Summary
Qui presentiamo un protocollo per il rilevamento fluorescente mediato da anticorpi di proteine in interi preparati di embrioni e larve di pesce zebra.
Abstract
L'immunohistochimica è una tecnica ampiamente utilizzata per esplorare l'espressione e la localizzazione delle proteine sia durante i normali stati di sviluppo che di malattia. Sebbene molti protocolli di immunohistochimica siano stati ottimizzati per le sezioni dei tessuti e dei tessuti dei mammiferi, questi protocolli spesso richiedono modifiche e ottimizzazione per gli organismi modello non mammiferi. I pesci zebra sono sempre più utilizzati come sistema modello nella ricerca di base, biomedica e traslazionale per studiare i meccanismi biologici molecolari, genetici e cellulari dei processi di sviluppo. Il pesce zebra offre molti vantaggi come sistema modello, ma richiede anche tecniche modificate per un rilevamento ottimale delle proteine. Qui, forniamo il nostro protocollo per l'immunohistochimica a fluorescenza integrale in embrioni di pesce zebra e larve. Questo protocollo descrive inoltre diverse strategie di montaggio che possono essere impiegate e una panoramica dei vantaggi e degli svantaggi offerti da ciascuna strategia. Descriviamo anche modifiche a questo protocollo per consentire il rilevamento di substrati cromogenici nell'intero tessuto di montaggio e il rilevamento della fluorescenza nel tessuto larvale sezionato. Questo protocollo è ampiamente applicabile allo studio di molte fasi di sviluppo e strutture embrionali.
Introduction
Il pesce zebra (Danio rerio) è emerso come un potente modello per lo studio dei processi biologici per diversi motivi, tra cui tempi di breve generazione, rapido sviluppo e amenabilità alle tecniche genetiche. Di conseguenza, i pesci zebra sono comunemente utilizzati in schermi ad alta produttività di piccole molecole per la ricerca tossicologica e la scoperta di farmaci. Il pesce zebra è anche un modello interessante per lo studio dei processi di sviluppo, dato che una singola femmina può produrre regolarmente 50-300 uova alla volta e gli embrioni otticamente chiari si sviluppano esternamente consentendo una visualizzazione efficiente dei processi di sviluppo. Tuttavia, le prime ricerche si basavano principalmente su schermi genetici in avanti utilizzando N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) o altri mutageni a causa di sfide nello stabilire tecniche genetiche inverse. Circa due decenni fa, i morfolino sono stati utilizzati per la prima volta nei pesci zebra per abbattere i geni mirati1. I morfolino sono piccoli oligonucleotidi antisensi che inibiscono la traduzione dell'mRNA bersaglio dopo la microiniezione in un embrione in una fase di sviluppo precoce. Una delle principali debolezze dei morfemole è che vengono diluite poiché le cellule si dividono e generalmente perdono efficacia di 72 ore dopo la fecondazione (hpf). Mentre i morfolino rimangono un potente strumento per la perturbazione del gene dei pesci zebra, le nucleasi effettore (TALEN) di trascrizione attivatori, le nucleasi zinco-dita (FN) e le ripetizioni palindromiche brevi (CRISPR) raggruppate regolarmente interspaziate (CRISPR) vengono utilizzate più recentemente per colpire direttamente il genoma del pesce zebra2,3. Queste strategie genetiche inverse, in combinazione con la genetica avanzata e gli schermi ad alta velocità, hanno stabilito il pesce zebra come un potente modello per studiare l'espressione e la funzione genica.
La capacità di studiare la funzione genica richiede generalmente una valutazione della distribuzione spatio-temporale dell'espressione genica o del prodotto genico. Le due tecniche più comunemente utilizzate per visualizzare tali modelli di espressione durante lo sviluppo precoce sono l'ibridazione in situ (ISH) e l'immunohistochimica a monte intero (IHC). L'ibridazione in situ è stata sviluppata per la prima volta nel 1969 e si basa sull'uso di sonde di RNA antisenso etichettate per rilevare l'espressione di mRNA in un organismo4. Al contrario, gli anticorpi etichettati sono utilizzati nell'immunoistochimica per visualizzare l'espressione proteica. L'idea di etichettare le proteine per il rilevamento risale ai5 del 1930 e il primo esperimento IHC è stato pubblicato nel 1941 quando gli anticorpi etichettati FITC sono stati utilizzati per rilevare batteri patogeni nei tessuti infetti6. ISH e IHC si sono evoluti e migliorati in modo significativo nel corso dei decenni successivi e sono ora entrambi regolarmente utilizzati nel laboratorio di ricerca molecolare e diagnostica7,8,9,10,11. Sebbene entrambe le tecniche abbiano vantaggi e svantaggi, IHC offre diversi vantaggi rispetto a ISH. In pratica, IHC è molto meno dispendioso in termini di tempo di ISH ed è generalmente meno costoso a seconda del costo dell'anticorpo primario. Inoltre, l'espressione dell'mRNA non è sempre una metrica affidabile dell'espressione proteica, come è stato dimostrato nei topi e negli esseri umani, che solo circa un terzo della variazione dell'abbondanza proteica può essere spiegata dall'abbondanza di mRNA12. Per questo motivo, IHC è un importante integratore per confermare i dati ISH, quando possibile. Infine, IHC può fornire dati subcellulari e di co-localizzazione che non possono essere determinati da ISH13,14,15. Qui, descriviamo un metodo passo-passo per rilevare in modo affidabile le proteine mediante immunostachimica in embrioni e larve di pesci zebra di montaggio intero. L'obiettivo di questa tecnica è determinare l'espressione spaziale e temporale di una proteina di interesse per l'intero embrione. Questa tecnologia utilizza anticorpi primari specifici dell'antigene e anticorpi secondari fluorescenti. Il protocollo è facilmente adattabile all'uso su sezioni di tessuto montate su slittamenti e per l'uso con substrati cromogenici al posto della fluorescenza. Utilizzando questo protocollo, dimostriamo che lo sviluppo del muscolo scheletrico del pesce zebra esprime i recettori del glutammato ionotropico, oltre ai recettori dell'acetilcolina. Le sottounità del recettore del glutammato di tipo NMDA sono rilevabili sul muscolo longitudinale a 23 hpf.
