Summary
Detta protokoll möjliggör en tidsmatchat Beskrivning av bakterietillväxt under stressförhållanden vid encells-och cell populationsnivåerna.
Abstract
Analys av bakteriernas förmåga att växa och överleva under stressförhållanden är avgörande för ett brett spektrum av mikrobiologiska studier. Det är relevant att karakterisera reaktionen av bakterieceller till stressinducerande behandlingar såsom exponering för antibiotika eller andra antimikrobiella föreningar, bestrålning, icke-Fysiologiskt pH, temperatur, eller salt koncentration. Olika stress behandlingar kan störa olika cellulära processer, inklusive celldelning, DNA-replikering, proteinsyntes, membran integritet, eller Cellcykelreglering. Dessa effekter är vanligtvis förknippade med specifika fenotyper på cell skalan. Därför kräver förståelse av omfattningen och orsakssamband av stressinducerad tillväxt eller livskraft brister en noggrann analys av flera parametrar, både på encellig och på populationsnivå. Den experimentella strategi som presenteras här kombinerar traditionell optisk densitet övervakning och plätering analyser med Single-cell analystekniker såsom flödescytometri och realtid mikroskopi Imaging i levande celler. Detta Multiscale ram möjliggör en tidslöst Beskrivning av effekterna av stress villkor på ödet för en bakterie population.
Introduction
Det övergripande syftet med detta protokoll är att analysera beteendet hos bakterieceller som utsätts för stress behandlingar på befolkningen och på encellig nivå. Bakteriell tillväxt och lönsamhet är traditionellt behandlas på befolkningsnivå med hjälp av optisk densitet övervakning (OD600Nm), som är en proxy av bakteriell cell Mass syntes, eller genom plätering analyser för att bestämma koncentrationen av livskraftiga celler i kulturen (kolonin bildar enhet per milliliter, CFU/ml). Under normala (obetonade) odlingsförhållanden, är OD600Nm och CFU/ml mätningar strikt korrelerade eftersom bakteriell fördubblings tiden beror direkt på cellmassan öka1,2. Emellertid, detta samband är ofta störs under förhållanden som påverkar cellmassa syntes3, cell Division4, eller som utlöser cell Lys. Ett enkelt exempel ges av stress behandlingar som hämmar celldelning, vilket resulterar i bildandet av trådformiga bakterieceller5,6. Trådformiga celler elongate normalt eftersom cell Mass syntesen är opåverkad, men de är oförmögna att dela upp i livskraftiga celler. Den optiska kulturens densitet kommer följaktligen att öka med tiden i normal takt men inte koncentrationen av livskraftiga celler som bestäms av pläteringsanalyser (CFU/mL). I detta fall, som i många andra, optisk densitet och plätering mätningar är informativa men misslyckas med att ge en omfattande förståelse av den observerade stressinducerad effekt. Dessa Ensemble analyser måste kombineras med Single-cell analystekniker för att möjliggöra en djupgående karakterisering av stressinducerade tillväxt brister.
Här beskrivs ett förfarande som kombinerar fyra kompletterande experimentella metoder: (1) traditionella pläteringsanalyser och grundläggande optisk densitet övervakning för att övervaka cellernas lönsamhet och cell Mass syntes, respektive; (2) flödescytometri för att utvärdera Cellstorlek och DNA-innehållsparametrar på ett stort antal celler; (3) mikroskopi Snapshot Imaging för att analysera cellmorfologi; och (4) tidsförlopp Single-cell Imaging i mikroflödessystem kammare för undersökning av tidsmässiga dynamiken i cell öde. Detta multi-Scale Framework gör det möjligt att tolka de globala effekterna på celltillväxt och lönsamhet i ljuset av beteendet hos enskilda celler. Detta förfarande kan tillämpas för att dechiffrera svaret från olika bakteriearter till praktiskt taget alla stress av intresse, inklusive tillväxt under särskilda förhållanden (dvs., odlingssubstrat, pH, temperatur, salt koncentration), eller exponering för antibiotika eller andra antimikrobiella substanser.
Protocol
1. cell kultur, spännings induktion och provtagningsförfarande
Obs: Använd steril kultur glas, pipettspetsar, och odlingssubstrat filtreras på 0,22 μm för att undvika bakgrunds partiklar. Här odlas cellkulturer i låg autofluorescence Rich definierade medium (se tabell över material)7,8.
