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Developmental Biology

जेब्राफिश भ्रूण और लार्वा में पूरे माउंट इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री

doi: 10.3791/60575 Published: January 29, 2020

Summary

यहां, हम जेब्राफिश भ्रूण और लार्वा की पूरी तैयारी में प्रोटीन का फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी-मध्यस्थता का पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं।

Abstract

इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री सामान्य विकास और रोग दोनों राज्यों के दौरान प्रोटीन अभिव्यक्ति और स्थानीयकरण का पता लगाने के लिए एक व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली तकनीक है। हालांकि स्तनधारी ऊतक और ऊतक वर्गों के लिए कई इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया गया है, इन प्रोटोकॉलों को अक्सर गैर-स्तनधारी मॉडल जीवों के लिए संशोधन और अनुकूलन की आवश्यकता होती है। जेब्राफिश का उपयोग विकास प्रक्रियाओं के आणविक, आनुवंशिक और सेल जैविक तंत्र की जांच करने के लिए बुनियादी, जैव चिकित्सा और ट्रांसलेशनल अनुसंधान में एक मॉडल प्रणाली के रूप में तेजी से किया जाता है। जेब्राफ़िश एक मॉडल प्रणाली के रूप में कई फायदे प्रदान करते हैं लेकिन इष्टतम प्रोटीन का पता लगाने के लिए संशोधित तकनीकों की भी आवश्यकता होती है। यहां, हम जेब्राफिश भ्रूण और लार्वा में पूरे माउंट फ्लोरेसेंस इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के लिए अपना प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। यह प्रोटोकॉल अतिरिक्त रूप से कई अलग-अलग बढ़ती रणनीतियों का वर्णन करता है जिन्हें नियोजित किया जा सकता है और प्रत्येक रणनीति प्रदान करने वाले लाभों और नुकसानों का अवलोकन करता है। हम इस प्रोटोकॉल में संशोधनों का भी वर्णन करते हैं ताकि पूरे माउंट ऊतक में गुणसूत्र सब्सट्रेट्स का पता लगाने और अनुभागित लार्वा ऊतकों में फ्लोरेसेंस डिटेक्शन की अनुमति दी जा सके। यह प्रोटोकॉल मोटे तौर पर कई विकासात्मक चरणों और भ्रूणीय संरचनाओं के अध्ययन पर लागू होता है।

Introduction

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जेब्राफिश(डैनियो रेरियो)कम पीढ़ी के समय, तेजी से विकास और आनुवंशिक तकनीकों के लिए amenability सहित कई कारणों से जैविक प्रक्रियाओं के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली मॉडल के रूप में उभरा है । नतीजतन, जेब्राफिश का उपयोग आमतौर पर विष विज्ञान अनुसंधान और दवा की खोज के लिए उच्च थ्रूपुट छोटे अणु स्क्रीन में किया जाता है। जेब्राफिश विकास प्रक्रियाओं के अध्ययन के लिए एक आकर्षक मॉडल भी है कि एक महिला नियमित रूप से एक समय में 50-300 अंडे का उत्पादन कर सकती है और ऑप्टिकल रूप से स्पष्ट भ्रूण विकास प्रक्रियाओं के कुशल दृश्य के लिए बाहरी रूप से विकसित होते हैं। हालांकि, शुरुआती शोध ज्यादातर रिवर्स जेनेटिक तकनीकों की स्थापना में चुनौतियों के कारण एन-एथिल-एन-नाइटरोसौरिया (ENU) या अन्य म्यूटगेन्स का उपयोग करके फॉरवर्ड जेनेटिक स्क्रीन पर भरोसा करते थे । मोटे तौर पर दो दशक पहले, मॉर्पोलिनोस का उपयोग पहले जेब्राफिश में लक्षित जीन1को नॉकआउट करने के लिए किया गया था। मॉर्पोलिनो छोटे एंटीसेंस ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स हैं जो शुरुआती विकास के चरण में भ्रूण में माइक्रोइंजेक्शन के बाद लक्ष्य एमआरएनए के अनुवाद को रोकते हैं। मॉर्फोलिनोस की एक बड़ी कमजोरी यह है कि वे कोशिकाओं को विभाजित करते हैं और आम तौर पर निषेचन (एचपीएफ) के बाद 72 घंटे तक प्रभावशीलता खो देते हैं। जबकि मॉर्फोलिनो जेब्राफिश जीन व्यवधान के लिए एक शक्तिशाली उपकरण बने हुए हैं, प्रतिलेखन सक्रियकर्ता की तरह प्रभावक न्यूकलीज (TALENs), जिंक-फिंगर न्यूक्लोप्स (जेडएफएन), और क्लस्टर नियमित रूप से इंटरस्पेस्ड शॉर्ट पैलिंड्रोमिक रिपीट (CRISPRs) का उपयोग हाल ही में जेब्राफिश जीनोम2,3को सीधे लक्षित करने के लिए किया जा रहा है। इन रिवर्स आनुवंशिक रणनीतियों, आगे आनुवंशिकी और उच्च थ्रूपुट स्क्रीन के साथ संयोजन में, जीन अभिव्यक्ति और समारोह का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली मॉडल के रूप में जेब्राफिश की स्थापना की है ।

जीन फ़ंक्शन का अध्ययन करने की क्षमता को आम तौर पर जीन या जीन उत्पाद अभिव्यक्ति के स्थानिक-लौकिक वितरण के मूल्यांकन की आवश्यकता होती है। प्रारंभिक विकास के दौरान इस तरह के अभिव्यक्ति पैटर्न की कल्पना करने के लिए दो सबसे अधिक उपयोग की जाने वाली तकनीक सीटू संकरण (ISH) और पूरे माउंट इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) में हैं। सीटू संकरण में पहली बार 1969 में विकसित किया गया था और एक जीव4में एमआरएनए अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए लेबल एंटीसेंस आरएनए जांच के उपयोग पर निर्भर करता है । इसके विपरीत, लेबल एंटीबॉडी का उपयोग प्रोटीन अभिव्यक्ति की कल्पना करने के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री में किया जाता है। पता लगाने के लिए प्रोटीन लेबलिंग का विचार 1930 के5 को वापस तिथियां और पहला आईएचसी प्रयोग १९४१ में प्रकाशित किया गया था जब FITC लेबल एंटीबॉडी संक्रमित ऊतकों6में रोगजनक बैक्टीरिया का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया । ईश और आईएचसी बाद के दशकों में विकसित हुए हैं और इसमें काफी सुधार हुआ है और अब दोनों का उपयोग नियमित रूप से आणविक और नैदानिक अनुसंधान प्रयोगशाला7,8,9,10,11में किया जाता है । जबकि दोनों तकनीकों के फायदे और नुकसान हैं, आईएचसी ईश पर कई लाभ प्रदान करता है। व्यावहारिक रूप से, आईएचसी ईश की तुलना में बहुत कम समय लगता है और आम तौर पर प्राथमिक एंटीबॉडी की लागत के आधार पर कम महंगा होता है। इसके अलावा, एमआरएनए अभिव्यक्ति हमेशा प्रोटीन अभिव्यक्ति का एक विश्वसनीय मीट्रिक नहीं होता है क्योंकि चूहों और मनुष्यों में यह प्रदर्शित किया गया है कि केवल एक तिहाई प्रोटीन बहुतायत भिन्नता को एमआरएनए बहुतायत12द्वारा समझाया जा सकता है। इस कारण से, आईएचसी ईश डेटा की पुष्टि करने के लिए एक महत्वपूर्ण पूरक है, जब संभव हो। अंत में, आईएचसी उपकोशिकीय और सह-स्थानीयकरण डेटा प्रदान कर सकता है जिसे ईश13,14,15द्वारा निर्धारित नहीं किया जा सकता है। यहां, हम पूरे माउंट जेब्राफिश भ्रूण और लार्वा में इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री द्वारा प्रोटीन का मज़बूती से पता लगाने के लिए एक कदम-दर-कदम विधि का वर्णन करते हैं। इस तकनीक का लक्ष्य पूरे भ्रूण में ब्याज के प्रोटीन की स्थानिक और लौकिक अभिव्यक्ति का निर्धारण करना है। यह तकनीक एंटीजन-विशिष्ट प्राथमिक एंटीबॉडी और फ्लोरोसेंटी टैग माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग करती है। प्रोटोकॉल आसानी से स्लाइड-घुड़सवार ऊतक वर्गों पर उपयोग करने के लिए और फ्लोरेसेंस के बदले गुणसूत्र सब्सट्रेट्स के साथ उपयोग के लिए अनुकूलनीय है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, हम प्रदर्शित करते हैं कि जेब्राफ़िश कंकाल मांसपेशी विकसित करना एसिटाइलकोलिन रिसेप्टर्स के अलावा आयोनोट्रोपिक ग्लूटामेट रिसेप्टर्स को व्यक्त करता है। एनएमडीए-प्रकार के ग्लूटामेट रिसेप्टर उपइकाइयों का 23 एचपीएफ पर देशीयकालीन मांसपेशी पर पता लगाया जा सकता है।

