Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para detecção de proteínas mediadas por anticorpos fluorescentes em preparações inteiras de embriões e larvas de zebrafish.
Abstract
A imunohistoquímica é uma técnica amplamente utilizada para explorar a expressão e localização de proteínas durante os estados normais de desenvolvimento e doenças. Embora muitos protocolos de imunohistoquímica tenham sido otimizados para seções de tecido e tecido mamíferos, esses protocolos muitas vezes requerem modificação e otimização para organismos modelos não mamíferos. Os zebrafish são cada vez mais utilizados como um sistema modelo em pesquisas básicas, biomédicas e translacionais para investigar os mecanismos biológicos moleculares, genéticos e celulares dos processos de desenvolvimento. Os zebrafish oferecem muitas vantagens como um sistema modelo, mas também exigem técnicas modificadas para detecção ideal de proteínas. Aqui, fornecemos nosso protocolo de imunohistoquímica de fluorescência em embriões e larvas de zebrafish. Este protocolo descreve além várias diferentes estratégias de montagem que podem ser empregadas e uma visão geral das vantagens e desvantagens que cada estratégia proporciona. Também descrevemos modificações neste protocolo para permitir a detecção de substratos cromosgênicos em tecido de montagem inteiro e detecção de fluorescência no tecido larval seccional. Este protocolo é amplamente aplicável ao estudo de muitas etapas de desenvolvimento e estruturas embrionárias.
Introduction
O zebrafish (Danio rerio) emergiu como um modelo poderoso para o estudo de processos biológicos por várias razões, incluindo curto tempo de geração, desenvolvimento rápido e comodidade às técnicas genéticas. Como resultado, os zebrafish são comumente usados em telas de moléculas pequenas de alto nível para pesquisa toxicológica e descoberta de drogas. Os zebrafish também são um modelo atraente para o estudo dos processos de desenvolvimento, dado que uma única fêmea pode produzir rotineiramente 50-300 ovos por vez e os embriões opticamente claros desenvolvem-se externamente permitindo uma visualização eficiente dos processos de desenvolvimento. No entanto, as primeiras pesquisas se basearam principalmente em telas genéticas avançadas usando N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) ou outras mutagens devido a desafios no estabelecimento de técnicas genéticas reversas. Cerca de duas décadas atrás, morfinas foram usadas pela primeira vez em zebrafish para derrubargenes1 . Morfinas são pequenos oligonucleotídeos antisenseque inibem a tradução do alvo mRNA após microinjeção em um embrião em um estágio inicial de desenvolvimento. Uma grande fraqueza dos morfolinos é que eles são diluídos à medida que as células se dividem e geralmente perdem eficácia por 72 horas após a fertilização (hpf). Enquanto morfinanos continuam sendo uma ferramenta poderosa para a interrupção do gene zebrafish, os núcleos eficazes ou causadors de transcrição (TALENs), núcleos de zinco-finger (ZFNs) e repetos curtos e regularmente interespaçados (CRISPRs) estão sendo usados mais recentemente para atingir diretamente o genoma do zebrafish2,3. Essas estratégias genéticas reversas, combinadas com a genética avançada e telas de alto nível, estabeleceram o zebrafish como um modelo poderoso para estudar a expressão genética e a função.
A capacidade de estudar a função genética geralmente requer uma avaliação da distribuição spatio-temporal da expressão do produto genético ou genético. As duas técnicas mais utilizadas para visualizar tais padrões de expressão durante o desenvolvimento precoce estão na hibridização situ (ISH) e toda a imunohistoquímica do monte (IHC). No situ a hibridização foi desenvolvida pela primeira vez em 1969 e conta com o uso de sondas de RNA antisense rotuladas para detectar a expressão mRNA em um organismo4. Em contraste, anticorpos rotulados são usados na imunohistoquímica para visualizar a expressão proteica. A ideia de rotular proteínas para detecção remonta aosanos 5 da década de 1930 e o primeiro experimento iHC foi publicado em 1941, quando anticorpos rotulados pela FITC foram usados para detectar bactérias patogênicas em tecidos infectados6. Ish e IHC evoluíram e melhoraram significativamente nas décadas seguintes e agora são utilizados rotineiramente no laboratório de pesquisa molecular e diagnóstico7,8,9,10,11. Embora ambas as técnicas tenham vantagens e desvantagens, o IHC oferece vários benefícios sobre o ISH. Na prática, o IHC é muito menos demorado do que o ISH e geralmente é menos caro dependendo do custo do anticorpo primário. Além disso, a expressão mRNA nem sempre é uma métrica confiável de expressão proteica como tem sido demonstrado em camundongos e humanos que apenas cerca de um terço da variação de abundância de proteínas pode ser explicada pela abundância mRNA12. Por essa razão, o IHC é um suplemento importante para confirmar os dados ish, quando possível. Finalmente, o IHC pode fornecer dados subcelulares e de colocalização que não podem ser determinados pelo ISH13,14,15. Aqui, descrevemos um método passo a passo para detectar de forma confiável proteínas por imunohistoquímica em embriões e larvas de zebrafish de monte inteiro. O objetivo desta técnica é determinar a expressão espacial e temporal de uma proteína de interesse em todo o embrião. Esta tecnologia utiliza anticorpos primários específicos de antígenos e anticorpos secundários fluorescentes marcados. O protocolo é prontamente adaptável para usar em seções de tecido montados em slides e para uso com substratos cromosgênicos em vez de fluorescência. Usando este protocolo, demonstramos que o desenvolvimento de músculos esqueléticos de zebrafish expressa receptores glutamato ionotrópicos, além de receptores de acetilcolina. Subunidades receptoras glutamato do tipo NMDA são detectáveis no músculo longitudinal a 23 hpf.
