Summary
Her presenterer vi en protokoll for fluorescerende antistoffmediert påvisning av proteiner i hele preparater av sebrafiskembryoer og larver.
Abstract
Immunohistochemistry er en mye brukt teknikk for å utforske proteinuttrykk og lokalisering under både normale utviklings- og sykdomstilstander. Selv om mange immunhistokjemiprotokoller er optimalisert for pattedyrvev og vevsseksjoner, krever disse protokollene ofte modifisering og optimalisering for ikke-pattedyrmodellorganismer. Sebrafisk brukes i økende grad som modellsystem i grunnleggende, biomedisinsk og translasjonell forskning for å undersøke molekylære, genetiske og cellebiologiske mekanismer for utviklingsprosesser. Sebrafisk tilbyr mange fordeler som modellsystem, men krever også modifiserte teknikker for optimal proteindeteksjon. Her gir vi vår protokoll for helmount fluorescens immunohistochemistry i sebrafisk embryoer og larver. Denne protokollen beskriver i tillegg flere ulike monteringsstrategier som kan brukes og en oversikt over fordelene og ulempene hver strategi gir. Vi beskriver også endringer i denne protokollen for å tillate påvisning av kromogene substrater i hele mount vev og fluorescens deteksjon i seksjonert larvevet. Denne protokollen gjelder bredt for studiet av mange utviklingsstadier og embryonale strukturer.
Introduction
Sebrafisken (Danio rerio) har dukket opp som en kraftig modell for studiet av biologiske prosesser av flere grunner, inkludert kort generasjonstid, rask utvikling og amenabilitet til genetiske teknikker. Som et resultat brukes sebrafisk ofte i høye gjennomstrømning små molekylskjermer for toksikologisk forskning og narkotikaoppdagelse. Sebrafisk er også en attraktiv modell for studiet av utviklingsprosesser gitt at en enkelt kvinne rutinemessig kan produsere 50-300 egg om gangen, og de optisk klare embryoene utvikler seg eksternt slik at det kan foreffektiv visualisering av utviklingsprosesser. Tidlig forskning var imidlertid hovedsakelig avhengig av fremover genetiske skjermer ved hjelp av N-etyl-N-nitrosourea (ENU) eller andre mutagens på grunn av utfordringer i å etablere omvendt genetiske teknikker. For omtrent to tiår siden ble morfonoer først brukt i sebrafisk til å slå ned målrettede gener1. Morpholinos er små antisense oligonucleotides som hemmer oversettelse av mål mRNA etter mikroinjeksjon i et embryo på et tidlig utviklingsstadium. En stor svakhet i morfonoer er at de fortynnes når cellene deler seg og mister generelt effektiviteten med 72 timer etter befruktning (hpf). Mens morfonoer forblir et kraftig verktøy for sebrafisk genforstyrrelser, transkripsjon aktivator-lignende effektor nucleases (TALENs), sink-finger nucleases (ZFNer), og gruppert regelmessig interspaced korte palindromic repetisjoner (CRISPRs) blir nylig brukt til å direkte målrette sebrafisk genom2,3. Disse omvendte genetiske strategiene, i kombinasjon med fremover genetikk og høye gjennomstrømningsskjermer, har etablert sebrafisken som en kraftig modell for å studere genuttrykk og funksjon.
Evnen til å studere genfunksjon krever generelt en evaluering av spatio-temporal fordeling av gen- eller genproduktuttrykk. De to mest brukte teknikkene for å visualisere slike uttrykksmønstre under tidlig utvikling er in situ hybridisering (ISH) og hele mount immunohistochemistry (IHC). In situ hybridisering ble først utviklet i 1969 og er avhengig av bruk av merkede antisense RNA-sonder for å oppdage mRNA-uttrykk i en organisme4. I motsetning brukes merkede antistoffer i immunhistokjemi for å visualisere proteinuttrykk. Ideen om merking proteiner for deteksjon dateres tilbake til 19305 og det første IHC eksperimentet ble publisert i 1941 da FITC-merkede antistoffer ble brukt til å oppdage patogene bakterier i infiserte vev6. ISH og IHC har utviklet seg og forbedret seg betydelig i løpet av de påfølgende tiårene, og brukes nå begge rutinemessig i molekylær- og diagnostisk forskningslaboratorium7,8,9,10,11. Mens begge teknikkene har fordeler og ulemper, tilbyr IHC flere fordeler over ISH. Praktisk talt er IHC mye mindre tidkrevende enn ISH og er generelt billigere avhengig av kostnaden for det primære antistoffet. I tillegg er mRNA-uttrykk ikke alltid en pålitelig beregning av proteinuttrykk som det har blitt demonstrert hos mus og mennesker at bare omtrent en tredjedel av proteinoverflodsvariasjonen kan forklares av mRNA overflod12. Av denne grunn er IHC et viktig supplement for å bekrefte ISH-data, når det er mulig. Til slutt kan IHC gi subcellulære og samlokaliseringsdata som ikke kan bestemmes av ISH13,14,15. Her beskriver vi en trinnvis metode for å på en pålitelig måte oppdage proteiner ved immunhistokjemi i hele mount sebrafiskembryoer og larver. Målet med denne teknikken er å bestemme det romlige og timelige uttrykket av et protein av interesse for hele embryoet. Denne teknologien benytter antigenspesifikke primære antistoffer og fluorescerende merket sekundære antistoffer. Protokollen er lett tilpasningsdyktig til bruk på lysbildemonterte vevseksjoner og for bruk med kromogene substrater i stedet for fluorescens. Ved hjelp av denne protokollen viser vi at utvikling av sebrafisk skjelettmuskulatur uttrykker ionotropiske glutamatreseptorer, i tillegg til acetylkolinreseptorer. NMDA-type glutamat reseptor underenheter er påviselig på langsgående muskelved 23 hpf.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Prosedyrene for å arbeide med sebrafisk avl voksne og embryoer beskrevet i denne protokollen ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved Murray State University.