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Protocol

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इस प्रोटोकॉल में वर्णित जेब्राफिश प्रजनन वयस्कों और भ्रूण के साथ काम करने की प्रक्रियाओं को मरे स्टेट यूनिवर्सिटी में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था ।

1. भ्रूण संग्रह और निर्धारण

  1. रात भर सिस्टम के पानी से भरे जाल या स्लॉटेड लाइनर के साथ टैंकों में वयस्क ज़ेब्राफिश मिश्रित सेक्स जोड़े या समूहों को रखकर स्पॉन टैंक तैयार करें।
  2. रोशनी पर, मल को हटाने के लिए ताजा प्रणाली पानी के लिए स्पॉन टैंक पानी बदलें। सुबह 9 बजे आने वाली रोशनी के साथ 14 एच/10 एच लाइट डार्क साइकिल का इस्तेमाल करें ।
  3. एक बार अंडे रखे जाने के बाद, वयस्कों को घर के टैंकों में वापस कर दें।
  4. उन्हें एक हस्तांतरण पाइप का उपयोग कर के ऊपर ड्राइंग या उन्हें एक जाल छलनी में डालने के द्वारा अंडे ले लीजिए।
  5. पेट्री व्यंजन के लिए अंडे हस्तांतरण भ्रूण माध्यम के साथ आधे रास्ते से भरा (जैसे 30% Danieau या E2 भ्रूण मध्यम ०.५ मिलीग्राम के साथ/
  6. किसी भी अंडे को हटा दें जो मर चुके हैं या विभाजित करने में विफल हैं।
    नोट: मृत भ्रूण आसानी से पहचाना जा सकता है के रूप में वे अपारदर्शी हो जाते है और अक्सर दिखाई देते है "बादल" । यदि मेथिलीन नीला भ्रूण माध्यम में जोड़ा जाता है, तो मृत भ्रूण गहरे नीले रंग की उपस्थिति पर लेते हैं।
  7. 28.5 डिग्री सेल्सियस पर अंडे के व्यंजन इनक्यूबेट जब तक वे वांछित चरण तक पहुंचने के लिए। इस प्रयोग के लिए भ्रूण को 23 एचपीएफ तक बढ़ाएं।
  8. वैकल्पिक) भ्रूण को मेलानोजेनेसिस16,17को रोकने के लिए भ्रूण माध्यम में 24 एचपीएफ से 200 माइक्रोएम 1-फिनाइल 2-थिओरिया (पीटीयू) में स्थानांतरित करें। वैकल्पिक रूप से, फिक्सेशन के बाद ब्लीच भ्रूण (वैकल्पिक धारा 5 देखें)।
  9. भ्रूण माध्यम या पीटीयू माध्यम को रोजाना बदलें।
  10. एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत अल्ट्रा-फाइन-टिप संदंश का उपयोग करके बिना रची भ्रूण को डोकोरियोनेट करें। वैकल्पिक रूप से, कमरे के तापमान पर कई मिनट के लिए भ्रूण माध्यम में 1 मिलीग्राम/mL Pronase में इनक्यूबेटिंग द्वारा रासायनिक रूप से dechorionate भ्रूण । भ्रूण को प्रोनसे निकालें और भ्रूण माध्यम से तीन बार धोएं।
  11. Dechorionated भ्रूण प्लास्टिक से चिपके रहेंगे । उन्हें भ्रूण माध्यम में भंग 1-2% अगारोज के साथ लेपित कांच या प्लास्टिक पेट्री व्यंजन में रखें। नुकसान को कम करने के लिए आग पॉलिश पाश्चर पिपेट का उपयोग कर dechorionated भ्रूण ले जाएँ।
  12. प्लास्टिक या आग पॉलिश पाइपका उपयोग करके भ्रूण को 1.5 मिलील अपकेंद्री ट्यूबों में स्थानांतरित करें।
  13. एक माइक्रोपाइपेट के साथ भ्रूण माध्यम निकालें। प्रत्येक तरल पदार्थ बदलने के बाद भ्रूण को कवर करने के लिए केवल पर्याप्त तरल छोड़ दें।
  14. रासायनिक धूम हुड में 1x फॉस्फेट-बफर्ड लवण (पीबीएस) में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) तैयार करें।
    सावधानी: पीएफए एक खतरनाक सामग्री है। दस्ताने पहनें और निर्धारित क्षेत्रों में दूषित तरल पदार्थ और ठोस का निपटान करें।
  15. कमरे के तापमान पर कोमल कमाल के साथ 1-2 घंटे के लिए 4% पीएफए में भ्रूण को ठीक करें। वैकल्पिक रूप से, भ्रूण 4 घंटे को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर ठीक करें।
  16. 5 मिन के लिए 1x पीबीएस + 1% ट्राइटन-एक्स (पीबीट्राइटन) में तीन बार धोएं।
  17. भ्रूण का तुरंत उपयोग करें या 1 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  18. दीर्घकालिक भंडारण के लिए, भ्रूण को 100% मेथनॉल (MeOH) 2 घंटे या रात भर -20 डिग्री सेल्सियस पर निर्जलित करें। कई महीनों तक मेओएच में -20 डिग्री सेल्सियस पर भ्रूण स्टोर करें।
    सावधानी: MeOH एक खतरनाक सामग्री है। दस्ताने पहनें और निर्धारित क्षेत्रों में दूषित तरल पदार्थ और ठोस का निपटान करें।

2. भ्रूण तैयारकरना

  1. कमरे के तापमान पर धारावाहिक ऊष्मायन के माध्यम से भ्रूण को फिर से हाइड्रेट करें।
    1. 75% MeOH/25% 1x PBS में 5 मिन, कमाल के लिए इनक्यूबेट।
    2. 50% MeOH/50% 1x PBS में 5 मिन, कमाल के लिए इनक्यूबेट।
    3. 25% MeOH/75% 1x PBS में 5 मिन, कमाल के लिए इनक्यूबेट।
    4. 5 मिन, कमाल के लिए 100% पीबीट्रिटन में इनक्यूबेट।
  2. (वैकल्पिक) बर्फ पर ताजा प्रोटीनेस कश्मीर वर्किंग सॉल्यूशन (पीबीट्राइटन में 10 μg/mL) को ताजा गल प्रोटीनके स्टॉक (10 मिलीग्राम/mL) के 10 माइक्रोन जोड़कर तैयार करें ।
    1. प्रोटीनके में 30 मिन तक पचाकर भ्रूण को परमीबिलाइज करें।
      नोट: सुझाए गए समय है <24 hpf: कोई पाचन; 24 एचपीएफ: 15 मिन पाचन; और 7 दिन पुराना: 30 मिन पाचन।
    2. PBTriton में permeabilized भ्रूण कुल्ला और कमरे के तापमान पर 20 min के लिए 4% पीएफए में फिर से ठीक है ।
    3. कोमल कमाल के साथ कमरे के तापमान पर 5 न्यूनतम के लिए PBTriton में तीन बार भ्रूण धोएं ।

