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Developmental Biology

제브라피시 배아와 애벌레의 전체 마운트 면역항암화학

doi: 10.3791/60575 Published: January 29, 2020

Summary

여기에서, 우리는 zebrafish 배아 및 애벌레의 전체 준비에 있는 단백질의 형광 항체 중재한 검출을 위한 프로토콜을 제시합니다.

Abstract

면역 조직 화학은 일반적인 발달 및 질병 상태 둘 다 도중 단백질 발현 그리고 현지화를 탐구하기 위하여 널리 이용되는 기술입니다. 많은 면역 조직 화학 프로토콜이 포유류 조직 및 조직 섹션에 최적화되었지만, 이러한 프로토콜은 종종 비 포유류 모델 유기체에 대한 수정 및 최적화가 필요합니다. Zebrafish는 발달 과정의 분자, 유전 및 세포 생물학적 메커니즘을 조사하기 위해 기본, 생물 의학 및 번역 연구에서 모델 시스템으로 점점 더 많이 사용되고 있습니다. Zebrafish는 모델 시스템으로서 많은 이점을 제공하지만 최적의 단백질 검출을 위해 수정된 기술이 필요합니다. 여기에서, 우리는 zebrafish 배아 및 애벌레에 있는 전체 마운트 형광 면역성 화학을 위한 우리의 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜은 또한 사용할 수 있는 여러 가지 장착 전략과 각 전략이 제공하는 장점과 단점에 대한 개요를 설명합니다. 우리는 또한 단면된 애벌레 조직에서 전체 마운트 조직 및 형광 검출에 있는 발색성 기단의 검출을 허용하기 위하여 이 프로토콜에 수정을 기술합니다. 이 프로토콜은 많은 발달 단계 및 배아 구조의 연구에 광범위하게 적용 가능하다.

Introduction

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제브라피쉬(Daniorerio)는짧은 생성 시간, 급속한 발달 및 유전 기술의 어메니티를 포함한 여러 가지 이유로 생물학적 과정의 연구를 위한 강력한 모델로 부상했습니다. 그 결과, 제브라피쉬는 독성 연구 및 약물 발견을 위해 처리량이 높은 소분자 스크린에 일반적으로 사용됩니다. Zebrafish는 한 번에 50-300 개의 알을 일상적으로 생산할 수 있고 광학적으로 명확한 배아가 외부에서 개발되어 개발 과정의 효율적인 시각화를 허용하는 것을 감안할 때 개발 프로세스 연구를위한 매력적인 모델입니다. 그러나, 초기 연구는 역유전 기술을 확립하는 도전 때문에 N-ethyl-N-n-n-nitrosourea (ENU) 또는 그밖 돌연변이원을 사용하여 앞으로 유전 스크린에 주로 의존했습니다. 대략 2십년 전, morpholinos는 표적으로 한 유전자를 녹다운하기 위하여 zebrafish에서 처음으로 이용되었습니다1. 모르폴리노는 초기 발달 단계에서 배아로 미세 주입 다음 표적 mRNA의 번역을 억제하는 작은 안티센스 올리고뉴클레오티드입니다. morpholinos의 주요 약점은 세포가 분열하고 일반적으로 72 시간 후 수정 (hpf)에 의해 효과를 잃을 때 희석된다는 것입니다. 모르폴리노는 제브라피시 유전자 파괴를 위한 강력한 도구로 남아 있지만, 전사 활성제와 같은 이펙터 뉴클레아제(TALENs), 아연-핑거 뉴클레아제(ZFNs), 클러스터된 정기적으로 간격이 짧은 팔린드로믹 반복(CRISPRs)이 최근에는 제브라피시 게놈2,3을직접 표적으로 하는 데 사용되고 있다. 이러한 역유전적 전략은 전방 유전학 및 높은 처리량 스크린과 함께 유전자 발현 및 기능을 연구하는 강력한 모델로 zebrafish를 확립했습니다.

유전자 기능을 연구하는 능력은 일반적으로 유전자 또는 유전자 생성물 발현의 시간적 분포에 대한 평가를 필요로 한다. 초기 발달 도중 그 같은 발현 패턴을 구상하기 위하여 일반적으로 이용되는 2개의 기술은 기업 혼성화 (ISH) 및 전체 마운트 면역성 화학 (IHC)에서 입니다. situ 혼성화는 1969년에 처음 개발되었고 유기체4에서mRNA 발현을 검출하기 위해 표지된 안티센스 RNA 프로브의 사용에 의존한다. 대조적으로, 표지된 항체는 단백질 발현을 구상하기 위하여 면역성 화학에서 이용됩니다. 검출을 위한 단백질 표지의 아이디어는 1930년대5로 거슬러 올라가고 첫번째 IHC 실험은 FITC 표지된 항체가 감염한 조직에 있는 병원성 박테리아를 검출하기 위하여 이용될 때 1941년에 간행되었습니다6. ISH와 IHC는 이후 수십 년 동안 크게 진화하고 개선되었으며 현재 분자 및 진단 연구 실험실7,8,9,10,11에서일상적으로 사용됩니다. 두 기술 모두 장점과 단점이 있지만 IHC는 ISH에 비해 몇 가지 이점을 제공합니다. 실질적으로, IHC는 ISH보다 훨씬 적은 시간이 소요되며 일반적으로 1차 항체의 비용에 따라 저렴하다. 또한, mRNA 발현은 항상 단백질 풍부도의 약 3분의 1만이 mRNA풍부도 12에의해 설명될 수 있다는 것을 마우스 및 인간에서 입증된 바와 같이 단백질 발현의 신뢰할 수 있는 메트릭이 아니다. 이러한 이유로 IHC는 가능한 경우 ISH 데이터를 확인하는 중요한 보충 자료입니다. 마지막으로, IHC는 ISH13,1415로결정할 수 없는 세포내 및 공동 지역화 데이터를 제공할 수 있습니다. 여기서, 우리는 제브라피시 배아 및 유충 전체에서 면역조직화학에 의해 단백질을 안정적으로 검출하는 단계별 방법을 설명한다. 이 기술의 목적은 전체 배아에서 관심 있는 단백질의 공간적 및 시간적 발현을 결정하는 것이다. 이 기술은 항원 특이적 1 차 항체 및 형광 태그이 붙은 이차 항체를 이용합니다. 이 프로토콜은 슬라이드 장착 조직 섹션에 사용하고 형광 대신 발색 기질과 함께 사용하기 위해 쉽게 적응할 수 있습니다. 이 프로토콜을 사용하여, 우리는 제브라피시 골격 근을 개발하는 것은 아세틸 콜린 수용체 이외에, ionotropic 글루타메이트 수용체를 표현한다는 것을 보여줍니다. NMDA 형 글루타메이트 수용체 소단위는 23 hpf에서 세로 근육에서 검출할 수 있습니다.

