Summary
이 프로토콜은 단일 세포 및 세포 집단 수준에서 스트레스 조건 하에서 세균 성장의 시간 해결 설명을 허용합니다.
Abstract
스트레스 조건하에서 성장하고 생존하는 세균 능력의 분석은 광범위한 미생물학 연구에 필수적입니다. 그것은 항생제 또는 그밖 항균 화합물, 조사, 비 생리적인 pH, 온도, 또는 소금 사격량에 노출과 같은 긴장 유도 처리에 세균성 세포의 반응을 특성화하기 위하여 관련있습니다. 다른 스트레스 치료 다른 세포 프로세스를 방해할 수 있습니다., 세포 분열을 포함 하 여, DNA 복제, 단백질 합성, 막 무결성, 또는 세포 주기 조절. 이 효력은 일반적으로 세포 규모에 특정 표현형과 연관됩니다. 따라서, 스트레스 유발 성장 또는 생존 력 결핍의 범위와 인과관계를 이해하려면 단일 세포와 인구 수준에서 여러 매개 변수를 주의 깊게 분석해야 합니다. 여기에 제시된 실험 전략은 살아있는 세포에 있는 유세포 측정및 실시간 현미경 화상 진찰과 같은 단세포 분석 기술과 전통적인 광학 조밀도 감시 및 도금 분석실험을 결합합니다. 이 다중 규모 프레임워크를 사용하면 스트레스 조건이 박테리아 집단의 운명에 미치는 영향에 대한 시간 해결 된 설명을 할 수 있습니다.
Introduction
이 프로토콜의 전반적인 목적은 집단과 단세포 수준에서 스트레스 치료에 노출된 세균 세포의 거동을 분석하는 것입니다. 세균 성장 및 생존율은 전통적으로 박테리아 세포 질량 합성의 프록시인 광학 밀도 모니터링(OD600nm)을사용하거나 배양에서 생존 가능한 세포의 농도를 결정하기 위한 도금 실험(밀리리터당 콜로니 형성 단위, CFU/mL)을 사용하여 집단 수준에서 해결됩니다. 정상 (스트레스없는) 성장 조건에서, OD600nm 및 CFU / mL 측정은 엄격하게 세균 이중 시간이 세포 질량 증가에 직접 의존하기 때문에 상관 관계1,2. 그러나, 이러한 상관관계는 세포 질량 합성3,세포 분열4,또는 세포 매포시스를 유발하는 조건하에서 종종 중단된다. 간단한 예는 필라멘트 세균 세포의 형성을 초래하는 세포 분열을 억제하는 스트레스 치료에 의해 제공된다5,6. 필라멘트 세포는 세포 질량 합성이 영향을 받지 않습니다 때문에 일반적으로 길게, 그러나 실행 가능한 세포로 분할할 수 없습니다. 배양 광학 밀도는 결과적으로 표준 속도로 시간이 지남에 따라 증가하지만 도금 검사법 (CFU / mL)에 의해 결정된 생존 세포의 농도가 아닙니다. 이 경우, 다른 많은 경우와 마찬가지로 광학 밀도 및 도금 측정은 유익하지만 관찰된 응력 유발 효과에 대한 포괄적인 이해를 제공하지 못합니다. 이 앙상블 분석은 긴장 유도한 성장 부족의 심층적인 특성을 허용하기 위하여 단세포 분석 기술과 결합될 필요가 있습니다.
여기서, 4개의 상보적인 실험 접근법을 결합하는 절차가 기재된다: (1) 기존의 도금 검법 및 기본 광학 밀도 모니터링은 각각 세포 생존가능성 및 세포 질량 합성을 모니터링한다; (2) 많은 수의 세포에 대한 세포 크기 및 DNA 함량 파라미터를 평가하는 유세포분석; (3) 세포 형태를 분석하기 위한 현미경 스냅샷 이미징; (4) 세포 운명의 시간 역학의 검사를 위한 미세 유체 챔버에서 시간 경과 단세포 화상 진찰. 이 다중 규모 프레임 워크는 개별 세포의 거동에 비추어 세포 성장 및 생존가능성에 대한 글로벌 효과를 해석할 수 있습니다. 이 절차는 특정 조건 (즉, 성장 배지, pH, 온도, 염 농도) 또는 항생제 또는 기타 에 노출을 포함하여 관심의 거의 모든 스트레스에 다양한 세균 종의 반응을 해독하기 위해 적용 될 수있다 항균 화합물.