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Protocol
Le procedure per lavorare con gli adulti e gli embrioni di allevamento di pesci zebra descritti in questo protocollo sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della Murray State University.
1. Raccolta e fissazione dell'embrione
- Preparare i serbatoi di deposizione delle uova mettendo coppie di sesso misti di pesce zebra adulti o gruppi in serbatoi con una rete o fodera scanalata riempita con acqua di sistema durante la notte.
- All'accesa, cambiare l'acqua del serbatoio di deposizione delle uova per l'acqua del sistema fresco per rimuovere le feci. Utilizzare un ciclo scuro chiaro di 14 h/10 h con luci accese alle 9 del mattino.
- Una volta che le uova sono deposte, riportare gli adulti ai serbatoi di casa.
- Raccogliere le uova disegnandole con un pipet di trasferimento o versandole in un colino a rete.
- Trasferire le uova ai piatti Petri riempiti a metà con mezzo embrionale (come il 30% Danieau o il mezzo embrionale E2 con 0,5 mg/L di blu di metilene), limitando il numero di embrioni per piatto a 50.
- Rimuovere eventuali uova morte o che non si dividono.
NOTA: Gli embrioni morti possono essere facilmente identificati quando diventano opachi e spesso appaiono "nuvolosi". Se il blu di metilene viene aggiunto al mezzo embrionale, gli embrioni morti assumono un aspetto blu scuro. - Incubare piatti di uova a 28,5 gradi centigradi fino a raggiungere lo stadio desiderato. Per questo esperimento, sollevare gli embrioni fino a 23 hpf.
- Facoltativo) Trasferire gli embrioni a 24 hpf a 200 M 1-fenili 2-thiourea (PTU) nel mezzo embrionale per prevenire la melanogenesi16,17. In alternativa, gli embrioni di candeggina dopo la fissazione (vedere la sezione facoltativa 5).
- Cambiare mezzo embrionale o PTU medio al giorno.
- Dechorionate embrioni non tratteggiati utilizzando pinze ultra-fine-punta sotto uno stereomicroscopio. In alternativa, gli embrioni chimicamente dechorionati incubano in 1 mg/mL Pronase in mezzo embrionale per diversi minuti a temperatura ambiente. Rimuovere gli embrioni da Pronase e lavarsi tre volte con il mezzo embrionale.
- Gli embrioni Dechorioned si attaccano alla plastica. Conservarli in piatti Petri in vetro o plastica rivestiti con 1-2% di agarose disciolti in mezzo embrionale. Spostare gli embrioni dechorionati utilizzando pipet Pasteur lucidati dal fuoco per ridurre al minimo i danni.
- Trasferire gli embrioni a tubi centrifuga 1,5 mL utilizzando un pipet di plastica o lucidato dal fuoco.
- Rimuovere il mezzo embrionale con una micropipetta. Lasciare solo abbastanza liquido per coprire solo gli embrioni dopo ogni cambiamento di liquido.
- Preparare il 4% di paraformaldeide (PFA) in 1x salina tamponata da fosfati (PBS) in una cappa di fumi chimici.
AVVISO: il PFA è un materiale pericoloso. Indossare guanti e smaltire i liquidi e i solidi contaminati in aree designate. - Fissare gli embrioni in 4% PFA per 1-2 h con dondolo delicato a temperatura ambiente. In alternativa, fissare gli embrioni da 4 h a una notte a 4 gradi centigradi.
- Lavare tre volte in 1x PBS - 1% Triton-X (PBTriton) per 5 min.
- Utilizzare gli embrioni immediatamente o conservare a 4 gradi centigradi per un massimo di 1 settimana.
- Per lo stoccaggio a lungo termine, disidratare gli embrioni in metanolo 100% (MeOH) 2 h o durante la notte a -20 gradi centigradi. Conservare gli embrioni a -20 gradi centigradi in MeOH per diversi mesi.
AVVISO: MeOH è un materiale pericoloso. Indossare guanti e smaltire i liquidi e i solidi contaminati in aree designate.
2. Preparazione dell'embrione
- Reidratare gli embrioni con incubazioni seriali a temperatura ambiente.
- Incubare nel 75% MeOH/25% 1x PBS per 5 min, dondolo.
- Incubare in 50% MeOH/50% 1x PBS per 5 min, dondolo.
- Incubare nel 25% MeOH/75% 1x PBS per 5 min, dondolo.
- Incubare in 100% PBTriton per 5 min, dondolo.
- (Facoltativo) Preparare sul ghiaccio una soluzione di lavoro fresca della proteinasi K (10 g/mL in PBTriton) aggiungendo 10 l di scorta di proteine K appena scongerate (10 mg/mL).
- Permeabilizzare gli embrioni digerindo fino a 30 min in Proteinase K.
NOTA: la tempistica suggerita è <24 hpf: nessuna digestione; 24 hpf: digestione di 15 min; e 7 giorni: digestione di 30 min. - Risciacquare gli embrioni permeabilizzati in PBTriton e ri-fissare in 4% PFA per 20 min a temperatura ambiente.
- Lavare gli embrioni tre volte in PBTriton per 5 min a temperatura ambiente con dondolo delicato.
- Permeabilizzare gli embrioni digerindo fino a 30 min in Proteinase K.