1. Embryo innsamling og fiksering
- Forbered gytetanker ved å plassere voksne sebrafisk blandet sex par eller grupper i tanker med en mesh eller slotted liner fylt med systemvann over natten.
- Ved lys på, endre gytetanken vann for ferskvann for å fjerne avføring. Bruk en 14 t /10 t lys mørk syklus med lys som kommer på 9 am.
- Når egg er lagt, returner de voksne til hjemmetanker.
- Samle egg ved å tegne dem opp ved hjelp av en overføringspipt eller helle dem inn i en maskesil.
- Overfør eggene til Petri-retter fylt halvveis med embryomedium (for eksempel 30% Danieau eller E2 embryomedium med 0,5 mg / L metylenblå), noe som begrenser antall embryoer per tallerken til 50.
- Fjern egg som er døde eller ikke deler seg.
MERK: Døde embryoer kan lett identifiseres som de blir ugjennomsiktige og ofte vises "overskyet". Hvis metylenblå legges til embryomedium, tar de døde embryoene på seg et mørkt blått utseende. - Inkuber retter av egg ved 28,5 ° C til de når ønsket stadium. For dette eksperimentet, løft embryoene til 23 hkf.
- Valgfritt) Overfør embryoene ved 24 hkf til 200 μM 1-fenyl 2-thiourea (PTU) i embryomedium for å forhindre melanogenese16,17. Alternativt kan blekeembryoer etter fiksering (se valgfri avsnitt 5).
- Endre embryomedium eller PTU medium daglig.
- Dechorionate unhatched embryoer ved hjelp av ultra-fine-tip tang under et stereomikroskop. Alternativt, kjemisk dechorionate embryoer ved å inkubere i 1 mg / ml Pronase i embryomedium i flere minutter ved romtemperatur. Fjern embryoene fra Pronase og vask tre ganger med embryomedium.
- Dechorionated embryoer vil holde seg til plast. Hold dem i glass eller plast Petri retter belagt med 1-2% agarose oppløst i embryo medium. Flytt dechorionerte embryoer ved hjelp av brannpolerte Pasteur pipts for å minimere skade.
- Overfør embryoene til 1,5 ml sentrifugerør ved hjelp av en plast- eller brannpolert pipet.
- Fjern embryomedium med mikropipette. La bare nok væske til å bare dekke embryoene etter hver væskeendring.
- Forbered 4% paraformaldehyd (PFA) i 1x fosfatbufret saltvann (PBS) i en kjemisk røykhette.
FORSIKTIG: PFA er et farlig materiale. Bruk hansker og kast forurensede væsker og faste stoffer i utpekte områder. - Fest embryoene i 4% PFA i 1-2 timer med mild gynge ved romtemperatur. Alternativt kan du fikse embryoene 4 timer til over natten ved 4 °C.
- Vask tre ganger i 1x PBS + 1% Triton-X (PBTriton) i 5 min.
- Bruk embryoene umiddelbart eller oppbevar ved 4 °C i opptil 1 uke.
- For langtidslagring dehydrerer du embryoene i 100 % metanol (MeOH) 2 timer eller over natten ved -20 °C. Oppbevar embryoene ved -20 °C i MeOH i flere måneder.
FORSIKTIG: MeOH er et farlig materiale. Bruk hansker og kast forurensede væsker og faste stoffer i utpekte områder.
2. Embryo forberedelse
- Rehydrer embryoene gjennom serieinkubasjoner ved romtemperatur.
- Inkuber i 75% MeOH/25% 1x PBS i 5 min, gynge.
- Inkuber i 50% MeOH/50% 1x PBS i 5 min, gynge.
- Inkuber i 25% MeOH/75% 1x PBS for 5 min, gynge.
- Inkuber i 100% PBTriton i 5 min, gynge.
- (Valgfritt) Forbered en frisk proteinase K arbeidsløsning (10 μg/ml i PBTriton) på is ved å legge til 10 μL nytint proteinase K-lager (10 mg/ml).
- Permeabilize embryoene ved å fordøye opptil 30 min i Proteinase K.
MERK: Foreslått timing er <24 hpf: ingen fordøyelse; 24 hkf: 15 min fordøyelse; og 7 dager gammel: 30 min fordøyelse. - Skyll permeabiliserte embryoer i PBTriton og re-fix i 4% PFA i 20 min ved romtemperatur.
- Vask embryoene tre ganger i PBTriton i 5 min ved romtemperatur med mild gynge.
- Permeabilize embryoene ved å fordøye opptil 30 min i Proteinase K.
3. Primær antistoffinkubasjon
- Velg en kommersiell blokkeringsløsning eller serum som samsvarer med sekundære antistoffvertsarter (f.eks. 10 % geitserum i PBTriton) med eller uten 2 mg/ml storfe serumalbumin (BSA).
- Blokker embryoene i blokkeringsoppløsning i 1-3 timer ved romtemperatur eller over natten ved 4 °C mens du gynger.
- Inkubat i primær antistoff fortynnet i blokkeringsoppløsning eller 1% serum i PBTriton over natten ved 4 °C mens du gynger. I dette eksperimentet var de primære antistoffene som ble brukt anti-NMDAR1, anti-pan-AMPA-reseptor og antifosfo-Histone H3, hver fortynnet til en endelig konsentrasjon på 1:500 i 1% geitserum i PBTriton.
- Vask fem ganger i PBTriton i 10 min ved romtemperatur mens du gynger.
4. Sekundær antistoffinkubasjon
- Velg et sekundært antistoff basert på vertsartene i det primære antistoffet og ønsket bølgelengde.
- Inkuber i sekundært antistoff fortynnet i blokkeringsoppløsning eller 1% serum i 2 timer ved romtemperatur (eller over natten ved 4 °C) under gynge.
MERK: Fluorescerende sekundære antistoffer er lysfølsomme. Vi brukte 1:500 geit-anti-mus Alexa488 fortynnet i 1% geit serum i PBTriton. - Dekk rørene med aluminiumsfolie eller deksel med en lysblokkerende boks for dette og alle påfølgende trinn.