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Protocol
Os procedimentos para trabalhar com adultos e embriões de criação de zebrafish descritos neste protocolo foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Estadual murray.
1. Coleta e Fixação de Embriões
- Prepare tanques de desova colocando pares sexuais mistos de zebrafish adultos ou grupos em tanques com uma malha ou forro ranhurado cheio de água do sistema durante a noite.
- Nas luzes acesas, troque a água do tanque de desova para água do sistema fresco para remover fezes. Use um ciclo escuro claro de 14 h/10 h com luzes acesas às 9h.
- Uma vez que os ovos são colocados, devolva os adultos para tanques domésticos.
- Colete ovos desenhando-os usando um pipet de transferência ou despejando-os em um filtro de malha.
- Transfira os ovos para pratos petri preenchidos no meio do caminho com meio embrião (como 30% danieau ou e2 meio embrião com 0,5 mg/L azul metileno), limitando o número de embriões por prato a 50.
- Remova todos os ovos que estejam mortos ou não se dividam.
NOTA: Embriões mortos podem ser facilmente identificados à medida que se tornam opacos e muitas vezes parecem "nublados". Se o azul metileno for adicionado ao meio embrionário, os embriões mortos assumem uma aparência azul escura. - Incubar pratos de ovos a 28,5 °C até chegarem ao estágio desejado. Para este experimento, levante os embriões até 23 hpf.
- Opcional) Transfira os embriões em 24 hpf para 200 μM 1-phenyl 2-thiourea (UPt) em meio embrionário para evitar a melagênese16,17. Alternativamente, embriões alvejantes pós-fixação (ver seção 5 opcional).
- Troque o meio embrião ou o PTU médio diariamente.
- Embriões decorionados sem eclosão usando fórceps ultra-finas um estereótipo. Alternativamente, embriões quimicamente dechorionatos incubando em 1 mg/mL Pronase em meio embrião por vários minutos à temperatura ambiente. Remova os embriões da Pronase e lave três vezes com meio embrião.
- Embriões descorados vão ficar com plástico. Mantenha-os em pratos de petri de vidro ou plástico revestidos com 1-2% de agarose dissolvida em meio embrião. Mova embriões descoionados usando tubos pasteur polidos pelo fogo para minimizar os danos.
- Transfira os embriões para tubos centrífugas de 1,5 mL usando um tubo de plástico ou polido de fogo.
- Remova o meio embrião com uma micropipeta. Deixe apenas líquido suficiente para cobrir os embriões após cada mudança de fluido.
- Prepare 4% de paraformaldeído (PFA) em 1x soro-tampão de fosfato (PBS) em um capô de fume químico.
ATENÇÃO: PfA é um material perigoso. Use luvas e descarte líquidos e sólidos contaminados em áreas designadas. - Conserte os embriões em 4% pfa para 1-2 h com balanço suave à temperatura ambiente. Alternativamente, conserte os embriões de 4h a noite a 4°C.
- Lave três vezes em 1x PBS + 1% Triton-X (PBTriton) por 5 min.
- Use os embriões imediatamente ou armazene a 4 °C por até 1 semana.
- Para armazenamento a longo prazo, desidratar os embriões em 100% de metanol (MeOH) 2 h ou durante a noite a -20 °C. Guarde os embriões a -20 °C no MeOH por vários meses.
CUIDADO: MeOH é um material perigoso. Use luvas e descarte líquidos e sólidos contaminados em áreas designadas.
2. Preparação de embriões
- Reidrate os embriões através de incubações em série à temperatura ambiente.
- Incubar em 75% MeOH/25% 1x PBS por 5 min, balançando.
- Incubar em 50% MeOH/50% 1x PBS por 5 min, balançando.
- Incubar em 25% MeOH/75% 1x PBS por 5 min, balançando.
- Incubar 100% PBTriton por 5 min, balançando.
- (Opcional) Prepare uma solução de trabalho de proteína k fresca (10 μg/mL em PBTriton) no gelo adicionando 10 μL de estoque de proteinase k recém-descongelado (10 mg/mL).
- Permeabilizar os embriões digerindo até 30 min em Proteinase K.
NOTA: O tempo sugerido é <24 hpf: sem digestão; 24 hpf: 15 min digestão; e 7 dias de idade: 30 min digestão. - Enxágüe embriões permeabilizados em PBTriton e refixação em 4% pfa por 20 min à temperatura ambiente.
- Lave os embriões três vezes em PBTriton por 5 min à temperatura ambiente com balanço suave.
- Permeabilizar os embriões digerindo até 30 min em Proteinase K.
3. Incubação primária de anticorpos
- Selecione uma solução de bloqueio comercial ou soro correspondente à espécie de hospedeiro de anticorpos secundários (ex. 10% soro de cabra em PBTriton) com ou sem 2 mg/mL Bovine Serum Albumin (BSA).
