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Developmental Biology

Immunohistochimie du mont entier dans les embryons et larves de poissons-zèbres

doi: 10.3791/60575 Published: January 29, 2020

Summary

Ici, nous présentons un protocole pour la détection fluorescente des protéines par anticorps dans des préparations entières d'embryons et de larves de poissons zèbres.

Abstract

L'immunohistochimie est une technique largement utilisée pour explorer l'expression et la localisation des protéines pendant les états normaux de développement et de maladie. Bien que de nombreux protocoles d'immunohistochimie aient été optimisés pour les sections des tissus et des tissus des mammifères, ces protocoles nécessitent souvent une modification et une optimisation pour les organismes modèles non mammifères. Le poisson zèbre est de plus en plus utilisé comme système modèle dans la recherche fondamentale, biomédicale et translationnelle pour étudier les mécanismes moléculaires, génétiques et biologiques cellulaires des processus de développement. Le poisson zèbre offre de nombreux avantages en tant que système modèle, mais nécessite également des techniques modifiées pour une détection optimale des protéines. Ici, nous fournissons notre protocole pour l'immunohistochimie de fluorescence de montage entier dans les embryons et les larves de poissons-zèbres. Ce protocole décrit en outre plusieurs stratégies de montage différentes qui peuvent être utilisées et une vue d'ensemble des avantages et des inconvénients de chaque stratégie fournit. Nous décrivons également des modifications à ce protocole pour permettre la détection des substrats chromogéniques dans le tissu entier de montage et la détection de fluorescence dans le tissu larvaire sectionné. Ce protocole est largement applicable à l'étude de nombreux stades de développement et structures embryonnaires.

Introduction

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Le poisson zèbre (Danio rerio) est devenu un modèle puissant pour l'étude des processus biologiques pour plusieurs raisons, y compris le temps de génération court, le développement rapide, et l'agréabilité aux techniques génétiques. En conséquence, le poisson zèbre est couramment utilisé dans les écrans à haut débit de petites molécules pour la recherche toxicologique et la découverte de médicaments. Le poisson zèbre est également un modèle attrayant pour l'étude des processus de développement étant donné qu'une seule femelle peut régulièrement produire 50-300 œufs à la fois et les embryons optiquement clairs se développent à l'extérieur permettant une visualisation efficace des processus de développement. Cependant, les premières recherches se sont surtout appuyées sur des écrans génétiques avancés utilisant n-éthyle-N-nitrosourea (ENU) ou d'autres mutagènes en raison de difficultés à établir des techniques génétiques inversées. Il y a environ deux décennies, les morpholinos ont été utilisés pour la première fois chez le poisson zèbre pour éliminer les gènes ciblés1. Les morpholinos sont de petits oligonucléotides antisens qui inhibent la traduction de l'ARNm cible après la microinjection dans un embryon à un stade de développement précoce. Une faiblesse majeure des morpholinos est qu'ils sont dilués pendant que les cellules se divisent et perdent généralement l'efficacité par 72 heures après la fertilisation (hpf). Tandis que les morpholinos restent un outil puissant pour la perturbation de gène de poisson-zèbre, les nucléases d'effecteur de transcription-comme d'activateur (TALENs), les nucléases de zinc-doigt (ZFNs), et les groupés régulièrement interspaced courtes répétitions palindromic (CRISPRs) sont plus récemment employés pour cibler directement le génome de poisson zèbre2,3. Ces stratégies génétiques inversées, combinées à la génétique avancée et aux écrans à haut débit, ont établi le poisson zèbre comme un modèle puissant pour étudier l'expression et la fonction des gènes.

La capacité d'étudier la fonction de gène exige généralement une évaluation de la distribution spatio-temporelle de l'expression de gène ou de produit de gène. Les deux techniques les plus couramment utilisées pour visualiser de tels modèles d'expression au début du développement sont l'hybridation in situ (ISH) et l'immunohistochimie de montage entier (IHC). L'hybridation in situ a été développée pour la première fois en 1969 et repose sur l'utilisation de sondes d'ARN antisens étiquetées pour détecter l'expression de l'ARNm dans un organisme4. En revanche, les anticorps étiquetés sont utilisés dans l'immunohistochimie pour visualiser l'expression des protéines. L'idée d'étiqueter les protéines pour la détection remonte auxannées 5 des années 1930 et la première expérience du CIH a été publiée en 1941 lorsque des anticorps étiquetés FITC ont été utilisés pour détecter les bactéries pathogènes dans les tissus infectés6. ISH et IHC ont évolué et amélioré de manière significative au cours des décennies suivantes et sont maintenant à la fois couramment utilisés dans le laboratoire de recherche moléculaire et diagnostique7,8,9,10,11. Bien que les deux techniques présentent des avantages et des inconvénients, le CSI offre plusieurs avantages par rapport à l'ISH. Pratiquement, le CSI prend beaucoup moins de temps qu'ISH et est généralement moins coûteux en fonction du coût de l'anticorps primaire. En outre, l'expression de l'ARNm n'est pas toujours une mesure fiable de l'expression des protéines, car il a été démontré chez les souris et les humains que seulement environ un tiers de la variation de l'abondance des protéines peut être expliquée par l'abondance de l'ARNm12. Pour cette raison, IHC est un supplément important pour confirmer les données ISH, si possible. Enfin, le CSI peut fournir des données subcellulaires et de co-localisation qui ne peuvent pas être déterminées par ISH13,14,15. Ici, nous décrivons une méthode étape par étape pour détecter de façon fiable des protéines par immunohistochimie dans les embryons et les larves de poissons zèbres de monture entière. Le but de cette technique est de déterminer l'expression spatiale et temporelle d'une protéine d'intérêt dans l'embryon entier. Cette technologie utilise des anticorps primaires spécifiques à l'antigène et des anticorps secondaires étiquetés fluorescents. Le protocole est facilement adaptable pour une utilisation sur les sections de tissu montés sur la diapositive et pour une utilisation avec des substrats chromogéniques au lieu de la fluorescence. Utilisant ce protocole, nous démontrons que le développement du muscle squelettique de poisson zèbre exprime des récepteurs ionotropic de glutamate, en plus des récepteurs d'acétylcholine. Les sous-unités de récepteur de glutamate de type NMDA sont détectables sur le muscle longitudinal à 23 hpf.