- Vask tre ganger i PBTriton i 10 min ved romtemperatur mens du gynger.
- Overfør embryoene til en 50% glyserolløsning i PBS over en seng på 2% oppsto i embryomedium og fortsett til dokumentasjon eller fortsett til ytterligere behandlingstrinn nedenfor.
Valgfrie trinn
5. Bleking
- Forbered blekemiddeloppløsningen i et 1,5 ml rør ved å tilsette 810,7 μL ddH2O, 89,3 μL på 2 M KOH og 100 μL på 30 % H2O2.
- Snu røret tre ganger for å blande.
- Pipette 1 ml blekemiddelløsningsretning til embryoene.
- Åpne embryorørhetten slik at gassen kan unnslippe. Trykk forsiktig på røret på benken for å løsne bobler.
- Overvåk blekeprosessen (bruk om nødvendig et mikroskop) og stopp reaksjonen når pigmentet er tilstrekkelig fjernet (ca. 5 min i 24 hkf eller 10 min i 72 hkf).
- Fjern blekemiddeloppløsningen forsiktig med en mikropipette og skyll embryoer tre ganger i 1 ml PBTriton.
MERK: Embryoer er klissete i dette trinnet. - Gå videre til dokumentasjon eller videre behandlingstrinn nedenfor.
6. Embryodisseksjon og deyolking
- For å fjerne eggeplommen, overfør en liten mengde (~ 200 μL eller nok til å dekke embryoet helt, men restriktiv nok til å begrense hvor det kan flyte) på 1x PBS til en depresjonlysbilde eller et vanlig glasslysbilde.
- Bruk en plastoverføringspipt til å flytte 1 eller flere embryoer til PBS-dråpene.
- Bruk ultra-fine tang og 00 insektpinner for å bryte fra hverandre eggeplommen og veldig forsiktig skrape eggeplommegranulat fra embryoets ventrale overflate (se også Cheng et al., 2014)18.
- Fjern eggeplommegranulat og fyll PBS etter behov.
- Gjenta til embryoet er tilstrekkelig fri for eggeplomme.
7. Flat montering på lysbilder
- Overfør deeggede embryoer til et ladet glasslysbilde med en plastpipette eller en 1 ml mikropipette med trimmet spiss (for å redusere skjærstress). Orient er ønsket med en 200 μL mikropipettespiss eller insektpinne.
- Wick bort overflødig PBS med en Kim tørke eller papirhåndkle.
- Tilsett 2-3 dråper monteringsmedi til lysbildet og trekkslip.
- Lufttørk i ca 5 til 10 min.
- Forsegle dekkglasset på lysbildet med klar neglelakk.
MERK: Kantene på dekkglasset må være helt dekket med et tynt, kontinuerlig lag med neglelakk. - La det tørke ca. 10 min før bildebehandling.
8. Montering i Agarose
- Forbered 1% agarose i embryomedium ved å legge til 0,5 g agarose til 50 ml embryomedium i en mikrobølgesikker kolbe eller beger på minst 3x større volum enn ønsket.
- Varm i mikrobølgeovn, virvlende hver 30 s, til agarose er helt oppløst.
- Lag 1 ml aliquots i 1,5 ml sentrifugerør. Oppbevar aliquots ved romtemperatur.
- Dekkrørhettene med hettelåser før oppvarming.
- Legg agaroserør ene i en flytende rørholder i et beger halvfylt med vann.
- Mikrobølgeovn begeret med flytende rør i 2-3 min, eller til agarose er helt smeltet.
- Overfør et embryo til det brolagte lysbildet med en plastpipette eller en 200 μL mikropipette med trimmet spiss (for å redusere skjærstress).
- Plasser embryoet på en rektangulær dekkslip ved hjelp av insektpinner og tilsett ca. 20 μL smeltet oppsto direkte til embryoet.
- Orienter raskt interesseområdet nærmest dekksslip en 00 insektpinner.
MERK: Dette er en opp-ned-brakett. - Sett agaroserøret tilbake til varmtvannsrøret mellom hver bruk og mikrobølgeovn etter behov.
- Bilde ved hjelp av et mikroskop når agarose stivner. Hold det monterte embryoet opp-ned for bruk på et invertert mikroskop. Vend omslaget slip over (slik at agarose er under coverslip) for bruk på oppreist mikroskoper.
9. Montering på brolagte lysbilder
- For å lage brolagte lysbilder, lim firkantede coverslips til glasslysbildet ved hjelp av en liten prikk med superlim.
MERK: Det skal være en trau på minst 5 mm bred mellom dekkslipsene. To #1 dekkslepper høy er vanligvis egnet for 24-48 hkf embryoer mens tre coverslips høy kan være nødvendig for 72 hkf. - Overfør 1-2 deeggede embryoer til det brolagte lysbildet med en plastpipette eller en 200 μL mikropipette med trimmet spiss (for å redusere skjærstress).
- Fukt bort overflødig væske med en Kim tørke eller papirhåndkle.
- Tilsett en dråpe ≥ 80 % glyserol direkte til embryoet.
- Dekk med et rektangulært dekselglass. Dråpeav glyserol bør berøre dekkglasset.
- Legg til mer glyserol til mellomrommet mellom dekkglasset og skyv etter behov for å dekke embryoet helt med en margin av glyserol på sidene av embryoet.
- Skyv det rektangulære dekkglasset forsiktig for å rulle embryoet på plass for bildebehandling.
10. DAB farging
MERK: Denne delen begynner etter trinn 4.2 ovenfor og erstatter resten av trinn 4.
- Inkuber embryoene i en blokkeringsløsning med peroksidasekonjugert sekundærantistoff i 2 timer ved romtemperatur eller over natten ved 4 °C mens de gynger.
- Vask tre ganger i PBTriton i 10 min ved romtemperatur.
- Overfør embryoene til en kulturplate eller depresjon glir med en overføringspipett.
- Bland 50 μL av 1% DAB (3,3'-diaminobenzidin) oppløst i ddH2O og 50 μL av 0,3% hydrogenperoksid og bringe til 1 ml med PBS.
