Summary
Aquí, presentamos un protocolo para la detección de proteínas mediadas por anticuerpos fluorescentes en preparaciones enteras de embriones y larvas de peces cebra.
Abstract
La inmunohistoquímica es una técnica ampliamente utilizada para explorar la expresión y localización de proteínas durante los estados normales de desarrollo y enfermedad. Aunque muchos protocolos de inmunohistoquímica se han optimizado para secciones de tejido y tejido de mamíferos, estos protocolos a menudo requieren modificación y optimización para organismos modelo no mamíferos. El pez cebra se utiliza cada vez más como sistema modelo en la investigación básica, biomédica y traslacional para investigar los mecanismos biológicos moleculares, genéticos y celulares de los procesos de desarrollo. Zebrafish ofrece muchas ventajas como sistema modelo, pero también requieren técnicas modificadas para una detección óptima de proteínas. Aquí, proporcionamos nuestro protocolo para la inmunohistoquímica de fluorescencia de montaje completo en embriones y larvas de peces cebra. Este protocolo también describe varias estrategias de montaje diferentes que se pueden emplear y una visión general de las ventajas y desventajas que proporciona cada estrategia. También describimos modificaciones a este protocolo para permitir la detección de sustratos cromogénicos en el tejido de montaje completo y la detección de fluorescencia en el tejido larvario seccionado. Este protocolo es ampliamente aplicable al estudio de muchas etapas de desarrollo y estructuras embrionarias.
Introduction
El pez cebra (Danio rerio) ha surgido como un modelo poderoso para el estudio de los procesos biológicos por varias razones, incluyendo el corto tiempo de generación, el desarrollo rápido, y la amenabilidad a las técnicas genéticas. Como resultado, el pez cebra se utiliza comúnmente en pantallas de moléculas pequeñas de alto rendimiento para la investigación toxicológica y el descubrimiento de fármacos. El pez cebra también es un modelo atractivo para el estudio de los procesos de desarrollo, ya que una sola hembra puede producir rutinariamente 50-300 huevos a la vez y los embriones ópticamente claros se desarrollan externamente permitiendo una visualización eficiente de los procesos de desarrollo. Sin embargo, las primeras investigaciones se basaron principalmente en pantallas genéticas delanteras utilizando N-etil-N-nitrosourea (ENU) u otros mutágenos debido a los desafíos en el establecimiento de técnicas genéticas inversas. Hace aproximadamente dos décadas, los morfosolinos se utilizaron por primera vez en peces cebra para derribar genes dirigidos1. Los morpholinos son pequeños oligonucleótidos antisentido que inhiben la traducción del ARNm objetivo después de la microinyección en un embrión en una etapa temprana del desarrollo. Una debilidad importante de los morfolinos es que se diluyen a medida que las células se dividen y generalmente pierden eficacia en 72 horas después de la fertilización (hpf). Si bien los morfolinos siguen siendo una poderosa herramienta para la alteración del gen del pez cebra, las nucleasas de efectos similares a los activadores de transcripción (TALEN), las nucleasas de zinc-dedo (ZFN) y las repeticiones palindrómicas cortas (CRISPR) interespaciadas regularmente agrupadas se utilizan más recientemente para apuntar directamente al genoma del pez cebra2,3. Estas estrategias genéticas inversas, en combinación con la genética delantera y las pantallas de alto rendimiento, han establecido el pez cebra como un modelo poderoso para estudiar la expresión y la función génicas.
La capacidad de estudiar la función génica generalmente requiere una evaluación de la distribución espacio-temporal de la expresión de genes o genes. Las dos técnicas más utilizadas para visualizar estos patrones de expresión durante el desarrollo temprano son la hibridación in situ (ISH) y la inmunohistoquímica de montaje completo (IHC). La hibridación in situ se desarrolló por primera vez en 1969 y se basa en el uso de sondas de ARN antisentido etiquetadas para detectar la expresión de ARNm en un organismo4. Por el contrario, los anticuerpos etiquetados se utilizan en la inmunohistoquímica para visualizar la expresión de proteínas. La idea de etiquetar proteínas para la detección se remonta a los5 de 1930 y el primer experimento del IHC se publicó en 1941 cuando se utilizaron anticuerpos etiquetados con FITC para detectar bacterias patógenas en los tejidos infectados6. ISH e IHC han evolucionado y mejorado significativamente en las décadas siguientes y ahora se utilizan rutinariamente en el laboratorio de investigación molecular y diagnóstica7,8,9,10,11. Si bien ambas técnicas tienen ventajas y desventajas, IHC ofrece varios beneficios sobre ISH. Prácticamente, IHC consume mucho menos tiempo que la ISH y generalmente es menos costoso dependiendo del costo del anticuerpo primario. Además, la expresión de ARNm no siempre es una métrica fiable de la expresión de proteínas, ya que se ha demostrado en ratones y humanos que sólo alrededor de un tercio de la variación de la abundancia de proteínas puede explicarse por la abundancia de ARNm12. Por esta razón, IHC es un suplemento importante para confirmar los datos de ISH, cuando sea posible. Por último, IHC puede proporcionar datos subcelulares y de colocalización que no pueden ser determinados por ISH13,14,15. Aquí, describimos un método paso a paso para detectar de forma fiable las proteínas mediante inmunohistoquímica en embriones y larvas de pez cebra de montaje completo. El objetivo de esta técnica es determinar la expresión espacial y temporal de una proteína de interés en todo el embrión. Esta tecnología utiliza anticuerpos primarios específicos para antígenos y anticuerpos secundarios etiquetados fluorescentemente. El protocolo es fácilmente adaptable para su uso en secciones de tejido deslizante y para su uso con sustratos cromogénicos en lugar de fluorescencia. Usando este protocolo, demostramos que el desarrollo de músculo esquelético de pez cebra expresa receptores de glutamato ionotrópico, además de receptores de acetilcolina. Las subunidades del receptor de glutamato de tipo NMDA son detectables en el músculo longitudinal a 23 hpf.