- Strimma bakterie stammen av intresse från en fryst glycerol lager på en Luria-buljong (LB) aguppstod tallrik (med selektiv antibiotika vid behov) och inkubera vid 37 ° c över natten (17 h).
Anmärkning: exemplet experiment som presenteras här använder Escherichia coli MG1655 Hupa-mcherry. Denna stam producerar fluorescerande märkta subenhet α av hu nukleoid associerat protein, vilket möjliggör ljusmikroskop visualisering av kromosomen i levande celler9. - Inokulera 5 mL medium med en enda koloni och växa vid 37 ° c med skakning vid 140 rotation per minut (rpm) över natten (17 h). Kolvar (≥ 50 mL) eller stor diameter (≥ 2 cm) provrör skall användas för att säkerställa tillfredsställande luftning av den agiterade kulturen.
- Följande morgon mäter den optiska densiteten vid 600 Nm (OD600Nm) och späder ut kulturen i ett provrör som innehåller färskt medium till en OD600nm på 0,01. Den totala volymen av kulturen måste justeras beroende på antalet tidspunkter som ska analyseras under experimentet.
- Fyll på ett 200 μL prov av kulturen i en mikroplatta (0,2 mL per brunn av arbetsvolym med en genomskinlig botten) och placera den i en automatiserad Plattläsare (se tabell över material) för övervakning av OD600Nm under inkubering vid 37 ° c.
- Inkubera det inokulerade test röret vid 37 ° c med skakning (140 rpm) till OD600Nm = 0,2, vilket motsvarar full exponentiell fas i Rich medium.
Notera: det är viktigt att odla cellerna i minst 4 − 5 generationer innan man uppnår en ordentlig exponentiell tillväxt. Det initiala inokulum som används i steg 1,3 (OD600Nm = 0,01) måste anpassas när det gäller tillväxt i fattigare medium (dvs. där den exponentiella fasen nås under OD 0,2), eller om fler generationer önskas (t. ex. för specifika fysiologiska studier eller för utökade stress behandlingar). - Vid OD600Nm = 0,2, ta följande kulturprover som motsvarar t0 -tidspunkten (exponentiellt växande celler före spännings induktion): (1) ett prov på 150 μl som omedelbart kan lastas i mikroflödessystem-apparaten för mikroskopiavbildning med tidsfördröjning (se avsnitt 2). 2. ett prov på 200 μL för utspädnings-och pläteringsanalysen (se avsnitt 3). 3. ett prov på 250 μL som skall sättas på is för flödescytometri (avsnitt 4). 4. ett prov på 10 μL som omedelbart skall deponeras på en aganmonterad glidbana för mikroskopi bildtagning (se avsnitt 5).
- Exponera cellkulturen kvar i provröret till den specifika stress behandling du vill undersöka och inkubera vid 37 ° c med skakning (140 rpm).
Notera: kulturen som växer i den automatiserade plattläsaren för OD600Nm övervakning bör också utsättas för stress behandling. - Vid relevanta tidpunkter efter stress behandlingen (t1, t2, t3etc.), ta följande cellprov från den stressade kulturen: (1) ett prov på 200 μl för utspädnings-och pläteringsanalysen (se avsnitt 2). 2. ett prov på 250 μL för att sätta på is för flödescytometrianalys (avsnitt 3). 4. ett prov på 10 μL som omedelbart skall deponeras på en aganmonterad glidbana för mikroskopi bildtagning (se avsnitt 4).
Anmärkning: varje stressinducerande behandling har en effektivitet som är dos-och tidsberoende. Därför kan det vara nödvändigt att köra preliminära tester för att bestämma dosen och behandlingstiden som ska användas för optimala resultat. Detta kan göras genom att utföra OD-övervakning med hjälp av en automatiserad Plattläsare (potentiellt förknippad med pläteringsanalyser) av en cellkultur som behandlats med en rad doser och exponeringstider. I det experiment som presenteras här, cellkulturen behandlades med cell Division-hämmande antibiotika cefalexin (Ceph.) vid 5 μg/ml slutkoncentration för 60 min. cefalexin spolades sedan bort genom att pelletera cellerna i en 15 ml tub med centrifugering (475 g, 5 min), ta bort supernatanten, rekyl cellpelleten i en lika stor volym av färskt medium genom skonsam pipettering, och överföra till ett rent rör. De tvättade cellerna inkuberades vid 37 ° c med skakning (140 rpm) för att möjliggöra återhämtning. Provet togs vid t60 (60 min efter cefalexi tillägg motsvarande den "cefalexin-60Min-behandlade" prov), t120 (60 min efter tvättning), och t180 (120 min efter tvättning).