FORSIKTIG: DAB er et farlig materiale. Bruk hansker og kast DAB forurensede væsker og faste stoffer i utpekte områder. - Dekk HRP-fargede embryoer med DAB-løsningen utarbeidet ovenfor og skjerm for fargeutvikling (vanligvis 1-5 min) under et mikroskop.
- Etter å ha nådd ønsket nivå av fargeutvikling, skyll embryoene kort i PBS.
- Overfør embryoene tilbake til et 1,5 ml rør før fiksering.
- Fest embryoene på nytt i 15-20 min i 4 % PFA ved romtemperatur.
- Vask embryoene tre ganger i PBTriton i 5 min.
- Fortsett til dokumentasjon.
11. Modifisert protokoll for farging seksjonert vev som er montert på lysbilder
- Omkranse vev som skal være farget med en pap penn.
- Overfør lysbildene til et fuktig kammer.
- Tilsett 1 ml PBS direkte i lysbildet.
- Inkuber 7 min ved romtemperatur for å fjerne innebyggingmedium.
- Hell av PBS ved å invertere lysbilde.
- Rehydrere 1 min i opptil 1 ml TNT-buffer (100 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,1% Tween20).
- Blokker i opptil 1 ml blokkeringsoppløsning (kommersielt eller 10 % serum + 2 % BSA) i 1 timer ved romtemperatur.
- Inkuber over natten i primær antistoff fortynnet i 1% serum eller blokkeringsoppløsning ved 4 °C.
- Vask fem ganger i opptil 1 ml TNT-buffer ved romtemperatur.
- Inkuber i sekundært antistoff i 2 timer ved romtemperatur eller over natten ved 4 °C. Dekk kammeret med folie eller bruk et mørkt lokk.
- Vask fem ganger i TNT ved romtemperatur. Hell av siste vask.
- Monter med 2-3 dråper monteringsmedium og dekkslip. La sitte 5-10 min.
- Forsegle dekkglasset på lysbildet ved hjelp av klar neglelakk. La det tørke helt før bildebehandling.
12. Dokumentasjon
- Registrer hele prosedyren og eventuelle avvik i en lab notatbok.
- Registrer konsentrasjonen, navnet, katalognummeret, produsenten og partinummeret til det primære antistoffet.
- Plasser riktig montert prøve på mikroskopstadiet. Finn området av interesse.
- Velg et relativt lyst eksempel. Still inn kameraeksponering og forsterkning slik at signalet er tilstrekkelig lyst uten å mette.
- Sammenlign fargingintensitet i samme interesseområde ved hjelp av de samme eksponeringsinnstillingene når du sammenligner mellom eksperimentelle antistoffmerkede embryoer og kontroll antistoff (f.eks. IgG) embryoer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hele mount immunohistochemistry bruker antistoffer for å oppdage det romlige mønsteret av proteinuttrykk i det intakte dyret. Den grunnleggende arbeidsflyten av immunohistokjemi (avbildet i figur 1)innebærer avl sebrafisk, heve og forberede embryoer, blokkere ikke-spesifikke antigener, bruke et antigenspesifikt primærantistoff for å målrette protein av interesse, oppdage at primære antistoff med et merket sekundært antistoff, montering av prøven og dokumentasjon.
Hele mount immunohistochemistry er et verdifullt verktøy for studiet av romlig og temporal protein uttrykk under sebrafisk utvikling. Sebrafisk viser spontane sammentrekninger mediert av gapkryss som begynner på før 19 hpf - før motor neuron kontakt19. Sebrafiskennevromuskulære krysset, som andre virveldyr, er mediert av acetylkolin som virker ved nikotiniske acetylkolinreseptorer. Disse monterte reseptorene oppdages først ved ca. 16 hkf og uttrykket utvides og remodellerer som nevroner danner kontakter20. Studier i frosker21 og rotter22 tyder på at skjelettmuskulaturen i virveldyr også kan uttrykke ionotropiske glutamatreseptorer. Hele mount immunohistochemistry for GluN1-underenheten av NMDA-type glutamatreseptoren avslører uttrykk for glutamatreseptorunderenheter gjennom utvikling av sebrafiskmuskel ved 23 hkf (Figur 2). Dette tilsvarer omtrent tidspunktet for motor neuron inervation. Uttrykket ble sammenlignet med ingen primære kontrollembryoer for å bestemme fiskens bakgrunnsfluorescens og det sekundære antistoffet og til en 2 μg/ml mus IgG for å bestemme de relative bidragene til uspesifikk antigenbinding. AMPA type glutamat reseptorer ble ikke oppdaget i musklene på dette utviklingsstadiet. Antistoffkonsentrasjoner er oppført i tabell 1. For å generere disse bildene ble disse embryoene behandlet som beskrevet i denne protokollen uten noen av de valgfrie trinnene bortsett fra deyolking. Embryoene var flate montert og dekkerlipped (Figur 3B).
Dividere celler uttrykker forskjellige histone modifikasjoner fra quiescent celler som kan oppdages ved immunohistochemistry ved hjelp av antistoffer som gjenkjenner spesifikke modifikasjoner, for eksempel protein fosforylering. Fosforylering av histone 3 ved serin 10 er forbundet med celledivisjon23. Endringene som presenteres for denne protokollen for tilpasning av immunohistokjemi til seksjonert vev som er montert på lysbilder ble brukt til å oppdage spreceller i larvalsebrafiskhjernen. Frosne deler av 72 hkfembryoer ble montert på sklier og immunisert for p-H3 (figur 4). Flere celler uttrykker p-H3, og uttrykk er mest bemerkelsesverdig i ventrikulære soner. Uttrykket ble sammenlignet med ingen primære kontrollembryoer og til en 2 μg/ml mus IgG for å bestemme de relative bidragene til uspesifikk antigenbinding.
| Antistoff | Målet | Konsentrasjon |
| Kontroll av mus IgG Isotype | Ikke-spesifikke antigener | 2 μg/ml |
| Mus anti-NMDAR1 | GluN1-delenhet | 1:1,000 |
| Geit anti-mus Alexa488 | Mus IgG | 1:500 |
| mus anti-fosfor-H3 | fosforylert histone H3 | 1:500 |
| Mus Anti-pan-AMPA reseptor | GluR1-4 (Andre) | 1:500 |
Tabell 1: Liste over antistoffer og konsentrasjoner som brukes.