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Protocol
Los procedimientos para trabajar con adultos y embriones reproductores de peces cebra descritos en este protocolo fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso Animal de la Universidad Estatal de Murray.
1. Recogida y fijación de embriones
- Prepare tanques de desove colocando parejas de sexo mixtas de pez cebra adultos en tanques con una malla o un revestimiento ranurado lleno de agua del sistema durante la noche.
- En las luces encendidas, cambie el agua del tanque de desove para agua fresca del sistema para eliminar las heces. Utilice un ciclo de luz oscura de 14 h/10 h con luces encendidas a las 9 am.
- Una vez que se pongan los huevos, devuelva a los adultos a los tanques domésticos.
- Recoger los huevos mediante la elaboración de ellos utilizando un pipeta de transferencia o vertiéndolos en un colador de malla.
- Transfiera los huevos a platos de Petri llenos de medio cuerpo con medio embrionario (como un 30% de danieau o un medio embrionario E2 con 0,5 mg/L de azul de metileno), limitando el número de embriones por plato a 50.
- Retire los huevos que estén muertos o que no se dividan.
NOTA: Los embriones muertos se pueden identificar fácilmente a medida que se vuelven opacos y a menudo aparecen "nublados". Si el azul de metileno se añade al medio embrionario, los embriones muertos tienen una apariencia azul oscuro. - Incubar platos de huevos a 28,5oC hasta que lleguen a la etapa deseada. Para este experimento, elevar los embriones hasta 23 hpf.
- Opcional) Transfiera los embriones a 24 hpf a 200 m 1-fenil 2-tiourea (PTU) en medio embrionario para prevenir la melanogénesis16,17. Alternativamente, blanquear los embriones después de la fijación (ver sección 5 opcional).
- Cambiar el medio embrionario o el medio de PTU diariamente.
- Dechorionar embriones desenombreced usando fórceps de punta ultrafina bajo un estereomicroscopio. Alternativamente, los embriones descolasten químicamente incubando en 1 mg/ml de pronasa en medio embrionario durante varios minutos a temperatura ambiente. Retire los embriones de Pronase y lávelos tres veces con medio embrionario.
- Los embriones desconredados se adhieren al plástico. Mantenerlos en platos Petri de vidrio o plástico recubiertos con 1-2% de agarosa disuelta en medio embrionario. Mueva embriones desconredados usando pipeteos Pasteur pulidos con fuego para minimizar el daño.
- Transfiera los embriones a tubos centrífugos de 1,5 ml utilizando un pipeta de plástico o pulida por fuego.
- Retire el medio embrionario con un micropités. Deje sólo suficiente líquido para cubrir los embriones después de cada cambio de líquido.
- Preparar 4% paraformaldehyde (PFA) en 1 x solución salina con fosfato (PBS) en una campana de humo químico.
ADVERTENCIA: PFA es un material peligroso. Use guantes y deseche líquidos y sólidos contaminados en áreas designadas. - Fijar los embriones en 4% PFA para 1-2 h con balanceo suave a temperatura ambiente. Alternativamente, fijar los embriones 4 h para pasar la noche a 4 oC.
- Lavar tres veces en 1PBS + 1% Triton-X (PBTriton) durante 5 min.
- Utilizar los embriones inmediatamente o almacenar a 4 oC durante un máximo de 1 semana.
- Para el almacenamiento a largo plazo, deshidratar los embriones en 100% metanol (MeOH) 2 h o durante la noche a -20 oC. Almacene los embriones a -20 oC en MeOH durante varios meses.
ADVERTENCIA: MeOH es un material peligroso. Use guantes y deseche líquidos y sólidos contaminados en áreas designadas.
2. Preparación de embriones
- Rehidratar los embriones a través de incubaciones en serie a temperatura ambiente.
- Incubar en 75% MeOH/25% 1x PBS durante 5 min, balanceándose.
- Incubar en 50% MeOH/50% 1x PBS durante 5 min, balanceándose.
- Incubar en 25% MeOH/75% 1x PBS durante 5 min, balanceándose.
- Incubar en 100% PBTriton durante 5 min, meciéndose.
- (Opcional) Preparar una solución de trabajo fresca de proteína K (10 g/ml en PBTriton) en hielo añadiendo 10 ml de caldo de proteína K recién desaliñado (10 mg/ml).
- Permeabilizar los embriones digiriendo hasta 30 min en Proteinase K.
NOTA: El tiempo sugerido es <24 hpf: sin digestión; 24 hpf: 15 min de digestión; y 7 días de edad: 30 min de digestión. - Enjuague los embriones permeabilizados en PBTriton y vuelva a fijarlos en 4% de PFA durante 20 min a temperatura ambiente.
- Lave los embriones tres veces en PBTriton durante 5 minutos a temperatura ambiente con un suave balanceo.
- Permeabilizar los embriones digiriendo hasta 30 min en Proteinase K.
3. Incubación de anticuerpos primarios
- Seleccione una solución de bloqueo comercial o suero que coincida con las especies de host de anticuerpos secundarios (por ejemplo, 10% de suero de cabra en PBTriton) con o sin 2 mg/ml de albúmina de suero bovino (BSA).