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Protocol

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Les procédures de travail avec les adultes reproducteurs de poissons zèbres et les embryons décrits dans ce protocole ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux de l'Université d'État de Murray.

1. Collection d'embryons et fixation

  1. Préparer les réservoirs de frai en plaçant des paires ou des groupes mixtes de poissons-zèbres adultes dans des réservoirs avec un maillage ou une doublure à fentes remplies d'eau du système pendant la nuit.
  2. Aux lumières allumées, modifiez l'eau du réservoir de frai pour l'eau fraîche du système afin d'éliminer les excréments. Utilisez un cycle sombre clair de 14 h/10 h avec des lumières qui s'allument à 9 h.
  3. Une fois les œufs pondus, retournez les adultes dans des réservoirs à la maison.
  4. Recueillir les œufs en les dessinant à l'aide d'une tuyauterie de transfert ou en les versant dans une passoire en maille.
  5. Transférer les œufs dans des plats Petri remplis à mi-chemin avec le milieu embryonnaire (comme 30% Danieau ou E2 embryon moyen avec 0,5 mg/L bleu méthylène), limitant le nombre d'embryons par plat à 50.
  6. Enlever les œufs morts ou qui ne se divisent pas.
    REMARQUE : Les embryons morts peuvent être facilement identifiés car ils deviennent opaques et semblent souvent « nuageux ». Si le bleu de méthylène est ajouté au milieu embryonnaire, les embryons morts prennent une apparence bleu foncé.
  7. Incuber les plats d'œufs à 28,5 oC jusqu'à ce qu'ils atteignent le stade désiré. Pour cette expérience, élever les embryons jusqu'à 23 hpf.
  8. Facultatif) Transférer les embryons à 24 hpf à 200 M 1-phényl 2-thiourea (PTU) dans le milieu embryonnaire pour prévenir la mélanogenèse16,17. Alternativement, les embryons d'eau de Javel après fixation (voir la section 5 en option).
  9. Changer l'embryon moyen ou PTU moyen tous les jours.
  10. Déchorionate embryons non éclos à l'aide de forceps ultra-fin-tip sous un stéréomicroscope. Alternativement, déchorionate chimiqueembryons en couvant dans 1 mg/mL Pronase dans le milieu d'embryon pendant plusieurs minutes à température ambiante. Retirer les embryons de Pronase et les laver trois fois avec le milieu embryonnaire.
  11. Les embryons déchorions s'en tiendront au plastique. Conservez-les dans des plats Petri en verre ou en plastique recouverts d'agarose de 1 à 2 % dissous dans un milieu embryonnaire. Déplacer les embryons déchorions à l'aide de pipets Pasteur polis au feu pour minimiser les dommages.
  12. Transférer les embryons dans des tubes centrifugeurs de 1,5 ml à l'aide d'une tuyauterie en plastique ou polie par le feu.
  13. Retirer le milieu embryonnaire à l'eclec. Ne laisser que suffisamment de liquide pour couvrir les embryons après chaque changement de liquide.
  14. Préparer 4 % de paraformaldéhyde (PFA) dans 1x salin tamponné par phosphate (PBS) dans une hotte chimique à fumée.
    CAUTION: PFA est une matière dangereuse. Portez des gants et jetez-les des liquides et des solides contaminés dans les zones désignées.
  15. Fixer les embryons en 4% PFA pour 1-2 h avec bascule douce à température ambiante. Alternativement, fixer les embryons de 4 h à la nuit à 4 oC.
  16. Laver trois fois en 1x PBS et 1% De Triton-X (PBTriton) pendant 5 min.
  17. Utilisez les embryons immédiatement ou entreposez-les à 4 oC jusqu'à 1 semaine.
  18. Pour le stockage à long terme, déshydrater les embryons dans 100% méthanol (MeOH) 2 h ou pendant la nuit à -20 oC. Conserver les embryons à -20 oC à MeOH pendant plusieurs mois.
    CAUTION: MeOH est une matière dangereuse. Portez des gants et jetez-les des liquides et des solides contaminés dans les zones désignées.

2. Préparation d'embryons

  1. Réhydratez les embryons par incubations en série à température ambiante.
    1. Incuber en 75% MeOH/25% 1x PBS pendant 5 min, à bascule.
    2. Incuber en 50% MeOH/50% 1x PBS pendant 5 min, à bascule.
    3. Incuber en 25% MeOH/75% 1x PBS pendant 5 min, à bascule.
    4. Incuber en 100% PBTriton pendant 5 min, à bascule.
  2. (Facultatif) Préparer une solution de travail nouvelle protéase K (10 g/mL en PBTriton) sur la glace en ajoutant 10 l de stock de protéase K fraîchement décongelé (10 mg/mL).
    1. Perméabilisez les embryons en digérant jusqu'à 30 min dans Proteinase K.
      REMARQUE : Le moment suggéré est de 24 hpf : pas de digestion ; 24 hpf : 15 min de digestion; et 7 jours: 30 min de digestion.
    2. Rincer les embryons perméabilisés dans PBTriton et re-fixer dans 4% PFA pendant 20 min à température ambiante.
    3. Laver les embryons trois fois en PBTriton pendant 5 min à température ambiante avec un léger basculement.