2. pläteringstest
Notera: pläteringsanalysen gör det möjligt att mäta koncentrationen av celler som kan generera en CFU i kulturproverna. Detta förfarande avslöjar den hastighet med vilken en cell delas upp i två livskraftiga celler och gör det möjligt att upptäcka celluppdelning arresteringar (t. ex., ökning av bakterie generationen tid för cell Lys).
- Förbered 10-faldigt seriella utspädningar upp till 10-7 av 200 μl av odlings provet i färskt medium. Platta 100 μL av lämplig utspädning på icke-selektiva LB-agriplåtar för att erhålla mellan 3 − 300 kolonier efter övernattning inkubation vid 37 ° c.
Anmärkning: seriell utspädning i färskt medium måste utföras snabbt för att begränsa bakterie divisionerna. Alternativt kan forskarna överväga att använda en saltlösning utan en kolkälla för att förhindra celldelningar under utspädnings processen. - Nästa dag, räkna antalet kolonier för att bestämma koncentrationen av livskraftiga celler (CFU/mL) i varje kultur prov. Rita CFU/mL som en funktion av tid för obehandlade och behandlade cellkulturer.
3. flödescytometri
Anmärkning: i följande avsnitt beskrivs beredningen av cellprover för flödescytometrianalys. Denna analysteknik avslöjar fördelningen av Cellstorlek och DNA-innehåll för ett stort antal celler. När det är möjligt rekommenderas det att omedelbart bearbeta flödescytometriproverna. Alternativt kan prover hållas på is (upp till 6 h) och analyseras samtidigt i slutet av dagen, när plätering och mikroskopi avbildning har utförts.
- Späd ut 250 μL odlingsprov för att erhålla 250 μL vid en koncentration av ~ 15 000 celler/μL (motsvarande en OD600Nm ~ 0,06) i färskt medium vid 4 ° c.
Obs: inkubering på is kommer att begränsa tillväxten och morfologisk modifiering av cellerna. Alternativt, användaren kan överväga att utföra fixering av cellerna i 75% etanol, som vanligtvis rekommenderas för flödescytometri10. - För DNA-färgning, blanda det bakteriella provet med en 10 μg/mL lösning av DNA fluorescerande färgämne (ratio 1:1) och inkubera i mörkret under 15 min innan du analyserar provet.
- Passera provet i flödescytometern med en ~ 120 000 celler/min flödeshastighet. Få fram spridda (FSC) och sidospridda (SSC) ljus samt DNA fluorescerande färg fluorescens signal (FL-1) med lämpliga inställningar.
- Rita FSC och FL-1 celltäthet histogram för att representera fördelningen av Cellstorlek och DNA-innehåll i cellpopulationen.
4. bild mikroskopi Imaging
Anmärkning: följande del beskriver utarbetandet av mikroskopi diabilder och bild förvärv för populations ögonblicksbild analys. Detta förfarande kommer att ge information om morfologin av cellerna (cell längd, bredd, form) och den intracellulära organisationen av nukleoid DNA.
- Värm den termoförklarade Mikroskop kammaren vid 37 ° c för att stabilisera temperaturen innan observationerna påbörjas. Denna kammare möjliggör temperaturmodulering av mikroskopets optik och prov stadiet under tidsförlopp experiment.
- Förbered agaros-monterade diabilder som beskrivs i Lesterlin och Dubarry7.
- Ta bort plastfilmen från botten av den blå ramen (se tabell över material), lämnar urholkad plastfilm på andra sidan. Stick den blå ramen på ett Mikroskop glas Slide.
- Pipettera ~ 150 μL smält 1% aguppstod medellång lösning och häll i den blå ram facket. Täck snabbt över med en ren täckslip för att ta bort överflödig vätska och vänta några minuter för att stelna i rumstemperatur.
- När cell provet är klart, ta bort täckslip och plastfilm från den blå ramen. Häll 10 μL cellprov på Agam-plattan och luta glas glaset försiktigt för att sprida droppet. När all vätska har adsorberats, stick en ren täckslip på den blå ramen för att täta provet. Mikroskopi bilden är nu klar för mikroskopi.
- Placera bilden på mikroskopet scenen och utföra bild förvärv med hjälp av genomlysnings ljus (med en faskontrast mål) och med ljuskälla excitation vid lämpliga våglängder (560 Nm för mCherry).