3. प्राथमिक एंटीबॉडी ऊष्मायन

  1. 2 मिलीग्राम/mL बोवाइन सीरम एल्बुमिन (बीएसए) के साथ या बिना माध्यमिक एंटीबॉडी होस्ट प्रजातियों (पीबीट्राइटन में पूर्व 10% बकरी सीरम) से मेल खाते हुए एक वाणिज्यिक अवरुद्ध समाधान या सीरम का चयन करें ।
  2. कमरे के तापमान पर 1-3 घंटे या रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर, जबकि कमाल के समाधान को अवरुद्ध करने में भ्रूण ब्लॉक।
  3. प्राथमिक एंटीबॉडी में इनक्यूबेट को ब्लॉक करने वाले समाधान में पतला किया गया है या रॉकिंग करते समय रात भर पीबीट्राइटन में 1% सीरम 4 डिग्री सेल्सियस पर पतला हो जाता है। इस प्रयोग में, उपयोग किए जाने वाले प्राथमिक एंटीबॉडी एंटी-एनएमडीए1, एंटी-पैन-एम्पा रिसेप्टर, और एंटी-फॉस्फो-हिस्टोन एच 3 थे, प्रत्येक पीबीट्रिटन में 1% बकरी सीरम में 1:500 की अंतिम एकाग्रता के लिए पतला था।
  4. कमरे के तापमान पर 10 न्यूनतम के लिए पीबीट्रिटन में पांच बार धोएं जबकि कमाल करते हैं।

4. सेकेंडरी एंटीबॉडी इन्क्यूबेशन

  1. प्राथमिक एंटीबॉडी की मेजबान प्रजातियों और वांछित तरंगदैर्ध्य के आधार पर एक माध्यमिक एंटीबॉडी का चयन करें।
  2. माध्यमिक एंटीबॉडी में इनक्यूबेट को अवरुद्ध समाधान में पतला करना या कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए 1% सीरम (या रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर) जबकि कमाल।
    नोट: फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी हल्के संवेदनशील होते हैं। हमने पीबीट्रिटन में 1% बकरी सीरम में पतला 1:500 बकरी-विरोधी माउस Alexa488 का उपयोग किया।
  3. इस और बाद के सभी चरणों के लिए एक प्रकाश अवरुद्ध बॉक्स के साथ एल्यूमीनियम पन्नी या कवर के साथ ट्यूबों को कवर करें।
  4. कमरे के तापमान पर 10 न्यूनतम के लिए पीबीट्रिटन में तीन बार धोएं जबकि कमाल।
  5. भ्रूण माध्यम में 2% agarose के एक बिस्तर पर PBS में एक ५०% ग्लाइसेरोल समाधान के लिए भ्रूण हस्तांतरण और प्रलेखन के लिए आगे बढ़ने या नीचे आगे प्रसंस्करण कदम के लिए आगे बढ़ना ।

वैकल्पिक कदम

5. ब्लीचिंग

  1. डीएच2ओ के 810.7 माइक्रोन, 2 एम कोएच के 89.3 माइक्रोन और 30% एच22के 100 माइक्रोन जोड़कर 1.5 एमएल ट्यूब में ब्लीच समाधान तैयार करें।
  2. ट्यूब को मिलाने के लिए तीन बार उलटा करें।
  3. भ्रूण के लिए ब्लीच समाधान दिशा के पिपेट 1 mL।
  4. गैस से बचने की अनुमति देने के लिए भ्रूण ट्यूब कैप खोलें। बुलबुले को उखाड़ फेंकने के लिए बेंच पर ट्यूब को धीरे से टैप करें।
  5. ब्लीचिंग प्रक्रिया की निगरानी करें (यदि आवश्यक हो तो माइक्रोस्कोप का उपयोग करें) और प्रतिक्रिया को रोकें जब वर्णक पर्याप्त रूप से हटा दिया जाता है (72 एचपीएफ के लिए 24 एचपीएफ या 10 मिन के लिए लगभग 5 मिन)।
  6. ध्यान से एक माइक्रोपाइपेट के साथ ब्लीचिंग समाधान को हटा दें और पीबीट्राइटन के 1 mL में तीन बार भ्रूण कुल्ला करें।
    नोट: भ्रूण इस कदम में चिपचिपा रहे हैं ।
  7. नीचे दस्तावेज या आगे प्रसंस्करण चरणों के लिए आगे बढ़ें।

6. भ्रूण विच्छेदन और Deyolking

  1. जर्दी को हटाने के लिए, एक छोटी राशि (~ 200 μL या भ्रूण को पूरी तरह से कवर करने के लिए पर्याप्त है लेकिन यह कहां तैर सकता है) को सीमित करने के लिए पर्याप्त मात्रा में स्थानांतरित करें।
  2. पीबीएस बूंद के लिए 1 या अधिक भ्रूण स्थानांतरित करने के लिए एक प्लास्टिक हस्तांतरण पाइप का प्रयोग करें।
  3. अल्ट्रा-फाइन संदंश और 00 कीट पिन का उपयोग करें ताकि जर्दी को तोड़दिया जा सके और भ्रूण की वेंट्रल सतह से जर्दी कणों को बहुत धीरे से कुरेदने के लिए (चेंग एट अल, 2014 भी देखें)18।
  4. जर्दी कणिकाओं को हटादें और आवश्यकतानुसार पीबीएस की भरपाई करें।
  5. दोहराएं जब तक भ्रूण पर्याप्त रूप से जर्दी से मुक्त है।

7. स्लाइड्स पर बढ़ते फ्लैट

  1. एक प्लास्टिक पिपेट या एक छंटनी टिप के साथ एक 1 mL माइक्रोपाइप्ट के साथ एक आवेशित ग्लास स्लाइड करने के लिए deyolked भ्रूण हस्तांतरण (कतरनी तनाव को कम करने के लिए) । ओरिएंट के रूप में एक 200 μL माइक्रोपाइपेट टिप या कीट पिन के साथ वांछित है।
  2. एक किम पोंछ या कागज तौलिया के साथ दूर अतिरिक्त PBS बाती ।
  3. स्लाइड और कवरस्लिप में बढ़ते मीडिया की 2-3 बूंदें जोड़ें।
  4. लगभग 5 से 10 वर्ष के लिए हवा सूखी।
  5. स्पष्ट नेल पॉलिश के साथ स्लाइड पर कवर ग्लास सील करें।
    नोट: कवर ग्लास के किनारों को पूरी तरह से नेल पॉलिश की पतली, निरंतर परत से ढका जाना चाहिए।
  6. इमेजिंग से पहले लगभग 10 सीन सूखने दें।

8. अगारोज में बढ़ते

  1. एक माइक्रोवेव सुरक्षित फ्लास्क या वांछित से कम से कम 3x अधिक मात्रा के बीकर में भ्रूण माध्यम के 50 mL में अगारोज के 0.5 ग्राम जोड़कर भ्रूण माध्यम में 1% अगारोज तैयार करें।
  2. एक माइक्रोवेव में गर्मी, हर 30 एस घूमता है, जब तक agarose पूरी तरह से भंग हो जाता है ।
  3. 1.5 mL सेंट्रलाइज ट्यूबमें 1 mL aliquots बनाओ। कमरे के तापमान पर एलिकोट्स स्टोर करें।
  4. हीटिंग से पहले कैप लॉक के साथ ट्यूब कैप को कवर करें।
  5. पानी से भरे बीकर में फ्लोटिंग ट्यूब होल्डर में अगारोज ट्यूब रखें।
  6. माइक्रोवेव 2-3 मिन के लिए फ्लोटिंग ट्यूबों के साथ बीकर, या जब तक अगारोज पूरी तरह से पिघल जाता है।
  7. एक प्लास्टिक पिपेट या एक छंटनी टिप के साथ एक 200 μL माइक्रोपाइपेट के साथ ब्रिज्ड स्लाइड करने के लिए एक भ्रूण हस्तांतरण (कतरनी तनाव को कम करने के लिए) ।
  8. कीट पिन का उपयोग करके एक आयताकार कवरस्लिप पर भ्रूण की स्थिति और भ्रूण में सीधे लगभग 20 μL पिघला हुआ अगारोज जोड़ें।
  9. 00 कीट पिन का उपयोग करके कवरस्लिप के निकटतम ब्याज के क्षेत्र को जल्दी से उन्मुख करें।
    नोट: यह एक उल्टा माउंट है ।
  10. जरूरत के अनुसार प्रत्येक उपयोग और माइक्रोवेव के बीच गर्म पानी ट्यूब फ्लोट करने के लिए अगारोज ट्यूब वापस।
  11. जब अगारोज कठोर हो जाता है तो माइक्रोस्कोप का उपयोग करके छवि। एक उल्टे माइक्रोस्कोप पर उपयोग के लिए घुड़सवार भ्रूण उल्टा रखें। ईमानदार माइक्रोस्कोप पर उपयोग के लिए कवरस्लिप को फ्लिप करें (इसलिए अगारोज कवरस्लिप के नीचे है) ।