- Bloqueie os embriões na solução de bloqueio por 1-3 h à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 °C enquanto balança.
- Incubar em anticorpo primário diluído na solução de bloqueio ou 1% de soro em PBTriton durante a noite a 4 °C enquanto balançava. Neste experimento, os principais anticorpos utilizados foram anti-NMDAR1, receptor anti-pan-AMPA e anti-fosfor-Histone H3, cada um diluído para uma concentração final de 1:500 em 1% de soro de cabra em PBTriton.
- Lave cinco vezes em PBTriton por 10 minutos à temperatura ambiente enquanto balança.
4. Incubação de anticorpos secundários
- Selecione um anticorpo secundário baseado na espécie hospedeira do anticorpo primário e no comprimento de onda desejado.
- Incubar em anticorpo secundário diluído na solução de bloqueio ou 1% de soro por 2 h à temperatura ambiente (ou durante a noite a 4 °C) enquanto balançava.
NOTA: Anticorpos secundários fluorescentes são sensíveis à luz. Usamos 1:500 cabra-anti-rato Alexa488 diluído em 1% de soro de cabra em PBTriton. - Cubra os tubos com papel alumínio ou tampa com uma caixa de bloqueio leve para esta e todas as etapas subsequentes.
- Lave três vezes em PBTriton por 10 min à temperatura ambiente enquanto balança.
- Transfira os embriões para uma solução de glicerol de 50% na PBS sobre um leito de 2% de agarose em meio embrião e prossiga para a documentação ou prossiga para novas etapas de processamento abaixo.
Etapas opcionais
5. Branqueamento
- Prepare a solução alvejante em um tubo de 1,5 mL adicionando 810,7 μL de ddH2O, 89,3 μL de 2 M KOH e 100 μL de 30% H2O2.
- Inverta o tubo três vezes para misturar.
- Pipette 1 mL de direção de solução alvejante para os embriões.
- Abra a tampa do tubo de embrião para permitir que o gás escape. Bata suavemente o tubo no banco para desalojar bolhas.
- Monitore o processo de branqueamento (use um microscópio, se necessário) e pare a reação quando o pigmento for suficientemente removido (aproximadamente 5 min para 24 hpf ou 10 min para 72 hpf).
- Remova cuidadosamente a solução de branqueamento com uma micropipeta e enxágue embriões três vezes em 1 mL de PBTriton.
NOTA: Os embriões são pegajosos nesta etapa. - Proceda para documentação ou mais etapas de processamento abaixo.
6. Dissecção embrionária e gema
- Para remover a gema, transfira uma pequena quantidade (~200 μL ou suficiente para cobrir completamente o embrião, mas restritiva o suficiente para limitar onde ele pode flutuar) de 1x PBS para um slide de depressão ou um escorregador de vidro simples.
- Use um tubo de transferência de plástico para mover 1 ou mais embriões para a gotícula PBS.
- Use fórceps ultrafinos e 00 pinos de inseto para quebrar a gema e raspar muito suavemente grânulos de gema da superfície ventral do embrião (veja também Cheng et al., 2014)18.
- Retire os grânulos de gema e reponha o PBS conforme necessário.
- Repita até que o embrião esteja suficientemente livre de gema.
7. Montagem plana em slides
- Transfira embriões deyolked para um slide de vidro carregado com uma pipeta de plástico ou uma micropipeta de 1 mL com uma ponta aparada (para reduzir o estresse da cisalhamento). Oriente como desejado com uma ponta de micropipette de 200 μL ou pino de inseto.
- Afaste o excesso de PBS com um lenço de Kim ou toalha de papel.
- Adicione 2-3 gotas de mídia de montagem ao slide e deslizamento de cobertura.
- O ar seco por aproximadamente 5 a 10 min.
- Sele o vidro da tampa no escorregador com esmalte claro.
NOTA: As bordas do vidro da tampa devem ser completamente cobertas com uma fina camada contínua de esmalte. - Deixe secar aproximadamente 10 min antes da imagem.
8. Montagem em Agarose
- Prepare 1% de agarose em meio de embrião adicionando 0,5 g de agarose a 50 mL de meio embrião em um frasco ou béquer seguro de micro-ondas de pelo menos 3x volume maior do que o desejado.
- Aqueça em um micro-ondas, girando a cada 30 s, até que a garose seja completamente dissolvida.
- Faça 1 mL alíquotas em tubos centrífugas de 1,5 mL. Guarde as alíquotas à temperatura ambiente.
- Cubra as tampas do tubo com tampas antes de aquecer.
- Coloque tubos de agarose em um suporte de tubo flutuante em um béquer meio cheio de água.
- Micro-ondas o béquer com tubos flutuantes por 2-3 min, ou até que a garose seja completamente derretida.
- Transfira um embrião para o slide ponteado com uma pipeta de plástico ou uma micropipeta de 200 μL com uma ponta aparada (para reduzir o estresse da cisalhamento).
- Posicione o embrião em um deslizamento de cobertura retangular usando pinos de inseto e adicione aproximadamente 20 μL de agarose derretida diretamente ao embrião.
- Oriente rapidamente a região de interesse mais próxima do deslizamento de cobertura usando 00 pinos de inseto.
NOTA: Este é um suporte de cabeça para baixo. - Devolva o tubo de agarose para o tubo de água quente flutuar entre cada uso e micro-ondas conforme necessário.