- Välj vyfält som innehåller isolerade celler för att underlätta automatiserad cell detektering vid bildanalys. Se till att minst 300 celler är avbildade för att möjliggöra robust statistisk analys av cellpopulationen.
5. microfluidics Time-lapse mikroskopi Imaging
Anmärkning: följande del förklarar beredningen av mikroflödessystem plattorna (se tabell över material), cell lastning, mikrofluidik program, och Time-lapse bild förvärv. Den här avbildnings proceduren avslöjar beteendet hos enskilda celler i realtid.
- Ta bort konserverings lösningen från mikroflödessystem plattan och ersätt den med färskt medium förvärmd till 37 ° c, enligt beskrivningen i mikroflödessystem Software användarhandbok.
- Försegla mikroflödessystem plattan till det mångfaldiga systemet och klicka på priming knappen.
- Placera mikroflödessystem plattan med det mångfaldiga systemet på mikroskopet scenen och förvärmas vid 37 ° c för ~ 2 h innan du påbörjar mikroskopi förvärvet.
Anmärkning: detta förvärmning steg är avgörande för att undvika dilatation av mikroflödessystem kammaren, vilket skulle förändra fokuseringen av mikroskopet under tidsförlopp experiment och kompromiss bild förvärv. - Tätar av mikroflödessystem plattan. Byt ut mediet från brunn 8 med 150 μL odlingsprov och Byt ut mediet från brunn 1 till 5 mot önskat medium med eller utan det stressinducerande reagensmedlet.
- Försegla mikroflödessystem plattan och placera den på mikroskopet scenen.
- På den mikroflödessystem programvaran (se tabell över material) kör cellen lastning förfarande. Kontrollera att belastningen av cellerna är tillfredsställande genom att titta under mikroskopet i genomlysning. Kör cellen lastning förfarande en andra gång om CELLTÄTHETEN i kammaren är otillräcklig.
- Utför noggrant fokus i genomlysnings läge och välj flera visningsområden som visar isolerade bakterier. Det är viktigt att välja fält som inte är överfulla för att kunna övervaka tillväxten av isolerade celler över tid (~ 10 − 20 celler per 100 μm2 rekommenderas). Detta kommer också att underlätta cell detektering under bildanalys.
- På den mikroflödessystem programvara, klicka på den skapa ett protokoll knappen. Program mera injektion av odlingssubstrat för 1 − 2 generations tids ekvivalenter så att cellerna kan anpassas (valfritt). Sedan programmera injektion av stress-inducerande medium under 10 min vid 2 PSI, följt av injektion vid 1 PSI för den önskade varaktigheten av stress behandling. Om du planerar att analysera återhämtningen av cellerna efter stress, programmera injektionen av färskt odlingssubstrat för önskad varaktighet.
Anmärkning: i experimentet presenteras här, cefalexin injicerades för 10 min vid 2 PSI, följt av 50 min vid 1 psi. Sedan, färskt odlingssubstrat injicerades vid 2 PSI för 10 min, följt av 3 h vid 1 psi. - Utför microskopi Imaging i Time-lapse-läge med 1 bildruta var 10 min med faskontrast i genomlysning och en 560 nm excitation ljuskälla för mCherry signalen om det behövs.
Obs: det är viktigt att starta mikroskopiskt bild förvärv samtidigt som starten av mikroflödessystem Injection Protocol.
6. bildanalys
ANMÄRKNINGAR: det här avsnittet beskriver kortfattat de viktigaste stegen för bearbetning och analys av ögonblicksbilder och tids fördröjnings mikroskopiavbildningar. Öppning och visualisering av mikroskopi bilder görs med öppen källkod ImageJ/Fiji (https://fiji.sc/)11. Kvantitativ bildanalys utförs med hjälp av öppen källkod ImageJ/Fiji programvara tillsammans med gratis MicrobeJ plugin12 (https://microbej.com). Detta protokoll använder MicrobeJ 5.13 I-versionen.
- Öppna Fiji programvara och MicrobeJ plugin.
- För ögonblicks bilds analys, släpp alla bilder som motsvarar en Mikroskop bild (ett prov) i MicrobeJ lastning bar att sammanfoga bilder och spara den erhållna bilden stackar fil. För Time-lapse data, släpp bara bilden stacken i lastning bar MicrobeJ.
