Summary
هنا، نقدم إجراء مفصل لتشغيل تصميم التجربة في مفاعل حيوي صغير آلي يليه حصاد الخلايا وقياس البروتين باستخدام عمود البروتين A.
Abstract
التحسين من العمليات الحيوية لزيادة غلة المنتجات المطلوبة هو من الأهمية في صناعة الأدوية الحيوية. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق اختيار السلالة وتطوير معلمات المعالجة الحيوية. وقد استخدمت قوارير الهز لهذا الغرض. ومع ذلك، فإنها تفتقر إلى القدرة على التحكم في معلمات العملية مثل درجة الحموضة والأكسجين المذاب (DO). ويمكن التغلب على هذا القيد بمساعدة مفاعل حيوي صغير آلي. هذه المفاعلات الحيوية تحاكي الزراعة على نطاق أوسع. واحدة من المزايا الرئيسية لهذا النظام هو دمج تصميم التجربة (وزارة التجارة) في البرنامج. يتيح هذا التكامل إنشاء تصميم حيث يمكن تنوع معلمات العملية المتعددة في وقت واحد. يمكن تحليل معلمات العملية الحرجة وظروف المعالجة الحيوية المثلى داخل البرنامج. التركيز على العمل المعروض هنا هو تعريف المستخدم على الخطوات التي ينطوي عليها تصميم العملية في البرمجيات ودمج وزارة الزراعة ضمن تشغيل الزراعة.
Introduction
بلغت قيمة السوق العالمية للأدوية الحيوية أكثر من 250 مليار دولار أمريكي في عام 2018، وقد توسعت باستمرار1. شركات الأدوية تتحرك بعيدا عن إنتاج الأدوية الجزيئية الصغيرة إلى العلاجات المنتجة تكنولوجيا حيوية مثل البروتينات المؤتلفة. وهذه وحدها مسؤولة عن إيرادات تزيد على 150 بليون دولار1. وتستخدم الآن خلايا الثدييات على نطاق واسع لإنتاج هذه البروتينات الصيدلانية المؤتلفة. في الفترة الحالية ، من بين 68 منتجًا معتمدًا تنتجها خلايا الثدييات ، يتم إنتاج 57 منتجًا بواسطة خلايا مبيض الهامستر الصينية (CHO)2. وتستخدم خلايا CHO خصيصا لإنتاج البروتينات المؤتلفة التي تتطلب تعديلات ما بعد الترجمة. ويفضل هذه الخلايا لأنها تنمو في تعليق وبالتالي تمكين نتائج قابلة للاستنساخ في مصل المتوسط الحرة المحددة كيميائيا3,4. الميزة الأخرى لاستخدام خلايا CHO هي أن بنية الغليكان للمنتج تشبه بنية الأجسام المضادة أحادية النسيلة البشرية (mAb) وتؤدي إلى زيادة غلة البروتين المؤتلف والإنتاجية المحددة بسبب تضخيم الجينات5.
وقد زاد العائد من المؤتلف CHO (rCHO) ثقافة الخلية بنسبة مائة مرة في العقدين الماضيين. ويعزى هذا التحسن إلى الاستفادة المثلى من معلمات العملية، واستراتيجية التغذية وتطوير مصل خال من المتوسط المحدد كيميائيا6. مع زيادة في متطلبات المنتجات الصيدلانية ، يزيد الضغط على كفاءة التكلفة والوقت لتطوير عملية الإنتاج7. للحد من الضغط مع ضمان جودة المنتج قد أعاد توجيه تركيز صناعة الأدوية على الجودة حسب التصميم (QbD). يتم استخدام QbD لفهم إنتاج المنتج وكذلك العملية. أداة حيوية تستخدم في ObD هو تصميم التجربة (DOE). فهو يساعد على زيادة فهم العملية من خلال الكشف عن العلاقة بين متغيرات الإدخال المختلفة وبيانات الإخراج الناتجة. إن تطبيق نهج وزارة الطاقة لتحسين العملية الحيوية مفيد خلال المراحل المبكرة من المشروع في استيعاب ظروف العملية وزيادة كمية ونوعية التتر. وهذا النهج مفيد بالمقارنة مع الاستراتيجية القديمة: عامل واحد في الوقت الواحد(OFAT). النهج الإحصائية لوزارة التعليم باستخدام الكلاسيكية، الجينين أو تاغوشي هي أعلى بكثير من OFAT8.