- Imagem usando um microscópio quando a agarose endurece. Mantenha o embrião montado de cabeça para baixo para uso em um microscópio invertido. Vire o deslizamento de cobertura (assim a agarose está o deslizamento de cobertura) para uso em microscópios eretos.
9. Montagem em Slides Bridged
- Para fazer slides de ponte, cole tampas quadradas no escorregador de vidro usando um pequeno pontilhado de supercola.
NOTA: Deve haver um cocho de pelo menos 5 mm de largura entre os deslizamentos de cobertura. Dois #1 deslizamentos de cobertura são tipicamente apropriados para embriões de 24-48 hpf, enquanto três deslizamentos de cobertura de altura podem ser necessários para 72 hpf. - Transfira 1-2 embriões desyolked para o slide pontecom uma pipeta de plástico ou uma micropipeta de 200 μL com uma ponta aparada (para reduzir o estresse da cisalhamento).
- Afaste o excesso de fluido com um lenço de Kim ou toalha de papel.
- Adicione uma gota de ≥80% de glicerol diretamente ao embrião.
- Cubra com um vidro de cobertura retangular. A gota do glicerol deve tocar no vidro da tampa.
- Adicione mais glicerol ao espaço entre o vidro da tampa e deslize conforme necessário para cobrir completamente o embrião com uma margem de glicerol nas laterais do embrião.
- Deslize o vidro da tampa retangular suavemente para enrolar o embrião em posição para imagem.
10. Coloração DAB
NOTA: Esta seção começa após a etapa 4.2 acima e substitui o resto da etapa 4.
- Incubar os embriões em uma solução de bloqueio com um anticorpo secundário conjugado peroxidase por 2 h à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 °C enquanto balança.
- Lave três vezes em PBTriton por 10 min à temperatura ambiente.
- Transfira os embriões para uma placa de cultura ou deslizamento de depressão com uma pipeta de transferência.
- Misture 50 μL de 1% DAB (3,3'-diaminobenzidina) dissolvido no DDH2O e 50 μL de 0,3% de peróxido de hidrogênio e leve a 1 mL com PBS.
CUIDADO: DAB é um material perigoso. Use luvas e descarte de líquidos e sólidos contaminados da DAB em áreas designadas. - Cubra embriões manchados de HRP com a solução DAB preparada acima e monitore o desenvolvimento de cores (tipicamente 1-5 min) um microscópio.
- Depois de atingir o nível desejado de desenvolvimento de cores, enxágue os embriões brevemente na PBS.
- Transfira os embriões de volta para um tubo de 1,5 mL antes da fixação.
- Refixar os embriões por 15-20 min em 4% de PFA em temperatura ambiente.
- Lave os embriões três vezes em PBTriton por 5 min.
- Proceda para a documentação.
11. Protocolo modificado para tecido seccionado de manchas que é montado em slides
- Tecido de cerca para ser manchado com uma caneta pap.
- Transfira os slides para uma câmara úmida.
- Adicione 1 mL de PBS diretamente ao slide.
- Incubar 7 min à temperatura ambiente para remover o meio de incorporação.
- Despeje o PBS invertendo slide.
- Reidratar 1 min em até 1 mL de tampão TNT (100 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl, 0,1% Tween20).
- Bloqueie em até 1 mL de solução de bloqueio (comercial ou 10% soro + 2% BSA) por 1 h à temperatura ambiente.
- Incubar durante a noite em anticorpo primário diluído em 1% soro ou solução de bloqueio a 4 °C.
- Lave cinco vezes em até 1 mL de tampão TNT à temperatura ambiente.
- Incubar em anticorpo secundário por 2h à temperatura ambiente ou durante a noite a 4°C. Cubra a câmara com papel alumínio ou use uma tampa escura.
- Lave cinco vezes em TNT à temperatura ambiente. Despeje a última lavagem.
- Montar com 2-3 gotas de montagem média e tampa. Vamos sentar 5-10 min.
- Sele o vidro da tampa no escorregador usando esmalte claro. Deixe secar completamente antes da imagem.
12. Documentação
- Registre o procedimento completo e quaisquer desvios em um caderno de laboratório.
- Registre a concentração, nome, número do catálogo, fabricante e número de lote do anticorpo primário.
- Coloque a amostra apropriadamente montada no palco do microscópio. Localize a região de interesse.
- Selecione um exemplo relativamente brilhante. Defina a exposição da câmera e ganhe para que o sinal seja suficientemente brilhante sem saturar.
- Compare a intensidade de coloração da mesma região de interesse usando os mesmos ajustes de exposição quando comparar entre embriões experimentais rotulados por anticorpos e anticorpos de controle (ex. IgG).
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Representative Results
Toda a imunohistoquímica da montagem usa anticorpos para detectar o padrão espacial de expressão proteica no animal intacto. O fluxo básico de imunohistoquímica (retratado na Figura 1) envolve a criação de zebrafish, criação e preparação de embriões, bloqueio de antígenos não específicos, o uso de um anticorpo primário específico para antígenos para atingir a proteína de interesse, detectando esse anticorpo primário com um anticorpo secundário rotulado, montando o espécime e documentando expressão.