3. Incubazione anticorpale primaria
- Selezionare una soluzione di blocco commerciale o un siero corrispondente alle specie host di anticorpi secondari (ad es. 10% siero di capra in PBTriton) con o senza 2 mg/mL Bovine Serum Albumin (BSA).
- Bloccare gli embrioni in soluzione di blocco per 1-3 h a temperatura ambiente o durante la notte a 4 gradi centigradi durante il dondolo.
- Incubare nell'anticorpo primario diluito in soluzione di blocco o 1% siero in PBTriton durante la notte a 4 gradi centigradi mentre dondola. In questo esperimento, gli anticorpi primari utilizzati erano anti-NMDAR1, recettore anti-pan-AMPA e anti-fosforo-Histone H3, ciascuno diluito ad una concentrazione finale di 1:500 nell'1% del siero di capra in PBTriton.
- Lavare cinque volte in PBTriton per 10 minuti a temperatura ambiente mentre dondola.
4. Incubazione anticorpale secondaria
- Selezionare un anticorpo secondario in base alla specie ospite dell'anticorpo primario e alla lunghezza d'onda desiderata.
- Incubare nell'anticorpo secondario diluito in soluzione di blocco o 1% siero per 2 h a temperatura ambiente (o durante la notte a 4 gradi centigradi) durante il dondolo.
NOTA: Gli anticorpi secondari fluorescenti sono sensibili alla luce. Abbiamo usato 1:500 capra-anti-topo Alexa488 diluito in 1% siero di capra in PBTriton. - Coprire i tubi con un foglio di alluminio o coprire con una scatola di blocco della luce per questo e tutti i passaggi successivi.
- Lavare tre volte in PBTriton per 10 min a temperatura ambiente mentre dondola.
- Trasferire gli embrioni a una soluzione glicerolo al 50% in PBS su un letto del 2% di agarose in mezzo embrionale e procedere alla documentazione o procedere a ulteriori fasi di lavorazione riportate di seguito.
Passaggi facoltativiOptional Steps
5. Sbiancamento
- Preparare la soluzione di candeggina in un tubo da 1,5 mL aggiungendo 810,7 gradi di ddH2O, 89,3 l l di 2 M KOH e 100 L del 30% H2O2.
- Invertire il tubo tre volte per mescolare.
- Pipetta 1 mL di direzione della soluzione di candeggina verso gli embrioni.
- Aprire il tappo del tubo dell'embrione per consentire alla fuoriuscita di gas. Toccare delicatamente il tubo sulla panca per spostare le bolle.
- Monitorare il processo di sbiancamento (utilizzare un microscopio se necessario) e interrompere la reazione quando il pigmento viene sufficientemente rimosso (circa 5 min per 24 hpf o 10 min per 72 hpf).
- Rimuovere con cautela la soluzione di sbiancamento con una micropipetta e risciacquare gli embrioni tre volte in 1 mL di PBTriton.
NOTA: gli embrioni sono appiccicosi in questo passaggio. - Procedere alla documentazione o a ulteriori procedure di elaborazione riportate di seguito.
6. Dissezione dell'embrione e Deyolking
- Per rimuovere il tuorlo, trasferire una piccola quantità (200 dollari l o abbastanza per coprire completamente l'embrione ma abbastanza restrittivo da limitare dove può galleggiare) di 1x PBS a uno scivolo di depressione o un vetro semplice.
- Utilizzare un tubo di trasferimento di plastica per spostare 1 o più embrioni nella goccia PBS.
- Utilizzare pinze ultra-sottili e 00 perni di insetti per rompere il tuorlo e molto delicatamente raschiare i granuli del tuorlo dalla superficie ventrale dell'embrione (vedi anche Cheng et al., 2014)18.
- Rimuovere i granuli del tuorlo e rifornire PBS in base alle esigenze.
- Ripetere fino a quando l'embrione è sufficientemente privo di tuorlo.
7. Montaggio piatto su vetrini
- Trasferire gli embrioni deyolked in uno scivolo di vetro caricato con una pipetta di plastica o una micropipetta da 1 mL con una punta tagliata (per ridurre lo stress da taglio). Orientarsi come desiderato con una punta di micropipetta o un perno per insetti da 200 luna.
- Wick via pbS in eccesso con una salvietta Kim o un asciugamano di carta.
- Aggiungere 2-3 gocce di supporto di montaggio alla diapositiva e coverslip.
- Asciugare all'aria per circa 5-10 min.
- Sigillare il vetro di copertura sul vetrino con uno smalto trasparente.
NOTA: I bordi del vetro di copertura devono essere completamente coperti con uno strato sottile e continuo di smalto. - Lasciare asciugare circa 10 min prima dell'imaging.
8. Montaggio ad Agarose
- Preparare l'1% di agarose nel mezzo embrionale aggiungendo 0,5 g di agarose a 50 mL di mezzo embrionale in un pallone a microonde o in un becher di volume almeno 3 volte superiore a quello desiderato.
- Riscaldare in un forno a microonde, vorticoso ogni 30 s, fino a agarose è completamente dissolto.
- Crea 1 mL di aliquote in tubi di centrifuga da 1,5 ml. Conservare le aliquote a temperatura ambiente.
- Coprire i tappi della metropolitana con serrature prima del riscaldamento.
- Mettere i tubi di agarose in un supporto di tubo galleggiante in un becher mezzo pieno d'acqua.
- Microonde il becher con tubi galleggianti per 2-3 min, o fino a quando agarose è completamente sciolto.
- Trasferire un embrione allo scivolo colmato con una pipetta di plastica o una micropipetta 200 con una punta tagliata (per ridurre lo stress da taglio).
- Posizionare l'embrione su un coperchio rettangolare utilizzando perni di insetto e aggiungere circa 20 anni di agarose fuso direttamente all'embrione.
- Orientare rapidamente la regione di interesse più vicina alla coverslip usando 00 perni di insetti.