- Bloquear los embriones en solución de bloqueo durante 1-3 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4 oC mientras se balancea.
- Incubar en anticuerpos primarios diluidos en solución de bloqueo o 1% de suero en PBTriton durante la noche a 4oC mientras se balancea. En este experimento, los anticuerpos primarios utilizados fueron anti-NMDAR1, receptor anti-pan-AMPA, y anti-fosfo-histona H3, cada uno diluido a una concentración final de 1:500 en 1% suero de cabra en PBTriton.
- Lavar cinco veces en PBTriton durante 10 minutos a temperatura ambiente mientras se balancea.
4. Incubación secundaria de anticuerpos
- Seleccione un anticuerpo secundario basado en las especies anfitrionas del anticuerpo primario y la longitud de onda deseada.
- Incubar en anticuerpos secundarios diluidos en solución de bloqueo o 1% de suero durante 2 h a temperatura ambiente (o durante la noche a 4oC) durante el balanceo.
NOTA: Los anticuerpos secundarios fluorescentes son sensibles a la luz. Usamos 1:500 cabra-anti-ratón Alexa488 diluido en 1% suero de cabra en PBTriton. - Cubra los tubos con papel de aluminio o cubra con una caja de bloqueo de luz para este y todos los pasos subsiguientes.
- Lavar tres veces en PBTriton durante 10 minutos a temperatura ambiente mientras se balancea.
- Transfiera los embriones a una solución de glicerol al 50% en PBS sobre un lecho de agarosa del 2% en medio embrionario y proceda a la documentación o proceda a los pasos de procesamiento posteriores a continuación.
Pasos opcionales
5. Blanqueamiento
- Preparar la solución de lejía en un tubo de 1,5 ml añadiendo 810,7 l de ddH2O, 89,3 ml de 2 M KOH y 100 ml de 30% H2O2.
- Invierta el tubo tres veces para mezclar.
- Pipetear 1 ml de dirección de la solución de lejía a los embriones.
- Abra la tapa del tubo embrionario para permitir que el gas escape. Toque suavemente el tubo en el banco para desalojar las burbujas.
- Supervise el proceso de blanqueo (utilice un microscopio si es necesario) y detenga la reacción cuando el pigmento se extraiga lo suficiente (aproximadamente 5 min para 24 hpf o 10 min para 72 hpf).
- Retire cuidadosamente la solución de blanqueo con un micropipeta y enjuague los embriones tres veces en 1 ml de PBTriton.
NOTA: Los embriones son pegajosos en este paso. - Continúe con la documentación o los pasos de procesamiento adicionales a continuación.
6. Disección de embriones y desyolking
- Para eliminar la yema, transfiera una pequeña cantidad (200 ol o suficiente para cubrir completamente el embrión, pero lo suficientemente restrictivo como para limitar dónde puede flotar) de 1x PBS a una diapositiva de depresión o un portaobjetos de vidrio liso.
- Utilice un pipeta de transferencia de plástico para mover 1 o más embriones a la gota de PBS.
- Utilice fórceps ultrafinos y 00 pines de insectos para romper la yema y raspar muy suavemente gránulos de yema de la superficie ventral del embrión (véase también Cheng et al., 2014)18.
- Retire los gránulos de yema y reponga PBS según sea necesario.
- Repita hasta que el embrión esté lo suficientemente libre de yema.
7. Montaje plano en diapositivas
- Transfiera embriones deyolked a un portaobjetos de vidrio cargado con una pipeta de plástico o una micropipeta de 1 ml con una punta recortada (para reducir el estrés de cizallamiento). Orientar como desee con una punta de micropipeta de 200 l o un pasador de insecto.
- Elimina el exceso de PBS con una toallita Kim o una toalla de papel.
- Agregue 2-3 gotas de soporte de montaje a la corredera y al cubreobjetos.
- Secar al aire durante aproximadamente 5 a 10 min.
- Selle el cristal de la cubierta sobre el portaobjetos con esmalte de uñas transparente.
NOTA: Los bordes del vidrio de la cubierta deben estar completamente cubiertos con una capa fina y continua de esmalte de uñas. - Dejar secar aproximadamente 10 minutos antes de la toma de imágenes.
8. Montaje en Agarose
- Preparar el 1% de agarosa en medio embrionario añadiendo 0,5 g de agarosa a 50 ml de medio embrionario en un matraz o vaso de precipitados aptos para microondas de al menos 3 veces mayor volumen del deseado.
- Calienta en un microondas, girando cada 30 s, hasta que la agarosa se disuelva por completo.
- Hacer 1 ml de alícuotas en tubos centrífugos de 1,5 ml. Almacene las alícuotas a temperatura ambiente.
- Cubra las tapas del tubo con cerraduras de tapa antes de calentar.
- Coloque los tubos de agarosa en un soporte de tubo flotante en un vaso de precipitados medio lleno de agua.
- Microonda el vaso de precipitados con tubos flotantes durante 2-3 minutos, o hasta que la agarosa esté completamente derretida.
- Transfiera un embrión a la corredera puenteada con una pipeta de plástico o una micropipeta de 200 ml con una punta recortada (para reducir el estrés de cizallamiento).
- Coloque el embrión en un cubreobjetos rectangular utilizando alfileres de insectos y agregue aproximadamente 20 ml de agarosa derretida directamente al embrión.
- Oriente rápidamente la región de interés más cercana al cubreobjetos usando 00 alfileres de insectos.