Protocol
1. 세포 배양, 스트레스 유도 및 샘플링 절차
참고: 배경 입자를 방지하기 위해 0.22 μm에서 여과된 멸균 배양 유리 제품, 파이펫 팁 및 성장 매체를 사용합니다. 여기서, 세포 배양은 낮은 자가형광 풍부 정의 배지에서 성장한다(자료표참조)7,8.
- 루리아-브롬(LB) 아가로즈 플레이트(필요한 경우 선택적 항생제)에 얼어붙은 글리세롤 스톡으로부터 관심균균을 줄무늬를 하고 밤새 37°C(17시간)에서 배양한다.
참고: 여기에 제시된 예제 실험은 대장균 MG1655 hupA-mCherry를 사용합니다. 이 균주는 HU 뉴클레오이드 관련 단백질의 형광 태그가 붙은 소단위 α를 생성하여 살아있는 세포에서 염색체의 광 현미경 시각화를허용합니다 9. - 단일 콜로니로 배지의 5 mL을 접종하고 37°C에서 성장시키고 분당 140회 회전(rpm)에서 하룻밤(17시간)까지 흔들어 서 있다. 플라스크 (≥50 mL) 또는 큰 직경 (≥2 cm) 시험관은 교반 배양의 만족스러운 폭기를 보장하기 위해 사용되어야합니다.
- 다음날 아침 600 nm(OD600nm)에서광학 밀도를 측정하고 0.01의 OD600nm에 신선한 배지를 포함하는 시험관으로 배양을 희석한다. 배양물의 총 부피는 실험 중에 분석할 시간 점의 수에 따라 조정되어야 합니다.
- 배양된 200 μL 샘플을 마이크로플레이트(작업량당 0.2 mL)에 적재하고 37°C에서 배양 시 OD600nm 모니터링을 위해 자동 플레이트 판독기(재료 표참조)에 놓습니다.
- 37°C에서 접종된 시험관을 OD600nm =0.2로 흔들어, 풍부한 배지에서의 전체 지수상에 대응하여 배양한다.
참고: 적절한 지수 성장을 달성하기 전에 적어도 4-5 세대 동안 세포를 성장시키는 것이 중요합니다. 단계 1.3 (OD600nm = 0.01)에서 사용되는 초기 접종은 가난한 매체에서 성장의 경우 (즉, 지수 상이 OD 0.2 이하에 도달하는 경우) 또는 더 많은 세대가 원할 경우 (예를 들어, 특정 생리 학적 연구 또는 확장 된 스트레스 치료에) 적응될 필요가 있다. - OD600nm = 0.2에서, t0 시간 점 (응력 유도 전에 기하급수적으로 성장하는 세포)에 해당하는 다음 배양 샘플을 취하십시오): (1) 시간 경과 현미경 이미징을 위해 미세 유체 장치에 즉시 적재되는 150 μL 샘플(섹션 2 참조); (2) 희석 및 도금 분석법(섹션 3 참조)을 위한 200 μL 샘플; (3) 유세포분석용 얼음에 넣을 250 μL 샘플(섹션 4); (4) 현미경 스냅샷 이미징을 위해 아가로오스 장착 슬라이드에 즉시 증착되는 10 μL 샘플(섹션 5 참조).
- 시험관에 남아 있는 세포 배양을 37°C에서 교배하여 조사하고 자양분하고자 하는 특정 스트레스 치료에 140 rpm(140 rpm)을 노출시다.
참고: OD600nm 모니터링을 위한 자동 플레이트 리더에서 성장하는 배양도 스트레스 처리를 받아야 한다. - 응력 치료 후 관련 시점(t1,t2,t3등)에서, 응력 배양으로부터 다음세포 샘플을 취한다: (1) 희석 및 도금 분석(섹션 2 참조)에 대한 200 μL 샘플; (2) 유세포분석용 얼음에 넣은 250 μL 시료(섹션 3); (4) 현미경 스냅샷 이미징을 위해 아가로오스 장착 슬라이드에 즉시 증착되는 10 μL 샘플(섹션 4 참조).