Toda a imunohistoquímica do monte é uma ferramenta valiosa para o estudo da expressão de proteína espacial e temporal durante o desenvolvimento de zebrafish. Zebrafish exibem contrações espontâneas mediadas por cruzamentos de lacunas a partir de 19 hpf - antes do contato com o neurônio motor19. A junção neuromuscular de zebrafish, como outros vertebrados, é mediada pela acetilcolina agindo em receptores de acetilcolina nicotina. Esses receptores montados são detectados pela primeira vez a aproximadamente 16 hpf e a expressão se expande e remodela à medida que os neurônios formam contatos20. Estudos em sapos21 e22 sugerem que o músculo esquelético dos vertebrados também pode expressar receptores ionotrópicos glutamato. Toda a imunohistoquímica de montagem para a subunidade GluN1 do receptor glutamato do tipo NMDA revela expressão de subunidades receptoras glutamato em todo o desenvolvimento de músculo zebrafish a 23 hpf(Figura 2). Isso corresponde aproximadamente ao tempo da inervação do neurônio motor. A expressão foi comparada a nenhum embrião de controle primário para determinar a fluorescência de fundo do peixe e do anticorpo secundário e a um IgG de 2 μg/mL para determinar as contribuições relativas da ligação antigen inespecífica. Receptores glutamato tipo AMPA não foram detectados nos músculos nesta fase de desenvolvimento. As concentrações de anticorpos estão listadas na Tabela 1. Para gerar essas imagens, esses embriões foram processados como descritos neste protocolo sem nenhuma das etapas opcionais, exceto para desaciação. Os embriões foram montados e cobertos(Figura 3B).
Células divisórias expressam diferentes modificações de histona de células quiescentes que podem ser detectadas por imunohistoquímica usando anticorpos que reconhecem modificações específicas, como fosforilação proteica. A fosforilação de histona 3 na serina 10 está associada à divisão celular23. As modificações apresentadas a este protocolo de adaptação da imunohistoquímica ao tecido seccionado que é montado em slides foi usada para detectar células proliferantes no cérebro de zebrafish larval. Seções congeladas de 72 embriões hpf foram montadas em slides e imunosmanchados para p-H3 (Figura 4). Várias células expressam p-H3, e a expressão é mais notável nas zonas ventriculares. A expressão foi comparada a nenhum embrião de controle primário e a um IgG de rato de 2 μg/mL para determinar as contribuições relativas da ligação antigen inespecífica.
| Anticorpo | Alvo | Concentração |
| Controle de Isótipo do IgG do mouse | Antígenos não específicos | 2 μg/mL |
| Mouse anti-NMDAR1 | Subunidade GluN1 | 1:1,000 |
| Anti-rato de cabra Alexa488 | Mouse IgG | 1:500 |
| Mouse Anti-phospho-H3 | fosforilado Histone H3 | 1:500 |
| Receptor anti-pan-AMPA do mouse | GluR1-4 | 1:500 |
Tabela 1: Lista de anticorpos e concentrações utilizadas.
Figura 1: Fluxograma de todo o procedimento de imunohistoquímica de montagem. O fluxo básico de trabalho do procedimento é a raça de peixes; coletar e preparar embriões; bloquear antígenos não específicos; incubar em anticorpos primários e secundários em séries; tecido de montagem; e documento. As etapas opcionais são indicadas com pequenas setas no ponto apropriado no fluxo de trabalho. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 2: Larvas esquemáticas e nmda receptor IHC resultados representativos. O uso de toda a imunohistoquímica do monte testou expressão do receptor glutamato no desenvolvimento muscular. A orientação e região de interesse em 23 hpf é indicada. Nenhum sinal foi detectável quando os anticorpos primários não foram incluídos. O anticorpo de controle do Mouse IgG mostra o baixo nível de expressão não específica. A subunidade GluN1 do receptor glutamato do tipo NMDA (NMDAR) é expressa em todo o músculo em desenvolvimento, com concentrações mais altas em limites somitas (pontas de flecha). Os receptores glutamato saqueador (AMPAR) do tipo AMPA não são expressos nesta fase. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 3: Esquema scheático de esquemas de montagem. (A)Um embrião afundado em 50% glicerol pode ser facilmente reposicionado. (B)Um embrião montado em um slide em meio de montagem pode ser preservado e imagem em uma data posterior. (C)Um embrião montado em uma gotícula de 1% de agarose pode ser fixado em posição de ver uma região difícil. (D)Um embrião montado em glicerol em um escorregador de ponte pode ser enrolado e reposicionado. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 4: Resultados representativos do IHC em tecido seccionado. Usando as modificações do protocolo nos passos opcionais, a imunohistoquímica testada para proliferar células no cérebro larval de zebrafish a 72 hpf. O anticorpo de controle do Mouse IgG e a exclusão de anticorpos primários revelam um baixo nível de expressão não específica. Como marcador de células proliferantes, o P-H3 é expresso em locais discretos, incluindo as zonas ventriculares (cabeça de flecha). Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
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Discussion
Imunohistoquímica é uma ferramenta versátil que pode ser usada para caracterizar a expressão spatio-temporal de praticamente qualquer proteína de interesse em um organismo. A imunohistoquímica é usada em uma grande variedade de tecidos e organismos modelo. Este protocolo foi otimizado para uso em zebrafish. A imunohistoquímica em diferentes espécies pode exigir diferentes técnicas de fixação e manuseio, bloqueando soluções dependendo das espécies e a presença de peroxidases endógenas, e tempos de incubação devido à espessura e composição dos tecidos. O IHC em zebrafish tem sido fundamental no avanço da nossa compreensão do câncer24, doença metabólica25, distúrbios neurológicos26, e inúmeras outras áreas de grande relevância para a saúde humana. Uma grande vantagem para o IHC é que o procedimento é relativamente curto em comparação com outras técnicas como ish e não é tecnicamente exigente. Há, no entanto, numerosos passos que requerem otimização com base na idade dos espécimes, o antígeno sendo alvo e os anticorpos sendo usados.