NOTA: Este es un soporte al revés. - Vuelva a colocar el tubo de agarosa en el flotador del tubo de agua caliente entre cada uso y el microondas según sea necesario.
- Imagen utilizando un microscopio cuando la agarosa se endurece. Mantenga el embrión montado boca abajo para usarlo en un microscopio invertido. Voltear el cubreobjetos (para que la agarosa esté debajo del cubreobjetos) para su uso en microscopios verticales.
9. Montaje en diapositivas puenteadas
- Para hacer diapositivas puenteadas, pegue las cubiertas cuadradas a la diapositiva de vidrio usando un pequeño punto de superpegamento.
NOTA: Debe haber una vaguada de al menos 5 mm de ancho entre los labios de las cubiertas. Dos #1 de cubiertas altas es típicamente apropiado para embriones de 24-48 hpf, mientras que tres cubresítos altos pueden ser necesarios para 72 hpf. - Transfiera 1-2 embriones deyolked a la corredera puenteada con una pipeta de plástico o una micropipeta de 200 l con una punta recortada (para reducir el estrés de cizallamiento).
- Elimina el exceso de líquido con una toallita Kim o una toalla de papel.
- Añadir una gota de glicerol del 80% directamente al embrión.
- Cubierta con una cubierta rectangular. La gota de glicerol debe tocar el cristal de la cubierta.
- Añadir más glicerol al espacio entre el cristal de la cubierta y deslizarse según sea necesario para cubrir completamente el embrión con un margen de glicerol en los lados del embrión.
- Deslice suavemente el vidrio de la cubierta rectangular para enrollar el embrión en su posición para la toma de imágenes.
10. Tinción DAB
NOTA: Esta sección comienza después del paso 4.2 anterior y reemplaza el resto del paso 4.
- Incubar los embriones en una solución de bloqueo con un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa durante 2 horas a temperatura ambiente o durante la noche a 4oC mientras se balancea.
- Lavar tres veces en PBTriton durante 10 min a temperatura ambiente.
- Transfiera los embriones a una placa de cultivo o diapositiva de depresión con una pipeta de transferencia.
- Mezclar 50 éL de 1% DAB (3,3'-diaminobenzidina) disuelto en ddH2O y 50 oL de 0,3% de peróxido de hidrógeno y llevar a 1 ml con PBS.
ADVERTENCIA: DAB es un material peligroso. Use guantes y deseche líquidos y sólidos contaminados por DAB en áreas designadas. - Cubra los embriones teñidos con HRP con la solución DAB preparada anteriormente y monitoree para el desarrollo del color (normalmente 1-5 min) bajo un microscopio.
- Después de alcanzar el nivel deseado de desarrollo de color, enjuague los embriones brevemente en PBS.
- Transfiera los embriones a un tubo de 1,5 ml antes de la fijación.
- Vuelva a fijar los embriones durante 15-20 min en 4% de PFA a temperatura ambiente.
- Lave los embriones tres veces en PBTriton durante 5 min.
- Proceda a la documentación.
11. Protocolo modificado para la tinción de tejido seccionado que se monta en diapositivas
- Rodear el tejido para ser manchado con una pluma de papá.
- Transfiera los portaobjetos a una cámara húmeda.
- Agregue 1 ml de PBS directamente a la diapositiva.
- Incubar 7 min a temperatura ambiente para eliminar el medio de incrustación.
- Vierta PBS invirtiendo la diapositiva.
- Rehidratar 1 min en hasta 1 mL de tampón TNT (100 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.1% Tween20).
- Bloquear en hasta 1 ml de solución de bloqueo (comercial o 10% de suero + 2% de BSA) durante 1 h a temperatura ambiente.
- Incubar durante la noche en anticuerpos primarios diluidos en suero del 1% o solución de bloqueo a 4oC.
- Lavar cinco veces en hasta 1 ml de tampón TNT a temperatura ambiente.
- Incubar en anticuerpos secundarios durante 2 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4oC. Cubra la cámara con papel de aluminio o utilice una tapa oscura.
- Lavar cinco veces en TNT a temperatura ambiente. Vierte el último lavado.
- Montar con 2-3 gotas de medio de montaje y cubreobjetos. Dejar sentarse 5-10 min.
- Selle el cristal de la cubierta sobre el portaobjetos con esmalte de uñas transparente. Deje secar completamente antes de tomar imágenes.
12. Documentación
- Registre el procedimiento completo y las desviaciones en un cuaderno de laboratorio.
- Registre la concentración, el nombre, el número de catálogo, el fabricante y el número de lote del anticuerpo principal.
- Coloque la muestra montada adecuadamente en la etapa del microscopio. Localice la región de interés.
- Seleccione un ejemplo relativamente brillante. Ajuste la exposición y la ganancia de la cámara para que la señal sea lo suficientemente brillante sin saturarla.
- Compare la intensidad de tinción de la misma región de interés utilizando los mismos ajustes de exposición al comparar entre embriones experimentales etiquetados con anticuerpos y embriones de anticuerpos de control (por ejemplo, IgG).
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Representative Results
La inmunohistoquímica de montaje completo utiliza anticuerpos para detectar el patrón espacial de expresión de proteínas en el animal intacto. El flujo de trabajo básico de la inmunohistoquímica (representado en la Figura 1)consiste en la cría de peces cebra, la cría y preparación de embriones, el bloqueo de antígenos no específicos, el uso de un anticuerpo primario específico del antígeno para apuntar a la proteína de interés, la detección de ese anticuerpo primario con un anticuerpo secundario etiquetado, el montaje del espécimen y la expresión de documentación.