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Protocol

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이 프로토콜에 설명된 제브라피쉬 사육 성인 및 배아와 함께 작업하는 절차는 머레이 주립 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인되었습니다.

1. 배아 수집 및 고정

  1. 하룻밤 동안 시스템 물로 채워진 메쉬 또는 슬롯 라이너와 탱크에 성인 제브라피쉬 혼합 섹스 쌍 또는 그룹을 배치하여 산란 탱크를 준비합니다.
  2. 불이 켜진 경우, 산란 탱크 물을 변경하여 담수계물을 제거합니다. 오전 9시에 조명이 켜진 14 h/10 h 의 밝은 어두운 주기를 사용하십시오.
  3. 계란이 놓이면 성인을 홈 탱크로 돌려보릅니다.
  4. 이송 파이펫을 사용하여 계란을 끌어 올려 수집하거나 메쉬 스트레이너에 부어.
  5. 계란을 배아 배지(예: 0.5 mg/L 메틸렌 블루의 30% 다니오 또는 E2 배아 배지)로 채워진 페트리 접시에 옮기면 접시당 배아 수가 50개로 제한됩니다.
  6. 죽었거나 분열하지 못한 계란을 제거합니다.
    참고: 죽은 배아는 불투명해지고 종종 "흐린" 것처럼 보이기 때문에 쉽게 식별할 수 있습니다. 메틸렌 블루가 배아 배지에 첨가되면 죽은 배아는 진한 파란색 모양을 취합니다.
  7. 원하는 단계에 도달할 때까지 28.5 °C에서 계란의 접시를 배양합니다. 이 실험을 위해, 배아를 23 hpf까지 올린다.
  8. 선택적) 배아를 24 hpf에서 200 μM으로 200 μM으로 옮기고 1-페닐 2-티우레아(PTU)를 배아 배지에서 옮기면 멜라닌 발생을방지16,17. 대안적으로, 표백제 배아 후 고정(선택적 섹션 5 참조).
  9. 매일 배아 배지 또는 PTU 배지를 변경하십시오.
  10. 입체 현미경으로 초미세 팁 집게를 사용하여 해치되지 않은 배아를 초초리오네이트. 대안적으로, 화학적으로 배아를 실온에서 몇 분 동안 배아 배지에서 1 mg/mL Pronase로 배양하여 배아를 배양한다. Pronase에서 배아를 제거하고 배아 배지로 세 번 씻으하십시오.
  11. 디코리오네이트 배아는 플라스틱에 달라붙을 것입니다. 배아 배지에 용해된 1-2%의 아가로즈로 코팅된 유리 또는 플라스틱 페트리 접시에 보관하십시오. 손상을 최소화하기 위해 불에 연마 된 파스퇴르 피펫을 사용하여 데코리오네이트 배아를 이동합니다.
  12. 플라스틱 또는 화재 광택 파이펫을 사용하여 배아를 1.5 mL 원심 분리튜브로 옮김을 옮김.
  13. 마이크로파이펫으로 배아 배지를 제거합니다. 각 유체 변경 후 배아를 덮을 만큼 충분한 액체만 둡니다.
  14. 화학 연기 후드에 1x 인산완충 식염수(PBS)에 4% 파라포름알데히드(PFA)를 준비합니다.
    주의: PFA는 유해 물질입니다. 장갑을 착용하고 지정된 장소에서 오염된 액체및 고형물을 폐기하십시오.
  15. 배아를 4% PFA에서 1-2시간 동안 실온에서 부드럽게 흔들어 고정시다. 대안적으로, 배아를 4°C에서 하룻밤까지 4시간 동안 고정한다.
  16. 1x PBS + 1% 트리톤-X(PBTriton)에서 3회 5분 동안 세척하세요.
  17. 배아를 즉시 사용하거나 최대 1주동안 4°C에서 보관하십시오.
  18. 장기 보관을 위해 배아를 100% 메탄올(MeOH) 2시간 또는 -20°C에서 하룻밤 동안 탈수시합니다. 배아를 MeOH에서 -20°C에서 몇 개월 동안 저장하였다.
    주의: MeOH는 유해 물질입니다. 장갑을 착용하고 지정된 장소에서 오염된 액체및 고형물을 폐기하십시오.

2. 배아 준비

  1. 실온에서 직렬 배양을 통해 배아를 재수화하십시오.
    1. 75% MeOH/25% 1x PBS로 5분 동안 배양하여 흔들어 주세요.
    2. 50 % MeOH / 50 % 1 x PBS로 5 분 동안 배양하십시오.
    3. 25% MeOH/75% 1x PBS를 5분 동안 배양하여 흔들어 주세요.
    4. 100 % PBTriton에서 5 분 동안 인큐베이션, 흔들.
  2. (선택 사항) 신선한 단백질타아제 K 원료(10 mg/mL)를 얼음에 10 μl의 단백질타아제 K 스톡(10 mg/mL)을 첨가하여 얼음 위에 신선한 단백질정제 K 작업 용액(10 μg/mL)을 준비합니다.
    1. 피야테라제 K에서 최대 30분까지 소화하여 배아를 투과시켜 배아를 투과시합니다.
      참고 : 제안 된 타이밍은 <24 hpf입니다 : 소화 없음; 24 hpf: 15 분 소화; 7 일 : 30 분 소화.
    2. PBTriton에서 배아를 헹구고 실온에서 20 분 동안 4 % PFA로 다시 고정하십시오.
    3. PBTriton에서 배아를 3회 3회 세척하고 실온에서 부드러운 흔들림으로 5분 간 세척합니다.