A duração de vários passos neste protocolo é flexível. As durações dadas para etapas flexíveis, como observado, representam tempos mínimos geralmente necessários. Em geral, sempre que os embriões são lavados três ou mais vezes em PBTriton, eles podem ser mantidos durante a noite a 4 °C na última lavagem, se necessário. Os tempos de permeabilização e fixação são menos flexíveis e só devem ser ajustados com intenção deliberada como parte de uma estratégia de solução de problemas. Notamos vários pontos do protocolo que são opcionais para mostrar como essas etapas podem ser integradas no fluxo de trabalho, como é experimentalmente relevante. Por exemplo, se a pigmentação interferir na detecção de sinais, evite a melagense por tratamento de PTU ou embriões fixos alvejantes. O branqueamento pode danificar o tecido, por isso deve-se tomar cuidado para minimizar o tempo que os embriões passam em alvejante. No entanto, o branqueamento pode ser preferível ao tratamento de TPT, o que pode afetar certos aspectos do desenvolvimento27,28,29,30. Também apresentamos opções para detecção fluorescente e cromosgênica. Se a fluorescência não for desejada ou se o antígeno produz um sinal muito fraco para ser adequadamente detectado pela microscopia de fluorescência, a detecção cromosgênica pode ser alcançada usando um anticorpo conjugado e DAB de peroxidase etacana (HRP).
O maior desafio do IHC em zebrafish é encontrar anticorpos adequados. De fato, ish é frequentemente usado como um proxy para expressão proteica quando anticorpos comerciais não estão disponíveis para a proteína desejada de interesse. Muitos anticorpos comerciais são projetados para atingir alvos de mamíferos e epítopos nem sempre são conservados em zebrafish. Quando disponível, selecione anticorpos disponíveis comercialmente que foram testados em zebrafish. Descobrimos que os anticorpos que reconhecem antígenos que são >80% conservados entre zebrafish e as espécies-alvo geralmente trabalham em zebrafish. Também descobrimos que os anticorpos que são demonstrados para funcionar em aves e/ou anfíbios, além de mamíferos geralmente também funcionam em zebrafish, mesmo quando a eficácia em zebrafish não foi testada. Normalmente, anticorpos policlonais desenvolvidos contra um antígeno mamífero são mais propensos a detectar homotélos de zebrafish do que anticorpos monoclonais devido à sua menor especificidade. Sempre que testa um novo anticorpo, é benéfico executar um experimento de controle positivo usando um peptídeo alvo cruzado, tecido mamífero ou células que são conhecidos por expressar a proteína, ou células que expressam uma construção repórter. Anticorpos também podem ser testados pela mancha ocidental para verificar o tamanho do antígeno alvo.
Embora a maioria dos anticorpos comerciais forneçam uma faixa de diluição sugerida para o IHC, é importante determinar empiricamente a diluição que funciona melhor. Concentrações de anticorpos que são muito altas muitas vezes resultam em manchas não específicas e maior fundo, enquanto pouco anticorpo não fornece um sinal perceptível. Dependendo do anticorpo e do antígeno, pode ser vantajoso primeiro permeabilizar os embriões conforme descrito na etapa 3.2 acima, no entanto, essa etapa pode não ser necessária e, em alguns casos, pode resultar em sinal reduzido. Este protocolo usa Triton-X-100 como um detergente que permeabiliza as células, o que pode ser suficiente para tecido fino ou expressão superficial. Tecidos profundos ou grossos, como regiões cerebrais profundas ou larvas mais antigas, podem exigir permeabilização proteinase. Por outro lado, triton-X-100 deve ser excluído de todas as etapas quando a imunocoloração apenas de proteínas na superfície celular é desejada sobre a rotulagem de proteínas intracelulares. A duração da etapa de bloqueio, bem como a escolha de uma solução de bloqueio comercial versus o uso de soro e BSA também podem ser ajustadas para corrigir a sensibilidade de anticorpos e a coloração de fundo. Altas concentrações de soro usados no bloqueio (10% neste protocolo) podem reduzir a coloração de fundo, embora deva ser diluída quando o anticorpo está presente para minimizar os locais de ligação de corpos mascarados. As soluções de bloqueio baseadas em plantas podem ser benéficas se o sinal de fundo for consistentemente alto, mesmo com diluições de anticorpos baixos (<1:1.000). Finalmente, a sensibilidade pode ser afinada pela stringência das lavas. Pode ser necessário aumentar ou diminuir a duração das etapas de lavagem pós-anticorpos, bem como ajustar a quantidade de Triton-X-100 no PBTriton. As faixas de trabalho típicas de PBTriton variam de 0,2% a 1,0% Triton-X-100. É uma boa prática ao usar um novo anticorpo para manchar embriões de controle negativo com IgG primário e rotulou anticorpos secundários para determinar a especificidade do anticorpos e identificar potenciais sinais falsos positivos.