9. ब्रिज्ड स्लाइड ्स पर बढ़ते

  1. ब्रिज्ड स्लाइड बनाने के लिए, सुपरग्लू के एक छोटे से डॉट का उपयोग करके ग्लास स्लाइड पर गोंद स्क्वायर कवरस्लिप।
    नोट: कवरस्लिप के बीच कम से कम 5 मिमी चौड़ा एक गर्त होनी चाहिए। दो #1 कवरस्लिप उच्च आम तौर पर 24-48 एचपीएफ भ्रूण के लिए उपयुक्त है जबकि तीन कवरस्लिप उच्च 72 एचपीएफ के लिए आवश्यक हो सकता है।
  2. एक प्लास्टिक पिपेट या एक छंटनी टिप के साथ एक 200 μL माइक्रोपाइपेट के साथ ब्रिज्ड स्लाइड करने के लिए 1-2 deyolked भ्रूण हस्तांतरण (कतरनी तनाव को कम करने के लिए) ।
  3. एक किम पोंछ या कागज तौलिया के साथ दूर अतिरिक्त तरल पदार्थ बाती ।
  4. भ्रूण के लिए सीधे 80% ग्लाइसेरोल की एक बूंद जोड़ें।
  5. आयताकार कवर ग्लास के साथ कवर करें। ग्लाइसेरोल की बूंद कवर ग्लास को छूना चाहिए।
  6. भ्रूण के किनारों पर ग्लाइसेरोल के मार्जिन के साथ भ्रूण को पूरी तरह से कवर करने के लिए आवश्यक कवर ग्लास और स्लाइड के बीच की जगह में अधिक ग्लाइसेरोल जोड़ें।
  7. इमेजिंग के लिए स्थिति में भ्रूण रोल करने के लिए आयताकार कवर ग्लास धीरे स्लाइड करें।

10. डीएबी धुंधला

नोट: यह अनुभाग ऊपर चरण 4.2 के बाद शुरू होता है और बाकी चरण 4 को बदल देता है।

  1. कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए या रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर एक पेरिक्सिडेस-conjugated माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ एक अवरुद्ध समाधान में भ्रूण इनक्यूबेट जबकि कमाल ।
  2. कमरे के तापमान पर 10 न्यूनतम के लिए पीबीट्राइटन में तीन बार धोएं।
  3. भ्रूण को एक स्थानांतरण पिपेट के साथ संस्कृति प्लेट या अवसाद स्लाइड में स्थानांतरित करें।
  4. डीएच2ओ में भंग 1% डीएबी (3,3'-डिमिनोबेंजिडीन) के 50 माइक्रोन मिलाएं और 0.3% हाइड्रोजन पेरोक्साइड के 50 माइक्रोन करें और पीबीएस के साथ 1 मिलील में लाएं।
    सावधानी: DAB एक खतरनाक सामग्री है। दस्ताने पहनें और निर्धारित क्षेत्रों में डीएबी दूषित तरल पदार्थ और ठोस का निपटान करें।
  5. ऊपर तैयार किए गए डीएबी समाधान के साथ एचआरपी-दाग भ्रूण को कवर करें और माइक्रोस्कोप के तहत रंग विकास (आमतौर पर 1-5 मिन) के लिए निगरानी करें।
  6. रंग विकास के वांछित स्तर तक पहुंचने के बाद, पीबीएस में संक्षेप में भ्रूण को कुल्ला करें।
  7. फिक्सेशन से पहले भ्रूण को 1.5 mL ट्यूब पर वापस स्थानांतरित करें।
  8. कमरे के तापमान पर 4% पीएफए में 15-20 न्यूनतम के लिए भ्रूण को फिर से ठीक करें।
  9. 5 मिन के लिए पीबीट्रिटन में भ्रूण को तीन बार धोएं।
  10. दस्तावेज के लिए आगे बढ़ें।

11. स्लीव्स पर चढ़कर लगे सेक्शन्ड टिश्यू के लिए संशोधित प्रोटोकॉल

  1. ऊतक को पैप पेन से दागने के लिए घेरना।
  2. स्लाइड्स को उमस भरे चैंबर में ट्रांसफर करें।
  3. स्लाइड में सीधे 1 mL ofPBS जोड़ें।
  4. एम्बेडिंग मीडियम को हटाने के लिए कमरे के तापमान पर 7 न्यूनतम इनक्यूबेट करें।
  5. स्लाइड उलटा द्वारा PBS डालो ।
  6. टीएनटी बफर (100 एमएम ट्रिस पीएच 8.0, 150 एमएम नैल, 0.1% ट्वीन20) के 1 एमएल में 1 मिन ्रेट करें।
  7. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए अवरुद्ध समाधान (वाणिज्यिक या 10% सीरम + 2% बीएसए) के 1 मीटर तक ब्लॉक करें।
  8. प्राथमिक एंटीबॉडी में रातोंरात इनक्यूबेट 1% सीरम में पतला या 4 डिग्री सेल्सियस पर अवरुद्ध समाधान।
  9. कमरे के तापमान पर टीएनटी बफर के 1 mL तक में पांच बार धोएं।
  10. कमरे के तापमान पर 2 घंटे या रात 4 डिग्री सेल्सियस पर माध्यमिक एंटीबॉडी में इनक्यूबेट। पन्नी के साथ चैंबर को कवर करें या एक काले ढक्कन का उपयोग करें।
  11. कमरे के तापमान पर टीएनटी में पांच बार धोएं। पिछले धोने डालो।
  12. बढ़ते मध्यम और कवरस्लिप की 2-3 बूंदों के साथ माउंट करें। चलो 5-10 min बैठते हैं।
  13. स्पष्ट नेल पॉलिश का उपयोग करके कवर ग्लास को स्लाइड पर सील करें। इमेजिंग से पहले पूरी तरह से सूखने दें।

12. प्रलेखन

  1. एक प्रयोगशाला नोटबुक में पूरी प्रक्रिया और किसी भी विचलन रिकॉर्ड करें।
  2. एकाग्रता, नाम, सूची संख्या, निर्माता, और प्राथमिक एंटीबॉडी की बहुत संख्या रिकॉर्ड करें।
  3. माइक्रोस्कोप चरण पर उचित रूप से घुड़सवार नमूना रखें। रुचि के क्षेत्र का पता लगाएं।
  4. अपेक्षाकृत उज्ज्वल उदाहरण का चयन करें। कैमरा एक्सपोजर सेट करें और लाभ ताकि संकेत संतृप्त किए बिना पर्याप्त रूप से उज्ज्वल हो।
  5. प्रयोगात्मक एंटीबॉडी लेबल भ्रूण और नियंत्रण एंटीबॉडी (पूर्व आईजीजी) भ्रूण के बीच तुलना करते समय एक ही एक्सपोजर सेटिंग्स का उपयोग करके ब्याज के एक ही क्षेत्र की धुंधला तीव्रता की तुलना करें।

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Representative Results

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पूरे माउंट इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री अक्षुण्ण जानवर में प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्थानिक पैटर्न का पता लगाने के लिए एंटीबॉडी का उपयोग करता है। इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के बुनियादी कार्यप्रवाह (चित्रा 1में चित्रित) में जेब्राफिश का प्रजनन, भ्रूण को बढ़ाना और तैयार करना, गैर-विशिष्ट एंटीजन को अवरुद्ध करना, ब्याज के प्रोटीन को लक्षित करने के लिए एंटीजन-विशिष्ट प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग करना, लेबल वाले माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ उस प्राथमिक एंटीबॉडी का पता लगाना, नमूना बढ़ते हुए, और अभिव्यक्ति का दस्तावेजीकरण करना शामिल है।

