Summary
ここでは、ゼブラフィッシュ胚および幼虫の全製剤におけるタンパク質の蛍光抗体媒介検出に関するプロトコルを提示する。
Abstract
免疫賦技化学は、正常な発達状態と疾患状態の両方でタンパク質の発現および局在を調べる広く使用されている技術です。多くの免疫組織化学プロトコルは哺乳類の組織および組織切片に最適化されているが、これらのプロトコルは、多くの場合、非哺乳類モデル生物の修飾および最適化を必要とする。ゼブラフィッシュは、発達過程の分子、遺伝、細胞の生物学的メカニズムを調べるための基礎的、生物医学的、および翻訳的研究のモデルシステムとしてますます使用されています。ゼブラフィッシュはモデルシステムとして多くの利点を提供しますが、最適なタンパク質検出のために修正技術も必要です。ここでは、ゼブラフィッシュ胚と幼虫の全実装蛍光免疫化学に関するプロトコルを提供します。このプロトコルでは、さらに、使用できるいくつかの異なる取り付け戦略と、各戦略が提供する利点と欠点の概要について説明します。また、このプロトコルの改変により、全実装組織における発がん基質の検出と、切片された幼虫組織における蛍光検出を可能にする。このプロトコルは、多くの発達段階および胚構造の研究に広く適用可能である。
Introduction
ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は、短期間、急速な発達、遺伝的手法の評価可能性など、いくつかの理由から、生物学的プロセスの研究のための強力なモデルとして登場しました。その結果、ゼブラフィッシュは、一般的に、毒性研究や創薬のためにハイスループットの低分子スクリーンで使用されています。ゼブラフィッシュはまた、単一の女性が日常的に一度に50〜300個の卵を生産することができ、光学的に透明な胚が外部的に発達し、発生過程を効率的に視覚化できることを考えると、発達プロセスの研究のための魅力的なモデルである。しかし、初期の研究は、逆遺伝的技術を確立する際の課題のために、N-エチルN-ニトロソーレ(ENU)または他の変異原体を使用して前方遺伝的スクリーンに主に依存していた。およそ20年前、ゼブラフィッシュで最初にモルフォリノが使用され、標的遺伝子1をノックダウンしました。モルフォリノスは、初期の発生段階で胚への微小注入後の標的mRNAの翻訳を阻害する小さなアンチセンスオリゴヌクレオチドである。モルフォリノの主な弱点は、細胞が分裂するにつれて希釈され、一般的に受精後72時間(hpf)によって有効性を失うことである。形態素はゼブラフィッシュ遺伝子破壊のための強力なツールであり続けるが、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、およびクラスター化された定期的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート(CRISPR)は、ゼブラフィッシュゲノム2、3を直接標的にするために使用されている。これらの逆遺伝戦略は、前方遺伝学および高スループットスクリーンと組み合わせて、遺伝子発現および機能を研究するための強力なモデルとしてゼブラフィッシュを確立している。
遺伝子機能を研究する能力は、一般に、遺伝子または遺伝子産物発現の時空間的分布の評価を必要とする。初期の開発中にこのような発現パターンを視覚化するために最も一般的に使用される2つの技術は、その後のハイブリダイゼーション(ISH)と全実装免疫賦技化学(IHC)です。in in situハイブリダイゼーションは1969年に初めて開発され、生物4におけるmRNA発現を検出するために標識アンチセンスRNAプローブの使用に依存している。対照的に、標識抗体は、タンパク質発現を視覚化するために免疫組織化学に使用されます。検出用にタンパク質を標識するという考えは1930年代5年にさかのぼり、FITC標識抗体が感染組織6の病原細菌を検出するために使用された1941年に最初のIHC実験が発表されました。ISH と IHC は、その後の数十年にわたって大幅に進化し、改善し、現在では分子診断研究所7、8、9、10、11で日常的に使用されています。どちらの手法にも利点と欠点がありますが、IHC には ISH に対していくつかの利点があります。実際には、IHCはISHよりも時間がかかり、一般抗体のコストに応じて一般的に安価です。また、mRNA発現は、mRNAの豊富なmRNA量12によって約3分の1のタンパク質の存在量変動しか説明できないことがマウスおよびヒトで実証されているように、常に確実なタンパク質発現指標とは限らない。このため、IHC は可能な場合に ISH データを確認する重要な補足です。最後に、IHCは、イシュ13、14、15で決定できない細胞内および共局在データを提供することができる。ここでは、ゼブラフィッシュ胚と幼虫の全山中の免疫賦形化学によってタンパク質を確実に検出する段階的な方法を説明します。この技術の目的は、胚全体に目的のタンパク質の空間的および時間的発現を決定することです。この技術は、抗原特異的一次抗体と蛍光タグ付き二次抗体を利用する。このプロトコルは、スライド取り付けされた組織切片での使用や、蛍光の代わりに発泡性基質での使用に容易に適応可能です。このプロトコルを用いて、ゼブラフィッシュ骨格筋の開発は、アセチルコリン受容体に加えて、電夫グルタミン酸受容体を発現することを実証する。NMDA型グルタミン酸受容体サブユニットは、23hpfで縦筋上で検出可能である。
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Protocol