Se a otimização de anticorpos não produzir um sinal positivo, pode ser devido ao mascaramento fixado do antígeno. Geralmente, a fixação em 4% de PFA não mascara locais de antígeno para evitar a ligação de anticorpos, embora o mascaramento de antígenos ocorra ocasionalmente com alguns anticorpos. A recuperação de antígenos pode resultar em danos ao embrião, mas um protocolo de trabalho foi descrito por Inoue e Wittbrodt31. Alternativamente, se o anticorpo selecionado for incompatível com 4% de PFA ou se a PFA resultar em alterações de morfologia celular, metanol, 2% de ácido tricotoáceo, ou glyoaxal pode ser usado para fixar as amostras27. A compatibilidade de um anticorpo com fixação de formaldeído deve ser determinada empiricamente. Se um sinal de controle positivo não puder ser obtido após a fixação da PFA, pode valer a pena tentar um fixativo alternativo, como o metanol. Protocolos alternativos de fixação também podem ser necessários para anticorpos primários que foram levantados contra antígenos conjugados (como gaba-BSA).
Existem várias opções eficazes para montar embriões de zebrafish imunosmanchados para imagem. Os embriões podem ser transferidos para uma placa de Petri de glicerol, posicionada com pinos ou fórceps, e imagens com uma visão ampla de cima ou abaixo através da imagem através do prato com um microscópio invertido (Figura 3A). Este método é simples, rápido e temporário. As desvantagens incluem a propensão para que os embriões rolem fora de foco no glicerol fluido, potenciais reflexos fora da superfície do glicerol no prato e a dificuldade de imagem através do prato grosso. Os embriões podem ser montados em lados de vidro(Figura 3B) com meio de montagem, tampas e esmalte. Essas montagens podem ser vistas em um microscópio vertical ou invertido. Embriões preparados dessa forma podem ser preparados antes do tempo e os slides armazenados a 4 °C até que a imagem ou possam ser armazenados e reavaliados posteriormente. Isso pode ser especialmente vantajoso quando o tempo de imagem é limitado. As desvantagens deste monte incluem as opções limitadas para a posição do embrião e a espessura do tecido, e a incapacidade de reposicionar ou recuperar embriões. Embriões montados desta forma muitas vezes precisam ser desyolking, já que os grânulos de gema são autofluorescentes nos canais de fluorescência mais comumente usados e não podem ser movidos ou removidos após a montagem. Quando a região de interesse requer um posicionamento difícil do embrião, pode ser mais vantajoso montar os embriões em 1% de agarose em um copo de cobertura (Figura 3C). O embrião pode ser mantido em posição com pinos de inseto com a região de interesse mais próxima do vidro de cobertura até que a agarose esfrie. A agarose manterá o embrião em posição sem que o embrião role por pelo menos vários minutos. A montagem de agarose é melhor para microscópios invertidos, embora o vidro de tampa possa ser invertido cuidadosamente para uso em um microscópio vertical. Esta montagem pode ser demorada e os embriões geralmente não são reposicionáveis ou recuperáveis. A montagem de embriões em slides bridged(Figura 3D) oferece um compromisso entre esses métodos. A montagem ponteda é rápida, e os embriões podem ser reposicionados e recuperados. A altura da ponte pode permitir maior flexibilidade na espessura do tecido e posição do embrião do que montagens planas, mantendo a capacidade de imagem de cima ou de baixo. Este método requer preparar os slides de ponte antes do tempo. A espessura do tecido a ser montado dita quantos deslizamentos de cobertura a ponte precisa ser. Os slides com ponte podem ser reutilizados várias vezes por um dia, mas devem ser descartados após a sessão de imagem, pois o glicerol é difícil de limpar os slides e lentamente desalojará a cola segurando a ponte.
O IHC é um método eficaz para determinar o tempo e o padrão de expressão proteica em um organismo ou tecido. O IHC tem várias vantagens sobre ish em que é relativamente baixo custo e pode ser concluído em uma fração do tempo normalmente necessário para ISH (2-3 dias versus 5-8 dias). Além disso, o IHC é um indicador melhor da expressão do produto genético, pois a detecção dos níveis de mRNA não prevê processos pós-transcrição e pós-tradução que podem afetar a expressão proteica. O IHC também é capaz de fornecer dados de localização subcelular (embora isso não seja verdade ao usar a coloração DAB), que não é oferecida pela ISH. É possível realizar um ISH/IHC duplo em zebrafish.
O IHC também tem algumas desvantagens, principalmente entre elas a disponibilidade de anticorpos. Embora existam numerosos anticorpos disponíveis que são de qualidade adequada para o IHC, encontrar anticorpos que trabalham especificamente em zebrafish é mais desafiador e muitas vezes requer testes e anticorpos de solução de problemas gerados contra antígenos mamíferos. No entanto, há um número crescente de anticorpos validados por zebrafish no mercado e o surgimento da tecnologia CRISPR/Cas9 tornou possível epítopo de proteínas endógenas através da engenharia de genomas. Esses processos são demorados e desafiadores, no entanto, e requerem validação da função proteica.