3. Incubation primaire d'anticorps

  1. Sélectionnez une solution de blocage commercial ou un sérum correspondant à l'espèce hôte d'anticorps secondaire (p. ex. 10 % de sérum de chèvre dans PBTriton) avec ou sans 2 mg/mL d'albumine bovine (BSA).
  2. Bloquer les embryons dans la solution de blocage pendant 1-3 h à température ambiante ou pendant la nuit à 4 oC pendant le basculement.
  3. Incuber dans l'anticorps primaire dilué dans la solution de blocage ou 1% de sérum dans PBTriton pendant la nuit à 4 oC tout en se balançant. Dans cette expérience, les anticorps primaires utilisés étaient anti-NMDAR1, récepteur anti-pan-AMPA, et anti-phospho-Histone H3, chacun dilué à une concentration finale de 1:500 dans 1% de sérum de chèvre dans PBTriton.
  4. Laver cinq fois dans PBTriton pendant 10 min à température ambiante tout en se balançant.

4. Incubation secondaire d'anticorps

  1. Sélectionnez un anticorps secondaire en fonction de l'espèce hôte de l'anticorps primaire et de la longueur d'onde désirée.
  2. Incuber dans un anticorps secondaire dilué dans une solution de blocage ou 1 % de sérum pendant 2 h à température ambiante (ou pendant la nuit à 4 oC) pendant le basculement.
    REMARQUE : Les anticorps secondaires fluorescents sont sensibles à la lumière. Nous avons utilisé 1:500 chèvre-anti-souris Alexa488 dilué dans 1% sérum de chèvre dans PBTriton.
  3. Couvrez les tubes de papier d'aluminium ou couvrez-les d'une boîte de blocage de la lumière pour cette étape et toutes les étapes suivantes.
  4. Laver trois fois dans PBTriton pendant 10 min à température ambiante tout en se balançant.
  5. Transférer les embryons à une solution de glycérol à 50 % dans le PBS sur un lit de 2 % d'agarose dans le milieu embryonnaire et procéder à la documentation ou procéder à d'autres étapes de traitement ci-dessous.

Étapes facultatives

5. Blanchiment

  1. Préparer la solution d'eau de Javel dans un tube de 1,5 ml en ajoutant 810,7 l de ddH2O, 89,3 l de 2 M KOH, et 100 oL de 30 % H2O2.
  2. Inverser le tube trois fois pour mélanger.
  3. Pipette 1 ml de direction de solution d'eau de Javel aux embryons.
  4. Ouvrez le bouchon du tube embryonnaire pour permettre au gaz de s'échapper. Appuyez doucement sur le tube sur le banc pour déloger les bulles.
  5. Surveiller le processus de blanchiment (utiliser un microscope si nécessaire) et arrêter la réaction lorsque le pigment est suffisamment enlevé (environ 5 min pour 24 hpf ou 10 min pour 72 hpf).
  6. Retirez soigneusement la solution de blanchiment à l'égard d'une micropipette et rincez les embryons trois fois en 1 ml de PBTriton.
    REMARQUE: Les embryons sont collants dans cette étape.
  7. Passez à la documentation ou à d'autres étapes de traitement ci-dessous.

6. Dissection d'embryon et dedeyolking

  1. Pour enlever le jaune, transférer une petite quantité (200 l ou assez pour couvrir complètement l'embryon, mais assez restrictive pour limiter l'endroit où il peut flotter) de 1x PBS à une glissière de dépression ou une glissière en verre ordinaire.
  2. Utilisez un tuyau de transfert en plastique pour déplacer 1 ou plusieurs embryons vers la gouttelette PBS.
  3. Utilisez des forceps ultra-fins et 00 broches d'insectes pour briser le jaune et gratter très doucement les granules de jaune de la surface ventrale de l'embryon (voir aussi Cheng et al., 2014)18.
  4. Retirer les granules de jaune et reconstituer le PBS au besoin.
  5. Répéter l'opération jusqu'à ce que l'embryon soit suffisamment exempt de jaune.

7. Montage plat sur diapositives

  1. Transférer les embryons deyolked sur une lame de verre chargée avec une pipette en plastique ou une micropipette de 1 ml avec une pointe parée (pour réduire le stress de cisaillement). Orientez comme désiré avec une pointe micropipette de 200 l ou une goupille d'insecte.
  2. Wick loin excès PBS avec une lingette Kim ou essuie-tout.
  3. Ajouter 2-3 gouttes de support de montage à la diapositive et coverslip.
  4. Sécher à l'air pendant environ 5 à 10 min.
  5. Scellez le verre de couverture sur la glissière avec du vernis à ongles transparent.
    REMARQUE : Les bords du verre de couverture doivent être complètement recouverts d'une fine couche continue de vernis à ongles.
  6. Laisser sécher environ 10 minutes avant l'imagerie.

8. Montage à Agarose

  1. Préparer 1 % d'agarose dans le milieu embryonnaire en ajoutant 0,5 g d'agarose à 50 ml de milieu embryonnaire dans un flacon ou un bécher allant au micro-ondes d'au moins 3 fois plus grand que désiré.
  2. Chauffer au micro-ondes, en tourbillonnant tous les 30 s, jusqu'à ce que l'agarose soit complètement dissoute.
  3. Faire 1 mL d'aliquots dans des tubes centrifugeurs de 1,5 ml. Conserver les aliquots à température ambiante.
  4. Couvrir les bouchons de tube avec des serrures de capuchon avant le chauffage.
  5. Placer les tubes d'agarose dans un support de tube flottant dans un bécher à moitié rempli d'eau.
  6. Cuire au micro-ondes le bécher avec des tubes flottants pendant 2-3 min, ou jusqu'à ce que l'agarose soit complètement fondue.
  7. Transférer un embryon sur la glissière pontée avec une pipette en plastique ou une micropipette de 200 l avec une pointe parée (pour réduire le stress de cisaillement).
  8. Placez l'embryon sur une couverture rectangulaire à l'aide d'épingles d'insectes et ajoutez environ 20 agarose fondue l'année directement à l'embryon.
  9. Orientez rapidement la région d'intérêt la plus proche de la couverture à l'aide de 00 broches d'insectes.
    REMARQUE : Il s'agit d'une monture à l'envers.
  10. Remettre le tube d'agarose dans le flotteur du tube d'eau chaude entre chaque utilisation et micro-ondes au besoin.
  11. Image à l'aide d'un microscope lorsque l'agarose durcit. Gardez l'embryon monté à l'envers pour être utilisé sur un microscope inversé. Retournez la couverture (de sorte que l'agarose est sous la couverture) pour une utilisation sur les microscopes droits.