このプロトコルに記載されているゼブラフィッシュ繁殖成人および胚を扱うための手順は、マレー州立大学の機関動物ケアおよび使用委員会によって承認された。
1. 胚の採取と固定
- 一晩システム水で満たされたメッシュまたはスロットライナーでタンクに大人のゼブラフィッシュ混合セックスペアまたはグループを配置することにより、産卵タンクを準備します。
- ライトが点灯している時に、新鮮な水を取り除くために産卵タンク水を交換してください。午前9時に点灯するライトで14時間/10時間のライトダークサイクルを使用してください。
- 卵が産まれると、大人を家庭用タンクに戻します。
- 転送ピペットを使用してそれらを描くか、メッシュストレーナーにそれらを注ぐことによって卵を収集します。
- 胚培地(0.5 mg/Lメチレンブルーの30%ダニオーまたはE2胚培地など)で半分に充填されたペトリ皿に卵を移し、1皿当たりの胚数を50個に制限する。
- 死んでいるか、分割に失敗した卵を取り除きます。
注:死んだ胚は、不透明になり、しばしば「曇っている」ように見えるため、容易に識別できます。メチレンブルーを胚培地に添加すると、死んだ胚は濃い青色の外観を取る。 - 卵の料理を所望の段階に達するまで28.5 °Cでインキュベートします。この実験では、胚を23hpfまで上げます。
- 任意)メラニン形成を防止するために、胚培地中で24hpfで24hpfで200 μM 1-チオ尿素(PTU)を移し、メラニン形成を防止する。あるいは、固定後の漂白胚(オプションセクション5を参照)。
- 胚培地またはPTU培地を毎日変更する。
- 立体顕微鏡下で超微細先端鉗子を用いて、ハッチングされていない胚をデコリオネートする。あるいは、胚培地中の1mg/mLプロナーゼを室温で数分間インキュベートすることによって、胚を化学的にデコリオネートする。プロナーゼから胚を取り出し、胚培地で3回洗浄する。
- 減交胚はプラスチックに付着します。1-2%のアガロースを胚培地に溶解したガラスまたはプラスチックペトリ皿に保管してください。損傷を最小限に抑えるために、火で磨かれたパスツールピペットを使用して、エコーリオネートされた胚を移動します。
- プラスチックまたは火で磨かれたピペットを使用して、胚を1.5mL遠心管に移します。
- マイクロピペットで胚培地を除去する。各流体の変化の後に胚を覆うのに十分な液体だけを残してください。
- 化学ヒュームフードに1xリン酸緩衝生理食塩基(PBS)で4%パラホルムアルデヒド(PFA)を調製します。
注意: PFA は危険物です。手袋を着用し、汚染された液体や固体を指定された場所に処分する。 - 室温で穏やかな揺れで1-2時間の4%PFAで胚を固定します。あるいは、胚を4時間4°Cで一晩に固定する。
- 1x PBS + 1% トリトン-X (PBTriton) で 5 分間 3 回洗浄します。
- 胚をすぐに使用するか、最大1週間4°Cで保存してください。
- 長期保存のために、100%メタノール(MeOH)2時間または-20°Cで一晩で胚を脱水する。数ヶ月間、MeOHで-20°Cに胚を保管してください。
注意: MeOH は危険物です。手袋を着用し、汚染された液体や固体を指定された場所に処分する。
2. 胚の準備
- 室温で連続インキュベーションを通じて胚を水分補給する。
- 75% MeOH/25% 1x PBS で 5 分間インキュベートし、ロッキングします。
- 5分間50%MeOH/50%1x PBSでインキュベートし、ロッキング。
- 5分、ロッキングのための25%MeOH / 75%1x PBSでインキュベート。
- 5分間100%PBTritonでインキュベートし、ロッキング。
- (オプション)新鮮なプロテイナーゼKの働き溶液(PBTritonで10 μg/mL)を氷の上に用意し、解凍したばかりのプロテイナーゼKストック(10mg/mL)を10μL加えて調製します。
- プロテイナーゼKで最大30分まで消化することにより、胚を透過します。
注: 推奨されるタイミングは <24 hpf: 消化なし;24 hpf: 15 分消化;そして7日齢:30分消化。 - PBTritonで浸透した胚をリンスし、室温で20分間4%PFAで再固定した。
- PBTritonで胚を3回洗浄し、穏やかなロッキングで室温で5分間洗います。
- プロテイナーゼKで最大30分まで消化することにより、胚を透過します。
3. 一次抗体インキュベーション
- 2 mg/mLウシ血清アルブミン(BSA)の有無にかかわらず、二次抗体宿主種(PBTritonで10%のヤギ血清)と一致する市販のブロッキング溶液または血清を選択します。
- 揺れながら、室温で1〜3時間、または4°Cで一晩ブロッキング溶液中の胚をブロックします。
- 一次抗体中のインキュベートは、ブロッキング中に4°Cで一晩、PBTriton中のブロッキング溶液または1%血清中に希釈した。この実験では、使用された一次抗体は、抗NMDAR1、抗汎パン-AMPA受容体、および抗ホスホ−ヒストンH3であり、それぞれPBTritonの1%ヤギ血清中の1:500の最終濃度に希釈した。
- ロッキングしながら、室温で10分間PBTritonで5回洗います。
4. 二次抗体インキュベーション
- 一次抗体と所望の波長の宿主種に基づいて二次抗体を選択する。
- 2次抗体でインキュベートし、ロッキングしながら、2時間(または4°Cで一晩)のブロッキング溶液または1%血清で希釈した。
注:蛍光二次抗体は光感受性です。我々は、PBTritonで1%ヤギ血清中に希釈した1:500ヤギ抗マウスAlexa488を使用した。 - この後のすべてのステップのためのアルミニウム箔またはライトブロッキングボックスでチューブをカバーします。