ज़ेब्राफिश विकास के दौरान स्थानिक और लौकिक प्रोटीन अभिव्यक्ति के अध्ययन के लिए पूरे माउंट इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री एक मूल्यवान उपकरण है। जेब्राफिश मोटर न्यूरॉन संपर्क19से पहले 19 एचपीएफ से पहले गैप जंक्शनों द्वारा मध्यस्थता सहज संकुचन प्रदर्शित करता है । जेब्राफिश न्यूरोमस्कुलर जंक्शन, अन्य कशेरुकी की तरह, निकोटीलकोलिन रिसेप्टर्स में अभिनय करने वाले एसीटाइलकोलिन द्वारा मध्यस्थता की जाती है। इन इकट्ठे रिसेप्टर्स को सबसे पहले लगभग 16 एचपीएफ में पाया जाता है और अभिव्यक्ति का विस्तार होता है और न्यूरॉन्स20से संपर्क बनाते हैं । मेंढक21 और चूहों22 में अध्ययन से पता चलता है कि कशेरुकी की कंकाल मांसपेशी भी आयोनोट्रोपिक ग्लूटामेट रिसेप्टर्स व्यक्त कर सकती है। एनएमडीए-प्रकार के ग्लूटामेट रिसेप्टर के ग्लूएन1 उपइकाई के लिए पूरे माउंट इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री से 23 एचपीएफ(चित्रा 2)में जेब्राफिश मांसपेशी विकसित करने के दौरान ग्लूटामेट रिसेप्टर उपइकाइयों की अभिव्यक्ति का पता चलता है। यह मोटर न्यूरॉन इनरवेशन के समय के साथ लगभग मेल खाती है। अभिव्यक्ति की तुलना मछली और माध्यमिक एंटीबॉडी की पृष्ठभूमि फ्लोरेसेंस निर्धारित करने के लिए कोई प्राथमिक नियंत्रण भ्रूण की तुलना में और गैर विशिष्ट एंटीजन बाध्यकारी के सापेक्ष योगदान का निर्धारण करने के लिए 2 μg/mL माउस IgG के लिए किया गया था । विकास के इस चरण में मांसपेशियों में एम्पा प्रकार ग्लूटामेट रिसेप्टर्स का पता नहीं चला। एंटीबॉडी सांद्रता तालिका 1में सूचीबद्ध हैं । इन छवियों को उत्पन्न करने के लिए, इन भ्रूणों को इस प्रोटोकॉल में वर्णित किया गया था, जिसमें डीयोलकिंग को छोड़कर वैकल्पिक चरणों में से कोई भी नहीं था। भ्रूण फ्लैट घुड़सवार और कवर किया गया(चित्रा 3बी)

कोशिकाओं को विभाजित करने से शांत कोशिकाओं से विभिन्न हिस्टोन संशोधनों को व्यक्त किया जाता है जिन्हें एंटीबॉडी का उपयोग करके इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री द्वारा पता लगाया जा सकता है जो विशिष्ट संशोधनों को पहचानते हैं, जैसे प्रोटीन फॉस्फोरिलेशन। सेरीन 10 में हिस्टोन 3 का फॉस्फोरिलाइजेशन सेल डिवीजन23से जुड़ा हुआ है । स्लाइड पर चढ़कर अनुभागित ऊतकों के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के अनुकूलन के लिए इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत संशोधनों का उपयोग लार्वा जेब्राफिश मस्तिष्क में प्रसार कोशिकाओं का पता लगाने के लिए किया गया था। 72 एचपीएफ भ्रूण के जमे हुए वर्गों स्लाइड पर मुहिम शुरू की और पी-H3(चित्रा 4)के लिए इम्यूनोदागित थे। कई कोशिकाएं पी-एच 3 को व्यक्त करती हैं, और वेंट्रिकुलर क्षेत्रों में अभिव्यक्ति सबसे उल्लेखनीय है। अभिव्यक्ति की तुलना कोई प्राथमिक नियंत्रण भ्रूण और गैर विशिष्ट एंटीजन बाध्यकारी के सापेक्ष योगदान का निर्धारण करने के लिए 2 μg/mL माउस IgG से की गई थी ।

एंटीबॉडी लक्ष्य एकाग्रता
माउस आईजीजी आइसोटाइप नियंत्रण गैर-विशिष्ट एंटीजन 2 μg/mL
माउस विरोधी NMDAR1 ग्लूएन1 उपइकाई 1:1,000
बकरी विरोधी माउस Alexa488 माउस आईजीजी 1:500
माउस एंटी फॉस्फो-एच 3 फॉस्फोरोरीटेड हिस्टोन एच3 1:500
माउस एंटी-पैन-एम्पा रिसेप्टर ग्लू1-4 1:500

तालिका 1: उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी और सांद्रता की सूची।

Figure 1
चित्रा 1: पूरे माउंट इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री प्रक्रिया का फ्लोचार्ट। प्रक्रिया का मूल कार्यप्रवाह मछली को प्रजनन करना है; भ्रूण इकट्ठा और तैयार; गैर-विशिष्ट एंटीजन को ब्लॉक करें; श्रृंखला में प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी में इनक्यूबेट; माउंट ऊतक; और दस्तावेज़। वैकल्पिक कदम कार्यप्रवाह में उचित बिंदु पर छोटे तीर के साथ इंगित कर रहे हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: लार्वा योजनाबद्ध और एनएमडीए रिसेप्टर आईएचसी प्रतिनिधि परिणाम। पूरे माउंट इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के उपयोग ने मांसपेशियों के विकास में ग्लूटामेट रिसेप्टर अभिव्यक्ति का परीक्षण किया। 23 एचपीएफ पर ओरिएंटेशन और ब्याज का क्षेत्र बताया गया है। प्राथमिक एंटीबॉडी शामिल नहीं होने पर कोई सिग्नल का पता नहीं चल पाया । माउस आईजीजी कंट्रोल एंटीबॉडी गैर-विशिष्ट अभिव्यक्ति के निम्न स्तर को दर्शाता है। एनएमडीए-प्रकार ग्लूटामेट रिसेप्टर (एनएमडीएआर) की ग्लूएन1 उपइकाई को विकासशील मांसपेशियों में व्यक्त किया जाता है, जिसमें सोमाइट सीमाओं (एरोहेड्स) पर उच्च सांद्रता होती है। एएमपीए-प्रकार के ग्लूटामेट रिसेप्टर्स (AMPAR) इस स्तर पर व्यक्त नहीं किए जाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: बढ़ते योजनाओं की योजनाबद्ध । (क)50% ग्लाइसेरोल में डूब गए भ्रूण को आसानी से फिर से तैनात किया जा सकता है। (ख)बढ़ते माध्यम में एक स्लाइड पर एक भ्रूण फ्लैट घुड़सवार संरक्षित और एक बाद की तारीख में छवि जा सकता है । (ग)एक कठिन क्षेत्र को देखने के लिए 1% अगारोज की बूंद में चढ़कर एक भ्रूण को तय किया जा सकता है । (घ)एक ब्रिजित स्लाइड पर ग्लाइसेरोल में चढ़कर एक भ्रूण को लुढ़काया और फिर से तैनात किया जा सकता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: अनुभागित ऊतक में आईएचसी के प्रतिनिधि परिणाम। वैकल्पिक चरणों में प्रोटोकॉल संशोधनों का उपयोग करते हुए, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री ने जेब्राफिश लार्वा मस्तिष्क में कोशिकाओं को 72 एचपीएफ में प्रसारित करने के लिए परीक्षण किया। माउस आईजीजी नियंत्रण एंटीबॉडी और प्राथमिक एंटीबॉडी को छोड़कर गैर-विशिष्ट अभिव्यक्ति के निम्न स्तर को प्रकट करते हैं। कोशिकाओं का प्रसार करने के मार्कर के रूप में, पी-एच 3 को विन्ट्रिकुलर जोन (एरोहेड) सहित असतत स्थानों में व्यक्त किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