La inmunohistoquímica de montaje completo es una herramienta valiosa para el estudio de la expresión de proteínas espaciales y temporales durante el desarrollo del pez cebra. El pez cebra presenta contracciones espontáneas mediadas por uniones de separación que comienzan antes de los 19 hpf, antes del contacto con las neuronas motoras19. La unión neuromuscular de pez cebra, al igual que otros vertebrados, está mediada por la acetilcolina que actúa en receptores de acetilcolina nicotínicos. Estos receptores ensamblados se detectan por primera vez a aproximadamente 16 hpf y la expresión se expande y se remodela a medida que las neuronas forman contactos20. Los estudios en ranas21 y ratas22 sugieren que el músculo esquelético de los vertebrados también puede expresar receptores de glutamato ionotrópico. La inmunohistoquímica de montaje completo para la subunidad GluN1 del receptor de glutamato de tipo NMDA revela la expresión de subunidades del receptor de glutamato a lo largo del desarrollo del músculo del pez cebra a 23 hpf(Figura 2). Esto corresponde aproximadamente con el momento de la inervación de la neurona motora. La expresión se comparó con embriones de control primario para determinar la fluorescencia de fondo del pez y el anticuerpo secundario y con un IgG de ratón de 2 g/ml para determinar las contribuciones relativas de la unión inespecífica de antígenos. Los receptores de glutamato tipo AMPA no se detectaron en los músculos en esta etapa de desarrollo. Las concentraciones de anticuerpos se enumeran en la Tabla 1. Para generar estas imágenes, estos embriones se procesaron como se describe en este protocolo sin ninguno de los pasos opcionales excepto para deyolking. Los embriones estaban planos montados y cubiertos(Figura 3B).
Las células divisorias expresan diferentes modificaciones histonas de las células en reposo que pueden ser detectadas por inmunohistoquímica utilizando anticuerpos que reconocen modificaciones específicas, como la fosforilación proteica. La fosforilación de la histona 3 en la serina 10 se asocia con la división celular23. Las modificaciones presentadas a este protocolo para la adaptación de la inmunohistoquímica al tejido seccionado que se monta en los portaobjetos se utilizaron para detectar células que proliferan en el cerebro de la cebra larval. Las secciones congeladas de 72 hpf embriones se montaron en diapositivas e inmunotintas para p-H3(Figura 4). Varias células expresan p-H3, y la expresión es más notable en las zonas ventriculares. La expresión se comparó con embriones de control primario y con un IgG de ratón de 2 g/ml para determinar las contribuciones relativas de la unión de antígenos inespecíficos.
| Anticuerpo | Objetivo | Concentración |
| Control de isotipo IgG de ratón | Antígenos no específicos | 2 g/ml |
| Ratón anti-NMDAR1 | Subunidad GluN1 | 1:1,000 |
| Cabra antiratón Alexa488 | Ratón IgG | 1:500 |
| Ratón Anti-fosfo-H3 | Histone H3 fosforilado | 1:500 |
| Receptor antipan-AMPA de ratón | GluR1-4 | 1:500 |
Tabla 1: Lista de anticuerpos y concentraciones utilizadas.
Figura 1: Diagrama de flujo del procedimiento de inmunohistoquímica de montaje completo. El flujo de trabajo básico del procedimiento es criar peces; recoger y preparar embriones; bloquear antígenos no específicos; incubar en anticuerpos primarios y secundarios en serie; montar tejido; y documento. Los pasos opcionales se indican con flechas pequeñas en el punto adecuado del flujo de trabajo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Resultados representativos del receptor IHC del receptor DE larvas y del receptor NMDA. El uso de inmunohistoquímica de montaje completo probó la expresión del receptor de glutamato en el desarrollo de músculo. Se indica la orientación y la región de interés a 23 cvf. No se detectó ninguna señal cuando no se incluyeron anticuerpos primarios. El anticuerpo de control IgG de ratón muestra el bajo nivel de expresión no específica. La subunidad GluN1 del receptor de glutamato de tipo NMDA (NMDAR) se expresa a través del músculo en desarrollo, con concentraciones más altas en los límites de la esomite (puntas de flecha). Los receptores de glutamato de tipo AMPA (AMPAR) no se expresan en esta etapa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Esquema de los esquemas de montaje. (A) Un embrión hundido en 50% glicerol puede ser fácilmente reposicionado. (B) Un embrión montado en una corredera en el medio de montaje se puede conservar e imaginar en una fecha posterior. (C) Un embrión montado en una gota de agarosa del 1% se puede fijar en posición para ver una región difícil. (D) Un embrión montado en glicerol en un portaobjetos puenteado puede ser enrollado y reposicionado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Resultados representativos de IHC en tejido seccionado. Utilizando las modificaciones del protocolo en los pasos opcionales, la inmunohistoquímica probó para detectar células que proliferan en el cerebro larvario del pez cebra a 72 hpf. Los anticuerpos de control de IgG de ratón y excluyendo los anticuerpos primarios revelan un bajo nivel de expresión no específica. Como marcador de células que proliferan, p-H3 se expresa en lugares discretos, incluidas las zonas ventriculares (cabeza de flecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La inmunohistoquímica es una herramienta versátil que se puede utilizar para caracterizar la expresión espacio-temporal de prácticamente cualquier proteína de interés en un organismo. La inmunohistoquímica se utiliza en una amplia variedad de tejidos y organismos modelo. Este protocolo ha sido optimizado para su uso en peces cebra. La inmunohistoquímica en diferentes especies puede requerir diferentes técnicas de fijación y manipulación, bloqueando las soluciones dependiendo de las especies y la presencia de peroxidasas endógenas, y los tiempos de incubación debido al grosor y composición de los tejidos. IHC en el pez cebra ha sido integral en el avance de nuestra comprensión del cáncer24,enfermedad metabólica25, trastornos neurológicos26,y muchas otras áreas de gran relevancia para la salud humana. Una ventaja importante para el IHC es que el procedimiento es relativamente corto en comparación con otras técnicas como la ISH y no es técnicamente exigente. Sin embargo, hay numerosos pasos que requieren optimización basada en la edad de los especímenes, el antígeno que se está apuntando y los anticuerpos que se utilizan.