- ロッキングしながら、室温で10分間PBTritonで3回洗います。
- 胚培地中の2%アガロースのベッドを介してPBS中の50%グリセロール溶液に胚を移し、文書化に進むか、または以下のさらなる処理ステップに進む。
オプションの手順
5. 漂白
- 810.7 μL の ddH2O、89.3 μL の 2 M KOH、100 μL の 30% H2O2を加えて、1.5 mL チューブに漂白剤溶液を調製します。
- チューブを3回反転して混合します。
- ピペット1 mLの漂白剤溶液方向を胚に対する。
- 胚管キャップを開けてガスを逃がします。ベンチのチューブを軽くタップして泡を取り除きます。
- 漂白プロセスを監視し(必要に応じて顕微鏡を使用)、顔料が十分に除去されたときに反応を停止します(24 hpfの場合は約5分、72hpfの場合は10分)。
- PBTritonの1 mLでマイクロピペットとリンス胚を3回慎重に除去します。
注:このステップでは胚は粘着性があります。 - 以下のドキュメントまたは追加の処理手順に進みます。
6. 胚解剖と脱離
- 黄身を取り除くために、1x PBSの少量(約200μLまたは十分に胚を完全に覆うのに十分だが、浮くことができる場所を制限するのに十分な制限)をうつ病スライドまたはプレーングラススライドに移す。
- プラスチックトランスファーピペットを使用して、1つ以上の胚をPBS液滴に移動します。
- 超微細鉗子と00個の昆虫ピンを使用して黄身を分解し、胚の腹側表面から黄身顆粒を非常に穏やかに削る(Chengら2014も参照)。
- 卵黄顆粒を取り除き、必要に応じてPBSを補充します。
- 胚が十分に黄身を含まないまで繰り返す。
7. スライド上のフラットマウント
- 脱黄胚をプラスチックピペットまたは1mLマイクロピペットをトリムチップで充電されたガラススライドに移す(せん断応力を軽減するため)。200 μL マイクロピペットチップまたは昆虫ピンで必要に応じて配向します。
- キムワイプまたはペーパータオルで余分なPBSを取り除きます。
- スライドとカバースリップに2~3滴のマウントメディアを追加します。
- 空気は約5〜10分間乾燥します。
- カバーガラスを透明なマニキュアでスライドにシールします。
注:カバーガラスの縁は、マニキュアの薄い、連続した層で完全に覆われている必要があります。 - 撮影前に10分程度乾燥させます。
アガロースでの取り付け
- マイクロ波安全フラスコまたはビーカーに50mLの胚培地に0.5gのアガロースを加えることによって、胚培地に1%のアガロースを調製する。
- アガロースが完全に溶解するまで、30sごとに渦巻く電子レンジで加熱します。
- 1.5 mL遠心チューブで1 mLのアリコートを作ります。アリコートを室温で保管します。
- 加熱する前にキャップロックでチューブキャップをカバーしてください。
- アガロースチューブを水で半分入ったビーカーに浮遊チューブホルダーに入れます。
- ビーカーに2〜3分間フローティングチューブを使用するか、アガロースが完全に溶けるまでマイクロ波を打ちます。
- プラスチック製のピペットまたは200 μLマイクロピペットをトリムチップでブリッジスライドに移します(せん断応力を軽減するため)。
- 昆虫ピンを使用して胚を長方形のカバースリップに配置し、約20 μLの溶けたアガロースを胚に直接加えます。
- 00の昆虫ピンを使用して、カバースリップに最も近い関心領域をすばやく向けます。
注:これは逆さまのマウントです。 - アガロースチューブを、必要に応じて各使用とマイクロ波の間の温水チューブフロートに戻します。
- アガロースが固まったら顕微鏡を用いた画像。取り付けられた胚を逆さまに保ち、逆顕微鏡で使用してください。直立顕微鏡で使用するためにカバースリップをひっくり返します(アガロースがカバースリップの下にあるように)。
9. ブリッジスライドへの取り付け
- ブリッジスライドを作るためには、スーパーグルーの小さなドットを使用してガラススライドに正方形のカバースリップを接着します。
注:カバースリップの間には少なくとも5mm幅のトラフが必要です。高い2つの#1カバーリップは通常24〜48 hpf胚に適していますが、高い3つのカバーリップは72 hpfに必要な場合があります。 - 1-2個の脱黄胚をプラスチックピペットまたは200μLマイクロピペットをトリムチップでブリッジスライドに移します(剪断応力を軽減するため)。
- キムワイプまたはペーパータオルで余分な液体を取り除きます。
- 胚に直接≥80%グリセロールの滴を追加します。
- 長方形のカバーガラスで覆います。グリセロールの液滴は、カバーガラスに触れる必要があります。
- 必要に応じてカバーガラスとスライドの間のスペースにさらにグリセロールを追加し、胚の側面にグリセロールのマージンで胚を完全に覆う。
- 長方形のカバーガラスをそっとスライドさせて、イメージング用の位置に胚を転がします。
10. DAB染色
注: このセクションは、上記の手順 4.2 の後に開始され、手順 4 の残りの部分を置き換えます。
- ペオキシダーゼ結合二次抗体を用いたブロッキング溶液中で胚を室温で2時間、または4°Cで一晩揺らしながらインキュベートする。
- PBTritonで3回、室温で10分間洗います。
- 胚を転写ピペットで培養プレートまたはうつ病スライドに移す。
- ddH 2 Oに50μL(3,3'-ジアミノベンジジン)を0.3%過酸化水素のddH2Oおよび50 μLに溶解し、PBSで1 mLに持ち込みます。
注意: DAB は危険物です。手袋を着用し、指定された領域でDAB汚染された液体や固体を処分します。 - HRP染色された胚を上記で調製したDAB溶液で覆い、顕微鏡下で色発生(通常は1〜5分)を監視する。
