोजर सिस्टम है जो अली में कोशिकाओं के प्रत्यक्ष और समरूप जोखिम को सक्षम बनाता है। एक पूर्व पूर्व सत्यापन अध्ययन के भीतर, इस एक्सपोजर सिस्टम की सामान्य प्रयोज्यता और इसकी हस्तांतरणीयता, स्थिरता और प्रजनन क्षमता का सफलतापूर्वक प्रदर्शन किया गया। हाल ही में जर्मन संघीय शिक्षा और अनुसंधान मंत्रालय द्वारा वित्त पोषित एक शोध परियोजना में, एक्सपोजर प्रणाली को सफलतापूर्वक मान्य किया गया था और परीक्षण यौगिकों के तीव्र साँस लेने के खतरों के लिए एक भविष्यवाणी मॉडल (पीएम) के रूप में स्थापित किया गया था। चूंकि स्वच्छ वायु नियंत्रण की गुणवत्ता पूर्व-सत्यापन अध्ययन के दौरान एक महत्वपूर्ण पैरामीटर निकली, कई प्रोटोकॉल और विधि अनुकूलन (उदाहरण के लिए, सेल संस्कृति आवेषण का परिवर्तन, 100 मीटर तक हेप्स एकाग्रता बढ़ाकर एक्सपोजर माध्यम के पीएच का स्थिरीकरण) सत्यापन अध्ययन की शुरुआत में लागू किया गया, जिससे अत्यधिक स्थिर और प्रजनन योग्य परिणाम और सभी प्रयोगशालाओंमेंस्वच्छ वायु व्यवहार्यता डेटा में पर्याप्त सुधार हुआ। A549 कोशिकाओं को तब अली में तीन स्वतंत्र प्रयोगशालाओं में 20 पूर्व-चयनित और कोडित परीक्षण पदार्थों के तीन अलग-अलग एक्सपोजर खुराक (25, 50 और 100 μg/सेमी2)के रूप में उजागर किया गया था, और साइटोटॉक्सिकिटी (विषाक्तता के संकेतक के रूप में उपयोग किया जाता है) संबंधित इनक्यूबेटर नियंत्रण ों की तुलना में था। तेरह कोडित पदार्थों का परीक्षण किया गया जिससे ट्रिपलिकेट, सात कोडित पदार्थों को एकल प्रयोगों के रूप में परीक्षण किया गया । परीक्षण पदार्थों को एक तीव्र साँस लेना खतरा डालती है जब सेल व्यवहार्यता ५०% से नीचे कम (प्रधानमंत्री ५०%) या 75% (पीएम 75%)।

जैसा कि चित्र 5में अनुकरणीय रूप से दिखाया गया है, विभिन्न परीक्षण पदार्थों के लिए A549 कोशिकाओं के प्रदर्शन में कोई, मध्यम या एक मजबूत विषाक्तता का प्रदर्शन नहीं किया गया है। चूंकि सभी प्रयोग स्वतंत्र रूप से तीन प्रयोगशालाओं में आयोजित किए गए थे, इसलिए प्रयोगशालाओं के भीतर और बीच में प्रजनन क्षमता और एक्सपोजर सिस्टम की पूर्वानुमेयता के बारे में डेटा का विश्लेषण किया गया था। लागू पीएम (पीएम 50% या पीएम 75%)के आधार पर, प्रयोगशाला के भीतर और प्रयोगशाला के बीच प्रजनन क्षमता 90-100% से लेकर, इस विधि की मजबूती और हस्तांतरणीयता का प्रदर्शन करती है। के रूप में सभी परीक्षण पदार्थों वीवो संदर्भ डेटा में उपलब्ध प्रासंगिक था (ओईसीडी टीजी ४०३ या टीजी ४३६ के अनुसार कम से एक विश्वसनीय अध्ययन के आधार पर एक पारंपरिक एलसी५० प्रोटोकॉल और एक एकाग्रता एक्स समय (सी एक्स टी) प्रोटोकॉल का उपयोग कर, की तुलना वीवो और इन विट्रो डेटा में 83% (10/12) की विशिष्टता और 85% (7/8)(तालिका 1)की संवेदनशीलता के साथ 85% (17/20) के समग्र सामंजस्य का पता चला। केवल दो पदार्थों को झूठा सकारात्मक और एक को झूठा नकारात्मक के रूप में वर्गीकृत किया गया था ।