참고: 각 스트레스 유발 치료는 용량과 시간에 따라 달라지는 효율성을 가지고 있습니다. 따라서, 최적의 결과 대 한 사용 하는 치료의 복용량 및 기간을 결정 하기 위해 예비 테스트를 실행 해야 할 수 있습니다. 이는 다양한 용량 및 노출 시간으로 처리된 세포 배양물의 자동 플레이트 리더(잠재적으로 도금 검문과 관련된)를 사용하여 OD 모니터링을 수행함으로써 수행될 수 있다. 여기에 제시된 실험에서, 세포 배양은 세포 분열을 억제하는 항생제 세팔렉신(Ceph.)을 60분 동안 5 μg/mL 최종 농도에서 처리한 후, 15 mL 튜브에서 세포를 펠렛하여 원심분리(475 g, 5 분)를 사용하여, 상체를 제거하고, 깨끗한 배지에 의해 세포 펠릿을 동일한 부피로 재중단시키고, 깨끗한 튜브로 동일한 부피로 세포 펠릿을 재중단시켰다. 세척된 세포를 37°C에서 교반(140 rpm)하여 배양하여 회수할 수 있도록 하였다. 샘플을 t 60(세팔렉신-60분 처리된' 샘플에 상응하는 세팔렉신 첨가 후 60분), t120(세척 후 60분), 및 t 180(세척 후 120분)에서 채취하였다.
2. 도금 분석
참고: 도금 분석법은 배양 샘플에서 CFU를 생성할 수 있는 세포의 농도를 측정할 수 있게 한다. 이 절차는 1개의 세포가 2개의 실행 가능한 세포로 분할하고 세포 분열 체포를 검출하는 것을 허용하는 비율을 제시합니다 (예를 들면, 세포 용해의 세균 생성 시간의 증가).
- 신선한 배지에서 배양 시료 200 μL 중 최대10배-7개의 직렬 희석을 준비합니다. 플레이트 100 μL은 37°C에서 하룻밤 배양 후 3−300 콜로니 사이에서 수득하기 위해 비선택적 LB 아가로즈 플레이트상에 적절한 희석을 하였다.
참고: 박테리아 분열을 제한하기 위해 신선한 배지의 직렬 희석을 신속하게 수행해야 합니다. 또는, 연구원은 희석 과정 도중 세포 분열을 방지하기 위하여 탄소 근원 없이 식염수 해결책을 사용하는 것을 고려할 수 있습니다. - 다음 날, 각 배양 샘플에서 생존 가능한 세포 (CFU / mL)의 농도를 결정하기 위해 콜로니의 수를 계산합니다. CFU/mL을 치료되지 않은 세포 배양에 대한 시간 함수로 플로팅합니다.
3. 유세포분석
참고: 다음 섹션에서는 유세포 분석분석을 위한 세포 샘플의 제조에 대해 설명합니다. 이 분석 기술은 많은 수의 세포에 대한 세포 크기 및 DNA 함량의 분포를 보여줍니다. 가능하면 유세포분석 샘플을 즉시 처리하는 것이 좋습니다. 또는, 시료는 얼음에 보관될 수 있습니다 (최대 6 시간) 하루의 끝에 동시에 분석, 일단 도금 및 현미경 이미징이 수행되었습니다.
- 배양 시료의 250 μL을 희석하여 4°C에서 신선한 배지에서 ~15,000 세포/μL(OD600nm~0.06)의 농도에서 250 μL을 얻었다.
참고 : 얼음에 배양세포의 성장과 형태 학적 변형을 제한합니다. 양자택일로, 사용자는 일반적으로 유세포 분석10을위해 추천되는 대로 75% 에탄올에 있는 세포의 고정을 능력을 발휘하는 것을 고려할 수 있습니다. - DNA 염색을 위해, 세균 샘플을 DNA 형광 염료(비율 1:1)의 10 μg/mL 용액과 혼합하고 샘플을 분석하기 전에 15분 동안 어둠 속에서 배양합니다.
- ~120,000 셀 / 분 유량으로 유량 세포계에 샘플을 전달합니다. 적절한 설정으로 전방 산란(FSC) 및 측면 산란(SSC) 광뿐만 아니라 DNA 형광 염료 형광 신호(FL-1)를 획득합니다.
- FSC 및 FL-1 세포 밀도 히스토그램을 플롯하여 세포 집단에서 세포 크기 및 DNA 함량의 분포를 나타낸다.
4. 스냅샷 현미경 이미징
참고: 다음 부분에서는 집단 스냅샷 분석을 위한 현미경 슬라이드 및 이미지 수집의 준비에 대해 설명합니다. 이 절차는 세포의 형태에 관한 정보를 제공 할 것입니다 (세포 길이, 폭, 모양) 핵 DNA의 세포 내 조직.
- 온도가 37°C에서 열전성 현미경 챔버를 예열하여 관찰을 시작하기 전에 온도를 안정화합니다. 이 챔버는 시간 경과 실험 동안 현미경 광학 및 샘플 단계의 온도 변조를 허용합니다.
- 레스터린과 뒤배리7에설명된 대로 아가로즈 장착 슬라이드를 준비한다.