3. 1 차 항체 배양

  1. 2 mg/mL 소 혈청 알부민(BSA)의 유무에 관계없이 이차 항체 숙주 종(예: PBTriton에서 10% 염소 혈청)과 일치하는 상업적 차단 용액 또는 혈청을 선택한다.
  2. 배아를 실온에서 1-3시간 동안 차단하거나 4°C에서 하룻밤 동안 흔들면서 차단용액으로 차단한다.
  3. 1차 항체에서 배양하여 반동하는 동안 4°C에서 하룻밤 동안 PBTriton에서 차단 용액 또는 1% 혈청으로 희석하였다. 본 실험에서, 사용된 1차 항체는 항-NMDAR1, 항-팬-AMPA 수용체, 및 항포스-히스톤 H3였으며, 각각 PBTriton에서 1% 염소 혈청에서 1:500의 최종 농도로 희석하였다.
  4. 흔들리는 동안 실온에서 10 분 동안 PBTriton에서 5 회 씻어 내주세요.

4. 이차 항체 배양

  1. 원발성 항체및 원하는 파장의 숙주 종에 기초하여 이차 항체를 선택한다.
  2. 이차 항체에 배양하여 반락 용액 또는 1% 혈청을 실온(또는 4°C에서 하룻밤)에서 2시간 동안 동안 흔들어 서 배양한다.
    참고: 형광 이차 항체는 빛에 민감합니다. 우리는 1:500 염소 반대로 마우스 Alexa488를 PBTriton에 있는 1% 염소 혈청에 희석했습니다 사용했습니다.
  3. 이 모든 후속 단계에 대한 빛 차단 상자로 알루미늄 호일 또는 커버튜브를 덮습니다.
  4. 흔들리는 동안 실온에서 10 분 동안 PBTriton에서 세 번 씻으하십시오.
  5. 배아배지에서 2% 아가로즈의 침대 위에 PBS에서 50% 글리세롤 용액으로 배아를 옮기고 문서화를 진행하거나 아래의 추가 처리 단계를 진행한다.

옵션 단계

5. 표백

  1. ddH2O의 810.7 μL, 89.3 μL의 2 M KOH, 및 30% H2O2의100 μL을 추가하여 1.5 mL 튜브에서 표백제를 준비한다.
  2. 튜브를 세 번 뒤집어 혼합합니다.
  3. 배아에 표백제 용액 방향의 피펫 1 mL.
  4. 배아 튜브 캡을 열어 가스가 빠져나오도록 합니다. 벤치의 튜브를 가볍게 두드려 거품을 빼냅니다.
  5. 표백 과정을 모니터링하고 (필요한 경우 현미경을 사용) 안료가 충분히 제거 될 때 반응을 중지 (약 5 24 hpf에 대한 분 또는 72 hpf에 대한 10 분).
  6. 조심스럽게 마이크로 파이펫으로 표백 용액을 제거하고 PBTriton의 1 mL에서 배아를 세 번 헹구어.
    참고: 배아는 이 단계에서 끈적끈적합니다.
  7. 아래 문서 또는 추가 처리 단계로 진행하십시오.

6. 배아 해부 및 탈교

  1. 노른자를 제거하려면, 소량 (~200 μL 또는 배아를 완전히 덮을 만큼 충분히 제한적이지만 부유 할 수있는 곳을 제한할 만큼 제한적)을 1x PBS를 우울증 슬라이드 또는 일반 유리 슬라이드로 옮니다.
  2. 플라스틱 이송 파이펫을 사용하여 1개 이상의 배아를 PBS 액적으로 이동합니다.
  3. 초미세 집게와 00 개의 곤충 핀을 사용하여 노른자를 분해하고 배아의 복부 표면에서 노른자 과립을 매우 부드럽게 긁어 냅니다 (2014 년 Cheng et al., 2014 참조)18.
  4. 노른자 과립을 제거하고 필요에 따라 PBS를 보충하십시오.
  5. 배아가 노른자가 충분히 없을 때까지 반복합니다.

7. 슬라이드에 플랫 장착

  1. 탈열 된 배아를 플라스틱 파이펫또는 트리밍 팁으로 1 mL 마이크로 파이펫으로 충전 된 유리 슬라이드로 옮기십시오 (전단 응력 감소). 200 μL 마이크로파이펫 팁 또는 곤충 핀으로 원하는 대로 방향을 지정합니다.
  2. 김 닦음이나 종이 타월로 여분의 PBS를 제거하십시오.
  3. 슬라이드와 커버슬립에 2-3 방울의 마운팅 미디어를 추가합니다.
  4. 약 5-10분 동안 공기 건조.
  5. 뚜껑 유리를 투명한 매니큐어로 슬라이드에 밀봉합니다.
    참고 : 커버 유리의 가장자리는 완전히 매니큐어의 얇고 연속 층으로 덮여 있어야합니다.
  6. 이미징 전에 약 10분 동안 건조시키십시오.

8. 아가로즈에 장착

  1. 배아 배지에 0.5 g의 아가로스를 50 mL의 배아 배지를 마이크로파 안전 플라스크 또는 비커에 첨가하여 배아 배지에 1% 아가로스를 원하는 것보다 3배 이상 더 많이 준비한다.
  2. 아가로즈가 완전히 녹을 때까지 전자레인지에서 30s마다 소용돌이치는 열을 가열합니다.
  3. 1.5 mL 원심 분리기 튜브에서 1 mL aliquots를 만드십시오. 별칭을 실온에서 보관하십시오.
  4. 가열하기 전에 캡 잠금 장치로 튜브 캡을 덮습니다.
  5. 아가로즈 튜브를 부유식 튜브 홀더에 물이 반쯤 채워진 비커에 놓습니다.
  6. 비커를 부동 튜브로 2-3분 간 또는 아가로즈가 완전히 녹을 때까지 전자레인지에 돌리십시오.
  7. 다듬어진 팁으로 플라스틱 파이펫 또는 200 μL 마이크로파이펫으로 배아를 브리지 슬라이드로 옮기십시오(전단 응력 감소).
  8. 곤충 핀을 사용하여 직사각형 커버 슬립에 배아를 배치하고 약 20 μL 용융 아가로스를 배아에 직접 추가합니다.
  9. 00 개의 곤충 핀을 사용하여 커버 슬립에 가장 가까운 관심 영역을 신속하게 지향하고 있습니다.
    참고: 이것은 거꾸로 된 마운트입니다.
  10. 필요에 따라 각 사용과 전자레인지 사이에 아가로즈 튜브를 온수 튜브 플로트에 되돌려 주세요.
  11. 아가로즈가 경화될 때 현미경을 이용한 이미지. 거꾸로 된 현미경에 사용하기 위해 장착 된 배아를 거꾸로 유지하십시오. 직립 현미경에 사용하기 위해 커버 슬립을 뒤집습니다 (아가로즈가 커버 슬립 아래에 있으므로)