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इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री एक बहुमुखी उपकरण है जिसका उपयोग किसी जीव में ब्याज के लगभग किसी भी प्रोटीन की स्थानिक-लौकिक अभिव्यक्ति की विशेषता के लिए किया जा सकता है। इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री का उपयोग विभिन्न प्रकार के ऊतकों और आदर्श जीवों पर किया जाता है। इस प्रोटोकॉल को जेब्राफिश में उपयोग के लिए अनुकूलित किया गया है। विभिन्न प्रजातियों में इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री को विभिन्न निर्धारण और हैंडलिंग तकनीकों की आवश्यकता हो सकती है, प्रजातियों के आधार पर समाधान अवरुद्ध हो सकता है और एंडोजेनस पेरोक्सिडेस की उपस्थिति, और ऊतकों की मोटाई और संरचना के कारण ऊष्मायन समय। जेब्राफिश में आईएचसी कैंसर24,मेटाबोलिक रोग25,न्यूरोलॉजिकल विकार26,और मानव स्वास्थ्य के लिए महान प्रासंगिकता के कई अन्य क्षेत्रों के बारे में हमारी समझ को आगे बढ़ाने में अभिन्न रहा है। आईएचसी के लिए एक प्रमुख लाभ यह है कि प्रक्रिया ईश जैसी अन्य तकनीकों की तुलना में अपेक्षाकृत कम है और तकनीकी रूप से मांग नहीं कर रही है। हालांकि, कई चरण हैं जिन्हें नमूनों की उम्र, एंटीजन को लक्षित किया जा रहा है, और एंटीबॉडी का उपयोग किए जाने के आधार पर अनुकूलन की आवश्यकता होती है।

इस प्रोटोकॉल में कई चरणों की अवधि लचीली है। के रूप में उल्लेख किया लचीला कदम के लिए दी गई अवधि आम तौर पर आवश्यक न्यूनतम समय का प्रतिनिधित्व करते हैं । आमतौर पर जब भी पीबीट्राइटन में भ्रूण को तीन या उससे अधिक बार धोया जाता है तो जरूरत पड़ने पर उन्हें आखिरी वॉश में 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर रखा जा सकता है। Permeabilization और निर्धारण समय कम लचीला कर रहे है और केवल एक समस्या निवारण रणनीति के भाग के रूप में जानबूझकर इरादे के साथ समायोजित किया जाना चाहिए । हमने प्रोटोकॉल में कई बिंदुओं को नोट किया जो यह दिखाने के लिए वैकल्पिक हैं कि इन चरणों को कार्यप्रवाह में कैसे एकीकृत किया जा सकता है जैसा कि प्रायोगिक रूप से प्रासंगिक है। उदाहरण के लिए, यदि पिगमेंटेशन सिग्नल डिटेक्शन में हस्तक्षेप करता है, तो पीटीयू उपचार या ब्लीच फिक्स्ड भ्रूण द्वारा मेलानोजेनसिस को रोकें। ब्लीचिंग ऊतक को नुकसान पहुंचा सकता है, इसलिए ध्यान रखना चाहिए कि भ्रूण ब्लीच में खर्च होने का समय कम से कम हो। हालांकि, ब्लीचिंग पीटीयू उपचार के लिए बेहतर हो सकती है, जो विकास27,28,29,30के कुछ पहलुओं को प्रभावित कर सकती है। हम फ्लोरोसेंट और क्रोमोजेनिक डिटेक्शन के लिए विकल्प भी पेश करते हैं। यदि फ्लोरेसेंस वांछित नहीं है या यदि एंटीजन एक संकेत पैदा करता है जो फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा पर्याप्त रूप से पता लगाने के लिए बहुत कमजोर है, तो क्रोमोजेनिक डिटेक्शन को सहिजन पेरोक्सिडेस (एचआरपी) -संयुग्मित एंटीबॉडी और डीएबी का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है।

जेब्राफिश में आईएचसी की सबसे बड़ी चुनौती उपयुक्त एंटीबॉडी ढूंढना है। दरअसल, ISH अक्सर प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में प्रयोग किया जाता है जब वाणिज्यिक एंटीबॉडी ब्याज के वांछित प्रोटीन के लिए उपलब्ध नहीं हैं । कई वाणिज्यिक एंटीबॉडी स्तनधारी लक्ष्यों को लक्षित करने के लिए डिज़ाइन किए गए हैं और एपिटोप हमेशा ज़ेब्राफिश में संरक्षित नहीं होते हैं। उपलब्ध होने पर, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंटीबॉडी का चयन करें जिनका परीक्षण जेब्राफिश में किया गया है। हमने पाया है कि एंटीबॉडी जो एंटीजन को पहचानते हैं जो जेब्राफिश और लक्षित प्रजातियों के बीच संरक्षित एंटीजन को पहचानते हैं जो आम तौर पर जेब्राफिश में काम करते हैं। हमने यह भी पाया है कि स्तनधारियों के अलावा पक्षियों और/या उभयचर ों में काम करने के लिए प्रदर्शित किए गए एंटीबॉडी आम तौर पर जेब्राफिश में भी काम करते हैं, यहां तक कि जब जेब्राफिश में प्रभावकारिता का परीक्षण नहीं किया गया है । आमतौर पर, स्तनधारी एंटीजन के खिलाफ विकसित पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी उनकी कम विशिष्टता के कारण मोनोक्लोनल एंटीबॉडी की तुलना में जेब्राफिश होमोलॉग का पता लगाने की अधिक संभावना होती है। जब भी एक नए एंटीबॉडी का परीक्षण, यह एक सकारात्मक नियंत्रण प्रयोग चलाने के लिए एक पार से जुड़े लक्ष्य पेप्टाइड, स्तनधारी ऊतक या कोशिकाओं है कि प्रोटीन, या कोशिकाओं है कि एक रिपोर्टर का निर्माण व्यक्त करने के लिए जाना जाता है का उपयोग कर फायदेमंद है । लक्ष्य एंटीजन के आकार को सत्यापित करने के लिए एंटीबॉडी का परीक्षण पश्चिमी दाग द्वारा भी किया जा सकता है।

जबकि अधिकांश वाणिज्यिक एंटीबॉडी आईएचसी के लिए एक सुझाए गए कमजोर पड़ने की सीमा प्रदान करते हैं, अनुभवजन्य रूप से कमजोर पड़ने का निर्धारण करना महत्वपूर्ण है जो सबसे अच्छा काम करता है। एंटीबॉडी सांद्रता जो बहुत अधिक होती है अक्सर गैर-विशिष्ट धुंधला और बढ़ी हुई पृष्ठभूमि होती है, जबकि बहुत कम एंटीबॉडी एक प्रत्यक्ष संकेत प्रदान करने में विफल रहता है। एंटीबॉडी और एंटीजन के आधार पर, ऊपर चरण 3.2 में वर्णित भ्रूण को पहले पारण करना लाभप्रद हो सकता है, हालांकि, यह कदम आवश्यक नहीं हो सकता है और कुछ उदाहरणों में कम संकेत हो सकता है। यह प्रोटोकॉल ट्राइटन-एक्स-100 को डिटर्जेंट के रूप में उपयोग करता है जो कोशिकाओं को परमीबिलाइज करता है, जो पतले ऊतक या सतही अभिव्यक्ति के लिए पर्याप्त हो सकता है। गहरे या मोटे ऊतक, जैसे गहरे मस्तिष्क क्षेत्र या पुराने लार्वा, प्रोटीन पेरमेलाइजेशन की आवश्यकता हो सकती है। इसके विपरीत, ट्राइटन-एक्स-100 को सभी चरणों से बाहर रखा जाना चाहिए जब कोशिका की सतह पर केवल प्रोटीन को इम्यूनोस्टेनिंग इंट्रासेलर प्रोटीन लेबलिंग पर वांछित है। अवरुद्ध चरण की अवधि के साथ-साथ सीरम और बीएसए का उपयोग करके वाणिज्यिक अवरुद्ध समाधान की पसंद को एंटीबॉडी संवेदनशीलता और पृष्ठभूमि धुंधला करने के लिए सही करने के लिए भी समायोजित किया जा सकता है। अवरुद्ध में उपयोग की जाने वाली सीरम की उच्च सांद्रता (इस प्रोटोकॉल में 10%), पृष्ठभूमि धुंधला को कम कर सकती है, हालांकि एंटीबॉडी को एंटीबॉडी बाध्यकारी साइटों को कम करने के लिए मौजूद होने पर पतला किया जाना चाहिए। यदि पृष्ठभूमि संकेत लगातार अधिक है, तो पौधे आधारित अवरुद्ध समाधान फायदेमंद हो सकते हैं, यहां तक कि कम एंटीबॉडी कमजोर होने (<1:1,000) पर भी। अंत में, संवेदनशीलता ठीक किया जा सकता है वॉश की तंगी से देखते हैं । इसके लिए जरूरी हो सकता है कि पोस्ट-एंटीबॉडी वॉश स्टेप्स की अवधि बढ़ाया जाए या घटाया जाए और साथ ही ट्राइटन-एक्स-100 की मात्रा को पीबीट्राइटन में एडजस्ट किया जाए। पीबीट्रिटन की विशिष्ट कार्य श्रृंखलाएं 0.2% से 1.0% ट्राइटन-एक्स-100 तक होती हैं। यह अच्छा अभ्यास है जब प्राथमिक IgG के साथ नकारात्मक नियंत्रण भ्रूण दाग और माध्यमिक एंटीबॉडी लेबल के लिए एंटीबॉडी विशिष्टता का निर्धारण और संभावित झूठी सकारात्मक संकेतों की पहचान के साथ नकारात्मक नियंत्रण भ्रूण दाग के लिए एक नया एंटीबॉडी का उपयोग कर रहा है ।