- Kör automatiserad detektion av cellernas konturer baserat på segmenteringen av faskontrast bild och, om det är relevant, av nukleoider baserat på segmenteringen av den färgade DNA-fluorescenssignalen. Kontrollera noggrannheten för cell identifieringen visuellt och Använd MicrobeJ Redigeringsverktyg för korrigering om det behövs. Spara resultatfilen som erhållits.
Obs: de inställningar som används för detektion av E. coli -celler anges i tabellen av material (se kolumnen kommentarer/Beskrivning av microbej). För andra bakteriearter (särskilt för icke-Rod-form bakterier), måste användaren förfina inställningarna innan detektering (se MicrobeJ tutorial). För tidsförlopp bilder, kör en semi-automatiserad detektering av cellerna med hjälp av MicrobeJ redigeringsverktyg kan vara att föredra att tillåta fokusering på ödet för enskilda celler (se MicrobeJ tutorial). - Klicka på ikonen resultj att slutföra analysen och få resultj fönstret. Många olika typer av output grafer kan genereras från den punkten. Rita de normaliserade histogrammen av cellens form/längd och medelvärdet av nukleoidantalet per cell.
Representative Results
Det förfarande som beskrivs användes för att analysera beteendet hos Escherichia coli K12 celler under övergående exponering för cefalexin, ett antibiotikum som specifikt hämmar celldelning (figur 1A)13. Den Hupa-mcherry E. coli stam som producerar fluorescerande märkt hu protein i samband med kromosom DNA användes för att undersöka dynamiken i kromosomen under denna behandling8,9. De exponentiellt växande Hupa-mCherry E. coli celler analyserades före (t0) och 60 min efter inkubering med cefalexin (t60). Sedan, antibiotikum spolades bort och återhämtning av cellpopulationen efter 1 h (t120) och 2 h (t180) analyserades (figur 1B).
Figur 1: förfarande för analys av bakteriella svar på stress behandlingar. A) Schematisk metod. B) tecknad serie som illustrerar cellmorfologin vid normal tillväxt i fylligt medium och under övergående exponering för cefalexin (Ceph.), från tillägg vid (t0) och efter cefalexin tvätt från (t60) till (t180). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Den parallella utvecklingen av OD och CFU/mL är en första indikator som hjälper till att förstå effekten av stress behandlingar. Dessa två parametrar är strikt korrelerade under oberörd tillväxt men är ofta okopplade och utvecklas självständigt under stress. Cellkulturer växer i närvaro av cefalexin uppvisade liknande OD600Nm ökar som de obetonade kulturer (figur 2a), visar att drogen inte påverkade cell Mass syntes. Emellertid, koncentrationen av livskraftiga celler ökade inte när cefalexin var närvarande på grund av strikt hämning av celldelning (figur 2B). Celler började dela igen när cefalexin togs bort och så småningom nådde en koncentration som motsvarar den ostressade kulturen vid (t180). Dessa resultat återspeglar den bakteriostatiska effekten av cefalexin, som inducerar en helt reversibel hämning av celldelning. Olika spänningar kommer att resultera i olika unkoppling av OD och CFU/mL kurvor, beroende på effekten induceras (t. ex., modifiering av cellens morfologi såsom filamentation eller utbuktning, celldöd med eller utan Lys). En icke uttömmande förteckning över möjliga resultat resultat som tyder på olika stressinducerade effekter presenteras i figur 2C.
Figur 2: bakterietillväxt övervakning av obehandlade och cefalexin-behandlade celler på populationsnivå. A) övervakning av optisk densitet (OD600Nm/ml). Bkoncentration av livskraftiga celler CFU/ml inom obehandlade och cefalexin-60Min-behandlade kulturer. Felstaplar anger standardavvikelsen för en experimentell triplicate. C) schematik om möjliga resultat och tillhörande stress effekter. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Encellig analys är avgörande för att korrekt tolka stressreaktionen som observerats på populationsnivå. Flödescytometri möjliggör undersökning av Cellstorlek och DNA-halt i flera tusen celler14,15 (figur 3). Exponeringen för cefalexin framkallade den parallella ökningen av Cellstorlek och DNA-halt (t60). När cefalexin togs bort, befolkningen Cellstorlek och DNA-innehåll minskade gradvis för att bli liknande den ostressade befolkningen vid t180. Dessa resultat visar att cefalexin inte inhiberar DNA-replikation och provocerade bildandet av trådformiga celler som innehöll flera kromosom motsvarigheter. Dessa glödtrådar delas in i celler med normal Cellstorlek och DNA-innehåll när drogen spolades bort. Flödescytometri resultat skulle vara mycket olika för spänningar som hämmar DNA-syntes, vilket leder till bildandet av trådformiga celler som innehåller endast en icke-replikerande kromosom. I så fall skulle cellstorleken öka på samma sätt, men skulle inte vara förknippad med ökning av DNA-innehåll.