9. 브리지 슬라이드에 장착

  1. 브리지 슬라이드를 만들기 위해 접착제 사각형 은 슈퍼 접착제의 작은 점을 사용하여 유리 슬라이드에 립을 덮습니다.
    참고: 커버슬립 사이에 는 최소 5mm 너비의 트로프가 있어야 합니다. 2개의 #1 커버립은 전형적으로 24-48 hpf 배아에 적합하고 3개의 커버립은 72 hpf를 위해 필요할 지도 모릅니다.
  2. 1-2개의 탈종된 배아를 플라스틱 파이펫으로 다리미끄럼또는 트리밍팁으로 200 μL 마이크로파이펫으로 옮기십시오(전단 응력 감소).
  3. 김 닦음이나 종이 타월로 여분의 액체를 제거하십시오.
  4. 배아에 직접 ≥80% 글리세롤 한 방울을 추가합니다.
  5. 직사각형 커버 유리로 덮습니다. 글리세롤의 물방울은 커버 유리를 만져야합니다.
  6. 배아의 측면에 글리세롤의 여백으로 배아를 완전히 덮기 위하여 필요에 따라 커버 유리와 슬라이드 사이 공간에 더 많은 글리세롤을 추가하십시오.
  7. 직사각형 커버 유리를 부드럽게 밀어 배아를 이미징을 위해 제자리로 굴리십시오.

10화 DAB 염색

참고: 이 섹션은 위의 4.2단계 이후 시작하여 4단계의 나머지 부분을 대체합니다.

  1. 배아를 반옥시다제-이차 항체로 차단 용액에 배합하여 실온에서 2시간 동안 또는 4°C에서 하룻밤 동안 흔들어.
  2. PBTriton에서 실온에서 10 분 동안 세 번 씻으소서.
  3. 배아를 배양 판 또는 우울증 슬라이드로 전사 파이펫으로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김을
  4. ddH2O와 0.3% 과산화수소 의 50 μL을 1% DAB(3,3'diaminobenzidine)의 50 μL을 혼합하고 PBS로 1 mL로 가져온다.
    주의: DAB는 유해 물질입니다. 장갑을 착용하고 DAB 오염 된 액체 및 고형물을 지정된 장소에서 폐기하십시오.
  5. 위에서 준비한 DAB 용액으로 HRP 염색 배아를 덮고 현미경으로 색 발달(전형적으로 1-5분)을 모니터링합니다.
  6. 원하는 색상 발달 수준에 도달한 후 PBS에서 배아를 간단히 헹구어 보시고 자합니다.
  7. 배아를 고정하기 전에 1.5 mL 튜브로 다시 옮김을 옮김시.
  8. 실온에서 4% PFA에서 15-20분 동안 배아를 다시 고정시.
  9. PBTriton에서 배아를 3회 5분 동안 세척합니다.
  10. 설명서를 진행합니다.

11. 슬라이드에 장착된 염색 단면 조직을 위한 수정된 프로토콜

  1. 파프 펜으로 염색할 조직을 둘러싸는다.
  2. 슬라이드를 습한 챔버로 옮김으로 옮김.
  3. 슬라이드에 직접 1mL의 PBS를 추가합니다.
  4. 실온에서 7분 동안 배양하여 임베딩 배지를 제거합니다.
  5. 슬라이드를 반전하여 PBS를 붓습니다.
  6. TNT 버퍼의 최대 1 mL에서 1 분 재수화 (100 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.1% Tween20).
  7. 실온에서 1시간 동안 최대 1mL의 차단 용액(상업용 또는 10% 혈청 + 2% BSA)을 차단합니다.
  8. 1% 혈청 또는 차단 용액을 4°C에서 희석한 1차 항체에서 하룻밤 동안 배양한다.
  9. 실온에서 TNT 버퍼의 최대 1mL에서 5회 세척하십시오.
  10. 실온에서 2시간 동안 또는 4°C에서 하룻밤 동안 이차 항체로 배양합니다. 챔버를 호일로 덮거나 어두운 뚜껑을 사용하십시오.
  11. 실온에서 TNT로 5회 세척하십시오. 마지막 세척을 붓습니다.
  12. 장착 매체와 커버 슬립 2-3 방울로 마운트합니다. 5-10 분 앉아 보자.
  13. 투명 매니큐어를 사용하여 커버 유리를 슬라이드에 밀봉합니다. 이미징 전에 완전히 건조시키십시오.

12. 문서

  1. 랩 노트북에 전체 프로시저 및 편차를 기록합니다.
  2. 1차 항체의 농도, 이름, 카탈로그 번호, 제조사 및 로트 수를 기록한다.
  3. 적절하게 장착된 샘플을 현미경 단계에 놓습니다. 관심 지역을 찾습니다.
  4. 비교적 밝은 예제를 선택합니다. 카메라 노출과 게인을 설정하여 신호가 포화되지 않고 충분히 밝아지않도록 합니다.
  5. 실험용 항체 표지 배아와 대조군 항체(예: IgG) 배아를 비교할 때 동일한 노출 설정을 사용하여 동일한 관심 영역의 염색 강도를 비교합니다.