NOTA: Si tratta di un supporto capovolto. - Riportare il tubo di agarose al tubo dell'acqua calda galleggiante tra ogni uso e microonde in base alle esigenze.
- Immagine con un microscopio quando l'agarose si indurisce. Tenere l'embrione montato capovolto per l'uso al microscopio invertito. Capovolgere il coperchio sopra (in modo che l'agarose è sotto il coperchio) per l'uso su microscopi eretti.
9. Montaggio su scivoli a ponte
- Per fare scivoli con bridge, incollare i copricapi quadrati alla diapositiva di vetro utilizzando un piccolo punto di supercolla.
NOTA: Dovrebbe esserci un trogolo largo almeno 5 mm tra i copricopertine. Due #1 copriletti alti è in genere appropriato per gli embrioni da 24-48 hpf, mentre tre copricapi alti possono essere necessari per 72 hpf. - Trasferire 1-2 embrioni deyolked al vetrino colmato con una pipetta di plastica o una micropipetta da 200 l con una punta tagliata (per ridurre lo stress da taglio).
- Wick via il liquido in eccesso con una salvietta Kim o un asciugamano di carta.
- Aggiungere una goccia di glicerolo dell'80% direttamente all'embrione.
- Coprire con un vetro di copertura rettangolare. La goccia di glicerolo dovrebbe toccare il vetro di copertura.
- Aggiungere più glicerolo allo spazio tra il vetro di copertura e lo scivolo necessario per coprire completamente l'embrione con un margine di glicerolo sui lati dell'embrione.
- Far scorrere delicatamente il vetro di copertura rettangolare per arrotolare l'embrione in posizione per l'imaging.
10. Colorazione DAB
NOTA: questa sezione inizia dopo il passaggio 4.2 precedente e sostituisce il resto del passaggio 4.
- Incubare gli embrioni in una soluzione di blocco con un anticorpo secondario coniugato perossidico per 2 h a temperatura ambiente o durante la notte a 4 gradi centigradi durante il dondolo.
- Lavare tre volte in PBTriton per 10 min a temperatura ambiente.
- Trasferire gli embrioni su una piastra di coltura o uno scivolo di depressione con una pipetta di trasferimento.
- Mescolare 50 - L dell'1% DAB (3,3'-diaminobenzidine) sciolto in ddH2O e 50 - L di 0,3% di perossido di idrogeno e portare a 1 mL con PBS.
AVVISO: DAB è un materiale pericoloso. Indossare guanti e smaltire i liquidi e i solidi contaminati DAB in aree designate. - Coprire gli embrioni macchiati HRP con la soluzione DAB preparata sopra e monitorare lo sviluppo del colore (in genere 1-5 min) al microscopio.
- Dopo aver raggiunto il livello desiderato di sviluppo del colore, risciacquare brevemente gli embrioni in PBS.
- Trasferire gli embrioni in un tubo da 1,5 mL prima della fissazione.
- Rifissare gli embrioni per 15-20 min in 4% PFA a temperatura ambiente.
- Lavare gli embrioni tre volte in PBTriton per 5 min.
- Procedere alla documentazione.
11. Protocollo modificato per la colorazione del tessuto sezionato montato su diapositive
- Accerchia il tessuto per essere macchiato con una pap pen.
- Trasferire le diapositive in una camera umida.
- Aggiungere 1 mL di PBS direttamente alla diapositiva.
- Incubare 7 min a temperatura ambiente per rimuovere il mezzo di incorporamento.
- Versare il PBS invertendo la diapositiva.
- Reidratare 1 min fino a 1 mL di tampone TNT (100 mM MM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.1% Tween20).
- Bloccare fino a 1 mL di soluzione di blocco (commerciale o 10% siero - 2% BSA) per 1 h a temperatura ambiente.
- Incubare durante la notte in anticorpi primari diluiti nel siero dell'1% o soluzione di blocco a 4 gradi centigradi.
- Lavare cinque volte fino a 1 mL di tampone TNT a temperatura ambiente.
- Incubare nell'anticorpo secondario per 2 ore a temperatura ambiente o peruna notte a 4 gradi centigradi. Coprire la camera con un foglio o utilizzare un coperchio scuro.
- Lavare cinque volte in TNT a temperatura ambiente. Versare l'ultimo lavaggio.
- Montare con 2-3 gocce di supporto di montaggio e coverslip. Lasciate inserire 5-10 min.
- Sigillare il vetro di copertura sulla diapositiva con smalto trasparente. Lasciare asciugare completamente prima dell'imaging.
12. Documentazione
- Registrare la procedura completa e le eventuali deviazioni in un notebook di laboratorio.
- Registrare la concentrazione, il nome, il numero di catalogo, il produttore e il numero di lotto dell'anticorpo primario.
- Posizionare il campione montato in modo appropriato sullo stadio del microscopio. Individuare la regione di interesse.
- Selezionare un esempio relativamente luminoso. Impostare l'esposizione e il guadagno della fotocamera in modo che il segnale sia sufficientemente luminoso senza saturare.
- Confrontare l'intensità di colorazione della stessa regione di interesse utilizzando le stesse impostazioni di esposizione quando si confrontano tra embrioni sperimentali con etichetta anticorpale e embrioni di anticorpi di controllo (ex. IgG).
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Representative Results
L'immunohistochimica integrale utilizza anticorpi per rilevare il modello spaziale dell'espressione proteica nell'animale intatto. Il flusso di lavoro di base dell'immunoistochimica (illustrata nella figura 1) prevede l'allevamento del pesce zebra, l'allevamento e la preparazione di embrioni, il blocco di antigeni non specifici, l'utilizzo di un antigene primario specifico dell'antigene per colpire la proteina di interesse, il rilevamento di tale anticorpo primario con un anticorpo secondario etichettato, il montaggio del campione e la documentazione dell'espressione.