9. Montage sur des glissières pontées

  1. Pour faire des diapositives pontées, collez les couvertures carrées à la glissière en verre à l'aide d'un petit point de superglue.
    REMARQUE : Il devrait y avoir un creux d'au moins 5 mm de large entre les couvertures. Deux #1 des couvertures élevées sont généralement appropriées pour les embryons de 24 à 48 hpf, tandis que trois couvertures élevées peuvent être nécessaires pour 72 hpf.
  2. Transférer 1-2 embryons deyolked à la glissière pontée avec une pipette en plastique ou une micropipette de 200 l avec une pointe parée (pour réduire le stress de cisaillement).
  3. Éliminez l'excès de liquide avec une lingette Kim ou une serviette en papier.
  4. Ajouter une goutte de glycérol de 80 % directement à l'embryon.
  5. Couvrir d'un verre de couverture rectangulaire. La gouttelette de glycérol doit toucher le verre de couverture.
  6. Ajouter plus de glycérol à l'espace entre le verre de couverture et glisser au besoin pour couvrir complètement l'embryon avec une marge de glycérol sur les côtés de l'embryon.
  7. Faites glisser doucement le verre de couverture rectangulaire pour rouler l'embryon en position pour l'imagerie.

10. DAB Staining

REMARQUE : Cette section commence après l'étape 4.2 ci-dessus et remplace le reste de l'étape 4.

  1. Incuber les embryons dans une solution de blocage à l'aide d'un anticorps secondaire conjugué à la peroxidase pendant 2 h à température ambiante ou pendant la nuit à 4 oC pendant le basculement.
  2. Laver trois fois dans PBTriton pendant 10 min à température ambiante.
  3. Transférer les embryons dans une plaque de culture ou une glissière de dépression avec une pipette de transfert.
  4. Mélanger 50 'L de 1% de DAB (3,3'-diaminobenzidine) dissous en ddH2O et 50 'L de 0,3% de peroxyde d'hydrogène et porter à 1 ml avec PBS.
    CAUTION: DAB est une matière dangereuse. Portez des gants et jetez les liquides et les solides contaminés par le DAB dans les zones désignées.
  5. Couvrez les embryons souillés hrP avec la solution DAB préparée ci-dessus et surveillez le développement des couleurs (généralement 1-5 min) au microscope.
  6. Après avoir atteint le niveau souhaité de développement des couleurs, rincez brièvement les embryons dans PBS.
  7. Transférer les embryons dans un tube de 1,5 ml avant la fixation.
  8. Refixez les embryons de 15 à 20 min en 4 % de PFA à température ambiante.
  9. Laver les embryons trois fois en PBTriton pendant 5 min.
  10. Passez à la documentation.

11. Protocole modifié pour la coloration des tissus sectionnés qui est monté sur des diapositives

  1. Encerclez le tissu à souir avec un stylo pap.
  2. Transférer les toboggans dans une chambre humide.
  3. Ajouter 1 mL de PBS directement sur la diapositive.
  4. Incuber 7 min à température ambiante pour enlever le milieu d'intégration.
  5. Verser PBS en inversant la glissière.
  6. Réhydratez 1 min dans jusqu'à 1 ml de tampon TNT (100 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,1 % Tween20).
  7. Bloquer jusqu'à 1 ml de solution de blocage (commercial ou sérum de 10% et 2% BSA) pendant 1 h à température ambiante.
  8. Incuber toute la nuit dans un anticorps primaire dilué dans 1 % de sérum ou une solution de blocage à 4 oC.
  9. Laver cinq fois dans jusqu'à 1 ml de tampon TNT à température ambiante.
  10. Incuber dans un anticorps secondaire pendant 2 h à température ambiante ou pendant la nuit à 4 oC. Couvrir la chambre de papier d'aluminium ou utiliser un couvercle foncé.
  11. Laver cinq fois en TNT à température ambiante. Verser le dernier lavage.
  12. Monter avec 2-3 gouttes de milieu de montage et de coverslip. Laisser s'asseoir 5-10 min.
  13. Scellez le verre de couverture sur la lame à l'aide de vernis à ongles transparent. Laisser sécher complètement avant l'imagerie.

12. Documentation

  1. Enregistrez la procédure complète et toutes les déviations dans un cahier de laboratoire.
  2. Enregistrez la concentration, le nom, le numéro de catalogue, le fabricant et le numéro de lot de l'anticorps primaire.
  3. Placez l'échantillon correctement monté sur l'étape de microscope. Localiser la région d'intérêt.
  4. Sélectionnez un exemple relativement lumineux. Définir l'exposition de la caméra et de gain de sorte que le signal est suffisamment lumineux sans saturer.
  5. Comparez l'intensité de coloration d'une même région d'intérêt en utilisant les mêmes paramètres d'exposition en comparant les embryons expérimentaux étiquetés par anticorps et les embryons d'anticorps témoins (ex. IgG).

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Representative Results

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L'immunohistochimie de montage entier emploie des anticorps pour détecter le modèle spatial de l'expression de protéine dans l'animal intact. Le flux de travail de base de l'immunohistochimie (représenté à la figure 1) consiste à élever le poisson zèbre, à élever et à préparer des embryons, à bloquer les antigènes non spécifiques, à utiliser un anticorps primaire spécifique à l'antigène pour cibler la protéine d'intérêt, à détecter cet anticorps primaire avec un anticorps secondaire étiqueté, à monter le spécimen et à documenter l'expression.