यदि एंटीबॉडी अनुकूलन सकारात्मक संकेत पैदा करने में विफल रहता है, तो यह एंटीजन को स्थिर मास्किंग के कारण हो सकता है। आम तौर पर, 4% पीएफए में निर्धारण एंटीबॉडी बाध्यकारी को रोकने के लिए एंटीजन साइटों का मुखौटा नहीं करता है, हालांकि एंटीजन मास्किंग कभी-कभी कुछ एंटीबॉडी के साथ होता है। एंटीजन रिट्रीवल के परिणामस्वरूप भ्रूण को नुकसान हो सकता है लेकिन एक कार्य प्रोटोकॉल को इनौ और विटब्रोड31द्वारा वर्णित किया गया है । वैकल्पिक रूप से, यदि चयनित एंटीबॉडी 4% पीएफए के साथ असंगत है या यदि पीएफए के परिणामस्वरूप सेलुलर आकृति विज्ञान परिवर्तन होता है, मेथनॉल, 2% ट्राइक्लोरोसेटिक एसिड, या ग्योक्सौल का उपयोग नमूनों को ठीक करने के लिए किया जा सकता है27। फॉर्मलडिहाइड निर्धारण के साथ एंटीबॉडी की अनुकूलता अनुभवजन्य रूप से निर्धारित की जानी चाहिए। यदि पीएफए निर्धारण के बाद सकारात्मक नियंत्रण संकेत प्राप्त नहीं किया जा सकता है, तो यह मेथनॉल जैसे वैकल्पिक फिक्सेटिव की कोशिश करने लायक हो सकता है। वैकल्पिक निर्धारण प्रोटोकॉल प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए भी आवश्यक हो सकते हैं जो संयुग्मित एंटीजन (जैसे गाबा-बीएसए) के खिलाफ उठाए गए थे।

इमेजिंग के लिए इम्यूनोदाग्ड जेब्राफिश भ्रूण के बढ़ते लिए कई प्रभावी विकल्प हैं। भ्रूण को ग्लिसरोल के पेट्री डिश में स्थानांतरित किया जा सकता है, पिन या संदंश के साथ तैनात किया जाता है, और एक उल्टे माइक्रोस्कोप(चित्रा 3ए)के साथ पकवान के माध्यम से ऊपर से या इमेजिंग के नीचे से एक वाइडफील्ड दृश्य के साथ या तो चित्रित किया जा सकता है। यह विधि सरल, त्वरित और अस्थायी है। कमियों में भ्रूण के लिए तरल पदार्थ ग्लाइसेरोल में ध्यान केंद्रित करने की प्रवृत्ति, पकवान में ग्लाइसेरोल की सतह से संभावित प्रतिबिंब, और मोटी डिश के माध्यम से इमेजिंग की कठिनाई शामिल है। भ्रूण कांच की ओर पर फ्लैट घुड़सवार किया जा सकता है(चित्रा 3बी)बढ़ते माध्यम, कवरस्लिप, और नेल पॉलिश के साथ । इन माउंट एक ईमानदार या उल्टे माइक्रोस्कोप पर देखा जा सकता है। इस तरह से तैयार भ्रूण समय से पहले तैयार किया जा सकता है और इमेजिंग तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत स्लाइड या बाद में संग्रहीत और पुनर्चित्रित किया जा सकता है। इमेजिंग समय सीमित होने पर यह विशेष रूप से लाभप्रद हो सकता है। इस माउंट के नुकसान भ्रूण की स्थिति और ऊतक मोटाई के लिए सीमित विकल्प शामिल हैं, और पुनर्स्थान या भ्रूण को ठीक करने में असमर्थता । इस तरह से घुड़सवार भ्रूण अक्सर deyolking की जरूरत है, के रूप में जर्दी कणिकाओं सबसे अधिक इस्तेमाल किया फ्लोरेसेंस चैनलों में autofluorescent है और ले जाया या बढ़ते के बाद नहीं हटाया जा सकता है । जब ब्याज के क्षेत्र में भ्रूण की कठिन स्थिति की आवश्यकता होती है, तो कवर ग्लास(चित्रा 3सी)पर 1% अगारोज में भ्रूण को माउंट करना सबसे लाभप्रद हो सकता है। भ्रूण को कवर ग्लास के निकटतम ब्याज के क्षेत्र के साथ कीट पिन के साथ स्थिति में आयोजित किया जा सकता है जब तक कि अगारोज ठंडा न हो जाए। अगारोज भ्रूण को कम से कई मिनट तक लुढ़कने के बिना स्थिति में पकड़ लेगा । अगारोज बढ़ते उल्टे माइक्रोस्कोप के लिए सबसे अच्छा है, हालांकि कवर ग्लास को एक ईमानदार माइक्रोस्कोप पर उपयोग के लिए ध्यान से उलटा किया जा सकता है। यह माउंट समय लेने वाला हो सकता है और भ्रूण आम तौर पर प्रतिस्थापित या वसूली योग्य नहीं होते हैं। ब्रिज्ड स्लाइड्स पर बढ़ते भ्रूण(चित्रा 3डी)इन तरीकों के बीच कुछ हद तक समझौता प्रदान करता है। ब्रिजित माउंट जल्दी है, और भ्रूण को फिर से तैनात किया जा सकता है और बरामद किया जा सकता है । पुल की ऊंचाई ऊपर या नीचे से छवि की क्षमता को बनाए रखते हुए, फ्लैट माउंट की तुलना में ऊतक मोटाई और भ्रूण की स्थिति में अधिक लचीलापन की अनुमति दे सकती है। इस विधि के लिए समय से पहले ब्रिजित स्लाइड तैयार करने की आवश्यकता होती है। ऊतक की मोटाई पर चढ़कर तय होता है कि पुल को कितने कवरस्लिप उच्च करने की आवश्यकता है। ब्रिज्ड स्लाइड एक दिन के लिए कई बार पुन: उपयोग किया जा सकता है, लेकिन इमेजिंग सत्र के बाद निपटाया जाना चाहिए क्योंकि ग्लाइसेरोल स्लाइड को साफ करना मुश्किल है और यह धीरे-धीरे पुल को पकड़े हुए गोंद को उखाड़ फेंकेगा।