L'immunohistochimica integrale è uno strumento prezioso per lo studio dell'espressione delle proteine spaziali e temporali durante lo sviluppo del pesce zebra. I pesci zebra mostrano contrazioni spontanee mediate da giunzioni gap a partire da prima di 19 hpf - prima del contatto del motoneurone19. La giunzione neuromuscolare del pesce zebra, come altri vertebrati, è mediata da acetilcolina che agisce arecettori acetilcolina nicotinica. Questi recettori assemblati vengono prima rilevati a circa 16 hpf e l'espressione si espande e rimodella come neuroni formano contatti20. Studi su rane21 e ratti22 suggeriscono che il muscolo scheletrico dei vertebrati può anche esprimere recettori del glutammato ionomotropico. L'immunohistochimica a montaggio intero per la sottounità GluN1 del recettore del glutammato tipo NMDA rivela l'espressione delle sottounità del recettore del glutammato durante lo sviluppo del muscolo del pesce zebra a 23 hpf (Figura 2). Questo corrisponde approssimativamente alla tempistica dell'innervazione del motoneurone. L'espressione è stata confrontata con nessun embrione di controllo primario per determinare la fluorescenza di fondo del pesce e dell'anticorpo secondario e con un IgG di topo a 2 g/mL per determinare i contributi relativi del legame dell'antigene non specifico. I recettori del glutammato di tipo AMPA non sono stati rilevati nei muscoli in questa fase di sviluppo. Le concentrazioni di anticorpi sono elencate nella Tabella 1. Per generare queste immagini, questi embrioni sono stati elaborati come descritto in questo protocollo senza passaggi facoltativi ad eccezione del deyolking. Gli embrioni erano piatti montati e copriti (Figura 3B).
Le cellule che si dividono esprimono diverse modifiche istoni che da cellule quiescenti che possono essere rilevate dall'immunoistochimica utilizzando anticorpi che riconoscono modifiche specifiche, come la fosforilazione proteica. La fosforo lation del tono 3 a serine 10 è associata alla divisione cellulare23. Le modifiche presentate a questo protocollo per l'adattamento dell'immunohistochimica al tessuto sezionato montato su vetrini sono state utilizzate per rilevare le cellule proliferanti nel cervello del pesce zebra larvale. Le sezioni congelate di embrioni da 72 hf sono state montate su vetrini e immunostainse per il p-H3 (Figura 4). Diverse cellule esprimono p-H3, e l'espressione è più notevole nelle zone ventricolari. L'espressione è stata confrontata con nessun embrione di controllo primario e con un IgG di topo da 2 g/mL per determinare i contributi relativi del legame dell'antigene non specifico.
| Anticorpo | bersaglio | Concentrazione |
| Controllo isotipo IgG mouse | Antigeni non specifici | 2 g/mL |
| Mouse anti-NMDAR1 | Sottounità GluN1 | 1:1,000 |
| Alexa488 anti topo di capra | Mouse IgG | 1:500 |
| Mouse Anti-phospho-H3 | istono fosforo H3 | 1:500 |
| Recettore anti-ampA del topo | GluR1-4 | 1:500 |
Tabella 1: Elenco degli anticorpi e delle concentrazioni utilizzate.
Figura 1: Diagramma di flusso dell'intera procedura di immunohistochimica di montaggio. Il flusso di lavoro di base della procedura è quello di allevare i pesci; raccogliere e preparare embrioni; bloccare gli antigeni non specifici; incubare negli anticorpi primari e secondari in serie; montare il tessuto; e documentare. I passaggi facoltativi sono indicati con frecce piccole nel punto appropriato del flusso di lavoro. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Risultati rappresentativi IHC dello schema delle larve e del recettore NMDA. L'uso dell'immunohistochimica di montaggio intero ha testato l'espressione del recettore del glutammato nello sviluppo muscolare. L'orientamento e la regione di interesse a 23 hpf è indicato. Nessun segnale era rilevabile quando gli anticorpi primari non erano inclusi. L'anticorpo di controllo Mouse IgG mostra il basso livello di espressione non specifica. La sottounità GluN1 del recettore del glutammato di tipo NMDA (NMDAR) è espressa attraverso il muscolo in via di sviluppo, con concentrazioni più elevate ai confini della somite (punte di freccia). I recettori del glutammato di tipo AMPA (AMPAR) non sono espressi in questa fase. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Schema degli schemi di montaggio. (A) Un embrione affondato nel 50% glicerolo può essere facilmente riposizionato. (B) Un embrione montato su un vetrino in mezzo di montaggio può essere conservato e immaginato in un secondo momento. (C) Un embrione montato in una goccia di 1% di agarose può essere fissato in posizione per visualizzare una regione difficile. (D) Un embrione montato in glicerolo su un vetrino a ponte può essere arrotolato e riposizionato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Risultati rappresentativi dell'IHC nel tessuto sezionato. Utilizzando le modifiche del protocollo nelle fasi facoltative, l'immunohistochimica è stata testata per la proliferazione delle cellule nel cervello larvale del pesce zebra a 72 hpf. Gli anticorpi di controllo IgG del topo ed esclusi gli anticorpi primari rivelano un basso livello di espressione non specifica. Come marcatore delle cellule che proliferano, il p-H3 è espresso in posizioni discrete, comprese le zone ventricolari (freccia). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
L'immunohistochimica è uno strumento versatile che può essere utilizzato per caratterizzare l'espressione spatio-temporale di praticamente qualsiasi proteina di interesse in un organismo. L'immunohistochimica è utilizzata su un'ampia varietà di tessuti e organismi modello. Questo protocollo è stato ottimizzato per l'uso nel pesce zebra. L'immunostochimica in specie diverse può richiedere diverse tecniche di fissazione e manipolazione, soluzioni di blocco a seconda delle specie e la presenza di perossie endogene e tempi di incubazione dovuti allo spessore e alla composizione dei tessuti. IHC nel pesce zebra è stato parte integrante nel promuovere la nostra comprensione del cancro24, malattia metabolica25, disturbi neurologici26, e numerose altre aree di grande rilevanza per la salute umana. Uno dei principali vantaggi dell'IHC è che la procedura è relativamente breve rispetto ad altre tecniche come ISH e non è tecnicamente impegnativa. Ci sono, tuttavia, numerosi passaggi che richiedono l'ottimizzazione in base all'età dei campioni, all'antigene preso di mira e agli anticorpi utilizzati.