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Representative Results

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전체 마운트 면역히스토화학은 항체를 사용하여 손상되지 않은 동물에서 단백질 발현의 공간 패턴을 검출합니다. 면역히스토화학의 기본 워크플로우(그림 1에묘사됨)는 제브라피시 사육, 배아 사육, 배아 사육 및 준비, 비특이적 항원 차단, 항원 특이적 1차 항체를 사용하여 관심 있는 단백질을 표적으로 하고, 표지된 이차 항체로 1차 항체를 검출하고, 시편을 장착하고, 발현을 문서화하는 것을 포함한다.

전체 마운트 면역 히스토화학은 제브라피시 발달 중 공간 및 시간 단백질 발현을 연구하는 데 유용한 도구입니다. Zebrafish는 19 hpf 이전에 시작하여 갭 접합에 의해 매개된 자발적인 수축을 나타낸다 - 운동 뉴런 접촉 전19. zebrafish 신경 근육 접합, 다른 척추 동물 처럼, 니코틴 아 세 틸 콜린 수용 체에서 행동 하는 아 세 틸 콜린에 의해 중재. 이러한 조립된 수용체는 약 16 hpf에서 처음 검출되고 뉴런이접촉20을형성함에 따라 발현이 확장되고 리모델링된다. 개구리21및22에 있는 연구 결과는 척추동물의 골격 근육이 또한 ionotropic 글루타메이트 수용체를 표현할 수 있다는 것을 건의합니다. NMDA형 글루타메이트 수용체의 GluN1 소부에 대한 전체 마운트 면역운동화학은 23 hpf에서 제브라피시 근육을 개발하는 전반에 걸쳐 글루타메이트 수용체 소단위의 발현을드러낸다(도 2). 이것은 대략 모터 신경 내성의 타이밍에 해당합니다. 발현은 물고기및 이차 항체의 배경 형광을 결정하기 위해 1차 대조군 배아와 비교되었고, 2 μg/mL 마우스 IgG에 비특이적 항원 결합의 상대적 기여도를 결정하였다. AMPA 형 글루타메이트 수용체는 개발의 이 단계에서 근육에서 검출되지 않았다. 항체 농도는 표 1에열거되어 있다. 이러한 영상을 생성하기 위해, 이들 배아는 탈교를 제외한 선택적 단계중 어느 것도 이 프로토콜에 기재된 바와 같이 처리되었다. 배아를 평평하게 장착하고 커버미드(도3B).

분할 세포는 단백질 인산화와 같은 특정 변형을 인식하는 항체를 사용하여 면역 성화학에 의해 검출 될 수있는 정지 세포에서 다른 히스톤 변형을 발현합니다. 세린(10)에서 히스톤 3의 인산화는 세포분열(23)과연관된다. 슬라이드에 장착된 단면 조직에 면역조직화학의 적응을 위한 이 프로토콜에 제시된 수정은 애벌레 제브라피시 뇌에서 증식세포를 검출하는데 사용되었다. 72 hpf 배아의 냉동 섹션은 슬라이드상에 장착하고 p-H3를 위해 면역 염색하였다(그림4). 몇몇 세포는 p-H3를 표현하고, 발현은 심실 구역에서 가장 주목할 만하다. 발현은 비특이적 항원 결합의 상대적 기여도를 결정하기 위해 1차 대조군 배아 및 2 μg/mL 마우스 IgG에 비교되었다.

항 체 대상 농도
마우스 IgG 이소타입 제어 비특이적 항원 2 μg/mL
마우스 안티 NMDAR1 글루N1 소단위 1:1,000
염소 안티 마우스 알렉사488 마우스 IgG 1:500
마우스 안티 포스 포-H3 포스포릴드 히스톤 H3 1:500
마우스 안티 팬 AMPA 수용체 글루R1-4 1:500

표 1: 사용된 항체 및 농도 목록.

Figure 1
그림 1: 전체 마운트 면역 조직 화학 절차의 순서도. 절차의 기본 워크플로우물고기는 번식하는 것입니다. 배아를 수집하고 준비; 비특이적 항원 차단; 시리즈에서 1 차 및 이차 항체에 배양; 마운트 조직; 및 문서에 있습니다. 선택적 단계는 워크플로의 적절한 지점에 작은 화살표로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
도 2: 유충 체질 및 NMDA 수용체 IHC 대표적인 결과. 전체 마운트 면역 운동 화학의 사용은 근육 을 개발에서 조미료 수용체 발현을 테스트했다. 23 hpf의 방향 및 관심 영역이 표시됩니다. 1차 항체가 포함되지 않았을 때 신호가 검출되지 않았습니다. 마우스 IgG 대조항체는 비특이적 발현의 낮은 수준을 나타낸다. NMDA 형 글루타메이트 수용체 (NMDAR)의 GluN1 소단위는 소미트 경계 (화살촉)에서 더 높은 농도로 개발 근육을 통해 표현됩니다. AMPA 형 글루타메이트 수용체 (AMPAR)는 이 단계에서 발현되지 않는다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 마운팅 방식의 회로도. (A)50% 글리세롤로 침몰한 배아를 쉽게 재배치할 수 있다. (B)장착 매체의 슬라이드에 평평하게 장착된 배아를 보존하고 나중에 이미지화할 수 있다. (C)1%의 액적에 장착된 배아는 어려운 부위를 볼 수 있는 위치에 고정될 수 있다. (D)다리가 있는 슬라이드에 글리세롤에 장착된 배아를 압연 및 재배치할 수 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
도 4: 단면 조직에서 IHC의 대표적인 결과. 선택적 단계에서 프로토콜 수정을 사용하여, 면역성 화학은 72 hpf에서 제브라피시 애벌레 뇌의 증식 세포를 위해 시험하였다. 마우스 IgG 대조항체및 1차 항체를 배제하는 것은 낮은 수준의 비특이적 발현을 드러낸다. 증식 세포의 마커로서, p-H3는 심실 영역(화살촉)을 포함하는 이산 위치에서 발현된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

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면역화학은 유기체에 관심 있는 거의 모든 단백질의 주공간적 발현을 특성화하는 데 사용할 수 있는 다목적 도구이다. 면역 조직 화학은 다양한 조직 및 모델 유기체에 사용됩니다. 이 프로토콜은 제브라피시에 사용하도록 최적화되었습니다. 상이한 종의 면역조직화학은 조직의 두께 및 조성으로 인한 종 및 내인성 과산화증의 존재에 따라 다른 고정 및 취급 기술, 차단 용액을 필요로 할 수 있습니다. 제브라피시의 IHC는 암24,대사질환25,신경질환26,그리고 인간의 건강과 의외로 많은 다른 분야에 대한 이해를 증진시키는 데 필수적이다. IHC의 한 가지 주요 장점은 절차가 ISH와 같은 다른 기술에 비해 상대적으로 짧고 기술적으로 까다롭지 않다는 것입니다. 그러나, 표본의 나이, 표적으로 되는 항원 및 항체에 근거를 둔 최적화를 요구하는 수많은 단계가 있습니다.