L'immunohistochimie de monture entière est un outil valable pour l'étude de l'expression spatiale et temporelle de protéine pendant le développement de poisson zèbre. Le poisson zèbre présente des contractions spontanées médiées par des jonctions d'écart commençant avant 19 hpf - avant le contact de neurone moteur19. La jonction neuromusculaire du poisson zèbre, comme d'autres vertébrés, est médiée par l'acétylcholine agissant aux récepteurs d'acétylcholine nicotinique. Ces récepteurs assemblés sont d'abord détectés à environ 16 hpf et l'expression se dilate et se transforme à mesure que les neurones forment des contacts20. Des études chez les grenouilles21 et les rats22 suggèrent que le muscle squelettique des vertébrés peut également exprimer des récepteurs ionotropiques de glutamate. L'immunohistochimie de montage entier pour la sous-unité de GluN1 du récepteur de glutamate de Type NMDA indique l'expression des sous-unités de récepteur de glutamate tout au long du muscle de développement de poisson zèbre à 23 hpf (figure 2). Cela correspond approximativement au moment de l'innervation de neurone moteur. L'expression n'a été comparée à aucun embryon témoin primaire pour déterminer la fluorescence de fond du poisson et de l'anticorps secondaire et à un IgG de souris de 2 g/mL pour déterminer les contributions relatives de la liaison non spécifique d'antigène. Les récepteurs de glutamate de type AMPA n'ont pas été détectés dans les muscles à ce stade de développement. Les concentrations d'anticorps sont énumérées dans le tableau 1. Pour générer ces images, ces embryons ont été traités comme décrit dans ce protocole sans aucune des étapes facultatives excepté le deyolking. Les embryons étaient montés à plat et rectinaient (Figure 3B).

Les cellules de division expriment différentes modifications d'histone des cellules quiescent escentes qui peuvent être détectées par immunohistochimie utilisant des anticorps qui reconnaissent des modifications spécifiques, telles que la phosphorylation de protéine. La phosphorylation de l'histone 3 à la sérine 10 est associée à la division cellulaire23. Les modifications présentées à ce protocole pour l'adaptation de l'immunohistochimie au tissu sectionné qui est monté sur des glissières ont été employées pour détecter des cellules proliférantes dans le cerveau larvaire de zèbre. Des sections congelées d'embryons de 72 hpf ont été montées sur des glissières et immunostained pour p-H3 (figure 4). Plusieurs cellules expriment p-H3, et l'expression est plus notable aux zones ventriculaires. L'expression n'a été comparée à aucun embryon témoin primaire et à un IgG de souris de 2 g/mL pour déterminer les contributions relatives de la liaison d'antigène non spécifique.

Anticorps Cible Concentration
Contrôle de l'isotype De la souris IgG Antigènes non spécifiques 2 g/mL
Souris anti-NMDAR1 Sous-unité GluN1 1:1,000
Chèvre anti-souris Alexa488 Souris IgG 1:500
Souris Anti-phospho-H3 histone phosphorylé H3 1:500
Récepteur Anti-pan-AMPA de souris GluR1-4 (en) 1:500

Tableau 1 : Liste des anticorps et des concentrations utilisées.

Figure 1
Figure 1 : Diagramme de flux de la procédure d'immunohistochimie de montage entier. Le flux de travail de base de la procédure est d'élever des poissons; recueillir et préparer des embryons; bloquer les antigènes non spécifiques; incuber dans les anticorps primaires et secondaires en série; monter le tissu; et documenter. Les étapes facultatives sont indiquées avec de petites flèches au point approprié dans le flux de travail. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Résultats représentatifs du schéma des larves et des récepteurs NMDA IHC. L'utilisation de l'immunohistochimie de montage entier a testé l'expression de récepteur de glutamate dans le muscle en développement. L'orientation et la région d'intérêt à 23 hpf sont indiquées. Aucun signal n'était détectable lorsque les anticorps primaires n'étaient pas inclus. L'anticorps de commande de souris IgG montre le bas niveau d'expression non spécifique. La sous-unité GluN1 du récepteur du glutamate de type NMDA (NMDAR) est exprimée à travers le muscle en développement, avec des concentrations plus élevées aux limites somites (pointes de flèche). Les récepteurs de glutamate de type AMPA (AMPAR) ne sont pas exprimés à ce stade. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Schéma des schémas de montage. (A) Un embryon coulé dans 50% de glycérol peut être facilement repositionné. (B) Un embryon monté à plat sur une glissière dans le support de montage peut être conservé et photographié à une date ultérieure. (C) Un embryon monté dans une gouttelette de 1% d'agarose peut être fixé en position de voir une région difficile. (D) Un embryon monté en glycérol sur une glissière pontée peut être roulé et repositionné. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Résultats représentatifs du CSI dans les tissus sectionnés. Utilisant les modifications de protocole dans les étapes facultatives, l'immunohistochimie a examiné pour proliférer des cellules dans le cerveau larvaire de poisson zèbre à 72 hpf. L'anticorps de commande d'IgG de souris et excluant les anticorps primaires indiquent un bas niveau d'expression non spécifique. En tant que marqueur des cellules proliférantes, le p-H3 s'exprime dans des endroits discrets, y compris les zones ventriculaires (pointe de flèche). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

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L'immunohistochimie est un outil polyvalent qui peut être utilisé pour caractériser l'expression spatio-temporelle de pratiquement n'importe quelle protéine d'intérêt dans un organisme. L'immunohistochimie est utilisée sur une grande variété de tissus et d'organismes modèles. Ce protocole a été optimisé pour une utilisation chez le poisson zèbre. L'immunohistochimie chez différentes espèces peut nécessiter différentes techniques de fixation et de manipulation, bloquant les solutions selon les espèces et la présence de peroxidas endogènes, et les temps d'incubation en raison de l'épaisseur et la composition des tissus. IHC chez le poisson zèbre a été partie intégrante dans l'avancement de notre compréhension du cancer24, maladie métabolique25, troubles neurologiques26, et de nombreux autres domaines d'une grande pertinence pour la santé humaine. Un avantage majeur pour IHC est que la procédure est relativement courte par rapport à d'autres techniques telles que ISH et n'est pas techniquement exigeante. Il existe cependant de nombreuses étapes qui nécessitent une optimisation basée sur l'âge des spécimens, l'antigène ciblé et les anticorps utilisés.