La durata di diversi passaggi in questo protocollo è flessibile. Le durate fornite per i passaggi flessibili, come indicato, rappresentano in genere tempi minimi. In generale, ogni volta che gli embrioni vengono lavati tre o più volte in PBTriton, possono essere conservati durante la notte a 4 gradi centigradi nell'ultimo lavaggio, se necessario. I tempi di permeabilizzazione e fissazione sono meno flessibili e devono essere regolati solo con intenzioni intenzionali nell'ambito di una strategia di risoluzione dei problemi. Abbiamo annotato diversi punti del protocollo facoltativi per mostrare come questi passaggi possono essere integrati nel flusso di lavoro, come è rilevante dal punto di vista sperimentale. Ad esempio, se la pigmentazione interferisce con il rilevamento del segnale, prevenire la melanogensi mediante il trattamento PTU o gli embrioni fissi di candeggina. Lo sbiancamento può danneggiare il tessuto, quindi bisogna fare attenzione a ridurre al minimo il tempo che gli embrioni trascorrono in candeggina. Tuttavia, lo sbiancamento può essere preferibile al trattamento PTU, che può influenzare alcuni aspetti dello sviluppo27,28,29,30. Presentiamo anche opzioni per la rilevazione fluorescente e cromogenica. Se la fluorescenza non è desiderata o se l'antigene produce un segnale troppo debole per essere rilevato in modo adeguato dalla microscopia a fluorescenza, il rilevamento cromogenico può essere ottenuto utilizzando un anticorpo coniugato e DAB conosidrato di rafano (HRP).
La sfida più grande dell'IHC nel pesce zebra è trovare anticorpi adatti. Infatti, l'ISH è spesso usato come proxy per l'espressione proteica quando gli anticorpi commerciali non sono disponibili per la proteina di interesse desiderata. Molti anticorpi commerciali sono progettati per colpire i bersagli dei mammiferi e gli epitopi non sono sempre conservati nel pesce zebra. Quando disponibile, selezionare gli anticorpi disponibili in commercio che sono stati testati nel pesce zebra. Abbiamo scoperto che gli anticorpi che riconoscono gli antigeni che sono >80% conservati tra il pesce zebra e le specie bersaglio generalmente funzionano nel pesce zebra. Abbiamo anche scoperto che gli anticorpi che sono dimostrati per funzionare sia negli uccelli e/o negli anfibi che oltre ai mammiferi generalmente funzionano anche nel pesce zebra, anche quando l'efficacia nel pesce zebra non è stata testata. Tipicamente, gli anticorpi policlonali sviluppati contro un antigene di mammiferi hanno maggiori probabilità di rilevare gli omologhi dei pesci zebra rispetto agli anticorpi monoclonali a causa della loro minore specificità. Ogni volta che si testa un nuovo anticorpo, è utile eseguire un esperimento di controllo positivo utilizzando un peptide bersaglio cross-linked, tessuto mammifero o cellule che sono noti per esprimere la proteina, o cellule che esprimono un costrutto reporter. Gli anticorpi possono anche essere testati da macchie occidentali per verificare la dimensione dell'antigene bersaglio.
Mentre la maggior parte degli anticorpi commerciali fornisce un intervallo di diluizione suggerito per l'IHC, è importante determinare empiricamente la diluizione che funziona meglio. Le concentrazioni di anticorpi troppo alte spesso si traducono in una colorazione non specifica e in un aumento dello sfondo, mentre un anticorpo troppo poco non riesce a fornire un segnale distinguibile. A seconda dell'anticorpo e dell'antigene, può essere vantaggioso permeteoprima gli embrioni come descritto al punto 3.2 precedente, tuttavia, questo passaggio potrebbe non essere necessario e in alcuni casi può comportare una riduzione del segnale. Questo protocollo utilizza Triton-X-100 come detergente che permeabilizza le cellule, che possono essere sufficienti per tessuto sottile o espressione superficiale. Tessuti profondi o spessi, come regioni cerebrali profonde o larve più vecchie, possono richiedere la permeabilizzazione della proteinasi. Al contrario, Triton-X-100 dovrebbe essere escluso da tutti i passaggi quando l'immunostaining solo le proteine sulla superficie cellulare è desiderato rispetto all'etichettatura delle proteine intracellulari. La durata della fase di blocco e la scelta di una soluzione di blocco commerciale rispetto all'utilizzo del siero e BSA possono anche essere regolati per correggere la sensibilità degli anticorpi e la colorazione di fondo. Alte concentrazioni di siero utilizzato nel blocco (10% in questo protocollo) possono ridurre la colorazione di fondo, anche se dovrebbero essere diluite quando l'anticorpo è presente per ridurre al minimo i siti di legame anticorpo mascherante. Le soluzioni di blocco basate su piante possono essere utili se il segnale di fondo è costantemente elevato, anche con diluizioni anticorpali basse (<1:1,000). Infine, la sensibilità può essere messa a punto dalla severità dei lavamenti. Potrebbe essere necessario aumentare o diminuire la durata dei passaggi di lavaggio post-anticorpo e regolare la quantità di Triton-X-100 nel PBTriton. Le tipiche gamme di lavoro di PBTriton vanno da 0,2% a 1,0% Triton-X-100. È buona norma quando si utilizza un nuovo anticorpo per macchiare gli embrioni di controllo negativo con IgG primario ed etichettati anticorpi secondari per determinare la specificità degli anticorpi e identificare potenziali falsi segnali positivi.