- 望ましいレベルの発色に達した後、PBSで胚を短時間すすいでください。
- 固定する前に胚を1.5mLのチューブに戻します。
- 室温で4%PFAで15〜20分間胚を再固定する。
- 5分間、PBTritonで胚を3回洗浄します。
- ドキュメントに進みます。
11. スライドに取り付けられる切片組織の染色のための修正されたプロトコル
- パップペンで染色する組織を囲む。
- 湿気の多いチャンバーにスライドを移します。
- スライドに直接 1 mL の PBS を追加します。
- 室温で7分間インキュベートし、埋め込み培地を除去する。
- スライドを反転させることによってPBSを注ぎます。
- 最大1 mLのTNTバッファー(100 mMトリスpH 8.0、150 mM NaCl、0.1%Tween20)で1mInを再水和します。
- 最大1 mLのブロッキング溶液(市販または10%血清+2%BSA)を室温で1時間ブロックします。
- 1%血清またはブロッキング溶液で4°Cで希釈した一次抗体で一晩インキュベートする。
- 室温で最大1 mLのTNTバッファーで5回洗浄します。
- 2次抗体で室温で2時間、または4°Cで一晩インキュベートする。ホイルでチャンバーを覆うか、暗い蓋を使用してください。
- TNTで5回室温で洗います。最後の洗濯物を注ぎます。
- マウント媒体とカバースリップの2-3滴でマウントします。5-10分座りましょう。
- 透明なマニキュアを使用してスライドにカバーガラスをシールします。撮影前に完全に乾燥させます。
12. ドキュメント
- ラボ ノートブックで、完全な手順と偏差を記録します。
- 一次抗体の濃度、名前、カタログ番号、製造業者、およびロット番号を記録します。
- 適切に取り付けられたサンプルを顕微鏡ステージに置きます。対象地域を検索します。
- 比較的明るい例を選択します。カメラの露出とゲインを設定して、信号が飽和状態にならずに十分に明るくなります。
- 実験抗体標識胚と対照抗体(例えばIgG)胚との間で比較する際に、同じ露光設定を用いて同じ対象領域の染色強度を比較する。
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Representative Results
全実装免疫組織化学は、無傷の動物におけるタンパク質発現の空間パターンを検出するために抗体を使用する。免疫組織化学の基本的なワークフロー(図1に示す)は、ゼブラフィッシュの繁殖、胚の発生および調製、非特異的抗原のブロッキング、目的のタンパク質を標的とする抗原特異的一次抗体の使用、標識された二次抗体を有する一次抗体の検出、標本の取り付け、および文書化を含む。
全実装免疫賦体化学は、ゼブラフィッシュの開発中に空間的および時間的なタンパク質発現の研究に役立つ貴重なツールです。ゼブラフィッシュは、運動ニューロンが接触する前の19hpfの前に始まるギャップ接合によって媒介される自発的収縮を示す19。ゼブラフィッシュ神経筋接合は、他の脊椎動物と同様に、ニコチン性アセチルコリン受容体で作用するアセチルコリンによって媒介される。これらの組み立て型受容体は、まず約16hpfで検出され、ニューロンが接触を形成するにつれて発現が拡大し、再モデル化される。カエル21およびラット22の研究は、脊椎動物の骨格筋も電離型グルタミン酸受容体を発現できることを示唆している。NMDA型グルタミン酸受容体のGluN1サブユニットに対する全実装免疫賦形化学は、23hpfでゼブラフィッシュ筋を発達させる全体を通してグルタミン酸受容体サブユニットの発現を明らかにする(図2)。これは、運動ニューロンの内部化のタイミングとほぼ一致する。発現は、魚と二次抗体のバックグラウンド蛍光を決定する一次対照胚と比較し、2μg/mLマウスIgGに対して非特異的抗原結合の相対寄与を決定した。AMPA型グルタミン酸受容体は、発達のこの段階では筋肉中に検出されなかった。抗体濃度は表1に列挙される。これらの画像を生成するために、これらの胚は、deyolkingを除く任意のステップのいずれもこのプロトコルで説明されているように処理された。胚は平らに取り付けられ、カバースリップした(図3B)。
分裂細胞は、タンパク質リン酸化などの特異的な修飾を認識する抗体を用いて免疫組織化学によって検出できる静止細胞からの異なるヒストン修飾を発現する。セリン10におけるヒストン3のリン酸化は、細胞分裂23と関連している。スライドに取り付けられた切片組織への免疫組織化学の適応のためにこのプロトコルに提示された改変は、幼虫ゼブラフィッシュ脳の増殖細胞を検出するために使用された。72 hpf胚の凍結部分は、p-H3用のスライドおよび免疫染色に取り付けられた(図4)。いくつかの細胞はp-H3を発現し、発現は心室領域で最も顕著である。発現は、一次対照胚がなく、2μg/mLマウスIgGと比較して、非特異的抗原結合の相対寄与を決定した。
| 抗体 | ターゲット | 濃度 |
| マウス IgG アイソタイプ コントロール | 非特異的抗原 | 2 μg/mL |
| マウスアンチNMDAR1 | GluN1サブユニット | 1:1,000 |
| ヤギアンチマウスAlexa488 | マウスイググ | 1:500 |
| マウスアンチホスホ-H3 | リン酸化ヒストンH3 | 1:500 |
| マウスアンチパンAMPA受容体 | GluR1-4 | 1:500 |
表1:使用する抗体および濃度のリスト。