- 파란색 프레임 의 하단에서 플라스틱 필름을 제거합니다(재료 표참조) 빈 플라스틱 필름을 다른 쪽에 둡니다. 현미경 유리 슬라이드에 파란색 프레임을 붙입니다.
- 피펫 ~ 150 μL의 용융 1% 아가로즈 중간 용액및 블루 프레임 구획 내에서 부어. 깨끗한 커버슬립으로 빠르게 덮어 여분의 액체를 제거하고 아가로즈 패드가 실온에서 고형화될 때까지 몇 분 동안 기다립니다.
- 셀 샘플이 준비되면 커버슬립과 플라스틱 필름을 파란색 프레임에서 제거합니다. 아가로즈 패드에 10 μL의 세포 샘플을 붓고 유리 슬라이드를 부드럽게 기울여 액적을 퍼뜨립니다. 모든 액체가 흡착되면 파란색 프레임에 깨끗한 커버 슬립을 붙이면 샘플을 밀봉하십시오. 현미경 슬라이드는 이제 현미경 검사법에 대 한 준비가.
- 현미경 스테이지에 슬라이드를 놓고 투과 된 빛 (위상 대비 목표)과 적절한 파장 (mCherry의 경우 560 nm)에서 광원 여기를 사용하여 이미지 수집을 수행합니다.
- 이미지 분석 중에 자동화된 셀 감지를 용이하게 하기 위해 격리된 셀을 포함하는 뷰 필드를 선택합니다. 세포 집단의 강력한 통계 분석을 허용하기 위해 적어도 300개의 셀이 이미지화되어 있는지 확인합니다.
5. 마이크로 유체 학적 시간 경과 현미경 이미징
참고: 다음 부분에서는 미세 유체 플레이트(재료 표참조), 셀 로딩, 미세 유체 학적 프로그램 및 시간 경과 이미지 수집의 준비에 대해 설명합니다. 이 화상 진찰 절차는 실시간으로 개별 적인 세포의 행동을 제시합니다.
- 미세 유체 플레이트에서 보존 용액을 제거하고 미세 유체 소프트웨어 사용자 가이드에 설명된 대로 37°C로 예열된 신선한 매체로 교체합니다.
- 미세 유체 플레이트를 매니폴드 시스템에 밀봉하고 프라이밍 버튼을 클릭합니다.
- 현미경 단계에 매니 폴드 시스템과 미세 유체 플레이트를 놓고 현미경 수집을 시작하기 전에 ~ 2 시간 동안 37 °C에서 예열하십시오.
참고: 이 예열 단계는 시간 경과 실험 도중 현미경의 초점을 변경하고 화상 취득을 손상하는 미세 유체 챔버의 팽창을 피하기 위하여 중요합니다. - 미세 유체 플레이트를 밀봉합니다. 배지를 웰 8에서 150 μL의 배양 샘플로 교체하고 응력 유도 시약의 유무에 관계없이 원하는 배지로 1에서 5까지의 배지를 대체합니다.
- 미세 유체 플레이트를 밀봉하여 현미경 단계에 놓습니다.
- 미세 유체 소프트웨어(재료 표참조)에서 셀 로딩 절차를 실행합니다. 세포의 로딩이 투과된 빛의 현미경 아래를 보면서 만족스러운지 확인합니다. 챔버 내의 셀 밀도가 충분하지 않은 경우 셀 로딩 절차를 두 번째로 실행합니다.
- 투과된 광 모드에서 신중하게 초점을 맞추고 고립된 박테리아를 보여주는 여러 시야를 선택합니다. 시간이 지남에 따라 단리된 세포의 성장을 모니터링할 수 있도록 혼잡하지 않은 필드를 선택하는 것이 중요합니다(100 μm2당 ~10-20 셀 권장). 이것은 또한 심상 분석 도중 세포 탐지를 용이하게 할 것입니다.
- 미세 유체 소프트웨어에서 프로토콜 만들기 단추를 클릭합니다. 세포가 적응할 수 있도록 1-2 생성 시간 등가물용 성장 배지의 주입을 프로그래밍합니다(선택 사항). 그런 다음 2 psi에서 10 분 동안 스트레스 유발 배지를 주입한 다음 스트레스 치료의 원하는 지속 기간 동안 1 psi에서 주사합니다. 스트레스 후 세포의 회복을 분석하려는 경우, 원하는 기간 동안 신선한 성장 배지의 주입을 프로그래밍하십시오.