이 프로토콜의 여러 단계 의 기간은 유연합니다. 설명된 대로 유연한 단계에 대해 주어진 기간은 일반적으로 필요한 최소한의 시간을 나타냅니다. 일반적으로, PBTriton에서 배아를 3회 이상 세척할 때마다, 필요한 경우 마지막 세척에서 4°C에서 하룻밤 동안 보관할 수 있다. 투과 및 고정 시간은 유연성이 낮으며 문제 해결 전략의 일환으로 의도적으로만 조정해야 합니다. 실험적으로 관련이 있는 것처럼 이러한 단계를 워크플로에 통합할 수 있는 방법을 보여 주는 프로토콜의 몇 가지 사항을 언급했습니다. 예를 들어, 색소 침착이 신호 검출을 방해하는 경우, PTU 치료 또는 표백제 고정 배아에 의한 멜라노겐증을 예방한다. 표백은 조직을 손상시킬 수 있으므로 배아가 표백제에 소비하는 시간을 최소화하기 위해 주의를 기울여야 합니다. 그러나, 표백은 PTU 치료, 이는 발달27,28,29,30의특정 양상에 영향을 미칠 수 있는 것이 바람직할 수 있다. 우리는 또한 형광 및 발색성 검출을 위한 선택권을 제시합니다. 형광이 바람직하지 않거나 항원이 형광 현미경 검사법에 의해 적절히 검출되기에 너무 약한 신호를 생성하는 경우, 발색성 검출은 고추냉이 과산화증(HRP)-접합 항체 및 DAB를 사용하여 달성될 수 있다.

제브라피시에서 IHC의 가장 큰 과제는 적합한 항체를 찾는 것입니다. 실제로, ISH는 상업적 항체가 관심 있는 원하는 단백질에 대해 이용가능하지 않을 때 단백질 발현을 위한 프록시로서 종종 사용된다. 많은 상업적 항체는 포유류 표적을 표적으로 하기 위하여 디자인되고 에피토프는 항상 zebrafish에서 보존되지 않습니다. 사용 가능한 경우, 제브라피시에서 테스트된 시판 항체를 선택하십시오. 우리는 제브라피시와 표적 종 사이에서 보존되는 >80%인 항원을 인식하는 항체가 일반적으로 제브라피시에서 작용한다는 것을 발견했습니다. 우리는 또한 포유류 이외에 조류 및 / 또는 양서류에서 작동하도록 입증 된 항체가 일반적으로 얼룩말피시의 효능이 테스트되지 않은 경우에도 zebrafish에서 작동한다는 것을 발견했습니다. 전형적으로, 포유류 항원대하여 개발된 폴리클로날 항체는 그들의 더 낮은 특이성 때문에 단일클론 항체 보다는 제브라피시 상동체를 검출하기 위하여 확률이 높습니다. 새로운 항체를 시험할 때마다, 단백질을 발현하는 것으로 알려진 가교 표적 펩티드, 포유류 조직 또는 세포를 사용하여 양성 대조군 실험을 실행하는 것이 유익하다. 항체는 또한 표적 항원의 크기를 확인하기 위하여 서쪽 얼룩에 의해 시험될 수 있습니다.

대부분의 상업적 항체는 IHC에 대한 제안된 희석 범위를 제공하지만, 가장 잘 작동하는 희석을 경험적으로 결정하는 것이 중요합니다. 너무 높은 항체 농도는 비특이적 염색 및 증가된 배경을 초래하는 반면, 너무 적은 항체는 식별 가능한 신호를 제공하지 못합니다. 항체 및 항원에 따라, 상기 3.2단계에서 설명된 바와 같이 먼저 배아를 투과시키는 것이 유리할 수 있지만, 이 단계는 필요하지 않을 수 있으며, 어떤 경우에는 감소된 신호를 초래할 수 있다. 이 프로토콜은 트리톤-X-100을 세포를 투과시키는 세제로 사용하며, 이는 얇은 조직 또는 표면 발현에 충분할 수 있습니다. 깊은 또는 두꺼운 조직, 깊은 뇌 영역 또는 이전 애벌레 등, 단백질 분해 기 투과해야 할 수 있습니다. 반대로, 트리톤-X-100은 세포 내 단백질표지를 통해 세포 표면에서 단백질만을 면역염색하는 것이 바람직한 경우 모든 단계에서 제외되어야 한다. 혈청 및 BSA를 사용하는 것에 비해 상업적 차단 용액의 선택뿐만 아니라 차단 단계의 지속 시간은 또한 항체 감도 및 배경 염색을 위해 보정하도록 조정될 수 있다. 차단에 사용되는 고농도의 혈청 (이 프로토콜에서 10 %)은 배경 염색을 줄일 수 있지만, 항체가 존재할 때 희석되어 마스킹 항체 결합 부위를 최소화해야합니다. 낮은 항체 희석(&1:1,000)에서도 배경 신호가 일관되게 높은 경우 식물 기반 차단 솔루션이 도움이 될 수 있습니다. 마지막으로, 민감도는 세안의 엄격성에 의해 미세 조정 될 수있다. PBTriton에서 트리톤-X-100의 양을 조절할 뿐만 아니라 차체 세척 단계의 지속 시간을 증가 또는 감소시킬 필요가 있을 수 있다. PBTriton의 일반적인 작업 범위는 0.2 % ~ 1.0 % 트리톤 - X-100에 걸쳐 있습니다. 새로운 항체를 사용하여 1 차적인 IgG를 가진 음성 통제 태아를 염색하고 항체 특이성을 결정하고 잠재적인 거짓 양성 신호를 확인하기 위하여 표지된 이차 항체를 사용하는 것이 좋습니다.