आईएचसी किसी जीव या ऊतक में प्रोटीन अभिव्यक्ति के समय और पैटर्न का निर्धारण करने के लिए एक प्रभावी तरीका है। आईएचसी में ISH पर कई फायदे है कि अपेक्षाकृत कम लागत है और समय के एक अंश में आम तौर पर ISH के लिए आवश्यक (2-3 दिन बनाम 5-8 दिन) पूरा किया जा सकता है । इसके अलावा, आईएचसी जीन उत्पाद अभिव्यक्ति का एक बेहतर संकेतक है क्योंकि एमआरएनए स्तरों का पता लगाने से पोस्टट्रांसक्रिप्शनल और पोस्टट्रांसलेशनल प्रक्रियाओं की भविष्यवाणी नहीं की जाती है जो प्रोटीन अभिव्यक्ति को प्रभावित कर सकती हैं। आईएचसी उपकोशिकीय स्थानीयकरण डेटा प्रदान करने में भी सक्षम है (हालांकि डीएबी धुंधला का उपयोग करते समय यह सच नहीं है), जो ईश द्वारा वहन नहीं किया जाता है। जेब्राफिश में ड्यूल ईश/आईएचसी करना संभव है ।

आईएचसी में कुछ कमियां भी हैं, जिनमें सबसे महत्वपूर्ण रूप से एंटीबॉडी उपलब्धता है। जबकि कई एंटीबॉडी उपलब्ध हैं जो आईएचसी के लिए उपयुक्त गुणवत्ता के हैं, एंटीबॉडी ढूंढना जो विशेष रूप से जेब्राफिश में काम करते हैं, अधिक चुनौतीपूर्ण है और अक्सर स्तनधारी एंटीजन के खिलाफ उत्पन्न परीक्षण और समस्या निवारण एंटीबॉडी की आवश्यकता होती है। हालांकि, बाजार पर जेब्राफिश मान्य एंटीबॉडी की संख्या बढ़ रही है और CRISPR/Cas9 प्रौद्योगिकी के उद्भव ने जीनोम इंजीनियरिंग के माध्यम से एंडोजेनस प्रोटीन को एपीटॉप करना संभव बना दिया है । ये प्रक्रियाएं समय लेने वाली और चुनौतीपूर्ण हैं, हालांकि, और प्रोटीन फ़ंक्शन के सत्यापन की आवश्यकता होती है।

इस रिपोर्ट में वर्णित प्रोटोकॉल मोटे तौर पर किसी भी स्तर पर जेब्राफिश भ्रूण और लार्वा पर इस्तेमाल किया जा सकता है और वयस्क जानवरों से ऊतकों पर भी लागू किया जा सकता है । इसके अलावा, यह प्रोटोकॉल थोड़ा संशोधन के साथ जमे हुए या पैराफिन अनुभागित नमूनों को धुंधला करने की अनुमति देता है। पूरे माउंट इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री का उपयोग मांसपेशियों में न्यूरोट्रांसमीटर रिसेप्टर आबादी की जांच करने के लिए किया गया था, जो जेब्राफिश मांसपेशियों के विकास में आयनट्रोपिक एनएमडीए ग्लूटामेट अनिवार्य उपइकान की अभिव्यक्ति का खुलासा करता था। विकासशील मांसपेशियों में यह व्यापक और फैलाना ज़ेनोपस लार्वा21विकसित करने में उसी रिसेप्टर उपइकाई की विकासात्मक अभिव्यक्ति के अनुरूप है। इससे पता चलता है कि मांसपेशियों के विकास में ग्लूटामेट रिसेप्टर्स की अभिव्यक्ति को विकासवादी रूप से संरक्षित किया जाता है। कुल मिलाकर, यह प्रोटोकॉल आईएचसी के उपयोग के माध्यम से जीन अभिव्यक्ति की बेहतर समझ प्राप्त करने के लिए मूल्यवान है और जेब्राफिश में प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्थानिक-लौकिक वितरण का निर्धारण करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है।

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कोई जानकारी नहीं है ।

Acknowledgments

एनआईएच ग्रांट 8P20GM103436 14 से फंडिंग।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Fisher Scientific BP160-100
Aluminum foil, heavy duty Kirkland Any brand may be substituted
Anti-NMDA antibody Millipore Sigma MAB363
Anti-phospho-Histone H3 (Ser10), clone RR002 Millipore Sigma 05-598
Anti-pan-AMPA receptor (GluR1-4) Millipore Sigma MABN832
Bovine serum albumin (BSA) Fisher Scientific BP1600-100
Calcium Nitrate [Ca(NO3)2] Sigma Aldrich C4955
Centrifuge tubes, 1.5 mL Axygen MCT150C
Clear nail polish Sally Hanson Any nail polish or hardener may be subsituted
Depression (concavity) slide Electron Miscroscopy Sciences 71878-01
Diaminobenzidine Thermo Scientific 1855920
Embryo medium, Danieau, 30% 17.4 mM NaCl, 0.21 mM KCl, 0.12 mM MgS04, 0.18 mM Ca(NO3)2, 1.5 mM HEPES in ultrapure water.
Embryo medium, E2 7.5 mM NaCl, 0.25 mM KCl, 0.5 mM MgSO4, 75 μM KH2PO4, 25 uM Na2HPO4, 0.5 mM CaCl2, 0.35 mM NaHCO3, 0.5 mg/L methylene blue
Floating tube holder Thermo Scientific 59744015
Fluorescence compound microscope Leica Biosystems DMi8
Fluorescence stereomicroscope Leica Biosystems M165-FC
Glass coverslips 18 mm x 18 mm Corning 284518
Glass coverslips 22 mm x 60 mm Thermo Scientific 22-050-222
Glass slides Fisher Scientific 12-544-4
Glycerol Fisher Scientific BP229-1
Goat anti-mouse IgG Alexa 488 Invitrogen A11001
HEPES solution Sigma Aldrich H0887
Humid chamber with lid Simport M920-2
Hydrogen peroxide, 30% Fisher Scientific H325-500
Immunedge pap pen Vector labs H-4000
Insect pins, size 00 Stoelting 5213323
Magnesium Sulfate (MgSO4 · 7H2O) Sigma Aldrich 63138
Mesh strainer Oneida Any brand may be substituted
Methanol Sigma Aldrich 34860
Methylene blue Sigma Aldrich M9140
Micro-tube cap lock Research Products International 145062
Microwave oven Toastmaster
Mouse IgG Sigma Aldrich I8765
Normal goat serum Millipore Sigma S02L1ML
Nutating mixer Fisher Scientific 88-861-044
Paraformaldehyde Fisher Scientific 04042-500
Pasteur pipettes Fisher Scientific 13-678-20C
PBTriton 1% TritonX-100 in 1x PBS
Permount mounting medium Fisher Chemical SP15-500
Petri dish (glass) Pyrex 3160100
Petri dish (plastic) Fisher Scientific FB0875713
1-phenyl 2-thiourea Acros Organics 207250250
Phosphate buffered saline (PBS), 10x, pH 7.4 Gibco 70011-044
Phosphate buffered saline (PBS), 1x 1x made from 10x stock diluted in dH2O
Potassium Chloride (KCl) Sigma Aldrich P9333
Potassium Hydroxide (KOH) Fisher P250-500
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) Sigma Aldrich P5655
Pronase Sigma Aldrich 10165921001
Proteinase K Invitrogen AM2544
Sodium Chloride (NaCl) Sigma Aldrich S7653
Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) Sigma Aldrich S7907
Spawning tank with lid and insert Aquaneering ZHCT100
SuperBlock PBS Thermo Scientific 37515
Superfrost + slides Fisher Scientific 12-550-15
Superglue gel 3M Scotch
TNT 100 mM Tris, pH 8.0; 150 mM NaCl; 0.1% Tween20; made in dH2O
Transfer pipette Fisher 13-711-7M
Trichloracetic Acid (Cl3CCOOH) Sigma Aldrich T6399
Tris Base Fisher Scientific S374-500
TritonX-100 Sigma Aldrich T9284
Tween20 Fisher Scientific BP337-500
Ultrafine forceps Fisher Scientific 16-100-121
Water, ultrapure/double distilled Fisher Scientific W2-20

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References

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जेब्राफिश भ्रूण और लार्वा में पूरे माउंट इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री
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Hammond-Weinberger, D. R., ZeRuth, G. T. Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae. J. Vis. Exp. (155), e60575, doi:10.3791/60575 (2020).More

Hammond-Weinberger, D. R., ZeRuth, G. T. Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae. J. Vis. Exp. (155), e60575, doi:10.3791/60575 (2020).

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