Se l'ottimizzazione dell'anticorpo non riesce a produrre un segnale positivo, potrebbe essere dovuto alla maschera fissativa dell'antigene. Generalmente, la fissazione nel 4% PFA non maschera i siti di antigeni per prevenire il legame degli anticorpi, anche se il mascheramento dell'antigene si verifica occasionalmente con alcuni anticorpi. Il recupero dell'antigene può causare danni all'embrione, ma un protocollo di lavoro è stato descritto da Inoue e Wittbrodt31. In alternativa, se l'anticorpo selezionato è incompatibile con il 4% di PFA o se la PFA provoca cambiamenti di morfologia cellulare, metanolo, 2% acido tricloroacetico o glioaxal può essere utilizzato per fissare i campioni27. La compatibilità di un anticorpo con fissazione della formaldeide deve essere determinata empiricamente. Se non è possibile ottenere un segnale di controllo positivo in base alla fissazione PFA, potrebbe valere la pena provare un fissativo alternativo come il metanolo. I protocolli di fissaggio alternativi possono essere necessari anche per gli anticorpi primari che sono stati sollevati contro gli antigeni coniugati (come GABA-BSA).
Ci sono diverse opzioni efficaci per il montaggio di embrioni di pesce zebra immunostained per l'imaging. Gli embrioni possono essere trasferiti in una parabola Petri di glicerolo, posizionati con perni o pinze, e immagine sia con una vista widefield dall'alto o dal basso di imaging attraverso il piatto con un microscopio invertito (Figura 3A). Questo metodo è semplice, rapido e temporaneo. I ritiri includono la propensione degli embrioni a srotolarsi fuori fuoco nel glicerolo liquido, potenziali riflessi dalla superficie del glicerolo nel piatto e la difficoltà di imaging attraverso il piatto spesso. Gli embrioni possono essere montati piatti su lati di vetro (Figura 3B) con mezzo di montaggio, coverlips e smalto. Questi supporti possono essere visualizzati in un microscopio verticale o invertito. Gli embrioni preparati in questo modo possono essere preparati in anticipo e i vetrini conservati a 4 gradi centigradi fino all'imaging o possono essere conservati e riimmaginati in un secondo momento. Questo può essere particolarmente vantaggioso quando il tempo di imaging è limitato. Gli svantaggi di questo aumento includono le opzioni limitate per la posizione e lo spessore del tessuto dell'embrione e l'incapacità di riposizionare o recuperare gli embrioni. Gli embrioni montati in questo modo spesso hanno bisogno di deyolking, come i granuli tuorlo sono autofluorescenti nei canali di fluorescenza più comunemente utilizzati e non possono essere spostati o rimossi dopo il montaggio. Quando la regione di interesse richiede un difficile posizionamento dell'embrione, può essere più vantaggioso montare gli embrioni in 1% agarose su un vetro di copertura (Figura 3C). L'embrione può essere tenuto in posizione con perni di insetti con la regione di interesse più vicina al vetro di copertura fino a quando l'agarose si raffredda. L'agarose terrà l'embrione in posizione senza che l'embrione rotolrà per almeno diversi minuti. Il montaggio di Agarose è ideale per i microscopi invertiti, anche se il vetro di copertura può essere invertito con attenzione per l'uso su un microscopio verticale. Questo aumento può richiedere molto tempo e gli embrioni non sono generalmente riposizionabili o recuperabili. Il montaggio di embrioni su vetrini collegati (Figura 3D) offre un po ' di un compromesso tra questi metodi. Il supporto ponte è veloce e gli embrioni possono essere riposizionati e recuperati. L'altezza del ponte può consentire una maggiore flessibilità nello spessore del tessuto e nella posizione dell'embrione rispetto ai supporti piatti, pur mantenendo la capacità di immagine dall'alto o dal basso. Questo metodo richiede la preparazione anticipata delle diapositive con bridge. Lo spessore del tessuto da montare determina il numero di coverlips alto il ponte deve essere. I vetrini a ponte possono essere riutilizzati più volte per un giorno, ma devono essere smaltiti dopo la sessione di imaging perché il glicerolo è difficile da pulire i vetrini e lentamente sloggia la colla tenendo premuto il ponte.
IHC è un metodo efficace per determinare la tempistica e il modello di espressione proteica in un organismo o tessuto. IHC ha diversi vantaggi rispetto a ISH in quanto è relativamente basso costo e può essere completato in una frazione del tempo tipicamente necessario per ISH (2-3 giorni contro 5-8 giorni). Inoltre, l'IHC è un indicatore migliore dell'espressione del prodotto genico in quanto il rilevamento dei livelli di mRNA non prevede processi post-trancrionali e post-traduzionali che possono influenzare l'espressione proteica. IHC è anche in grado di fornire dati di localizzazione subcellulare (anche se questo non è vero quando si utilizza la colorazione DAB), che non è offerto da ISH. È possibile eseguire un doppio ISH/IHC nel pesce zebra.
IHC ha anche alcuni inconvenienti, soprattutto tra cui la disponibilità di anticorpi. Mentre ci sono numerosi anticorpi disponibili che sono di qualità adeguata per IHC, trovare anticorpi che funzionano specificamente nel pesce zebra è più impegnativo e spesso richiede test e risoluzione degli anticorpi generati contro gli antigeni dei mammiferi. Tuttavia, ci sono un numero crescente di anticorpi convalidati da pesci zebra sul mercato e l'emergere della tecnologia CRISPR/Cas9 ha reso possibile l'epitopo tag delle proteine endogene attraverso l'ingegneria genomica. Questi processi sono tuttavia dispendiosi in termini di tempo e impegnativi e richiedono la convalida della funzione proteica.