図1:全実装免疫賦技化学手順のフローチャート。手順の基本的なワークフローは、魚を繁殖することです。胚を収集し、準備する。ブロック非特異的抗原;一次抗体および二次抗体のインキュベートマウント組織;とドキュメント。オプションのステップは、ワークフローの適切なポイントに小さな矢印で示されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:幼虫模式図及びNMDA受容体IHC代表結果全体のマウント免疫賦験化学の使用は、筋肉の発達にグルタミン酸受容体発現をテストしました.23 hpf での対象の方向と領域が示されます。一次抗体が含まれていない場合、シグナルは検出されなかった。マウスIgGコントロール抗体は、非特異的発現の低レベルを示す。NMDA型グルタミン酸受容体(NMDAR)のGluN1サブユニットは、発達中の筋肉全体で発現し、サマイト境界(矢印)でより高い濃度で発現する。AMPA型グルタミン酸受容体(AMPAR)は現段階では発現しない。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:取り付けスキームの概略図(A) 50%グリセロールに沈んだ胚は、容易に再配置することができる。(B) 装着媒体のスライドに平らに取り付けられた胚は、後日保存して画像化することができる。(C)アガロース1%の液滴に取り付けられた胚は、困難な領域を見るために位置に固定することができる。(D) ブリッジされたスライド上のグリセロールに取り付けられた胚を転がして再配置することができる。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:切片組織におけるIHCの代表的な結果。任意のステップでプロトコル修飾を用いて、免疫賦活化学は72hpfでゼブラフィッシュ幼虫脳の細胞の増殖について試験した。マウスIgGコントロール抗体および一次抗体を除外すると、非特異的発現の低レベルが明らかになる。増殖細胞のマーカーとして、p-H3は心室領域(矢印)を含む離散的な場所で発現される。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
免疫組織化学は、生物に関心のあるほぼすべてのタンパク質の時空間的発現を特徴付けるために使用できる汎用性の高いツールです。免疫組織化学は、多種多様な組織およびモデル生物に使用される。このプロトコルはゼブラフィッシュでの使用のために最適化されています。異なる種の免疫組織化学は、異なる固定および取り扱い技術、種および内因性ペルオキシダーゼの存在に応じて溶液を遮断し、組織の厚さと組成によるインキュベーション時間を必要とするかもしれない。ゼブラフィッシュのIHCは、癌24、代謝疾患25、神経疾患26、および人間の健康に大きな関連性を持つ他の多くの分野の理解を進める上で不可欠であった。IHCの大きな利点の1つは、この手順がISHなどの他の技術と比較して比較的短く、技術的に要求が厳しくなくてはならないということです。しかし、検体の年齢、標的とする抗原、および使用されている抗体に基づいて最適化を必要とする多数のステップがあります。
このプロトコルの複数のステップの期間は柔軟です。前述のように、柔軟なステップに与えられた期間は、一般的に必要な最小の時間を表します。一般に、胚がPBTritonで3回以上洗浄されるときはいつでも、必要に応じて最後の洗浄で4°Cで一晩保管することができます。パーメアビライゼーションと固定時間は柔軟性が低く、トラブルシューティング戦略の一環として意図的に調整する必要があります。我々は、これらのステップを実験的に関連するワークフローに統合する方法を示すためにオプションであるプロトコルのいくつかの点を指摘した。例えば、色素沈着がシグナル検出を妨げる場合、PTU処理または漂白固定胚によるメラニンゲンの予防を行う。漂白は組織に損傷を与える可能性があるため、胚が漂白剤に費やす時間を最小限に抑えるように注意する必要があります。しかし、PTU処理よりも漂白が好ましく、現像の特定の側面に影響を与える可能性があります27,28,29,30.また、蛍光検出と発がん検出のオプションも紹介します。蛍光が望ましくない場合や、抗原が蛍光顕微鏡検査で十分に検出できない弱いシグナルを生成する場合、発色検出は、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合抗体およびDABを用いて達成することができる。
ゼブラフィッシュにおけるIHCの最大の課題は、適切な抗体を見つけることです。実際、目的のタンパク質に対して市販の抗体が利用できない場合、イシュはタンパク質発現の代理として使用されることが多い。多くの市販の抗体は、哺乳動物の標的を標的とするように設計されており、エピトープはゼブラフィッシュでは必ずしも保存されていません。利用可能な場合は、ゼブラフィッシュで試験された市販の抗体を選択する。ゼブラフィッシュと標的種の間で>80%保存されている抗原を認識する抗体は、一般的にゼブラフィッシュで働くことを発見しました。また、哺乳類に加えて鳥類や両生類のいずれでも働くことを実証された抗体は、ゼブラフィッシュの有効性がテストされていない場合でも、一般的にゼブラフィッシュでも働くことを発見しました。典型的には、哺乳動物抗原に対して開発されたポリクローナル抗体は、その特異性が低いためモノクローナル抗体よりもゼブラフィッシュホモログを検出する可能性が高い。新しい抗体を試験する場合は、架橋標的ペプチド、タンパク質を発現することが知られている哺乳動物の組織または細胞、またはレポーターコンストラクトを発現する細胞を用いて陽性対照実験を行うことは有益である。抗体はまた、標的抗原のサイズを検証するためにウェスタンブロットによって試験することができる。