संक्षेप में, सत्यापन अध्ययन के हमारे परिणाम चयनित हवाई कणों की तीव्र फेफड़े के सिटोटॉक्सिकता के गुणात्मक मूल्यांकन के लिए एक हस्तांतरणीय, प्रजनन योग्य और भविष्य कहनेवाला स्क्रीनिंग विधि प्रस्तुत करते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: अली में या जलमग्न परिस्थितियों में कोशिकाओं का एक्सपोजर। A549 कोशिकाओं को या तो एक्सपोजर सिस्टम के इनलेट के माध्यम से अली (बाएं) पर या एक्सपोजर मीडियम (नीले डॉट्स) में पतला परीक्षण पदार्थ के साथ एक परीक्षण पदार्थ (बाएं) के साथ उजागर किया जा सकता है जो पनडुब्बी स्थितियां (दाएं) बनाते हैं। लाल बिंदीदार लाइनें संबंधित प्रयोगात्मक सेटअप में एक्सपोजर मीडियम (उज्ज्वल लाल) के भरने के स्तर का प्रतिनिधित्व करती हैं। इस आंकड़े को Tsoutsoulopoulos एट अल24से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: एक्सपोजर मॉड्यूल। इनलेट एडाप्टर, एयरोसोल गाइडिंग मॉड्यूल, सैंपलिंग और सॉकेट मॉड्यूल और हैंड व्हील के साथ लॉकिंग मॉड्यूल से मिलकर रेडियल फ्लो सिस्टम के बेसिक मॉड्यूल का योजनाबद्ध सिंहावलोकन। इस आंकड़े को Aufderheide एट अल17से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: एक्सपोजर सिस्टम का अवलोकन। घटक स्वच्छ हवा और कण जोखिम के लिए दो एक्सपोजर मॉड्यूल, एल्यूट्रिएटर और इसी नियंत्रण इकाई सहित एयरोसोल जनरेटर, और मध्यम पंप हैं। इस आंकड़े को Aufderheide एट अल17से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: परीक्षण विधि के अनुकूलन के बाद स्वच्छ वायु व्यवहार्यता डेटा। हवा को साफ करने के लिए कोशिकाओं के एक्सपोजर के कारण समय के साथ सेल व्यवहार्यता में कोई कमी नहीं आई, जिससे पूर्व-सत्यापन अध्ययन की तुलना में स्वच्छ वायु व्यवहार्यता डेटा में पर्याप्त सुधार हुआ। सभी स्वच्छ वायु नियंत्रण प्रत्येक प्रयोगशाला (लैब 1-3) और एक्सपोजर समय (एन = 46 प्रति प्रयोगशाला और समय में बिंदु) के लिए एकत्र किए गए थे। डेटा एक औसत लाइन और मूंछ द्वारा इंगित सीमा के साथ बॉक्सप्लॉट के रूप में प्रदर्शित कर रहे हैं । इस आंकड़े को Tsoutsoulopoulos एट अल23से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: विभिन्न परीक्षण पदार्थों के लिए A549 कोशिकाओं का एक्सपोजर। (A)टंगस्टन (चतुर्थ) कार्बाइड के लिए A549 कोशिकाओं के एक्सपोजर ने तीन अलग-अलग एक्सपोजर खुराकों के लिए सेल व्यवहार्यता में कोई कमी नहीं दिखाई और गैर-विषाक्त (एन = 3 प्रति प्रयोगशाला और एक्सपोजर खुराक) दिखाई दिया। (ख)टेट्राब्रोमोफ्थेलिक एंहाइड्राइड के लिए कोशिकाओं का एक्सपोजर एक मध्यम विषाक्तता में सभी प्रयोगशालाओं के लिए एक अच्छी खुराक प्रतिक्रिया वक्र (एन = 1 प्रति प्रयोगशाला और एक्सपोजर खुराक) पेश करता है। (C)जिंक डाइमेथिलडिथियोकार्बामेट ने एक मजबूत विषाक्तता का प्रदर्शन किया, जिससे 25 μg/cm2 (n = 3 प्रति प्रयोगशाला और एक्सपोजर खुराक) की जमा खुराक के बाद पहले से ही कम सेल व्यवहार्यता हुई। त्रुटि सलाखों के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं। इस आंकड़े को Tsoutsoulopoulos एट अल23से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