La durée de plusieurs étapes de ce protocole est flexible. Les durées indiquées pour les étapes flexibles, comme indiqué, représentent des temps minimes généralement requis. En général, chaque fois que les embryons sont lavés trois fois ou plus en PBTriton, ils peuvent être conservés toute la nuit à 4 oC dans le dernier lavage si nécessaire. Les temps de perméabilisation et de fixation sont moins flexibles et ne devraient être ajustés qu'avec intention délibérée dans le cadre d'une stratégie de dépannage. Nous avons noté plusieurs points du protocole qui sont facultatifs pour montrer comment ces étapes peuvent être intégrées dans le flux de travail tel qu'il est expérimentalement pertinent. Par exemple, si la pigmentation interfère avec la détection du signal, prévenir la mélanogensis par le traitement PTU ou blanchir les embryons fixes. Le blanchiment peut endommager les tissus, il faut donc prendre soin de minimiser le temps que les embryons passent dans l'eau de Javel. Cependant, le blanchiment peut être préférable au traitement PTU, qui peut affecter certains aspects du développement27,28,29,30. Nous présentons également des options pour la détection fluorescente et chromogénique. Si la fluorescence n'est pas désirée ou si l'antigène produit un signal trop faible pour être détecté adéquatement par microscopie de fluorescence, la détection chromogénique peut être réalisée à l'aide d'un anticorps conjugué au raifort peroxidase (HRP) et d'un DAB.

Le plus grand défi de l'IHC chez le poisson zèbre est de trouver des anticorps appropriés. En effet, ISH est souvent utilisé comme un proxy pour l'expression des protéines lorsque les anticorps commerciaux ne sont pas disponibles pour la protéine désirée d'intérêt. De nombreux anticorps commerciaux sont conçus pour cibler les cibles des mammifères et les épitopes ne sont pas toujours conservés dans le poisson zèbre. Lorsqu'il est disponible, sélectionnez des anticorps disponibles dans le commerce qui ont été testés chez le poisson zèbre. Nous avons constaté que les anticorps qui reconnaissent les antigènes qui sont conservés entre le poisson zèbre et les espèces cibles travaillent généralement dans le poisson zèbre. Nous avons également constaté que les anticorps dont il est démontré qu'ils fonctionnent chez les oiseaux et/ou les amphibiens, en plus des mammifères, fonctionnent généralement aussi chez le poisson zèbre, même lorsque l'efficacité du poisson zèbre n'a pas été testée. Typiquement, les anticorps polyclonal développés contre un antigène de mammifères sont plus susceptibles de détecter des homoloques de poissons zèbres que les anticorps monoclonaux en raison de leur faible spécificité. Chaque fois que l'essai d'un nouvel anticorps, il est bénéfique d'exécuter une expérience de contrôle positif à l'aide d'un peptide cible interconnecté, tissu de mammifères ou des cellules qui sont connus pour exprimer la protéine, ou des cellules qui expriment une construction journaliste. Les anticorps peuvent également être testés par western blot pour vérifier la taille de l'antigène cible.

Bien que la plupart des anticorps commerciaux fournissent une plage de dilution suggérée pour iHC, il est important de déterminer empiriquement la dilution qui fonctionne le mieux. Les concentrations d'anticorps qui sont trop élevées entraînent souvent une coloration non spécifique et une augmentation du fond, tandis que trop peu d'anticorps ne fournissent pas un signal perceptible. Selon l'anticorps et l'antigène, il peut être avantageux de perméabiliser d'abord les embryons tels que décrits à l'étape 3.2 ci-dessus, cependant, cette étape peut ne pas être nécessaire et, dans certains cas, peut entraîner une réduction du signal. Ce protocole utilise Triton-X-100 comme détergent qui perméabilizes cellules, ce qui peut être suffisant pour les tissus minces ou l'expression superficielle. Les tissus profonds ou épais, tels que les régions profondes du cerveau ou les larves plus âgées, peuvent nécessiter une perméabilisation protéinase. Inversement, Triton-X-100 devrait être exclu de toutes les étapes lorsque l'immunostaining seulement les protéines à la surface des cellules est souhaitée sur l'étiquetage des protéines intracellulaires. La durée de l'étape de blocage ainsi que le choix d'une solution de blocage commercial par rapport à l'utilisation de sérum et BSA peuvent également être ajustés pour corriger la sensibilité des anticorps et la coloration de fond. Des concentrations élevées de sérum utilisées dans le blocage (10% dans ce protocole) peuvent réduire la coloration de fond, mais doivent être diluées lorsque l'anticorps est présent pour minimiser les sites de liaison d'anticorps de masquage. Les solutions de blocage à base d'usines peuvent être bénéfiques si le signal de fond est constamment élevé, même à faible dilution d'anticorps (lt;1,000). Enfin, la sensibilité peut être affinée par la rigueur des lavages. Il peut être nécessaire d'augmenter ou de diminuer la durée des étapes de lavage post-anticorps ainsi que d'ajuster la quantité de Triton-X-100 dans le PBTriton. Les plages de travail typiques de PBTriton s'étendent de 0,2 % à 1,0 % Triton-X-100. Il est de bonne pratique lors de l'utilisation d'un nouvel anticorps pour tacher les embryons témoins négatifs avec igG primaire et les anticorps secondaires étiquetés pour déterminer la spécificité des anticorps et d'identifier les signaux positifs potentiels faux.