Figur 1: Flytskjema for hele immunhistokjemiprosedyren. Den grunnleggende arbeidsflyten av prosedyren er å avle fisk; samle inn og forberede embryoer; blokkere ikke-spesifikke antigener; inkuber i primære og sekundære antistoffer i serien; mount vev; og dokumenter. Valgfrie trinn angis med små piler på riktig punkt i arbeidsflyten. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Larver skjematiske og NMDA reseptor IHC representative resultater. Bruken av hele mount immunohistochemistry testet glutamat reseptor uttrykk i å utvikle muskel. Orienteringen og området av interesse ved 23 hkf er indikert. Ingen signaler var påviselig når primære antistoffer ikke ble inkludert. Muse-IgG-kontrollantistoffviser det lave nivået av ikke-spesifikt uttrykk. GluN1-underenheten av NMDA-type glutamatreseptoren (NMDAR) uttrykkes på tvers av muskelen som utvikler muskler, med høyere konsentrasjoner ved somittgrenser (pilspisser). AMPA-type glutamat reseptorer (AMPAR) er ikke uttrykt på dette stadiet. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Skjematisk av monteringsordninger. (A) Et embryo senket i 50% glyserol kan enkelt flyttes. (B) Et embryo som er flatmontert på et lysbilde i monteringsmediet, kan bevares og avbildet på et senere tidspunkt. (C) Et embryo montert i en dråpe på 1% agarose kan festes i posisjon for å se en vanskelig region. (D) Et embryo montert i glyserol på et brolysbilde kan rulles og flyttes. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Representative resultater av IHC i seksjonert vev. Ved hjelp av protokollendringer i de valgfrie trinnene, testet immunohistokjemi for å spre celler i sebrafisklarvalhjernen ved 72 hkf. Mouse IgG kontroll antistoff og unntatt primære antistoffer avslører et lavt nivå av ikke-spesifikt uttrykk. Som en markør for prolifererende celler uttrykkes p-H3 på diskrete steder, inkludert ventrikulære soner (pilhode). Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Immunohistochemistry er et allsidig verktøy som kan brukes til å karakterisere spatio-temporal uttrykk for nesten alle proteinav interesse i en organisme. Immunohistochemistry brukes på et bredt utvalg av vev og modellorganismer. Denne protokollen er optimalisert for bruk i sebrafisk. Immunhistokjemi i forskjellige arter kan kreve forskjellige fikserings- og håndteringsteknikker, blokkerende løsninger avhengig av arter og tilstedeværelse av endogene peroksidaer, og inkubasjonstider på grunn av tykkelsen og sammensetningen av vev. IHC i sebrafisk har vært integrert i å fremme vår forståelse av kreft24, metabolsk sykdom25, nevrologiske lidelser26, og mange andre områder av stor relevans for menneskers helse. En stor fordel for IHC er at prosedyren er relativt kort i forhold til andre teknikker som ISH og er ikke teknisk krevende. Det er imidlertid mange trinn som krever optimalisering basert på prøvealderen, antigenet blir målrettet, og antistoffene som brukes.
Varigheten av flere trinn i denne protokollen er fleksibel. Varigheter gitt for fleksible trinn som nevnt representerer minimale tider som vanligvis kreves. Generelt, når embryoer vaskes tre eller flere ganger i PBTriton, kan de holdes over natten ved 4 °C i siste vask om nødvendig. Permeabiliserings- og fikseringstidene er mindre fleksible og bør bare justeres med bevisst intensjon som en del av en feilsøkingsstrategi. Vi noterte flere punkter i protokollen som er valgfrie for å vise hvordan disse trinnene kan integreres i arbeidsflyten som er eksperimentelt relevant. For eksempel, hvis pigmentering forstyrrer signaldeteksjon, forhindre melanogensis ved PTU-behandling eller blekemiddelfaste embryoer. Bleking kan skade vev, så det må utvises forsiktighet for å minimere tiden embryoer bruker på blekemiddel. Bleking kan imidlertid foretrekke å PTU behandling, som kan påvirke visse aspekter av utvikling27,28,29,30. Vi presenterer også alternativer for fluorescerende og kromogen deteksjon. Hvis fluorescens ikke er ønsket, eller hvis antigenet produserer et signal som er for svakt til å bli tilstrekkelig oppdaget av fluorescensmikroskopi, kan kromogen deteksjon oppnås ved hjelp av en pepperrot peroksidase (HRP)-konjugert antistoff og DAB.
Den største utfordringen med IHC i sebrafisk er å finne egnede antistoffer. Faktisk brukes ISH ofte som proxy for proteinuttrykk når kommersielle antistoffer ikke er tilgjengelige for ønsket protein av interesse. Mange kommersielle antistoffer er designet for å målrette pattedyrmål og epitoper er ikke alltid bevart i sebrafisk. Når det er tilgjengelig, velg kommersielt tilgjengelige antistoffer som har blitt testet i sebrafisk. Vi har funnet ut at antistoffer som gjenkjenner antigener som er > 80% bevart mellom sebrafisk og målartene generelt fungerer i sebrafisk. Vi har også funnet ut at antistoffer som er demonstrert for å fungere hos enten fugler og/eller amfibier i tillegg til pattedyr generelt også fungerer i sebrafisk, selv når effekt i sebrafisk ikke er testet. Vanligvis er polyklonale antistoffer utviklet mot et pattedyrantigen mer sannsynlig å oppdage sebrafiskhomologer enn monoklonale antistoffer på grunn av deres lavere spesifisitet. Når du tester et nytt antistoff, er det gunstig å kjøre et positivt kontrolleksperiment ved hjelp av et kryssbundet målpeptid, pattedyrvev eller celler som er kjent for å uttrykke proteinet, eller celler som uttrykker en reporterkonstruksjon. Antistoffer kan også testes av vestlig blot for å verifisere størrelsen på målet antigen.