ほとんどの市販の抗体は、IHCの希釈範囲を示唆していますが、最も効果的な希釈を経験的に決定することが重要です。抗体濃度が高すぎると、非特異的な染色や背景の増加が起こり、抗体が少なすぎると識別可能なシグナルが得られない場合があります。抗体および抗原によっては、先に述べたステップ3.2で説明したように胚を最初に透過処理することが有利であり得るが、しかし、このステップは必要なく、場合によってはシグナルの低下をもたらす可能性がある。このプロトコルは、細胞を透過する洗浄剤としてTriton-X-100を使用し、薄い組織または表面的な発現に十分である可能性があります。深部脳領域や高齢の幼虫のような深部または厚い組織は、プロテイナーゼ透過性を必要とするかもしれない。逆に、細胞表面での免疫染色のみが細胞内タンパク質の標識よりも望ましい場合、Triton-X-100は全てのステップから除外されるべきである。ブロッキングステップの持続時間と、血清およびBSAを用いたものに対する市販のブロッキング溶液の選択も、抗体感受性およびバックグラウンド染色の補正のために調整することができる。ブロッキングに使用される血清の高濃度(このプロトコルでは10%)は、バックグラウンド染色を減らすことができますが、抗体が存在する場合は、マスキング抗体結合部位を最小限に抑えるために希釈する必要があります。植物ベースのブロッキング溶液は、低抗体希釈(<1:1,000)であっても、バックグラウンドシグナルが一貫して高い場合に有益である可能性があります。最後に、感度は、ワッシュのストリンジェンシーによって微調整することができます。抗体後の洗浄ステップの持続時間を増減させるとともに、PBTritonのTriton-X-100の量を調整する必要があるかもしれません。PBTritonの典型的な働く範囲は0.2%から1.0%のトリトンX-100に及ぶ。新しい抗体を使用して、一次IgGおよび標識された二次抗体を用いて陰性対照胚を染色し、抗体の特異性を決定し、潜在的な偽陽性シグナルを同定する場合に適しています。
抗体最適化が陽性シグナルを生成できない場合、抗原を固定マスキングすることによるものと考えられる。一般的に、4%PFAでの固定は、抗体結合を防止するために抗原部位をマスクしないが、抗原マスキングは、いくつかの抗体で時折起こる。抗原検索は、胚に損傷を与えることができますが、働くプロトコルは井上とウィットブロット31によって記述されています。あるいは、選択した抗体が4%PFAと適合しない場合、またはPFAが細胞形態変化をもたらす場合、メタノール、2%トリクロロ酢酸、またはグリョアキシャルを用いて試料27を固定することができる。ホルムアルデヒド固定との抗体の適合性は、経験的に決定されなければならない。PFA固定後に正の制御シグナルが得られない場合は、メタノールなどの代替固定を試してみる価値があります。結合抗原(GABA-BSAなど)に対して上昇した一次抗体にも、代替固定プロトコルが必要な場合があります。
免疫染色ゼブラフィッシュ胚をイメージング用に取り付けるための有効なオプションがいくつかあります。胚は、ピンまたは鉗子で配置されたグリセロールのペトリ皿に移し、反転顕微鏡で皿を通して上からまたは下から広視野の画像で画像化することができる(図3A)。この方法は、簡単で、迅速かつ一時的です。欠点は、液体グリセロールに焦点を当てずに胚がロールアウトする傾向、皿のグリセロールの表面から潜在的な反射、および厚い皿を通してイメージングすることの難しさなどです。胚は、取り付け媒体、カバースリップ、マニキュアを備えたガラス側面(図3B)に平らに取り付けることができます。これらの台紙は直立または逆顕微鏡で見ることができる。このようにして調製した胚は、イメージングまで4°Cで保存されたスライドを事前に準備したり、後で保存して再イメージングすることができます。これは、撮像時間が限られている場合に特に有利であり得る。このマウントの欠点は、胚の位置および組織の厚さのための限られたオプション、および再位置または回復の胚ができないことが含まれます。この方法で取り付けられた胚は、卵黄顆粒が最も一般的に使用される蛍光チャネルで自己蛍光であり、取り付け後に移動または除去することができないため、しばしばデヨルキングを必要とします。対象領域が胚の位置決めが困難な場合、胚をカバーガラス上の1%アガロースに取り付けるのが最も有利である(図3C)。胚はアガロースが冷却されるまでカバーガラスに最も関心のある領域を持つ昆虫ピンと位置に保持することができる。アガロースは、胚が少なくとも数分間転がることなく胚を所定の位置に保持する。アガロースの土台は、立ち上がった顕微鏡の使用のためにカバーガラスを注意深く反転させることができるが、逆顕微鏡のために最もよい。このマウントは時間がかかり、胚は一般的に再配置または回収不可能である。ブリッジされたスライド上に胚を取り付ける(図3D)は、これらの方法の間にやや妥協を提供する。橋渡しされた台紙は速く、そして胚は位置を変え、回復することができる。ブリッジの高さは、上または下から画像化する能力を維持しながら、平らなマウントよりも組織の厚さと胚の位置に大きな柔軟性を可能にすることができます。この方法では、ブリッジされたスライドを事前に準備する必要があります。取り付ける組織の厚さは、橋の高さのカバースリップの数を決定します。ブリッジされたスライドは1日に数回再利用することができますが、グリセロールはスライドをきれいにするのが難しく、ブリッジを保持している接着剤をゆっくりと取り除くので、イメージングセッション後に処分する必要があります。