يمكن تنفيذ العملية وتحسين الوسائط في قوارير اهتزازية. القوارير غير مكلفة نسبيا. ومع ذلك ، فإنه ليس من الممكن للسيطرة على المعلمات مثل درجة الحرارة ودرجة الحموضة والأكسجين المذاب (DO). للتغلب على هذه العيوب، يمكن استخدام المفاعلات الحيوية متعددة الإستعمالات على مقاعد البدلاء التي تتراوح بين حجم العمل من 0.5 لتر إلى 5 لتر. وتوفر المفاعلات رصدا ً واسع النطاق على الإنترنت ومراقبة للعمليات. ومع ذلك ، فإن استخدام المفاعل الحيوي متعدد الإستخدامات هو وقت كثيف وكثيف العمالة. من أجل التغلب على هذه العيوب ، يتم استخدام مفاعل حيوي جديد أحادي الاستخدام يجمع بين العملية الشاملة لمراقبة المفاعل الحيوي على أعلى مقاعد البدلاء وسهولة التعامل مع قارورة الهزة. وقد ساهم نظام فحص الإنتاجية العالية والتكنولوجيا ذات الاستخدام الواحد في تعزيز كفاءة أداء العمليةوتطويرها 9.
في هذه المقالة، يتم سرد المبادئ التوجيهية لتحميل الوصفة في برنامج المفاعل الحيوي الصغير الآلي (AMBR). يتم دراسة تأثير سرعات التحريك المختلفة ودرجة الحموضة على تركيز الخلية القابلة للحياة (VCC) وtiter أثناء هذه التجربة. يتم تنفيذ النتيجة التجريبية والتحليل مع تصميم برنامج التجارب MODDE 12. يتم إجراء تحليلات المنتج في نظام كروماتوغرافيا سائلة عالية الضغط (HPLC) مع عمود بروتين A. وهو يقوم على مبدأ أن منطقة Fc من mAb يربط إلى البروتين A مع تقارب عالية10،11. مع هذه الطريقة، فمن الممكن لتحديد وقياس mAb. يتم تنفيذ القياس الكمي على مناطق الذروة اللاوتية المقاسة في 280 نانومتر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1- إجراء الثقافة المسبقة
ملاحظة: يتم استخدام الخلايا المؤتلفة CHO DG44 مع تركيز خلية قابلة للحياة من 1 × 107 خلايا / مل لهذا البروتوكول.
- إذابة القارورة التي تحتوي على 1.2 مل من الخلايا إلى درجة حرارة الغرفة ونقل تعليق الخلية على الفور إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي 15 مل يحتوي على 10 مل من متوسط البذور الباردة.
- طرد مركزي أنبوب الطرد المركزي المخروطية لمدة 5 دقائق في 190 × ز ودرجة حرارة الغرفة والتخلص من supernatant.
- قبل الحرارة 150 مل من متوسط البذور في قارورة اهتزاز 500 مل إلى 36.8 درجة مئوية.
- إعادة تعليق بلطف بيليه الخلية في 10 مل من متوسط البذور الدافئة مسبقا ونقل الخلايا إلى قارورة يهز.
- استخدم 1 مل من العينة من القارورة لقياس VCC الأولي والجدوى باستخدام عداد الخلية.
ملاحظة: وينبغي أن تكون قابلية البقاء أعلى من 70٪ بعد ذوبان للزراعة الناجحة. - احتضان قارورة الهزة في شاكر مداري (قطر شاكر من 19 ملم) عند 36.8 درجة مئوية و 7.5٪ CO2 مع معدل اهتزاز من 120 دورة في الدقيقة.
ملاحظة: تختلف هذه الظروف حسب إجهاد الخلية والمتوسطة. - بعد ثلاثة أيام من تمرير الخلايا، قم بإزالة قارورة الهزة من شاكر ووضعها تحت خزانة تدفق اللامينار. خذ 1 مل من العينة لقياس تركيز الخلية النهائية. حساب حجم ليتم نقلها إلى جديدة قبل تسخين هاوية البذور المتوسطة بحيث تركيز الخلية الأولية في الممر الجديد هو 2 × 105 خلايا / مل.
- مرور الخلايا 5 مرات في المجموع قبل نقلها إلى المفاعل الحيوي للزراعة الرئيسية.
2- الزراعة الرئيسية
- قياس تركيز الخلية النهائية للزراعة المسبقة. حساب حجم ليتم نقلها إلى المفاعل الحيوي بحيث تركيز الخلية الأولية في المفاعل هو 3 × 105 خلايا / مل.
- ملء المفاعل مع المتوسطة الإنتاج قبل يوم واحد من التطعيم لتوازن المفاعل وتعيين معلمات العملية مثل درجة الحرارة والحموضة وDO.