Mens de fleste kommersielle antistoffer gir et foreslått fortynningsområde for IHC, er det viktig å empirisk bestemme fortynningen som fungerer best. Antistoffkonsentrasjoner som er for høye, resulterer ofte i ikke-spesifikk farging og økt bakgrunn, mens for lite antistoff ikke gir et merkbart signal. Avhengig av antistoffet og antigenet, kan det være en fordel å først permeabilisere embryoene som beskrevet i trinn 3.2 ovenfor, men dette trinnet kan ikke være nødvendig, og i noen tilfeller kan det føre til redusert signal. Denne protokollen bruker Triton-X-100 som et vaskemiddel som permeabilizes celler, som kan være tilstrekkelig for tynt vev eller overfladisk uttrykk. Dypt eller tykt vev, som dype hjerneregioner eller eldre larver, kan kreve proteinase permeabilisering. Omvendt bør Triton-X-100 utelukkes fra alle trinn når immunstaining bare proteiner på celleoverflaten er ønsket over merking intracellulære proteiner. Varigheten av blokkeringstrinnet samt valget av en kommersiell blokkeringsløsning kontra bruk av serum og BSA kan også justeres for å korrigere for antistofffølsomhet og bakgrunnsfarging. Høye konsentrasjoner av serum som brukes i blokkering (10 % i denne protokollen) kan redusere bakgrunnsfarging, men bør fortynnes når antistoffet er tilstede for å minimere maskeringav antistoffbindingssteder. Plantebaserte blokkeringsløsninger kan være gunstige hvis bakgrunnssignalet er konsekvent høyt, selv ved lave antistofffortynninger (<1:1000). Til slutt kan følsomheten finjusteres av strengeren til vaskene. Det kan være nødvendig å øke eller redusere varigheten av trinnene for vasking etter antistoff, samt justere mengden Triton-X-100 i PBTriton. Typiske arbeidsområder av PBTriton span 0,2% til 1,0% Triton-X-100. Det er god praksis når du bruker et nytt antistoff for å flekke negative kontrollembryoer med primær IgG og merkede sekundære antistoffer for å bestemme antistoffspesifisitet og identifisere potensielle falske positive signaler.
Hvis antistoffoptimalisering ikke gir et positivt signal, kan det skyldes den fikserende maskeringen av antigenet. Vanligvis maskerer fiksering i 4% PFA ikke antigenområder for å forhindre antistoffbinding, selv om antigenmaskering av og til forekommer med noen antistoffer. Antigen gjenfinning kan føre til skade på embryoet, men en arbeidsprotokoll er beskrevet av Inoue og Wittbrodt31. Alternativt, hvis det valgte antistoffet er uforenlig med 4% PFA eller hvis PFA resulterer i cellulære morfologiendringer, kan metanol, 2% trikloreddiksyre eller glyoaxal brukes til å fikse prøvene27. Kompatibilitet av et antistoff med formaldehyd fiksering må bestemmes empirisk. Hvis et positivt kontrollsignal ikke kan oppnås etter PFA-fiksering, kan det være verdt å prøve et alternativt fikseringsmiddel som metanol. Alternative fikseringsprotokoller kan også være nødvendige for primære antistoffer som ble reist mot konjugerte antigener (som GABA-BSA).
Det finnes flere effektive alternativer for montering av immunfargede sebrafiskembryoer for bildebehandling. Embryoer kan overføres til en Petri-tallerken med glyserol, plassert med pinner eller tang, og avbildet enten med et bredt feltsyn ovenfra eller nedenfra gjennom bildet gjennom parabolen med et invertert mikroskop (Figur 3A). Denne metoden er enkel, rask og midlertidig. Ulemper inkluderer tilbøyelighet til embryoer å rulle ut av fokus i væsken glyserol, potensielle refleksjoner av overflaten av glyserol i parabolen, og vanskeligheten med å forestille seg gjennom den tykke parabolen. Embryoer kan monteres flatt på glasssidene (figur 3B) med monteringsmedium, dekkslips og neglelakk. Disse brakettene kan ses på et oppreist eller invertert mikroskop. Embryoer utarbeidet på denne måten kan tilberedes på forhånd og lysbildene som er lagret ved 4 °C til bildebehandling eller kan lagres og reimaged senere. Dette kan være spesielt fordelaktig når bildetiden er begrenset. Ulempene med denne braketten inkluderer de begrensede alternativene for embryoposisjon og vevtykkelse, og manglende evne til å omplassere eller gjenopprette embryoer. Embryoer montert på denne måten trenger ofte deyolking, da eggeplommer granulat er autofluorescerende i de fleste brukte fluorescenskanaler og kan ikke flyttes eller fjernes etter montering. Når interesseområdet krever vanskelig posisjonering av embryoet, kan det være mest fordelaktig å montere embryoene i 1% oppsto på et dekselglass (Figur 3C). Embryoet kan holdes på plass med insektpinner med interesseområdet nærmest dekkglasset til agarose avkjøles. Agarose vil holde embryoet i posisjon uten at embryoet ruller i minst flere minutter. Agarose montering er best for invertert mikroskoper, selv om omslagsglasset kan invertere nøye for bruk på et oppreist mikroskop. Denne braketten kan være tidkrevende og embryoer er vanligvis ikke repositionable eller gjenopprettes. Montering av embryoer på brolysbilder (Figur 3D) tilbyr noe av et kompromiss mellom disse metodene. Den brolagte braketten er rask, og embryoer kan flyttes og gjenopprettes. Høyden på broen kan tillate større fleksibilitet i vevtykkelse og embryoposisjon enn flate fester, samtidig som evnen til å bilde ovenfra eller under opprettholdes. Denne metoden krever klargjøring av de brolagte lysbildene på forhånd. Tykkelsen på vevet som skal monteres dikterer hvor mange dekkslepper høyt broen må være. Brolagte lysbilder kan gjenbrukes flere ganger i én dag, men bør kastes etter bildeøkten fordi glyserolen er vanskelig å rense av lysbildene, og det vil sakte løsne limet som holder broen.