La duración de varios pasos en este protocolo es flexible. Las duraciones dadas para pasos flexibles como se indica representan tiempos mínimos generalmente requeridos. En general, siempre que los embriones se lavan tres o más veces en PBTriton, se pueden mantener durante la noche a 4 oC en el último lavado si es necesario. Los tiempos de permeabilización y fijación son menos flexibles y solo deben ajustarse con intención deliberada como parte de una estrategia de solución de problemas. Hemos observado varios puntos en el protocolo que son opcionales para mostrar cómo se pueden integrar estos pasos en el flujo de trabajo como es experimentalmente relevante. Por ejemplo, si la pigmentación interfiere con la detección de señales, evite la melanogensis mediante el tratamiento de la PTU o los embriones fijos de lejía. El blanqueamiento puede dañar el tejido, por lo que se debe tener cuidado de minimizar el tiempo que los embriones pasan en lejía. Sin embargo, el blanqueo puede ser preferible al tratamiento de la PTU, que puede afectar a ciertos aspectos del desarrollo27,28,29,30. También presentamos opciones para la detección fluorescente y cromogénica. Si no se desea fluorescencia o si el antígeno produce una señal demasiado débil para ser detectada adecuadamente por microscopía de fluorescencia, la detección cromogénica se puede lograr utilizando un anticuerpo conjugado conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) y DAB.
El mayor desafío de IHC en el pez cebra es encontrar anticuerpos adecuados. De hecho, la ISH se utiliza a menudo como un proxy para la expresión de proteínas cuando los anticuerpos comerciales no están disponibles para la proteína deseada de interés. Muchos anticuerpos comerciales están diseñados para atacar objetivos de mamíferos y los epítopos no siempre se conservan en peces cebra. Cuando esté disponible, seleccione anticuerpos disponibles comercialmente que hayan sido probados en peces cebra. Hemos encontrado que los anticuerpos que reconocen antígenos que se conservan >80% entre el pez cebra y las especies objetivo generalmente trabajan en el pez cebra. También hemos encontrado que los anticuerpos que se demuestra que funcionan en aves y/o anfibios, además de los mamíferos generalmente también funcionan en peces cebra, incluso cuando no se ha probado la eficacia en peces cebra. Típicamente, los anticuerpos policlonales desarrollados contra un antígeno mamífero son más propensos a detectar homologos de peces cebra que los anticuerpos monoclonales debido a su menor especificidad. Siempre que se prueba un nuevo anticuerpo, es beneficioso llevar a cabo un experimento de control positivo utilizando un péptido objetivo reticulado, tejido de mamífero o células que se sabe que expresan la proteína, o células que expresan una construcción de reportero. Los anticuerpos también pueden ser probados por western blot para verificar el tamaño del antígeno objetivo.
Mientras que la mayoría de los anticuerpos comerciales proporcionan un rango de dilución sugerido para IHC, es importante determinar empíricamente la dilución que funciona mejor. Las concentraciones de anticuerpos que son demasiado altas a menudo dan lugar a manchas no específicas y a un mayor fondo, mientras que el muy poco anticuerpo no proporciona una señal discernible. Dependiendo del anticuerpo y el antígeno, puede ser ventajoso primero permeabilizar los embriones como se describe en el paso 3.2 anterior, sin embargo, este paso puede no ser necesario y en algunos casos puede resultar en una señal reducida. Este protocolo utiliza Triton-X-100 como detergente que permeabiliza las células, que pueden ser suficientes para el tejido delgado o la expresión superficial. El tejido profundo o grueso, como las regiones cerebrales profundas o las larvas más antiguas, puede requerir permeabilización de la proteinasa. Por el contrario, Triton-X-100 debe excluirse de todos los pasos cuando se desea inmunostamar sólo proteínas en la superficie celular sobre el etiquetado de proteínas intracelulares. La duración del paso de bloqueo, así como la elección de una solución de bloqueo comercial en comparación con el uso de suero y BSA también se pueden ajustar para corregir la sensibilidad de anticuerpos y la tinción de fondo. Las altas concentraciones de suero utilizadas en el bloqueo (10% en este protocolo) pueden reducir la tinción de fondo, aunque deben diluirse cuando hay anticuerpos presentes para minimizar los sitios de unión de anticuerpos de enmascaramiento. Las soluciones de bloqueo basadas en plantas pueden ser beneficiosas si la señal de fondo es consistentemente alta, incluso en diluciones de anticuerpos bajas (<1:1,000). Por último, la sensibilidad se puede afinar por la rigela de los lavados. Puede ser necesario aumentar o disminuir la duración de los pasos de lavado post-anticuerpos, así como ajustar la cantidad de Tritón-X-100 en el PBTriton. Los rangos de trabajo típicos de PBTriton abarcan 0.2% a 1.0% Triton-X-100. Es una buena práctica cuando se utiliza un nuevo anticuerpo para manchar embriones de control negativos con IgG primario y anticuerpos secundarios etiquetados para determinar la especificidad de los anticuerpos e identificar posibles señales falsas positivas.