항체 최적화가 양성 신호를 생성하지 못하는 경우, 항원을 마스킹하는 고정제 때문일 수 있다. 일반적으로, 4% PFA에 있는 고정은 항원 마스킹이 때때로 몇몇 항체로 생기더라도, 항체 결합을 방지하기 위하여 항원 사이트를 마스크하지 않습니다. 항원 회수는 배아에 손상을 초래할 수 있지만 작동 프로토콜은 이노우에 및 Wittbrodt31에의해 기술되었다. 대안적으로, 선택된 항체가 4% PFA와 호환되지 않거나 PFA가 세포 형태 변화를 초래하는 경우, 메탄올, 2% 트리클로로아세트산, 또는 글류악살은시료(27)를고정하는데 사용될 수 있다. 포름알데히드 고정을 가진 항체의 호환성은 경험적으로 결정되어야 합니다. PFA 고정 후 양성 제어 신호를 얻을 수 없는 경우, 메탄올과 같은 대체 고정제를 시도해 볼 가치가 있을 수 있습니다. 대체 고정 프로토콜은 또한 공액 항원(GABA-BSA와 같은)에 대하여 제기된 1 차적인 항체를 위해 필요할 지도 모릅니다.

화상 진찰을 위한 면역 염색한 zebrafish 태아를 설치를 위한 몇몇 효과적인 선택권이 있습니다. 배아는 핀 또는 집게로 배치된 글리세롤의 페트리 접시로 옮겨질 수 있으며, 뒤집힌 현미경으로 접시를 통해 위 또는 아래에서 광시야를 통해 이미지화할 수있습니다(그림 3A). 이 방법은 간단하고 빠르며 일시적입니다. 단점은 유체 글리세롤에 초점 밖으로 롤 배아에 대한 성향을 포함, 접시에 글리세롤의 표면에서 잠재적 인 반사, 두꺼운 접시를 통해 이미징의 어려움. 배아는 장착 매체, 커버립 및 매니큐어로 유리 면에 평평하게 장착 할 수 있습니다(그림 3B). 이 마운트는 직립 또는 반전 현미경으로 볼 수 있습니다. 이러한 방식으로 제조된 배아는 이미징이 있을 때까지 미리 제조되고 슬라이드를 4°C에서 저장하거나 나중에 저장 및 재영상화할 수 있다. 이는 이미징 시간이 제한될 때 특히 유리할 수 있습니다. 이 마운트의 단점은 배아 위치 및 조직 두께에 대한 제한된 옵션과 배아를 재배치하거나 복구 할 수 없다는 것을 포함합니다. 이런 식으로 장착된 배아는 노른자 과립이 가장 일반적으로 사용되는 형광 채널에서 자가 형광이며 장착 후 이동하거나 제거 할 수 없기 때문에 종종 탈열이 필요합니다. 관심 영역이 배아의 어려운 위치 지정을 필요로 하는 경우, 커버 유리 위에 1% 아가로즈에 배아를 장착하는 것이 가장 유리할 수있다(도 3C). 배아는 아가로세가 냉각될 때까지 커버 유리에 가장 가까운 관심 영역을 가진 곤충 핀으로 제자리에 고정될 수 있다. 아가로즈는 배아가 적어도 몇 분 동안 압연되지 않고 배아를 제자리에 고정시킬 것이다. Agarose 장착은 수직 현미경에 사용하기 위해 커버 유리를 신중하게 반전 시킬 수 있지만 반전 된 현미경에 가장 적합합니다. 이 마운트는 시간이 많이 소요될 수 있으며 배아는 일반적으로 재배치되거나 복구할 수 없습니다. 브리지 슬라이드에 배아를 장착(그림 3D)이러한 방법 사이의 다소 타협을 제공합니다. 브리지 마운트는 빠르며 배아를 재배치하고 복구 할 수 있습니다. 다리의 높이는 위 또는 아래에서 이미지 할 수있는 능력을 유지하면서, 평면 마운트보다 조직 두께와 배아 위치에 더 큰 유연성을 허용 할 수 있습니다. 이 방법을 사용하려면 브리지된 슬라이드를 미리 준비해야 합니다. 장착할 조직의 두께는 교량이 얼마나 많은 커버립을 높여야 하는지를 결정합니다. 브리지 슬라이드는 하루 동안 여러 번 재사용할 수 있지만 글리세롤은 슬라이드를 청소하기 어렵고 다리를 들고 있는 접착제를 천천히 빼내기 때문에 이미징 세션 후에 폐기해야 합니다.

IHC는 유기체 또는 조직에서 단백질 발현의 타이밍 및 패턴을 결정하는 효과적인 방법이다. IHC는 상대적으로 저렴한 비용으로 ISH에 비해 몇 가지 장점을 가지며 일반적으로 ISH에 필요한 시간의 일부분으로 완료될 수 있습니다(2-3일 대 5-8일). 또한, IHC는 단백질 발현에 영향을 미칠 수 있는 사후 전사 및 번역 후 과정을 예측하지 못하는 mRNA 수준의 검출로서 유전자 생성물 발현의 더 나은 지표이다. IHC는 또한 SIC에서 부여하지 않는 세포외 지역화 데이터(DAB 염색 사용 시 사실이 아님)를 제공할 수 있습니다. 제브라피시에서 이중 ISH/IHC를 수행할 수 있습니다.

IHC는 또한 항체 가용성인 그들 사이에서 가장 중요한 몇몇 결백이 있습니다. IHC에 적합한 품질의 수많은 항체가 있지만, 제브라피시에서 특별히 작동하는 항체를 찾는 것은 더 어렵고 종종 포유류 항원에서 생성된 항체를 테스트하고 문제를 해결해야 합니다. 그러나, 시장에 제브라피쉬 검증 항체의 증가가 있고 CRISPR/Cas9 기술의 출현은 게놈 공학을 통해 내인성 단백질을 에피토프하는 가능하게 했습니다. 그러나 이러한 과정은 시간이 많이 걸리고 도전적이며 단백질 기능의 검증이 필요합니다.