वीवो में संदर्भ परिणाम परिणाम इन विट्रो
पदार्थ ओईसीडी टीजी सीएलपी विनियमन विषाक्तता पीएम 50% पीएम 75% वीवो/इन विट्रो में अनुसार
टंगस्टन (चतुर्थ) कार्बाइड 403 द. सी. 0 0 0 हाँ
टंगस्टन (चतुर्थ) कार्बाइड नैनो - n. सी. 0 0 0 हाँ
एन, एन-एथिलीनबिस (एन-एसिटिलेसेमाइड) EPA OPPTS 870.1300 n. सी. 0 0 0 हाँ
सिलिकॉन डाइऑक्साइड 403 n. सी. 0 0 0 हाँ
डायमोनियम हाइड्रोजनोर्थो-फॉस्फेट 403 n. सी. 0 0 0 हाँ
डाइसोडियम फ्लोरोफॉस्फेट 403 n. सी. 0 0 0 हाँ
नियोडिमियम ऑक्साइड 436 n. सी. 0 0 0 हाँ
पोटेशियम हाइड्रोजन मोनोपरसल्फेट 403 n. सी. 0 0 0 हाँ
साइक्लोहेप्टा-पेंटीलोज 403 n. सी. 0 0 0 (2x) / 1 (1x) (हां)
वनाडिम (III) ऑक्साइड 403 n. सी. 0 0 0 (2x) / 1 (1x) (हां)
टेट्रापोटैशियम पायरोफॉस्फेट 403 n. सी. 0 1 1 नहीं
टेट्रा-ब्रोमोफ्थेलिक एंहाइड्राइड 403 (समान) n. सी. 0 1 1 नहीं
सेटाइलपाइरिडिनियम क्लोराइड 403 तीव्र टॉक्स। 2 1 1 1 हाँ
एन-लॉरोइलसरकोसिन सोडियम नमक 403 तीव्र टॉक्स। 2 1 1 1 हाँ
जिंक डिमेथिलडिथिओ-कार्बामेट 403 तीव्र टॉक्स। 2 1 1 1 हाँ
कॉपर (II) हाइड्रोक्साइड 403 तीव्र टॉक्स। 2 1 1 1 हाँ
जिंक सेलेनिट 436 तीव्र टॉक्स। 3 1 1 1 हाँ
सोडियम मेटावनेडेट 403 तीव्र टॉक्स। 4 1 1 1 हाँ
दीवानदियम पेंटाऑक्साइड 403 तीव्र टॉक्स। 4 1 1 1 हाँ
कैडमियम टेल्यूराइड 403 तीव्र टॉक्स। 4 (नि.सी.) 1 0 0 नहीं
n. सी= वर्गीकृत नहीं; 0 = गैर विषैले; 1 = विषाक्त; सीएलपी = वर्गीकरण, लेबलिंग और पैकेजिंग