Si la optimización de anticuerpos no produce una señal positiva, puede deberse al enmascaramiento fijador del antígeno. Generalmente, la fijación en 4% PFA no enmascara los sitios de antígeno para prevenir la unión de anticuerpos, aunque el enmascaramiento de antígenos ocurre ocasionalmente con algunos anticuerpos. La recuperación de antígenos puede causar daños en el embrión, pero inoue y Wittbrodt31han descrito un protocolo de trabajo. Alternativamente, si el anticuerpo seleccionado es incompatible con 4% PFA o si la PFA da lugar a cambios en la morfología celular, se puede utilizar metanol, ácido tricloroacético al 2% o glioaxal para fijar las muestras27. La compatibilidad de un anticuerpo con fijación de formaldehído debe determinarse empíricamente. Si no se puede obtener una señal de control positiva después de la fijación de PFA, puede valer la pena probar un fijador alternativo como el metanol. Los protocolos de fijación alternativos también pueden ser necesarios para los anticuerpos primarios que se plantearon contra los antígenos conjugados (como GABA-BSA).
Existen varias opciones eficaces para el montaje de embriones de pez cebra inmuno-pescado inmuno-pescado para la toma de imágenes. Los embriones pueden ser transferidos a una placa Petri de glicerol, colocados con alfileres o fórceps, e imágenes ya sea con una vista de campo ancho desde arriba o desde abajo imágenes a través de la placa con un microscopio invertido(Figura 3A). Este método es simple, rápido y temporal. Los inconvenientes incluyen la propensión a que los embriones se desenfoquen en el glicerol fluido, los reflejos potenciales de la superficie del glicerol en el plato, y la dificultad de la toma de imágenes a través del plato grueso. Los embriones se pueden montar planos en los lados de vidrio(Figura 3B)con medio de montaje, tapas y esmalte de uñas. Estos soportes se pueden ver en un microscopio vertical o invertido. Los embriones preparados de esta manera se pueden preparar con antelación y las diapositivas se almacenan a 4 oC hasta la toma de imágenes o se pueden almacenar y volver a crear una imagen más tarde. Esto puede ser especialmente ventajoso cuando el tiempo de diagnóstico por imágenes es limitado. Las desventajas de este soporte incluyen las opciones limitadas para la posición del embrión y el grosor del tejido, y la incapacidad para reposicionar o recuperar embriones. Los embriones montados de esta manera a menudo necesitan deyolking, ya que los gránulos de yema son autofluorescentes en los canales de fluorescencia más utilizados y no se pueden mover o quitar después del montaje. Cuando la región de interés requiere un difícil posicionamiento del embrión, puede ser más ventajoso montar los embriones en 1% de agarosa en un cristal de cubierta(Figura 3C). El embrión se puede mantener en posición con pasadores de insectos con la región de interés más cercana al vidrio de la cubierta hasta que la agarosa se enfríe. La agarosa mantendrá el embrión en posición sin que el embrión rodee durante al menos varios minutos. El montaje en agarosa es el mejor para microscopios invertidos, aunque el vidrio de la cubierta se puede invertir cuidadosamente para su uso en un microscopio vertical. Este montaje puede llevar mucho tiempo y los embriones generalmente no son reposicionables ni recuperables. El montaje de embriones en diapositivas puenteadas(Figura 3D)ofrece un compromiso entre estos métodos. El soporte puentedo es rápido, y los embriones se pueden reposicionar y recuperar. La altura del puente puede permitir una mayor flexibilidad en el grosor del tejido y la posición del embrión que los soportes planos, manteniendo la capacidad de crear imágenes desde arriba o abajo. Este método requiere la preparación de las diapositivas puenteadas con antelación. El grosor del tejido a montar dicta cuántas cubiertas tiene que ser el puente. Los portaobjetos puenteados se pueden reutilizar varias veces durante un día, pero deben eliminarse después de la sesión de imágenes porque el glicerol es difícil de limpiar las diapositivas y desalojará lentamente el pegamento que sostiene el puente.
IHC es un método eficaz para determinar el momento y el patrón de expresión de proteínas en un organismo o tejido. IHC tiene varias ventajas sobre ISH en que es relativamente bajo costo y se puede completar en una fracción del tiempo típicamente necesario para ISH (2-3 días frente a 5-8 días). Además, IHC es un mejor indicador de la expresión del producto genético, ya que la detección de los niveles de ARNm no predicen los procesos posttranscripcionales y posttranslacionales que pueden afectar la expresión de proteínas. IHC también es capaz de proporcionar datos de localización subcelular (aunque esto no es cierto cuando se utiliza la tinción DAB), que no es dado por ISH. Es posible realizar un doble ISH/IHC en el pez cebra.
IHC también tiene algunos inconvenientes, entre ellos la disponibilidad de anticuerpos. Si bien hay numerosos anticuerpos disponibles que son de calidad adecuada para IHC, encontrar anticuerpos que funcionan específicamente en el pez cebra es más difícil y a menudo requiere pruebas y solución de problemas de anticuerpos generados contra antígenos de mamíferos. Sin embargo, hay un número cada vez mayor de anticuerpos validados por peces cebra en el mercado y la aparición de la tecnología CRISPR/Cas9 ha hecho posible etiquetar proteínas endógenas a través de la ingeniería del genoma. Sin embargo, estos procesos consumen mucho tiempo y son desafiantes y requieren la validación de la función proteica.