IHC er en effektiv metode for å bestemme tidspunktet og mønsteret av proteinuttrykk i en organisme eller vev. IHC har flere fordeler fremfor ISH i det er relativt lave kostnader og kan fullføres på en brøkdel av tiden som vanligvis er nødvendig for ISH (2-3 dager versus 5-8 dager). I tillegg er IHC en bedre indikator på genproduktuttrykk som påvisning av mRNA-nivåer forutsier ikke posttranskripsjonelle og posttranstransleringsprosesser som kan påvirke proteinuttrykk. IHC er også i stand til å gi subcellulære lokaliseringsdata (selv om dette ikke er sant når du bruker DAB-farging), som ikke gis av ISH. Det er mulig å utføre en dobbel ISH / IHC i sebrafisk.
IHC har også noen ulemper, fremst blant dem er antistoff tilgjengelighet. Mens det er mange antistoffer tilgjengelig som er av egnet kvalitet for IHC, finne antistoffer som spesifikt fungerer i sebrafisk er mer utfordrende og ofte krever testing og feilsøking antistoffer generert mot pattedyr antigener. Det er imidlertid økende antall sebrafiskvaliderte antistoffer på markedet, og fremveksten av CRISPR/Cas9-teknologi har gjort det mulig å epitope tag endogene proteiner gjennom genomteknikk. Disse prosessene er tidkrevende og utfordrende, men, og krever validering av proteinfunksjon.
Protokollen som er beskrevet i denne rapporten, kan brukes bredt på sebrafiskembryoer og larver på ethvert stadium og kan også brukes på vev fra voksne dyr. I tillegg tillater denne protokollen også farging av frosne eller parafinseksjonerte prøver med liten modifikasjon. Hele mount immunohistochemistry ble brukt til å undersøke nevrotransmitter reseptor populasjoner i muskel, avslørende uttrykk for ionotropisk NMDA glutamat reseptor obligatorisk subunit 1 i å utvikle sebrafisk muskel. Denne ganske utbredte og diffuse farging over utviklingsmuskelen er i samsvar med utviklingsuttrykket til samme reseptorunderenhet i å utvikle Xenopus larver21. Dette tyder på at uttrykket av glutamat reseptorer i å utvikle muskel er evolusjonært bevart. Til sammen er denne protokollen verdifull for å få en bedre forståelse av genuttrykk gjennom bruk av IHC og gir et kraftig verktøy for å bestemme spatio-temporal fordeling av proteinuttrykk i sebrafisk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen informasjon å avsløre.
Acknowledgments
Støtte fra NIH bevilge 8P20GM103436 14.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-100 | |
| Aluminum foil, heavy duty | Kirkland | Any brand may be substituted | |
| Anti-NMDA antibody | Millipore Sigma | MAB363 | |
| Anti-phospho-Histone H3 (Ser10), clone RR002 | Millipore Sigma | 05-598 | |
| Anti-pan-AMPA receptor (GluR1-4) | Millipore Sigma | MABN832 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Calcium Nitrate [Ca(NO3)2] | Sigma Aldrich | C4955 | |
| Centrifuge tubes, 1.5 mL | Axygen | MCT150C | |
| Clear nail polish | Sally Hanson | Any nail polish or hardener may be subsituted | |
| Depression (concavity) slide | Electron Miscroscopy Sciences | 71878-01 | |
| Diaminobenzidine | Thermo Scientific | 1855920 | |
| Embryo medium, Danieau, 30% | 17.4 mM NaCl, 0.21 mM KCl, 0.12 mM MgS04, 0.18 mM Ca(NO3)2, 1.5 mM HEPES in ultrapure water. | ||
| Embryo medium, E2 | 7.5 mM NaCl, 0.25 mM KCl, 0.5 mM MgSO4, 75 μM KH2PO4, 25 uM Na2HPO4, 0.5 mM CaCl2, 0.35 mM NaHCO3, 0.5 mg/L methylene blue | ||
| Floating tube holder | Thermo Scientific | 59744015 | |
| Fluorescence compound microscope | Leica Biosystems | DMi8 | |
| Fluorescence stereomicroscope | Leica Biosystems | M165-FC | |
| Glass coverslips 18 mm x 18 mm | Corning | 284518 | |
| Glass coverslips 22 mm x 60 mm | Thermo Scientific | 22-050-222 | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Goat anti-mouse IgG Alexa 488 | Invitrogen | A11001 | |
| HEPES solution | Sigma Aldrich | H0887 | |
| Humid chamber with lid | Simport | M920-2 | |
| Hydrogen peroxide, 30% | Fisher Scientific | H325-500 | |
| Immunedge pap pen | Vector labs | H-4000 | |
| Insect pins, size 00 | Stoelting | 5213323 | |
| Magnesium Sulfate (MgSO4 · 7H2O) | Sigma Aldrich | 63138 | |
| Mesh strainer | Oneida | Any brand may be substituted | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 34860 | |
| Methylene blue | Sigma Aldrich | M9140 | |
| Micro-tube cap lock | Research Products International | 145062 | |
| Microwave oven | Toastmaster | ||
| Mouse IgG | Sigma Aldrich | I8765 | |
| Normal goat serum | Millipore Sigma | S02L1ML | |
| Nutating mixer | Fisher Scientific | 88-861-044 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 04042-500 | |
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| PBTriton | 1% TritonX-100 in 1x PBS | ||
| Permount mounting medium | Fisher Chemical | SP15-500 | |
| Petri dish (glass) | Pyrex | 3160100 | |
| Petri dish (plastic) | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| 1-phenyl 2-thiourea | Acros Organics | 207250250 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), 10x, pH 7.4 | Gibco | 70011-044 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), 1x | 1x made from 10x stock diluted in dH2O | ||
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma Aldrich | P9333 | |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Fisher | P250-500 | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Sigma Aldrich | P5655 | |
| Pronase | Sigma Aldrich | 10165921001 | |
| Proteinase K | Invitrogen | AM2544 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | S7653 | |
| Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | Sigma Aldrich | S7907 | |
| Spawning tank with lid and insert | Aquaneering | ZHCT100 | |
| SuperBlock PBS | Thermo Scientific | 37515 | |
| Superfrost + slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Superglue gel | 3M Scotch | ||
| TNT | 100 mM Tris, pH 8.0; 150 mM NaCl; 0.1% Tween20; made in dH2O | ||
| Transfer pipette | Fisher | 13-711-7M | |
| Trichloracetic Acid (Cl3CCOOH) | Sigma Aldrich | T6399 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | S374-500 | |
| TritonX-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| Tween20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Ultrafine forceps | Fisher Scientific | 16-100-121 | |
| Water, ultrapure/double distilled | Fisher Scientific | W2-20 |
References
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish. Nature Genetics. 26 (2), 216-220 (2000).
- Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. 3rd ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in Biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).
- Irion, U., Krauss, J., Nusslein-Volhard, C. Precise and efficient genome editing in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system. Development. 141 (24), 4827-4830 (2014).
- van der Ploeg, M. Cytochemical nucleic acid research during the twentieth century. European Journal of Histochemistry. 44 (1), 7-42 (2000).
- Marrack, J. Nature of Antibodies. Nature. 133 (3356), 292-293 (1934).
- Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).
- Lopez, M. E. Combined in situ Hybridization/Immunohistochemistry (ISH/IH) on Free-floating Vibratome Tissue Sections. Bio-protocol. 4 (18), (2014).
- Morimoto, M., Morita, N., Ozawa, H., Yokoyama, K., Kawata, M. Distribution of glucocorticoid receptor immunoreactivity and mRNA in the rat brain: an immunohistochemical and in situ hybridization study. Neuroscience Research. 26 (3), 235-269 (1996).
- Newton, S. S., Dow, A., Terwilliger, R., Duman, R. A simplified method for combined immunohistochemistry and in-situ hybridization in fresh-frozen, cryocut mouse brain sections. Brain Research Protocols. 9 (3), 214-219 (2002).
- Corthell, J. T. Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls. Corthell, J. T. , Academic Press. 105-111 (2014).
- Corthell, J. T. Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls. Corthell, J. T. , Academic Press. 91-103 (2014).
- Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nature Reviews Genetics. 13 (4), 227-232 (2012).
- Semache, M., Ghislain, J., Zarrouki, B., Tremblay, C., Poitout, V. Pancreatic and duodenal homeobox-1 nuclear localization is regulated by glucose in dispersed rat islets but not in insulin-secreting cell lines. Islets. 6 (4), e982376 (2014).
- Kang, H. S., Beak, J. Y., Kim, Y. S., Herbert, R., Jetten, A. M. Glis3 is associated with primary cilia and Wwtr1/TAZ and implicated in polycystic kidney disease. Molecular and Cellular Biology. 29 (10), 2556-2569 (2009).
- Billova, S., Galanopoulou, A. S., Seidah, N. G., Qiu, X., Kumar, U. Immunohistochemical expression and colocalization of somatostatin, carboxypeptidase-E and prohormone convertases 1 and 2 in rat brain. Neuroscience. 147 (2), 403-418 (2007).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , University of Oregon Press. (2000).
- Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish: A Practical Approach. , Oxford University Press. (2002).
- Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. Flat mount preparation for observation and analysis of zebrafish embryo specimens stained by whole mount in situ hybridization. Journal of Visualized Experiments. (89), (2014).
- Brennan, C., Mangoli, M., Dyer, C. E. F., Ashworth, R. Acetylcholine and calcium signalling regulates muscle fibre formation in the zebrafish embryo. Journal of Cell Science. 118 (22), 5181 (2005).
- Liu, D. W., Westerfield, M. Clustering of muscle acetylcholine receptors requires motoneurons in live embryos, but not in cell culture. The Journal of Neuroscience. 12 (5), 1859 (1992).
- Borodinsky, L. N., Spitzer, N. C. Activity-dependent neurotransmitter-receptor matching at the neuromuscular junction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (1), 335-340 (2007).
- Brunelli, G., et al. Glutamatergic reinnervation through peripheral nerve graft dictates assembly of glutamatergic synapses at rat skeletal muscle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (24), 8752-8757 (2005).
- Hans, F., Dimitrov, S. Histone H3 phosphorylation and cell division. Oncogene. 20 (24), 3021-3027 (2001).
- Yee, N. S., Pack, M. Zebrafish as a model for pancreatic cancer research. Methods in Molecular Medicine. 103, 273-298 (2005).
- Seth, A., Stemple, D. L., Barroso, I. The emerging use of zebrafish to model metabolic disease. Disease Models & Mechanisms. 6 (5), 1080-1088 (2013).
- Fontana, B. D., Mezzomo, N. J., Kalueff, A. V., Rosemberg, D. B. The developing utility of zebrafish models of neurological and neuropsychiatric disorders: A critical review. Experimental Neurology. 299 (Pt A), 157-171 (2018).
- Richter, K. N., et al. Glyoxal as an alternative fixative to formaldehyde in immunostaining and super-resolution microscopy. The EMBO journal. 37 (1), 139-159 (2018).
- Elsalini, O. A., Rohr, K. B. Phenylthiourea disrupts thyroid function in developing zebrafish. Development genes and evolution. 212 (12), 593-598 (2003).
- Wang, W. D., Wang, Y., Wen, H. J., Buhler, D. R., Hu, C. H. Phenylthiourea as a weak activator of aryl hydrocarbon receptor inhibiting 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin-induced CYP1A1 transcription in zebrafish embryo. Biochemical pharmacology. 68 (1), 63-71 (2004).
- Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and IGF signaling. PloS one. 6 (8), e22991 (2011).
- Inoue, D., Wittbrodt, J. One for all--a highly efficient and versatile method for fluorescent immunostaining in fish embryos. PLoS One. 6 (5), e19713 (2011).