तालिका 1: वीवो और इन विट्रो परिणामों के बीच अनुसार। 20 पदार्थों में से 10 पदार्थों को सही नकारात्मक के रूप में वर्गीकृत किया गया था, और सात पदार्थों को सही ढंग से सकारात्मक के रूप में वर्गीकृत किया गया था, जिससे ८५% (17/20) का सामंजस्य हो गया था । इस तालिका को Tsoutsoulopoulos एट अल23से संशोधित किया गया है । (टेस्ट नंबर 403: तीव्र साँस लेना विषाक्तता, परीक्षण संख्या 436: तीव्र साँस लेना विषाक्तता - तीव्र विषाक्त वर्ग विधि; तीव्र टॉक्स। 2 = घातक, तीव्र विषाक्त पदार्थ। 3 = विषाक्त, तीव्र विषाक्त पदार्थ। 4 = हानिकारक)।

Supplementary Figure 1
अनुपूरक चित्र 1: पदार्थ कंटेनर की विधानसभा । CULTEX डीजी (धूल जनरेटर) उपयोगकर्ता मैनुअल से लिया चित्र । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Supplementary Figure 2
अनुपूरक चित्रा 2: एक्सपोजर सिस्टम का एयरोसोल गाइडिंग मॉड्यूल। A) एयरोसोल मार्गदर्शक मॉड्यूल के शीर्ष दृश्य और बी) नीचे देखें। CULTEX RFS (रेडियल फ्लो सिस्टम) उपयोगकर्ता मैनुअल से लिया चित्र। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Supplementary Figure 3
अनुपूरक चित्रा 3: एयरोसोल जनरेटर। ए) एयरोसोल जनरेटर का योजनाबद्ध सिंहावलोकन, जिसमें एयरोसोल जनरेटर टॉप और एलुट्रिएटर शामिल हैं। बी का विस्तृत दृश्य) एरोसोल जनरेटर टॉप और सी) एलुट्रिएटर। CULTEX डीजी (धूल जनरेटर) उपयोगकर्ता मैनुअल से लिया चित्र । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Supplementary Figure 4
पूरक चित्रा 4: एयरोसोल जनरेटर नियंत्रण सॉफ्टवेयर। CULTEX डीजी (धूल जनरेटर) उपयोगकर्ता मैनुअल से लिया चित्र । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

हाल के वर्षों में साँस लेने योग्य कणों के तीव्र साँस लेने के खतरे के बारे में जानकारी प्राप्त करने और 3आर सिद्धांत25के अनुसार पशु प्रयोगों को कम करने और प्रतिस्थापित करने के लिए कई गैर-पशु साँस लेना विषाक्तता परीक्षण मॉडल विकसित किए गए हैं।

सेल कल्चर मॉडल के संदर्भ में, कोशिकाओं का एक्सपोजर जलमग्न परिस्थितियों में या अली में किया जा सकता है। जलमग्न परिस्थितियों में कोशिकाओं को उजागर करने से फिजीको-रासायनिक गुणों को प्रभावित किया जा सकता है और इस प्रकार, एक परीक्षण पदार्थ के जहरीले गुण12। इन विट्रो अली साँस लेना मॉडल, हालांकि, जलमग्न जोखिम की तुलना में उच्च जैविक और शारीरिक समानता के साथ मानव जोखिम की स्थिति की नकल और इसलिए बेहतर हवाई कणों की तीव्र साँस लेना विषाक्तता का विश्लेषण करने के लिए अनुकूल हैं । अन्य मौजूदा एक्सपोजर मॉड्यूल के संबंध में CULTEX आरएफएस का महत्व न केवल अली स्थितियों के तहत कोशिकाओं का एक्सपोजर है बल्कि कणों का बहुत समरूप वितरण और जमाव भी है। रैखिक एयरोसोल मार्गदर्शन के साथ अनुक्रमिक एक्सपोजर मॉडल के विपरीत, इस एक्सपोजर विधि का मॉड्यूलर डिजाइन एक रेडियल आपूर्ति लाइन को सक्षम बनाता है जिससे कोशिकाओं17पर कणों का एक बहुत ही समरूप जमाव होता है।