IHCは、生物または組織におけるタンパク質発現のタイミングおよびパターンを決定するための有効な方法である。IHC は、比較的低コストで、通常、ISH に必要な時間のほんの一部で完了することができるという点で、ISH に比べていくつかの利点があります (2-3 日対 5-8 日)。さらに、IHCは、mRNAレベルの検出がタンパク質発現に影響を与える可能性のある転写後および翻訳後のプロセスを予測しないことから、遺伝子産物発現のより良い指標です。IHCは、細胞内局在化データを提供することも可能であり(DAB染色を使用する場合はそうではないが)、これはISHによって提供されない。ゼブラフィッシュで二重ISH/IHCを行うことが可能です。
IHCにもいくつかの欠点があり、その中でも抗体の可用性が最も重要です。IHCに適した品質の抗体は数多くありますが、ゼブラフィッシュで特異的に働く抗体を見つけることはより困難であり、哺乳類抗原に対して生成された抗体のテストとトラブルシューティングが必要な場合が多いです。しかし、ゼブラフィッシュの検証済み抗体が市場に出てきており、CRISPR/Cas9技術の登場により、ゲノム工学を通じて内因性タンパク質のエピトープタグが可能になりました。しかし、これらのプロセスは時間と困難であり、タンパク質機能の検証が必要です。
この報告書に記載されているプロトコルは、ゼブラフィッシュの胚および幼虫に対して任意の段階で広く使用することができ、成動物の組織にも適用することができる。さらに、このプロトコルは、凍結またはパラフィン切断されたサンプルの染色もほとんど変更を加えなくすることができます。全マウント免疫賦験化学は、筋肉中の神経伝達物質受容体集団を調べるために使用され、ゼブラフィッシュ筋肉の発達における電夫NMDAグルタミン酸受容体義務サブユニット1の発現を明らかにした。これは、発達中の筋全体にかなり広く及びびびびまん性染色は、ゼノプス幼虫21の発達における同じ受容体サブユニットの発達発現と一致している。これは、発達筋におけるグルタミン酸受容体の発現が進化的に保存されていることを示唆している。全体として、このプロトコルは、IHCを使用して遺伝子発現のより良い理解を得るための価値があり、ゼブラフィッシュにおけるタンパク質発現の時空間的分布を決定するための強力なツールを提供する。
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Disclosures
著者らは開示する情報を持っていません。
Acknowledgments
NIH助成金8P20GM103436 14からの資金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-100 | |
| Aluminum foil, heavy duty | Kirkland | Any brand may be substituted | |
| Anti-NMDA antibody | Millipore Sigma | MAB363 | |
| Anti-phospho-Histone H3 (Ser10), clone RR002 | Millipore Sigma | 05-598 | |
| Anti-pan-AMPA receptor (GluR1-4) | Millipore Sigma | MABN832 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Calcium Nitrate [Ca(NO3)2] | Sigma Aldrich | C4955 | |
| Centrifuge tubes, 1.5 mL | Axygen | MCT150C | |
| Clear nail polish | Sally Hanson | Any nail polish or hardener may be subsituted | |
| Depression (concavity) slide | Electron Miscroscopy Sciences | 71878-01 | |
| Diaminobenzidine | Thermo Scientific | 1855920 | |
| Embryo medium, Danieau, 30% | 17.4 mM NaCl, 0.21 mM KCl, 0.12 mM MgS04, 0.18 mM Ca(NO3)2, 1.5 mM HEPES in ultrapure water. | ||
| Embryo medium, E2 | 7.5 mM NaCl, 0.25 mM KCl, 0.5 mM MgSO4, 75 μM KH2PO4, 25 uM Na2HPO4, 0.5 mM CaCl2, 0.35 mM NaHCO3, 0.5 mg/L methylene blue | ||
| Floating tube holder | Thermo Scientific | 59744015 | |
| Fluorescence compound microscope | Leica Biosystems | DMi8 | |
| Fluorescence stereomicroscope | Leica Biosystems | M165-FC | |
| Glass coverslips 18 mm x 18 mm | Corning | 284518 | |
| Glass coverslips 22 mm x 60 mm | Thermo Scientific | 22-050-222 | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Goat anti-mouse IgG Alexa 488 | Invitrogen | A11001 | |
| HEPES solution | Sigma Aldrich | H0887 | |