Si l'optimisation des anticorps ne produit pas un signal positif, il peut être dû au masque fixatif de l'antigène. Généralement, la fixation dans 4% PFA ne masque pas les sites d'antigène pour empêcher la liaison d'anticorps, bien que le masquage d'antigène se produise occasionnellement avec quelques anticorps. La récupération d'antigène peut endommager l'embryon, mais un protocole de travail a été décrit par Inoue et Wittbrodt31. Alternativement, si l'anticorps sélectionné est incompatible avec 4% PFA ou si PFA entraîne des changements de morphologie cellulaire, méthanol, 2% acide trichloroacétique, ou glyoaxal peut être utilisé pour fixer les échantillons27. La compatibilité d'un anticorps avec fixation du formaldéhyde doit être déterminée empiriquement. Si un signal de contrôle positif ne peut pas être obtenu après fixation PFA, il peut être utile d'essayer un fixatif alternatif comme le méthanol. D'autres protocoles de fixation peuvent également être nécessaires pour les anticorps primaires qui ont été soulevés contre les antigènes conjugués (tels que LE GABA-BSA).

Il existe plusieurs options efficaces pour monter des embryons de poisson zèbre immunostained pour l'imagerie. Les embryons peuvent être transférés dans un plat de glycérol Petri, positionnés avec des épingles ou des forceps, et représentés soit avec une vue large d'en haut ou d'images ci-dessous à travers le plat avec un microscope inversé (Figure 3A). Cette méthode est simple, rapide et temporaire. Les inconvénients comprennent la propension des embryons à se concentrer sur le glycérol liquide, les réflexions potentielles sur la surface du glycérol dans le plat et la difficulté de l'imagerie à travers le plat épais. Les embryons peuvent être montés à plat sur les côtés en verre (Figure 3B) avec le milieu de montage, les couvertures et le vernis à ongles. Ces montures peuvent être visualisées sur un microscope droit ou inversé. Les embryons préparés de cette façon peuvent être préparés à l'avance et les diapositives stockées à 4 oC jusqu'à l'imagerie ou peuvent être stockées et réimaginées plus tard. Cela peut être particulièrement avantageux lorsque le temps d'imagerie est limité. Les inconvénients de cette monture comprennent les options limitées pour la position de l'embryon et l'épaisseur des tissus, et l'incapacité de repositionner ou de récupérer des embryons. Les embryons montés de cette façon ont souvent besoin de deyolking, car les granules de jaune sont autofluorescents dans les canaux de fluorescence les plus couramment utilisés et ne peuvent pas être déplacés ou enlevés après le montage. Lorsque la région d'intérêt nécessite un positionnement difficile de l'embryon, il peut être plus avantageux de monter les embryons en 1% d'agarose sur un verre de couverture (Figure 3C). L'embryon peut être maintenu en position avec des broches d'insectes avec la région d'intérêt la plus proche du verre de couverture jusqu'à ce que l'agarose refroidisse. L'agarose maintiendra l'embryon en position sans que l'embryon ne roule pendant au moins plusieurs minutes. Le montage d'agarose est le meilleur pour les microscopes inversés, bien que le verre de couverture puisse être inversé soigneusement pour l'usage sur un microscope droit. Cette monture peut prendre du temps et les embryons ne sont généralement pas repositionnables ou récupérables. Le montage d'embryons sur des diapositives pontées (figure 3D) offre un certain compromis entre ces méthodes. La monture pontée est rapide, et les embryons peuvent être repositionnés et récupérés. La hauteur du pont peut permettre une plus grande flexibilité dans l'épaisseur des tissus et la position de l'embryon que les montures plates, tout en maintenant la capacité d'image rattacher d'en haut ou en dessous. Cette méthode nécessite la préparation des diapositives pontées à l'avance. L'épaisseur du tissu à monter dicte le nombre de couvertures hautes que le pont doit être. Les glissières bridgeées peuvent être réutilisées plusieurs fois pendant une journée, mais doivent être éliminées après la séance d'imagerie parce que le glycérol est difficile à nettoyer les glissières et qu'il délogera lentement la colle qui tient le pont.

Le CSI est une méthode efficace pour déterminer le moment et le modèle de l'expression des protéines dans un organisme ou un tissu. IHC a plusieurs avantages par rapport à ISH en ce qui est relativement faible coût et peut être complété en une fraction du temps généralement nécessaire pour ISH (2-3 jours contre 5-8 jours). En outre, le CiPH est un meilleur indicateur de l'expression des produits géniques, car la détection des niveaux d'ARNm ne prédisent pas les processus posttranscriptionnels et post-traductionnels qui peuvent affecter l'expression des protéines. IHC est également capable de fournir des données de localisation subcellulaire (bien que ce n'est pas vrai lors de l'utilisation de la coloration DAB), qui n'est pas accordée par ISH. Il est possible d'effectuer un double ISH/IHC chez le poisson zèbre.

IHC a également quelques inconvénients, en premier lieu parmi eux étant la disponibilité des anticorps. Bien qu'il existe de nombreux anticorps disponibles qui sont de qualité appropriée pour IHC, trouver des anticorps qui travaillent spécifiquement dans le poisson zèbre est plus difficile et nécessite souvent des tests et des anticorps de dépannage générés contre les antigènes mammifères. Cependant, il y a de plus en plus d'anticorps zébrés validés sur le marché et l'émergence de la technologie CRISPR/Cas9 a permis d'épitoper les protéines endogènes grâce à l'ingénierie génomique. Ces processus sont longs et difficiles, cependant, et nécessitent la validation de la fonction protéique.