सफल एक्सपोजर प्रयोगों के लिए सबसे महत्वपूर्ण बिंदु स्वच्छ वायु नियंत्रण की स्थिर और अनुकूल गुणवत्ता है। विशेष ध्यान दिया जाना चाहिए कि स्वच्छ वायु नियंत्रण की व्यवहार्यता समय के साथ प्रभावित नहीं होती है और इसी इनक्यूबेटर नियंत्रणों की तुलना में 100% पर संभव के रूप में बंद होती है। स्वच्छ वायु व्यवहार्यता के बारे में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने वाले कारक उपयुक्त सेल संस्कृति आवेषण, एक्सपोजर माध्यम के पीएच मूल्य और स्वच्छ हवा की संरचना का विकल्प हैं। सेल कल्चर आवेषण के संदर्भ में, एक अच्छी गुणवत्ता और छिद्रों के उच्च घनत्व की गारंटी दी जानी चाहिए। यह एक बेहतर मध्यम आपूर्ति और सेल संस्कृति आवेषण के अंदर एक उच्च सापेक्ष आर्द्रता सुनिश्चित करता है,26desiccation से कोशिकाओं की रक्षा । साइड वॉल उद्घाटन के साथ सेल कल्चर आवेषण का उपयोग करके, साइड वॉल उद्घाटन के माध्यम से परीक्षण कणों के रिसाव से बचने के लिए विशेष सम्मिलित आस्तीन का उपयोग किया जाना चाहिए जो जोखिम माध्यम के संभवतः संदूषण का कारण बन सकता है। 8 से अधिक पीएच मूल्य के बदलाव से कोशिकाओं पर पहले से ही विषाक्त प्रभाव पड़ सकता है और इसलिए कोशिका व्यवहार्यता27की हानि हो सकती है । यह विशेष रूप से लंबे समय तक कण जमाव समय (जैसे, 60 न्यूनतम) में होता है यदि स्वच्छ हवा में 5% से कम सीओ2 होता है या एक्सपोजर माध्यम की हेप्स एकाग्रता बहुत कम होती है जिससे बचना पड़ता है।

प्रोटोकॉल का एक महत्वपूर्ण मुद्दा परीक्षण पदार्थों का दबाव है। एक स्थिर कण जोखिम को सक्षम करने के लिए परीक्षण पदार्थों को पदार्थ कंटेनर के भीतर पाउडर केक के लिए पर्याप्त रूप से संकुचित किया जाना चाहिए। इस प्रकार, पदार्थों को उनके प्रेस गुणों के बारे में प्रारंभिक प्रयोगों में विशेषता होनी चाहिए और जानकारी प्राप्त करने के लिए कि किस प्रेस प्लंजर, स्क्रैपिंग ब्लेड या फ़ीड दरों का उपयोग किया जाना है।

हाइड्रोलिक प्रेस का अधिकतम दबाव दबाव, हालांकि, 10 केएन है, जो एक ही समय में ग्लास सिलेंडर के लिए लोड सीमा का प्रतिनिधित्व करता है और इस प्रकार, दबाने की प्रक्रिया की सीमा। पदार्थ कंटेनर 10 केएन की तुलना में उच्च दबाने वाली ताकतों का सामना नहीं कर सकता है। एक उच्च दबाने वाला बल क्रिस्टलीय पदार्थों के दबाने की पेशकश कर सकता है और इस प्रकार, इस प्रेस की प्रयोज्यता का विस्तार कर सकता है लेकिन अधिक मजबूत पदार्थ कंटेनरों की आवश्यकता होगी।