참고: 여기에 제시된 실험에서, 세팔렉신은 2psi에서 10분 동안 주입되었고, 그 다음에 1psi에서 50분이 뒤따랐다. 이어서, 신선한 성장 배지를 10분 동안 2psi로 주입하고, 그 다음에 3시간 1psi로 주입하였다. - 전송된 빛의 위상 대비를 사용하여 10분마다 1프레임씩 타임랩스 모드에서 현미경 이미징을 수행하고 필요한 경우 mCherry 신호에 대한 560nm 여기 광원을 사용하십시오.
참고: 미세 유체 주입 프로토콜의 시작과 동시에 현미경 이미지 수집을 시작하는 것이 중요합니다.
6. 이미지 분석
참고: 이 섹션에서는 스냅샷 및 타임랩스 현미경 이미지의 처리 및 분석의 주요 단계를 간략하게 설명합니다. 현미경 이미지의 개폐 및 시각화는 오픈 소스 ImageJ /피지 (https://fiji.sc/)11로수행됩니다. 정량적 이미지 분석은 무료 미생물 플러그인12 (https://microbej.com)와 함께 오픈 소스 ImageJ / 피지 소프트웨어를 사용하여 수행됩니다. 이 프로토콜은 MicrobeJ 5.13I 버전을 사용합니다.
- 피지 소프트웨어와 MicrobeJ 플러그인을 엽니다.
- 스냅샷 분석을 위해 하나의 현미경 슬라이드(샘플 1개)에 해당하는 모든 이미지를 MicrobeJ 로딩 막대에 놓아 이미지를 연결하고 획득한 이미지 스택 파일을 저장합니다. 시간 경과 데이터의 경우 이미지 스택을 MicrobeJ의 로딩 막대에 놓기만 하면 됩니다.
- 위상 대비 이미지의 세분화에 기초하여 세포의 윤곽을 자동 검출하고, 관련이 있는 경우, 염색된 DNA 형광 신호의 세분화에 기초한 핵형성의. 세포 검출의 정확도를 시각적으로 확인하고 필요한 경우 수정을 위해 MicrobeJ 편집 도구를 사용합니다. 가져온 결과 파일을 저장합니다.
참고: 대장균 세포 검출에 사용되는 설정은 재료 표에 표시됩니다(MicrobeJ의 주석/설명 열 참조). 다른 세균 종(특히 막대 모양이 아닌 박테리아의 경우)의 경우 사용자는 감지하기 전에 설정을 구체화해야 합니다(MicrobeJ 자습서 참조). 시간 경과 이미지의 경우, MicrobeJ 편집 도구를 사용하여 세포의 반자동 검출을 실행하는 것이 개별 세포의 운명에 초점을 맞출 수 있도록 하는 것이 바람직할 수 있습니다(MicrobeJ 자습서 참조). - 결과를 클릭하여 분석을 완료하고 ResultJ 창을 가져옵니다. 이 시점에서 다양한 유형의 출력 그래프를 생성할 수 있습니다. 세포 모양/길이및 세포당 평균 핵수의 정규화된 히스토그램을 플로팅합니다.
Representative Results
기재된 절차는 세포 분열을 특이하게 억제하는 항생제인 세팔렉신에 일시적인 노출 동안 대장균 K12 세포의 거동을 분석하는데사용되었다(도 1A)13. 염색체 DNA와 관련된 형광 표지된 HU 단백질을 생성하는 hupA-mCherry E. 대장균 균주는 이 치료 전반에 걸쳐 염색체의 역학을 조사하기 위해 사용되었고8,9. 기하급수적으로 성장하는 hupA-mCherry E. 대장균 세포는 세팔렉신(t 60)으로 배양후(t0)및 60분 전에 분석하였다. 이어서, 항생제를 씻어 내고 1시간(t120)및 2시간(t180)후에 세포 집단의 회복을 분석하였다(도1B).
그림 1: 스트레스 치료에 대한 세균 반응 분석 절차. (A)방법의 회로도. (B)풍부한 배지에서 정상적인 성장 동안 세포 형태를 예시하는 만화와 세팔렉신(Ceph.)에 일시적인 노출 동안,(t0)에서추가된 후(t60)에서(t)에서 (t180)까지세팔렉신 세척을 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
OD와 CFU/mL의 병렬 진화는 스트레스 치료의 효과를 이해하는 데 도움이 되는 첫 번째 지표입니다. 이 두 매개 변수는 흔들리지 않는 성장 중에 엄격하게 상관관계가 있지만 종종 결합되지 않고 스트레스를 받으며 독립적으로 진화합니다. 세팔렉신의 존재에서 성장하는 세포 배양은 비스트레스 배양부(도2A)로서유사한 OD600nm 증가를 나타내며, 약물이 세포 질량 합성에 영향을 미치지 않았음을 나타낸다. 그러나, 세포 분열의 엄격한 억제로 인해 세팔렉신이 존재했을 때 생존 세포의 농도는 증가하지않았다(도 2B). 세포는 세팔렉신이 제거되었을 때 다시 분할하기 시작했고 결국 (t180)에서스트레스가 없는 배양물과 동등한 농도에 도달하였다. 이러한 결과는 세포 분열의 완전히 가역적 억제를 유도하는 세팔렉신의 박테리오성 효과를 반영합니다. 다른 응력은 유도된 효과에 따라 OD 및 CFU/mL 곡선의 다른 분리를 초래합니다(예를 들어, 필라멘트 또는 부푼 것과 같은 세포 형태, 용해 유무에 관계없이 세포 사멸). 다른 스트레스 유발 효과를 나타내는 가능한 결과 결과의 비철저한 목록은 그림 2C에제시되어 있다.