Il protocollo descritto nella presente relazione può essere utilizzato ampiamente su embrioni di pesce zebra e larve in qualsiasi fase e può essere applicato anche ai tessuti di animali adulti. Inoltre, questo protocollo consente anche di colorare campioni congelati o sezionato in paraffina con poca modifica. L'immunohistochimica a monte intero è stata utilizzata per esaminare le popolazioni di recettori del neurotrasmettitore nel muscolo, rivelando l'espressione del recettore ionotropico del glutammato NMDA sottounità 1 nello sviluppo del muscolo del pesce zebra. Questa colorazione piuttosto diffusa e diffusa attraverso il muscolo in via di sviluppo è coerente con l'espressione dello sviluppo della stessa sottounità recettore nello sviluppo di larve Xenopus21. Ciò suggerisce che l'espressione dei recettori del glutammato nello sviluppo muscolare è conservata evolutivamente. Complessivamente, questo protocollo è prezioso per ottenere una migliore comprensione dell'espressione genica attraverso l'uso di IHC e fornisce un potente strumento per determinare la distribuzione spatio-temporale dell'espressione proteica nel pesce zebra.
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Disclosures
Gli autori non hanno informazioni da divulgare.
Acknowledgments
Finanziamenti della sovvenzione NIH 8P20GM103436 14.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-100 | |
| Aluminum foil, heavy duty | Kirkland | Any brand may be substituted | |
| Anti-NMDA antibody | Millipore Sigma | MAB363 | |
| Anti-phospho-Histone H3 (Ser10), clone RR002 | Millipore Sigma | 05-598 | |
| Anti-pan-AMPA receptor (GluR1-4) | Millipore Sigma | MABN832 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Calcium Nitrate [Ca(NO3)2] | Sigma Aldrich | C4955 | |
| Centrifuge tubes, 1.5 mL | Axygen | MCT150C | |
| Clear nail polish | Sally Hanson | Any nail polish or hardener may be subsituted | |
| Depression (concavity) slide | Electron Miscroscopy Sciences | 71878-01 | |
| Diaminobenzidine | Thermo Scientific | 1855920 | |
| Embryo medium, Danieau, 30% | 17.4 mM NaCl, 0.21 mM KCl, 0.12 mM MgS04, 0.18 mM Ca(NO3)2, 1.5 mM HEPES in ultrapure water. | ||
| Embryo medium, E2 | 7.5 mM NaCl, 0.25 mM KCl, 0.5 mM MgSO4, 75 μM KH2PO4, 25 uM Na2HPO4, 0.5 mM CaCl2, 0.35 mM NaHCO3, 0.5 mg/L methylene blue | ||
| Floating tube holder | Thermo Scientific | 59744015 | |
| Fluorescence compound microscope | Leica Biosystems | DMi8 | |
| Fluorescence stereomicroscope | Leica Biosystems | M165-FC | |
| Glass coverslips 18 mm x 18 mm | Corning | 284518 | |
| Glass coverslips 22 mm x 60 mm | Thermo Scientific | 22-050-222 | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Goat anti-mouse IgG Alexa 488 | Invitrogen | A11001 | |
| HEPES solution | Sigma Aldrich | H0887 | |
| Humid chamber with lid | Simport | M920-2 | |
| Hydrogen peroxide, 30% | Fisher Scientific | H325-500 | |
| Immunedge pap pen | Vector labs | H-4000 | |
| Insect pins, size 00 | Stoelting | 5213323 | |
| Magnesium Sulfate (MgSO4 · 7H2O) | Sigma Aldrich | 63138 | |
| Mesh strainer | Oneida | Any brand may be substituted | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 34860 | |
| Methylene blue | Sigma Aldrich | M9140 | |
| Micro-tube cap lock | Research Products International | 145062 | |
| Microwave oven | Toastmaster | ||
| Mouse IgG | Sigma Aldrich | I8765 | |
| Normal goat serum | Millipore Sigma | S02L1ML | |
| Nutating mixer | Fisher Scientific | 88-861-044 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 04042-500 | |
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| PBTriton | 1% TritonX-100 in 1x PBS | ||
| Permount mounting medium | Fisher Chemical | SP15-500 | |
| Petri dish (glass) | Pyrex | 3160100 | |
| Petri dish (plastic) | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| 1-phenyl 2-thiourea | Acros Organics | 207250250 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), 10x, pH 7.4 | Gibco | 70011-044 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), 1x | 1x made from 10x stock diluted in dH2O | ||
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma Aldrich | P9333 | |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Fisher | P250-500 | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Sigma Aldrich | P5655 | |
| Pronase | Sigma Aldrich | 10165921001 | |
| Proteinase K | Invitrogen | AM2544 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | S7653 | |
| Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | Sigma Aldrich | S7907 | |
| Spawning tank with lid and insert | Aquaneering | ZHCT100 | |
| SuperBlock PBS | Thermo Scientific | 37515 | |
| Superfrost + slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Superglue gel | 3M Scotch | ||
| TNT | 100 mM Tris, pH 8.0; 150 mM NaCl; 0.1% Tween20; made in dH2O | ||
| Transfer pipette | Fisher | 13-711-7M | |
| Trichloracetic Acid (Cl3CCOOH) | Sigma Aldrich | T6399 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | S374-500 | |
| TritonX-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| Tween20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Ultrafine forceps | Fisher Scientific | 16-100-121 | |
| Water, ultrapure/double distilled | Fisher Scientific | W2-20 |
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