Le protocole décrit dans ce rapport peut être largement utilisé sur les embryons et les larves de poissons zèbres à n'importe quel stade et peut être appliqué sur les tissus d'animaux adultes ainsi. En outre, ce protocole permet également la coloration d'échantillons congelés ou sectionnés de paraffine avec peu de modification. L'immunohistochemistry entier de montage a été employé pour examiner des populations de récepteur de neurotransmetteur dans le muscle, révélant l'expression du sous-unité obligatoire de récepteur de glutamate ionotropic de NMDA 1 dans le muscle de zèbre se développant. Cette coloration assez répandue et diffuse à travers le muscle en développement est compatible avec l'expression développementale de la même sous-unité de récepteur dans le développement des larves de Xenopus21. Ceci suggère que l'expression des récepteurs de glutamate dans le muscle en développement soit évolutivement conservée. Au total, ce protocole est précieux pour acquérir une meilleure compréhension de l'expression des gènes grâce à l'utilisation du CiSE et fournit un outil puissant pour déterminer la distribution spatio-temporelle de l'expression des protéines chez le poisson zèbre.

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Disclosures

Les auteurs n'ont aucune information à divulguer.

Acknowledgments

Financement de la subvention des NIH 8P20GM103436 14.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Fisher Scientific BP160-100
Aluminum foil, heavy duty Kirkland Any brand may be substituted
Anti-NMDA antibody Millipore Sigma MAB363
Anti-phospho-Histone H3 (Ser10), clone RR002 Millipore Sigma 05-598
Anti-pan-AMPA receptor (GluR1-4) Millipore Sigma MABN832
Bovine serum albumin (BSA) Fisher Scientific BP1600-100
Calcium Nitrate [Ca(NO3)2] Sigma Aldrich C4955
Centrifuge tubes, 1.5 mL Axygen MCT150C
Clear nail polish Sally Hanson Any nail polish or hardener may be subsituted
Depression (concavity) slide Electron Miscroscopy Sciences 71878-01
Diaminobenzidine Thermo Scientific 1855920
Embryo medium, Danieau, 30% 17.4 mM NaCl, 0.21 mM KCl, 0.12 mM MgS04, 0.18 mM Ca(NO3)2, 1.5 mM HEPES in ultrapure water.
Embryo medium, E2 7.5 mM NaCl, 0.25 mM KCl, 0.5 mM MgSO4, 75 μM KH2PO4, 25 uM Na2HPO4, 0.5 mM CaCl2, 0.35 mM NaHCO3, 0.5 mg/L methylene blue
Floating tube holder Thermo Scientific 59744015
Fluorescence compound microscope Leica Biosystems DMi8
Fluorescence stereomicroscope Leica Biosystems M165-FC
Glass coverslips 18 mm x 18 mm Corning 284518
Glass coverslips 22 mm x 60 mm Thermo Scientific 22-050-222
Glass slides Fisher Scientific 12-544-4
Glycerol Fisher Scientific BP229-1
Goat anti-mouse IgG Alexa 488 Invitrogen A11001
HEPES solution Sigma Aldrich H0887
Humid chamber with lid Simport M920-2
Hydrogen peroxide, 30% Fisher Scientific H325-500
Immunedge pap pen Vector labs H-4000
Insect pins, size 00 Stoelting 5213323
Magnesium Sulfate (MgSO4 · 7H2O) Sigma Aldrich 63138
Mesh strainer Oneida Any brand may be substituted
Methanol Sigma Aldrich 34860
Methylene blue Sigma Aldrich M9140
Micro-tube cap lock Research Products International 145062
Microwave oven Toastmaster
Mouse IgG Sigma Aldrich I8765
Normal goat serum Millipore Sigma S02L1ML
Nutating mixer Fisher Scientific 88-861-044
Paraformaldehyde Fisher Scientific 04042-500
Pasteur pipettes Fisher Scientific 13-678-20C
PBTriton 1% TritonX-100 in 1x PBS
Permount mounting medium Fisher Chemical SP15-500
Petri dish (glass) Pyrex 3160100
Petri dish (plastic) Fisher Scientific FB0875713
1-phenyl 2-thiourea Acros Organics 207250250
Phosphate buffered saline (PBS), 10x, pH 7.4 Gibco 70011-044
Phosphate buffered saline (PBS), 1x 1x made from 10x stock diluted in dH2O
Potassium Chloride (KCl) Sigma Aldrich P9333
Potassium Hydroxide (KOH) Fisher P250-500
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) Sigma Aldrich P5655
Pronase Sigma Aldrich 10165921001
Proteinase K Invitrogen AM2544
Sodium Chloride (NaCl) Sigma Aldrich S7653
Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) Sigma Aldrich S7907
Spawning tank with lid and insert Aquaneering ZHCT100
SuperBlock PBS Thermo Scientific 37515
Superfrost + slides Fisher Scientific 12-550-15
Superglue gel 3M Scotch
TNT 100 mM Tris, pH 8.0; 150 mM NaCl; 0.1% Tween20; made in dH2O
Transfer pipette Fisher 13-711-7M
Trichloracetic Acid (Cl3CCOOH) Sigma Aldrich T6399
Tris Base Fisher Scientific S374-500
TritonX-100 Sigma Aldrich T9284
Tween20 Fisher Scientific BP337-500
Ultrafine forceps Fisher Scientific 16-100-121
Water, ultrapure/double distilled Fisher Scientific W2-20

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Immunohistochimie du mont entier dans les embryons et larves de poissons-zèbres
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Hammond-Weinberger, D. R., ZeRuth, G. T. Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae. J. Vis. Exp. (155), e60575, doi:10.3791/60575 (2020).More

Hammond-Weinberger, D. R., ZeRuth, G. T. Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae. J. Vis. Exp. (155), e60575, doi:10.3791/60575 (2020).

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