O protocolo descrito neste relatório pode ser usado amplamente em embriões de zebrafish e larvas em qualquer estágio e pode ser aplicado a tecidos de animais adultos também. Além disso, este protocolo também permite a coloração de amostras congeladas ou seccionadas de parafina com pouca modificação. Toda a imunohistoquímica do monte foi usada para examinar populações de receptores neurotransmissores em músculos, revelando expressão do receptor glutamato nmda ionotrópico obrigatório subunidade 1 no desenvolvimento de músculos zebrafish. Essa coloração bastante difundida e difusa em todo o músculo em desenvolvimento é consistente com a expressão de desenvolvimento da mesma subunidade receptora no desenvolvimento de larvas xenopus21. Isso sugere que a expressão dos receptores glutamatos no desenvolvimento muscular é evolutivamente conservada. Ao todo, este protocolo é valioso para obter uma melhor compreensão da expressão genética através do uso do IHC e fornece uma poderosa ferramenta para determinar a distribuição spatio-temporal da expressão proteica em zebrafish.
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Disclosures
Os autores não têm informações para divulgar.
Acknowledgments
Financiamento do NIH conceder 8P20GM103436 14.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-100 | |
| Aluminum foil, heavy duty | Kirkland | Any brand may be substituted | |
| Anti-NMDA antibody | Millipore Sigma | MAB363 | |
| Anti-phospho-Histone H3 (Ser10), clone RR002 | Millipore Sigma | 05-598 | |
| Anti-pan-AMPA receptor (GluR1-4) | Millipore Sigma | MABN832 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Calcium Nitrate [Ca(NO3)2] | Sigma Aldrich | C4955 | |
| Centrifuge tubes, 1.5 mL | Axygen | MCT150C | |
| Clear nail polish | Sally Hanson | Any nail polish or hardener may be subsituted | |
| Depression (concavity) slide | Electron Miscroscopy Sciences | 71878-01 | |
| Diaminobenzidine | Thermo Scientific | 1855920 | |
| Embryo medium, Danieau, 30% | 17.4 mM NaCl, 0.21 mM KCl, 0.12 mM MgS04, 0.18 mM Ca(NO3)2, 1.5 mM HEPES in ultrapure water. | ||
| Embryo medium, E2 | 7.5 mM NaCl, 0.25 mM KCl, 0.5 mM MgSO4, 75 μM KH2PO4, 25 uM Na2HPO4, 0.5 mM CaCl2, 0.35 mM NaHCO3, 0.5 mg/L methylene blue | ||
| Floating tube holder | Thermo Scientific | 59744015 | |
| Fluorescence compound microscope | Leica Biosystems | DMi8 | |
| Fluorescence stereomicroscope | Leica Biosystems | M165-FC | |
| Glass coverslips 18 mm x 18 mm | Corning | 284518 | |
| Glass coverslips 22 mm x 60 mm | Thermo Scientific | 22-050-222 | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Goat anti-mouse IgG Alexa 488 | Invitrogen | A11001 | |
| HEPES solution | Sigma Aldrich | H0887 | |
| Humid chamber with lid | Simport | M920-2 | |
| Hydrogen peroxide, 30% | Fisher Scientific | H325-500 | |
| Immunedge pap pen | Vector labs | H-4000 | |
| Insect pins, size 00 | Stoelting | 5213323 | |
| Magnesium Sulfate (MgSO4 · 7H2O) | Sigma Aldrich | 63138 | |
| Mesh strainer | Oneida | Any brand may be substituted | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 34860 | |
| Methylene blue | Sigma Aldrich | M9140 | |
| Micro-tube cap lock | Research Products International | 145062 | |
| Microwave oven | Toastmaster | ||
| Mouse IgG | Sigma Aldrich | I8765 | |
| Normal goat serum | Millipore Sigma | S02L1ML | |
| Nutating mixer | Fisher Scientific | 88-861-044 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 04042-500 | |
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| PBTriton | 1% TritonX-100 in 1x PBS | ||
| Permount mounting medium | Fisher Chemical | SP15-500 | |
| Petri dish (glass) | Pyrex | 3160100 | |
| Petri dish (plastic) | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| 1-phenyl 2-thiourea | Acros Organics | 207250250 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), 10x, pH 7.4 | Gibco | 70011-044 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), 1x | 1x made from 10x stock diluted in dH2O | ||
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma Aldrich | P9333 | |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Fisher | P250-500 | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Sigma Aldrich | P5655 | |
| Pronase | Sigma Aldrich | 10165921001 | |
| Proteinase K | Invitrogen | AM2544 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | S7653 | |
| Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | Sigma Aldrich | S7907 | |
| Spawning tank with lid and insert | Aquaneering | ZHCT100 | |
| SuperBlock PBS | Thermo Scientific | 37515 | |
| Superfrost + slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Superglue gel | 3M Scotch | ||
| TNT | 100 mM Tris, pH 8.0; 150 mM NaCl; 0.1% Tween20; made in dH2O | ||
| Transfer pipette | Fisher | 13-711-7M | |
| Trichloracetic Acid (Cl3CCOOH) | Sigma Aldrich | T6399 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | S374-500 | |
| TritonX-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| Tween20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Ultrafine forceps | Fisher Scientific | 16-100-121 | |
| Water, ultrapure/double distilled | Fisher Scientific | W2-20 |
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