Figur 3: representativ flödescytometri analys av obehandlade och cefalexin-60Min-behandlade celler. A) histogram för cell storleksfördelning (FSC-H). B) histogram av DNA-innehåll (FL1-SYTO9). n = 120 000 celler analyserade. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Snapshot mikroskopi Imaging användes för att undersöka cellens morfologi och den intracellulära organisationen av DNA som visas av hu-mcherry lokalisering (figur 4a). Cephalexin provocerade bildandet av långa celler med normal cellbredd och ingen Division septa. Dessa släta glödtrådar innehöll regelbundet fördelade DNA-strukturer som kallas nukleoider, bekräftar att cefalexin inte påverkade kromosom replikering och segregering. Kvantitativ bildanalys bekräftade till stor del den Cellstorlek och DNA-innehållsökning som tidigare observerats med flödescytometri (figur 4B, C). Resultaten skulle vara mycket olika för spänningar som inducerar DNA-skador, vilket leder till bildandet av trådformiga celler där replikering fortsätter men segregering är nedsatt. I så fall skulle Cellstorlek och DNA-innehåll öka på samma sätt, men cellerna skulle hysa en enda ostrukturerad massa av DNA. Ögonblicksbilder kan också avslöja andra typer av avvikande cell former eller närvaron av mini, anucleate, eller lyserat celler (spökceller).
Figur 4: mikroskopi ögonblicksbild analys av obehandlade och cefalexin-60Min-behandlade celler. A) representativa mikroskopibildersomvisar faskontrast (grå) och HU-mcherry-signal (röd). B) histogram för distribution av cell längder. Skalstapel = 5 μm. (C) histogram av antalet nukleoid per cell. Mellan 800 och 2 000 celler analyserades för varje prov. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Time-lapse mikroskopi i samband med mikroflödessystem apparat16 bidragit till att fastställa fenotyper som tidigare observerats och ger ytterligare insikter om utveckling och kausalitet av tillväxt bristen. Time-lapse bilder (figur 5A och film 1) bekräftade att cell förlängning (cell Mass syntes), och kromosom replikering och segregering inte hämmas av exponering för cefalexin. Dessutom avslöjade det processen för återhämtning när cefalexin togs bort. Analys av den trådformiga cellen härstamning visade att celldelningen startar ~ 20 min efter tvättning bort drogen (figur 5B). De resulterande uppdelade cellerna var livskraftiga, eftersom de i sin tur delas, så småningom leder till bildandet av 33 celler som uppvisar normal storlek och DNA-innehåll. Detta tillät beräkning av en total generationstid på ~ 31 min över 180 min av experimentet, som liknar den generation tid som beräknats för den ostressade befolkningen från CFU/mL mätningar (~ 33 min).
Figur 5: mikroskopi tidsfördröjning analys av cefalexin-60Min-behandlade celler. A) representativa mikroskopibildersomvisar faskontrast (grå) och HU-mcherry-signal (röd). Den övervakade trådformiga cellen indikeras av den vita konturerna, och delade celler med olika färger. Skalstapel = 5 μm. (B) schematisk representation av den trådformiga cell linjen som motsvarar panelen (a) och film 1. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Film 1: Microfluidic film av E. coli hu-mcherry behandlas med cefalexin. Cefalexin injicerades efter 60 min, följt av injektion av färskt RDM medium för 3 h. tid anges i gult (1 ram varje 10 min). Scale bar = 5 μm. vänligen klicka här för att se denna video (Högerklicka för att ladda ner).
Discussion
Det är viktigt att uppmärksamma tillväxt tillståndet för cellerna under förfarandet. Odla cellerna över flera generationer innan de når en fullständig exponentiell fas. För framgången med denna metod är det viktigt att alla celler prover samlas samtidigt, och det är bäst att analysera endast en behandlad och en obehandlad kultur på samma gång. Cell prov för mikroskopi avbildning skall bibehållas vid försöks temperaturen under hela förfarandet. Det är då viktigt att förvärmas Mikroskop kammaren och mikroflödessystem kammare innan experimentet inleds. Om cellprover för flödescytometri inte kan analyseras lätt, kan de hållas på is i upp till 6 h. inkubation på is kommer att begränsa tillväxten och morfologisk modifiering av cellerna. Alternativt, användaren kan överväga att använda fixering av cellerna i etanol 75%, som vanligtvis rekommenderas för flödescytometri10. Om protokollet kräver tvättning av spännings induktor från mediet, Centrifugera och Pipettera celler mycket noggrant för att undvika att skada de potentiella avvikande cellerna.