| Humid chamber with lid | Simport | M920-2 | |
| Hydrogen peroxide, 30% | Fisher Scientific | H325-500 | |
| Immunedge pap pen | Vector labs | H-4000 | |
| Insect pins, size 00 | Stoelting | 5213323 | |
| Magnesium Sulfate (MgSO4 · 7H2O) | Sigma Aldrich | 63138 | |
| Mesh strainer | Oneida | Any brand may be substituted | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 34860 | |
| Methylene blue | Sigma Aldrich | M9140 | |
| Micro-tube cap lock | Research Products International | 145062 | |
| Microwave oven | Toastmaster | ||
| Mouse IgG | Sigma Aldrich | I8765 | |
| Normal goat serum | Millipore Sigma | S02L1ML | |
| Nutating mixer | Fisher Scientific | 88-861-044 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 04042-500 | |
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| PBTriton | 1% TritonX-100 in 1x PBS | ||
| Permount mounting medium | Fisher Chemical | SP15-500 | |
| Petri dish (glass) | Pyrex | 3160100 | |
| Petri dish (plastic) | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| 1-phenyl 2-thiourea | Acros Organics | 207250250 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), 10x, pH 7.4 | Gibco | 70011-044 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), 1x | 1x made from 10x stock diluted in dH2O | ||
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma Aldrich | P9333 | |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Fisher | P250-500 | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Sigma Aldrich | P5655 | |
| Pronase | Sigma Aldrich | 10165921001 | |
| Proteinase K | Invitrogen | AM2544 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | S7653 | |
| Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | Sigma Aldrich | S7907 | |
| Spawning tank with lid and insert | Aquaneering | ZHCT100 | |
| SuperBlock PBS | Thermo Scientific | 37515 | |
| Superfrost + slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Superglue gel | 3M Scotch | ||
| TNT | 100 mM Tris, pH 8.0; 150 mM NaCl; 0.1% Tween20; made in dH2O | ||
| Transfer pipette | Fisher | 13-711-7M | |
| Trichloracetic Acid (Cl3CCOOH) | Sigma Aldrich | T6399 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | S374-500 | |
| TritonX-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| Tween20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Ultrafine forceps | Fisher Scientific | 16-100-121 | |
| Water, ultrapure/double distilled | Fisher Scientific | W2-20 |
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