इसके अलावा, इस एक्सपोजर सिस्टम जो मुख्य रूप से हवाई कण एक्सपोजर की जांच के लिए डिज़ाइन किया गया है, को एयरोसोल उत्पादन विधि और एक्सपोजर मॉड्यूल की सामग्री के आधार पर तरल एयरोसोल और अत्यधिक विषाक्त और आक्रामक गैसों के संपर्क में आड्ड किया जा सकता है। एक झिल्ली नेबुलाइजर के साथ एयरोसोल जनरेटर का आदान-प्रदान करना और स्टेनलेस-स्टील एक्सपोजर मॉड्यूल का उपयोग करने से कोशिकाओं के एक्सपोजर को अत्यधिक विषाक्त तरल एयरोसोल24में सक्षम बनाया गया।

एक और महत्वपूर्ण मुद्दा अधिभार प्रभाव है । सेल व्यवहार्यता न केवल एक परीक्षण पदार्थ के विषविज्ञानी गुणों से प्रभावित हो सकती है बल्कि कोशिकाओं पर जमा पदार्थ की मात्रा से भी प्रभावित हो सकती है। यह एक्सपोजर सिस्टम मानव अल्वेलर क्षेत्र में शारीरिक स्थितियों के लिए वास्तव में पर्याप्त समानता दिखाता है लेकिन इसमें कणों को हटाने के लिए कोई निकासी तंत्र शामिल नहीं है। इसलिए यह बहुत महत्वपूर्ण है कि बहुत बड़ी संख्या में कणों के कारण कोशिका व्यवहार्यता बाधित न हो ।

यहां प्रोटोकॉल अली में खेती मानव फेफड़ों की कोशिकाओं के समरूप जोखिम को हवाई कणों के लिए वर्णित करता है। प्रजनन क्षमता, इसकी मजबूती और हस्तांतरणीयता वर्तमान एक्सपोजर प्रणाली को उनके तीव्र साँस लेने की विषाक्तता के बारे में साँस लेने योग्य कणों के गुणात्मक मूल्यांकन के लिए एक इन विट्रो स्क्रीनिंग विधि के रूप में लागू करती है। क्योंकि विट्रो विधियों में कोई विकल्प अब तक पर्याप्त रूप से मान्य नहीं किया गया है, तीव्र फेफड़े की विषाक्तता अभी भी जानवरों (जैसे, पूरे शरीर कक्षों, नाक या मुंह से केवल तरीकों) को उजागर करके मूल्यांकन किया जा रहा है । तीव्र साँस लेना विषाक्तता (जैसे, टीजी 403, टीजी 433 और टीजी 436) के लिए आमतौर पर स्वीकार किए जाते हैं ओईसीडी परीक्षण दिशानिर्देश वर्तमान में21,22,28,29पशु मॉडलों पर आधारित हैं। इसलिए भविष्य की एक दिशा तीव्र साँस लेना विषाक्तता के लिए एक इन विट्रो परीक्षण दिशानिर्देश के रूप में स्वीकृति के लिए आर्थिक सहयोग और विकास संगठन (ओईसीडी) में लागू करने के लिए किया जाएगा ।

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Disclosures

एटी, केजी, एबी, एसएच, एचएम, टीजी, एचटी और डीएस के लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है । कंपनी Cultex प्रौद्योगिकी GmbH (पूर्व Cultex प्रयोगशालाओं GmbH) उपकरणों का उत्पादन (जैसे, CULTEX RFS, CULTEX डीजी) इस लेख में इस्तेमाल किया । एनएम इस अध्ययन के दौरान Cultex प्रयोगशालाओं GmbH के एक कर्मचारी था । ओके Cultex प्रौद्योगिकी GmbH (पूर्व Cultex प्रयोगशालाओं GmbH) के एक कर्मचारी है । इस उपकरण के लिए पेटेंट पीसीटी/EP2009/007054 Cultex प्रौद्योगिकी जीएमबीएच के संस्थापक प्रो डॉ उल्रिच मोहर (पूर्व Cultex प्रयोगशालाओं GmbH) द्वारा आयोजित किया जाता है ।