Både flödescytometri och ögonblicks bilds analys ger tillgång till Cellstorlek och parametrar för DNA-innehåll, med ögonblicksbilder som ger ytterligare observation av cellmorfologin. DNA-färgning med DAPI10 (4 ', 6-diamidino-2-fenylindol) eller andra stabila DNA-färgämnen kan utföras om ingen fluorescerande fusion finns tillgänglig för att observera nukleoiderna i organismen av intresse. Om flödescytometrianalys inte kan utföras är det viktigt att avbilda och analysera ett stort antal celler med mikroskopi.
Mikroskopi avbildning kan också utföras med hjälp av stammar som transporterar fluorescerande fusioner till proteiner som är inblandade i specifika vägar av intresse. Detta skulle bidra till att avslöja effekten av stress på en mängd olika cellulära processer såsom replikering, transkription, cellväggsyntes, eller celldelning. Metoden kan appliceras på en rad bakteriearter, det enda kravet är att den mikrofluidiska apparaten skall vara förenlig med cellernas morfologi. Standard mikroflödessystem plattor är lämpliga för spö-form bakterier med en cellbredd mellan 0,7 μm och 4,5 μm. Kocker, ovokocker eller andra bakteriestammar med säregna former måste dock testas. Alternativt, om mikroflödessystem experiment inte kan utföras på grund av otillgänglighet av utrustningen eller oförenliga bakteriestammar, tid-lapse Imaging kan utföras på aganmonterade diabilder för en maximal tid på 2H.
Den övergripande fördelen med denna multi-Scale analys är att ge en global vision av effekten av stress induktion på flera aspekter av bakteriell tillväxtförmåga (dvs., Mass syntes, cell lönsamhet, cellmorfologi, membran integritet, DNA-innehåll) och hur dessa utvecklas med tiden i en bakterie population som växer under stressförhållanden. Det gör det också möjligt att analysera återställande av normal tillväxt på Single-cellnivå och populationsnivå. Metoden är tillämplig på ett brett spektrum av bakteriearter och praktiskt taget alla typer av stress behandling, såsom exponering för antibiotika eller andra antimikrobiella substanser, analys av påverkan av interaktion med andra organismer i flera arter populationer eller effekten av genetisk mutation.
Disclosures
Författarna förklarade inga konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Författarna tackar F. kornett för att ge Hupa-mCherry stam, a. Dedieu för tekniskt stöd med cytometry, och a. Ducret för hjälp med MicrobeJ. Finansiering: C. Lesterlin erkänner INSERM och CNRS institutioner samt ATIP-Avenir programmet, Schlumberger Stiftelsen för utbildning och forskning (FSER 2019), den ANR finansiering för PlasMed forskningsprogram (ANR-18-CE35-0008) samt FINOVI för finansiering till J. Cayron; La Ligue contre le cancer för finansiering av flödescytometerns utrustning. Författare bidrag: C.L. och J.C. konstruerade förfarandet och skrev papperet; J.C. utförde experimenten och analyserade data.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | BioRad | 1613100 | Certified molecular biology agarose |
| Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer | ThermoFisher scientific | A24858 | Cytometer |
| CellASIC ONIX Microfluidic System | Merck Millipore | CAX2-S0000 | Microfluidic system |
| CellASIC ONIX2 FG | Merck Millipore | ONIX2 1.0.1 | Microfluidic software |
| CellASIC ONIX2 Manifold Basic | Merck Millipore | CAX2-MBC20 | Manifold system |
| CytoOne 96-well plate with lid | Starlab | CC7672-7596 | Microplate with 0,2 mL well working volume and clear flat bottom, for automated plate reader |
| E. coli strain carrying a chromosomal insertion for a hupA-mCherry fusion | Created by P1 transduction of hupA-mCherry in E. coli MG1655 | ||
| Fiji | ImageJ | https://fiji.sc/ | Image software. Cite Schindelin et al. if used in publication |
| Gene Frame | Thermo Scientific | AB-0578 | Blue frame (125 μL, 1,7 x 2,8 cm) |