그림 2: 집단 수준에서 치료되지 않은 세팔렉신 처리 세포의 세균 성장 모니터링. (A)광학 밀도 모니터링(OD600nm/mL). (B)처리되지 않은 및 60분 처리 배양 내의 생존 가능한 세포 (CFU/mL)의 농도. 오차 막대는 실험 삼중에 대한 표준 편차를 나타냅니다. (C)가능한 결과 및 관련 스트레스 효과의 회로도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
단세포 분석은 인구 수준에서 관찰된 응력 반응을 정확하게 해석하는 데 필수적입니다. 유세포측정법은 세포 크기 및 수천 개의 세포 체의 DNA 함량을14,15(도 3)로검사할 수 있다. 세팔렉신에 노출은 세포 크기와 DNA 함량의 병렬 증가를 유발 (t60). 세팔렉신이 제거되었을 때, 집단 세포 크기 및 DNA 함량은 t180에서스트레스받지 않은 집단과 유사하게 점차 감소하였다. 이 결과는 세팔렉신이 DNA 복제를 억제하지 않았고 여러 염색체 등가물을 포함하는 필라멘트 세포의 형성을 유발했다는 것을 보여줍니다. 이 필라멘트는 약물을 씻어 버렸을 때 정상 세포 크기와 DNA 함량을 가진 세포로 나뉘었다. 유세포 분석 결과는 DNA 합성을 억제하는 응력에 대해 매우 다를 것이며, 이는 하나의 비복제 염색체만을 포함하는 필라멘트 세포의 형성으로 이어진다. 이 경우에, 세포 크기는 유사하게 증가할 것입니다 그러나 DNA 내용에 있는 증가와 연관되지 않을 것입니다.
도 3: 처리되지 않은 세포 및 60분 처리된 세포의 대표적인 유동 세포분석. (A)세포 크기 분포 히스토그램 (FSC-H). (B)DNA 내용 히스토그램 (FL1-SYTO9). n = 분석된 셀 120,000개. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
스냅샷 현미경 이미징은 HU-mCherry 국소화에 의해 나타난 DNA의 세포 형태 및 세포내 조직을 검사하는 데사용되었다(도 4A). 세팔렉신은 정상적인 세포 폭과 분열 이없는 긴 세포의 형성을 유발했습니다. 이 매끄러운 필라멘트는 세팔렉신이 염색체 복제 및 분리에 영향을 미치지 않았다는 것을 확인, 핵신에게 불린 정규 간격DNA 구조물을 포함했습니다. 정량적 영상 분석은 유세포측정으로 이전에 관찰된 세포 크기 및 DNA 함량 증가를 크게 확인하였다(도4B,C). 결과는 DNA 손상을 유도하는 응력에 대해 매우 다를 것이고, 이는 복제가 계속되지만 분리가 손상되는 필라멘트 세포의 형성으로 이어질 것입니다. 이 경우에, 세포 크기 및 DNA 내용은 유사하게 증가할 것입니다, 그러나 세포는 DNA의 단 하나 구조화되지 않은 질량을 항구할 것입니다. 스냅샷 이미지는 다른 종류의 비정상적인 세포 모양 또는 미니, 핵수핵 또는 포리 세포(ghost cell)의 존재를 나타낼 수도 있습니다.