Acknowledgments

इस काम को जर्मन फेडरल मिनिस्ट्री ऑफ एजुकेशन एंड रिसर्च (बुंदेसियम फ्यूर बिलडुंग एंड फोर्सचुंग, बीएमबीएफ, जर्मनी (ग्रांट 031A581, सब-प्रोजेक्ट ए-डी) और जर्मन रिसर्च फाउंडेशन (ड्यूश फोर्सचुंग्सेस्चेफ्ट, डीएफजी) द्वारा समर्थित किया गया था, अनुसंधान प्रशिक्षण समूह GRK 2338)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cells
A549 ATCC CCL-185
Cell culture medium and supplies
DMEM Biochrom, Berlin, Germany FG 0415 used as growth medium
DMEM Gibco-Invitrogen, Darmstadt, Germany 22320 used as exposure medium
FBS superior Biochrom, Berlin, Germany S 0615
Gentamycin (10mg/mL) Biochrom, Berlin, Germany A 2710
HEPES 1M Th. Geyer, Renningen, Germany L 0180
PBS Biochrom, Berlin, Germany L 1825
Trypsin/EDTA (0.05%/0.02%) Biochrom, Berlin, Germany L 2143
Cell culture material
CASY Cups Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany REF 05651794
Cell culture plates Corning, Wiesbaden, Germany 3516 6­-well plates
Corning Transwell cell culture inserts Corning, Wiesbaden, Germany 3450 24mm inserts; 6-­well plates; 0.4 µm
Chemicals
CASYton Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany REF 05651808001
Compressed Air (DIN EN 12021) Linde Gas Therapeutics GmbH, Oberschleißheim, Germany 2290152
WST-1 Abcam, Cambridge, United Kingdom ab155902
Instruments + equipment
CASY Cell Counter Schärfe System GmbH, Reutlingen, Germany
Circulation thermostat LAUDA, Lauda-Königshofen, Germany Ecoline RE 100
CULTEX HyP - Hydraulic Press Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany
CULTEX insert sleeve Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany
CULTEX RFS - Radial Flow System Type 2 (module for particle exposure) Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany
CULTEX RFS - Radial Flow System Type 2 (module for clean air exposure) Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany
CULTEX supply
Flow controller 0-30 ml/min (IQ-Flow) Bronkhorst Deutschland Nord GmbH
Flow controller 0-1,5 l/min (EL-Flow) Bronkhorst Deutschland Nord GmbH
Filters (large) Munktell & Filtrak GmbH, Sachsen, Germany LP-050 Munktell Sterile Filter; Particle retention efficiency > 99,999%
Filters (small) Parker Hannifin Corporation, Mainz, Germany 9933-05-DQ Balston disposable filter
Medium pump Cole-Parmer GmbH, Wertheim, Germany Ismatec IPC High Precision Multichannel Dispenser digital peristaltic pump
Microplate Reader Infinite M200 Pro Tecan Deutschland GmbH, Crailsheim, Germany
Vakuum pump KNF, Freiburg, Germany N86 KT.18
Vögtlin mass flow controller 0,2-10 l/min TrigasFI GmbH Vögtlin red-y compact regulator, Typ-Nr.: GCR-C3SA-BA20
Water Bath LAUDA, Lauda-Königshofen, Germany Ecoline Staredition RE 104

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References

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Tsoutsoulopoulos, A., Gohlsch, K., Möhle, N., Breit, A., Hoffmann, S., Krischenowski, O., Mückter, H., Gudermann, T., Thiermann, H., Aufderheide, M., Steinritz, D. Assessment of the Acute Inhalation Toxicity of Airborne Particles by Exposing Cultivated Human Lung Cells at the Air-Liquid Interface. J. Vis. Exp. (156), e60572, doi:10.3791/60572 (2020).

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