| Luria-Broth agarose medium | MP Biomedicals | 3002232 | Growth medium for plating assay |
| MicrobeJ | Imagej/Fiji plugin | https://www.microbej.com/ | Microscopy image analysis plugin. Cite Ducret et al. If used in publication; Detection settings: For bacteria : Area (μm2): 0,1-max; Length (μm): 0,5-max; Width (μm): 0,6-max; Range (μm): 0,5-max; Angularity (rad): 0-0,3; 0-max for all other parameters. For nucleoid: Tolerance: 500; Threshold: Local; 0-max for all other parameters |
| Microfluidic Plates CellASIC ONIX | Merck Millipore | B04A-03-5PK | Plate for Microfluidic system |
| Microscope Nikon eclipse Ti | Nikon | Fluorescence microscope | |
| MOPS EZ Rich Defined Medium (RDM) | Teknova | M2105 | Growth rich medium, 10x MOPS Mixture, 0,132 M K2HPO4, 10x AGCU, 5x Supplement EZ, 20% Glucose. Filtered at 0,22 μm |
| SYTO9 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain | ThermoFisher scientific | S34854 | DNA fluorescent dye |
| TECAN Infinite M1000 | TECAN | 30034301 | Automated plate reader |
References
- Donachie, W. D., Begg, K. J., Vicente, M. Cell length, cell growth and cell division. Nature. 264 (5584), 328-333 (1976).
- Donachie, W. D., Blakely, G. W. Coupling the initiation of chromosome replication to cell size in Escherichia coli. Current Opinion in Microbiology. 6 (2), 146-150 (2003).
- Patterson, D., Gillespie, D. Effect of Elevated Temperatures on Protein Synthesis in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 112 (3), 1177 (1972).
- Begg, K. J., Donachie, W. D. Cell shape and division in Escherichia coli: experiments with shape and division mutants. Journal of Bacteriology. 163 (2), 615-622 (1985).
- Van De Putte, P., Van Dillewijn, J., Roersch, A. The Selection of Mutants of Escherichia Coli with Impaired Cell Division at Elevated Temperature. Mutation Research. 106, 121-128 (1964).
- Walker, A. R. Initial characterization of temperature-sensitive cell division mutants of Escherichia coli. Biochemical and Biophysical Research Communications. 47 (5), 1074-1079 (1972).
- Lesterlin, C., Duabrry, N. Investigating Bacterial Chromosome Architecture. Chromosome Architecture. 1431, http://link.springer.com/10.1007/978-1-4939-3631-1_6 61-72 (2016).
- Stracy, M., et al. Live-cell superresolution microscopy reveals the organization of RNA polymerase in the bacterial nucleoid. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (32), E4390-E4399 (2015).
- Fisher, J. K., et al. Four-dimensional imaging of E. coli nucleoid organization and dynamics in living cells. Cell. 153 (4), 882-895 (2013).
- Lesterlin, C., Pages, C., Dubarry, N., Dasgupta, S., Cornet, F. Asymmetry of chromosome Replichores renders the DNA translocase activity of FtsK essential for cell division and cell shape maintenance in Escherichia coli. PLoS genetics. 4 (12), e1000288 (2008).
- Schindelin, J., et al. Fiji - an Open Source platform for biological image analysis. Nature Methods. 9 (7), (2019).
- Ducret, A., Quardokus, E. M., Brun, Y. V. MicrobeJ, a tool for high throughput bacterial cell detection and quantitative analysis. Nature Microbiology. 1 (7), 16077 (2016).
- Rolinson, G. N. Effect of beta-lactam antibiotics on bacterial cell growth rate. Journal of General Microbiology. 120 (2), 317-323 (1980).
- Boye, E., Løbner-Olesen, A. Flow cytometry: illuminating microbiology. The New Biologist. 2 (2), 119-125 (1990).
- Rieseberg, M., Kasper, C., Reardon, K. F., Scheper, T. Flow cytometry in biotechnology. Applied Microbiology and Biotechnology. 56 (3-4), 350-360 (2001).
- Nolivos, S., et al. Role of AcrAB-TolC multidrug efflux pump in drug-resistance acquisition by plasmid transfer. Science. 364 (6442), 778-782 (2019).
- Chao, Y., Zhang, T. Optimization of fixation methods for observation of bacterial cell morphology and surface ultrastructures by atomic force microscopy. Applied Microbiology and Biotechnology. 92 (2), 381-392 (2011).