그림 4: 치료되지 않은 세포및 60분 처리된 세포의 현미경 스냅샷 분석. (A)위상 대비(회색) 및 HU-mCherry 신호(빨간색)를 나타내는 대표적인 현미경 이미지. (B)세포 길이 분포 히스토그램. 스케일 바 = 5 μm.(C)세포당 핵수의 히스토그램. 800 와 2,000 세포 사이 각 샘플에 대 한 분석 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
미세유체장치(16)와 관련된 시간 경과 현미경 검사는 이전에 관찰된 표현형을 결정하는 데 도움을 주었고 성장 결핍의 발달 및 인과관계에 관한 추가적인 통찰력을 제공한다. 타임랩스이미지(도 5A 및 영화 1)는세포 신장(cell mass synthesis) 및 염색체 복제 및 분리가 세팔렉신에 노출됨으로써 억제되지 않음을 확인하였다. 또한 세팔렉신이 제거되었을 때 회복 과정을 밝혀냈습니다. 필라멘트 세포 계보의 분석은 세포 분열이 약물을 씻어낸 후 ~ 20분 ~20분 후에 다시 시작되는 것으로나타났다(도 5B). 그 결과 분할된 세포는 차례로 분할되었기 때문에, 결국 정상 크기와 DNA 함량을 나타내는 33개의 세포의 형성으로 이끌어 내립니다. 이를 통해 실험의 180분 동안 ~31분의 전체 생성 시간을 계산할 수 있었는데, 이는 CFU/mL 측정에서 스트레스받지 않은 집단에 대해 계산된 생성 시간과 유사하다(~33분).
그림 5: 세팔렉신-60분 처리 된 세포의 현미경 검사법 시간 경과 분석. (A)위상 대비(회색) 및 HU-mCherry 신호(빨간색)를 나타내는 대표적인 현미경 이미지. 모니터링된 필라멘트 셀은 흰색 윤곽선으로 표시되고, 세포를 다른 색상으로 나눈다. 배율 막대 = 5 μm.(B)패널(A)및 무비 1에대응하는 필라멘트 세포 계보의 개략적 표현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
영화 1: 대장균 HU-mCherry의 미세 유체 영화는 세팔렉신으로 처리. 세팔렉신은 60분 후에 주입되었고, 그 다음에 3시간 동안 신선한 RDM 배지를 주입한 후, 노란색으로 표시된 시간(1프레임마다 10분)을 나타냈다. 배율 늘이기 바 = 5 μm. 이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오 (다운로드 하려면 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하십시오).
Discussion
절차 동안 세포의 성장 상태에주의를 기울이는 것이 필수적입니다. 전체 지수 단계에 도달하기 전에 여러 세대에 걸쳐 세포를 성장. 이 방법의 성공을 위해 모든 세포 샘플을 동시에 수집하는 것이 중요하며 처리된 하나와 처리되지 않은 배양액을 동시에 분석하는 것이 가장 좋습니다. 현미경 검사법 화상 진찰을 위한 세포 견본은 절차 내내 실험온도에서 유지되어야 합니다. 그런 다음 실험을 시작하기 전에 현미경 챔버 및 미세 유체 챔버를 예열하는 것이 필수적입니다. 유세포측정을 위한 세포 견본이 쉽게 분석될 수 없는 경우에, 그(것)들은 얼음에 최대 6 시간 동안 얼음에 보관될 수 있습니다. 양자택일로, 사용자는 일반적으로 유세포 분석10을위해 추천되는 에탄올 75%에 있는 세포의 고정을 사용하여 고려할 수 있습니다. 프로토콜이 배지, 원심분리기 및 파이펫 세포로부터 응력 인덕터를 세척해야 하는 경우 잠재적인 비정상적인 세포를 손상시키지 않도록 매우 신중하게 합니다.
유세포 분석과 스냅샷 분석은 세포 크기 및 DNA 함량 파라미터에 대한 액세스를 제공하며, 스냅샷은 세포 형태에 대한 추가적인 관찰을 제공합니다. DAPI10 (4,6-diamidino-2-phenylindole) 또는 기타 안정적인 DNA 염료로 염색하는 것은 관심있는 유기체에서 핵을 관찰할 수 있는 형광 융합이 없는 경우에 수행될 수 있다. 유세포분석이 수행될 수 없는 경우, 현미경검사법에 의해 많은 수의 세포를 심상하고 분석하는 것이 중요합니다.
현미경 검사법 화상 진찰은 또한 관심의 특정 통로에서 관련시킨 단백질에 형광성 융합을 운반하는 긴장을 사용하여 수행될 수 있습니다. 이것은 복제, 전사, 세포벽 합성, 또는 세포 분열과 같은 다양한 세포 과정에 대한 스트레스의 영향을 밝히는 데 도움이 될 것입니다. 이 방법은 다양한 세균 종에 적용될 수 있으며, 유일한 요건은 미세 유체 장치가 세포의 형태와 호환되어야 한다는 것이다. 표준 미세 유체 플레이트는 세포 폭이 0.7 μm에서 4.5 μm 사이의 막대 모양 박테리아에 편리합니다. 그러나, cocci, ovococci, 또는 특유한 모양을 가진 그밖 세균성 긴장은 시험될 필요가 있습니다. 양자 택일로, 장비또는 호환되지 않는 세균성 긴장의 가용성 때문에 microfluidic 실험을 수행할 수 없는 경우에, 시간 경과 화상 진찰은 2h의 최대 기간 동안 agarose 장착된 슬라이드에 수행될 수 있습니다.