이 보고서에 기술된 프로토콜은 모든 단계에서 제브라피시 배아 및 유충에 광범위하게 사용될 수 있으며 성인 동물의 조직에도 적용될 수 있습니다. 또한,이 프로토콜은 또한 약간의 수정으로 냉동 또는 파라핀 단면 샘플의 염색을 허용합니다. 전체 마운트 면역 운동화학은 근육의 신경 전달 물질 수용체 집단을 검사하는 데 사용되었으며, 제브라피시 근육 개발시 ionotropic NMDA 글루타메이트 수용체 의무 하위 단위 1의 발현을 드러냈습니다. 이러한 다소 광범위하고 확산성 염색은 제노푸스 유충21을개발하는 데 서 동일한 수용체 소단위의 발달 발현과 일치한다. 이것은 근육 개발에 조미료 수용체의 발현이 진화적으로 보존된다는 것을 시사한다. 전부, 이 프로토콜은 IHC의 사용을 통해 유전자 발현의 더 나은 이해를 얻기위한 가치가 있으며 얼룩말에서 단백질 발현의 시간적 분포를 결정하기위한 강력한 도구를 제공합니다.

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Disclosures

저자는 공개 할 정보가 없습니다.

Acknowledgments

NIH 보조금 8P20GM103436 14.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Fisher Scientific BP160-100
Aluminum foil, heavy duty Kirkland Any brand may be substituted
Anti-NMDA antibody Millipore Sigma MAB363
Anti-phospho-Histone H3 (Ser10), clone RR002 Millipore Sigma 05-598
Anti-pan-AMPA receptor (GluR1-4) Millipore Sigma MABN832
Bovine serum albumin (BSA) Fisher Scientific BP1600-100
Calcium Nitrate [Ca(NO3)2] Sigma Aldrich C4955
Centrifuge tubes, 1.5 mL Axygen MCT150C
Clear nail polish Sally Hanson Any nail polish or hardener may be subsituted
Depression (concavity) slide Electron Miscroscopy Sciences 71878-01
Diaminobenzidine Thermo Scientific 1855920
Embryo medium, Danieau, 30% 17.4 mM NaCl, 0.21 mM KCl, 0.12 mM MgS04, 0.18 mM Ca(NO3)2, 1.5 mM HEPES in ultrapure water.
Embryo medium, E2 7.5 mM NaCl, 0.25 mM KCl, 0.5 mM MgSO4, 75 μM KH2PO4, 25 uM Na2HPO4, 0.5 mM CaCl2, 0.35 mM NaHCO3, 0.5 mg/L methylene blue
Floating tube holder Thermo Scientific 59744015
Fluorescence compound microscope Leica Biosystems DMi8
Fluorescence stereomicroscope Leica Biosystems M165-FC
Glass coverslips 18 mm x 18 mm Corning 284518
Glass coverslips 22 mm x 60 mm Thermo Scientific 22-050-222
Glass slides Fisher Scientific 12-544-4
Glycerol Fisher Scientific BP229-1
Goat anti-mouse IgG Alexa 488 Invitrogen A11001
HEPES solution Sigma Aldrich H0887
Humid chamber with lid Simport M920-2
Hydrogen peroxide, 30% Fisher Scientific H325-500
Immunedge pap pen Vector labs H-4000
Insect pins, size 00 Stoelting 5213323
Magnesium Sulfate (MgSO4 · 7H2O) Sigma Aldrich 63138
Mesh strainer Oneida Any brand may be substituted
Methanol Sigma Aldrich 34860
Methylene blue Sigma Aldrich M9140
Micro-tube cap lock Research Products International 145062
Microwave oven Toastmaster
Mouse IgG Sigma Aldrich I8765
Normal goat serum Millipore Sigma S02L1ML
Nutating mixer Fisher Scientific 88-861-044
Paraformaldehyde Fisher Scientific 04042-500
Pasteur pipettes Fisher Scientific 13-678-20C
PBTriton 1% TritonX-100 in 1x PBS
Permount mounting medium Fisher Chemical SP15-500
Petri dish (glass) Pyrex 3160100
Petri dish (plastic) Fisher Scientific FB0875713
1-phenyl 2-thiourea Acros Organics 207250250
Phosphate buffered saline (PBS), 10x, pH 7.4 Gibco 70011-044
Phosphate buffered saline (PBS), 1x 1x made from 10x stock diluted in dH2O
Potassium Chloride (KCl) Sigma Aldrich P9333
Potassium Hydroxide (KOH) Fisher P250-500
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) Sigma Aldrich P5655
Pronase Sigma Aldrich 10165921001
Proteinase K Invitrogen AM2544
Sodium Chloride (NaCl) Sigma Aldrich S7653
Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) Sigma Aldrich S7907
Spawning tank with lid and insert Aquaneering ZHCT100
SuperBlock PBS Thermo Scientific 37515
Superfrost + slides Fisher Scientific 12-550-15
Superglue gel 3M Scotch
TNT 100 mM Tris, pH 8.0; 150 mM NaCl; 0.1% Tween20; made in dH2O
Transfer pipette Fisher 13-711-7M
Trichloracetic Acid (Cl3CCOOH) Sigma Aldrich T6399
Tris Base Fisher Scientific S374-500
TritonX-100 Sigma Aldrich T9284
Tween20 Fisher Scientific BP337-500
Ultrafine forceps Fisher Scientific 16-100-121
Water, ultrapure/double distilled Fisher Scientific W2-20

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제브라피시 배아와 애벌레의 전체 마운트 면역항암화학
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Hammond-Weinberger, D. R., ZeRuth, G. T. Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae. J. Vis. Exp. (155), e60575, doi:10.3791/60575 (2020).More

Hammond-Weinberger, D. R., ZeRuth, G. T. Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae. J. Vis. Exp. (155), e60575, doi:10.3791/60575 (2020).

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