El protocolo descrito en este informe puede utilizarse ampliamente en embriones y larvas de peces cebra en cualquier etapa y también puede aplicarse a los tejidos de animales adultos. Además, este protocolo también permite la tinción de muestras congeladas o seccionadas con parafina con poca modificación. La inmunohistoquímica de montaje completo se utilizó para examinar las poblaciones de receptores de neurotransmisores en el músculo, revelando la expresión del receptor de glutamato NMDA ionotrópico subunidad 1 en el desarrollo de músculo de pez cebra. Esta tinción bastante extendida y difusa a través del músculo en desarrollo es consistente con la expresión del desarrollo de la misma subunidad receptora en el desarrollo de larvas de Xenopus21. Esto sugiere que la expresión de receptores de glutamato en el desarrollo de músculo se conserva evolutivamente. En conjunto, este protocolo es valioso para obtener una mejor comprensión de la expresión génica a través del uso de IHC y proporciona una poderosa herramienta para determinar la distribución espacio-temporal de la expresión proteica en el pez cebra.
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Disclosures
Los autores no tienen información que revelar.
Acknowledgments
Financiación de NIH subvención 8P20GM103436 14.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-100 | |
| Aluminum foil, heavy duty | Kirkland | Any brand may be substituted | |
| Anti-NMDA antibody | Millipore Sigma | MAB363 | |
| Anti-phospho-Histone H3 (Ser10), clone RR002 | Millipore Sigma | 05-598 | |
| Anti-pan-AMPA receptor (GluR1-4) | Millipore Sigma | MABN832 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Calcium Nitrate [Ca(NO3)2] | Sigma Aldrich | C4955 | |
| Centrifuge tubes, 1.5 mL | Axygen | MCT150C | |
| Clear nail polish | Sally Hanson | Any nail polish or hardener may be subsituted | |
| Depression (concavity) slide | Electron Miscroscopy Sciences | 71878-01 | |
| Diaminobenzidine | Thermo Scientific | 1855920 | |
| Embryo medium, Danieau, 30% | 17.4 mM NaCl, 0.21 mM KCl, 0.12 mM MgS04, 0.18 mM Ca(NO3)2, 1.5 mM HEPES in ultrapure water. | ||
| Embryo medium, E2 | 7.5 mM NaCl, 0.25 mM KCl, 0.5 mM MgSO4, 75 μM KH2PO4, 25 uM Na2HPO4, 0.5 mM CaCl2, 0.35 mM NaHCO3, 0.5 mg/L methylene blue | ||
| Floating tube holder | Thermo Scientific | 59744015 | |
| Fluorescence compound microscope | Leica Biosystems | DMi8 | |
| Fluorescence stereomicroscope | Leica Biosystems | M165-FC | |
| Glass coverslips 18 mm x 18 mm | Corning | 284518 | |
| Glass coverslips 22 mm x 60 mm | Thermo Scientific | 22-050-222 | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Goat anti-mouse IgG Alexa 488 | Invitrogen | A11001 | |
| HEPES solution | Sigma Aldrich | H0887 | |
| Humid chamber with lid | Simport | M920-2 | |
| Hydrogen peroxide, 30% | Fisher Scientific | H325-500 | |
| Immunedge pap pen | Vector labs | H-4000 | |
| Insect pins, size 00 | Stoelting | 5213323 | |
| Magnesium Sulfate (MgSO4 · 7H2O) | Sigma Aldrich | 63138 | |
| Mesh strainer | Oneida | Any brand may be substituted | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 34860 | |
| Methylene blue | Sigma Aldrich | M9140 | |
| Micro-tube cap lock | Research Products International | 145062 | |
| Microwave oven | Toastmaster | ||
| Mouse IgG | Sigma Aldrich | I8765 | |
| Normal goat serum | Millipore Sigma | S02L1ML | |
| Nutating mixer | Fisher Scientific | 88-861-044 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 04042-500 | |
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| PBTriton | 1% TritonX-100 in 1x PBS | ||
| Permount mounting medium | Fisher Chemical | SP15-500 | |
| Petri dish (glass) | Pyrex | 3160100 | |
| Petri dish (plastic) | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| 1-phenyl 2-thiourea | Acros Organics | 207250250 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), 10x, pH 7.4 | Gibco | 70011-044 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), 1x | 1x made from 10x stock diluted in dH2O | ||
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma Aldrich | P9333 | |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Fisher | P250-500 | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Sigma Aldrich | P5655 | |
| Pronase | Sigma Aldrich | 10165921001 | |
| Proteinase K | Invitrogen | AM2544 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | S7653 | |
| Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | Sigma Aldrich | S7907 | |
| Spawning tank with lid and insert | Aquaneering | ZHCT100 | |
| SuperBlock PBS | Thermo Scientific | 37515 | |
| Superfrost + slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Superglue gel | 3M Scotch | ||
| TNT | 100 mM Tris, pH 8.0; 150 mM NaCl; 0.1% Tween20; made in dH2O | ||
| Transfer pipette | Fisher | 13-711-7M | |
| Trichloracetic Acid (Cl3CCOOH) | Sigma Aldrich | T6399 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | S374-500 | |
| TritonX-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| Tween20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Ultrafine forceps | Fisher Scientific | 16-100-121 | |
| Water, ultrapure/double distilled | Fisher Scientific | W2-20 |
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