이 다중 규모 분석의 전반적인 이점은 세균 성장 능력의 여러 측면에 대한 스트레스 유도의 효과에 대한 글로벌 비전을 제공하는 것입니다 (즉, 질량 합성, 세포 생존력, 세포 형태, 막 무결성, DNA 함량) 및 방법 이들은 스트레스 조건 하에서 증가하는 세균성 인구에 있는 시간으로 발전합니다. 그것은 또한 단일 세포 수준 및 인구 수준에서 정상 성장의 복원을 분석 할 수 있습니다. 접근법은 광범위한 세균 종및 항생제 또는 기타 항균 화합물에 대한 노출, 다종의 다른 유기체와의 상호 작용의 영향 분석과 같은 거의 모든 종류의 스트레스 치료에 적용 가능합니다. 또는 유전 돌연변이의 영향.
Disclosures
저자들은 경쟁적인 이해관계가 없다고 선언했다.
Acknowledgments
저자는 hupA-mCherry 긴장을 제공하는 F. 코넷, 세포 측정에 대한 기술 지원을위한 A. Dedieu, 그리고 마이크로 베J에 대한 도움을 A. 듀크렛 감사합니다. 자금 조달: C. Lesterlin은 Inserm 및 CNRS 기관뿐만 아니라 ATIP-Avenir 프로그램, 교육 및 연구를위한 슐럼버거 재단 (FSER 2019), PlasMed 연구 프로그램 (ANR-18-CE35-0008)에 대한 ANR 자금 조달뿐만 아니라 J. Cayron에 대한 자금 조달을위한 FINOVI를 인정합니다. 라 리그 는 유세포계 장비의 자금 조달을 위해 르 암을 모순. 저자 기여: C.L. 및 J.C.는 절차를 설계하고 논문을 썼습니다. J.C.는 실험을 수행하고 데이터를 분석하였다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | BioRad | 1613100 | Certified molecular biology agarose |
| Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer | ThermoFisher scientific | A24858 | Cytometer |
| CellASIC ONIX Microfluidic System | Merck Millipore | CAX2-S0000 | Microfluidic system |
| CellASIC ONIX2 FG | Merck Millipore | ONIX2 1.0.1 | Microfluidic software |
| CellASIC ONIX2 Manifold Basic | Merck Millipore | CAX2-MBC20 | Manifold system |
| CytoOne 96-well plate with lid | Starlab | CC7672-7596 | Microplate with 0,2 mL well working volume and clear flat bottom, for automated plate reader |
| E. coli strain carrying a chromosomal insertion for a hupA-mCherry fusion | Created by P1 transduction of hupA-mCherry in E. coli MG1655 | ||
| Fiji | ImageJ | https://fiji.sc/ | Image software. Cite Schindelin et al. if used in publication |
| Gene Frame | Thermo Scientific | AB-0578 | Blue frame (125 μL, 1,7 x 2,8 cm) |
| Luria-Broth agarose medium | MP Biomedicals | 3002232 | Growth medium for plating assay |
| MicrobeJ | Imagej/Fiji plugin | https://www.microbej.com/ | Microscopy image analysis plugin. Cite Ducret et al. If used in publication; Detection settings: For bacteria : Area (μm2): 0,1-max; Length (μm): 0,5-max; Width (μm): 0,6-max; Range (μm): 0,5-max; Angularity (rad): 0-0,3; 0-max for all other parameters. For nucleoid: Tolerance: 500; Threshold: Local; 0-max for all other parameters |
| Microfluidic Plates CellASIC ONIX | Merck Millipore | B04A-03-5PK | Plate for Microfluidic system |
| Microscope Nikon eclipse Ti | Nikon | Fluorescence microscope | |
| MOPS EZ Rich Defined Medium (RDM) | Teknova | M2105 | Growth rich medium, 10x MOPS Mixture, 0,132 M K2HPO4, 10x AGCU, 5x Supplement EZ, 20% Glucose. Filtered at 0,22 μm |
| SYTO9 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain | ThermoFisher scientific | S34854 | DNA fluorescent dye |
| TECAN Infinite M1000 | TECAN | 30034301 | Automated plate reader |
References
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