ملاحظة: شروط الزراعة هي 36.8 درجة مئوية و 60٪ تركيز الأكسجين المذاب (DO). اختبرنا سرعات التحريك من 1050 دورة في الدقيقة و 1300 دورة في الدقيقة جنبا إلى جنب مع درجة الحموضة من 6.9 و 7.1 و 7.3. المدة الإجمالية للزراعة هي 12 يوما حتى يتم حصاد الخلايا. يتم تشغيل عملية الدفعي لمدة 72 ساعة يتم بعدها إضافة وسيط التغذية كل 24 ساعة. يتم سرد البروتوكول الذي سيتم استخدامه للزراعة بالتفصيل في الجزء التالي.
3. كتابة وصفة في الآلي مايكرو مفاعل حيوي البرمجيات
ملاحظة: هناك طريقتان لكتابة وصفة في برنامج ثقافة الخلية AMBR: يتم إنشاؤه إما باستخدام معالج أو عن طريق إضافة كل خطوة يدويًا. لأغراض هذا البروتوكول، يتم عرض الخطوات باستخدام المعالج.
- إنشاء تجربة جديدة
- فتح برنامج ثقافة الخلية AMBR وفي علامة التبويب مقدمة انقر على إنشاء تجربة جديدة.
- تحميل الوصفة
- في علامة التبويب التجربة الجديدة، أدخل اسم التجربة مع التاريخ الذي سيتم إجراؤه اجرانه فيه.
- تفعيل نقطة التفتيش لمحطة الثقافة والسفن التي سيتم استخدامها أثناء الزراعة. كما سيتم تنشيط علامات إضافة تلقائية لـ DOE للانتقال بسهولة أثناء برمجة تجربة DOE. انقر على التالي للتبديل إلى علامة التبويب التالية.
- تعيين معلومات حول إضافة وسائل الإعلام إلى السفينة جنبا إلى جنب مع مضاد للرغوة، والتطعيم، والأعلاف والجلوكوز.
- تنشيط نقطة الاختيار إضافة لوحة الوسائط. حدد نوع اللوحة واسمها وموقع اللوحة التي تحتوي على الوسط.
تنبيه: اعتمادا على نوع لوحة وإذا كان لوحة يحتوي على غطاء، تنشيط الاختيار على هو ليد لضمان الأداء السلس للمعالج السائل - انقر على إضافة الوسائط إلى السفن. أدخل حجم الوسائط التي سيتم إضافتها إلى السفن. تحديد رسم خرائط نقل وسائل الإعلام من اللوحة إلى السفن. انقر على التالي للتبديل إلى علامة التبويب التالية.
- تنشيط نقطة الاختيار إضافة لوحة الوسائط. حدد نوع اللوحة واسمها وموقع اللوحة التي تحتوي على الوسط.
- تعيين شروط الزراعة في المفاعل.
- بعد أن يتم تغذية المعلومات الإعلامية في البرنامج، تعيين شروط الزراعة. انقر على حالة وسائل الإعلام وملء درجة الحرارة، والهدف DO، والحد من درجة الحموضة العليا واثارة دورة في الدقيقة (حتى اثارة أو أسفل التحريك).
- تعيين إضافة التطعيمات إلى الأوعية.
- تنشيط إضافة لوحة الخلية. حدد نوع اللوحة واسمها وموقع اللوحة التي تحتوي على الوسط.
- انقر على إضافة الخلايا إلى السفن. أدخل وقت التطعيم وحجم الوسائط التي سيتم إضافتها إلى الأوعية.
- تحديد المسار الذي سلكه المعالج السائل لنقل الخلية من اللوحة إلى الأوعية. انقر على التالي للتبديل إلى علامة التبويب التالية.
ملاحظة: ضمان إلغاء تنشيط إعادة استخدام تلميحات مابيت لتجنب التلوث المتبادل وتركيز الخلية الأولية غير صحيحة قابلة للحياة.
- تعيين إضافة الأعلاف والجلوكوز ومضادات الرغوة.
ملاحظة: إجراءات إضافة الأعلاف والجلوكوز ومضادات الرغوة مشابهة لبعضها البعض. من أجل هذا البروتوكول يتم سرد الإجراء ل "تغذية". ويمكن تكرار هذا للجلوكوز ومضاد الرغوة.- قم بتنشيط لوحة إضافة تغذية وحدد نوع اللوحة واسمها وموقعها. انقر على إضافة تغذية إلى السفن وأدخل حجم الأعلاف التي سيتم إضافتها إلى السفن. تحديد رسم خرائط نقل الأعلاف من اللوحة إلى السفن.
- اعتمادا على زراعة، إضافة عدد من الأعلاف إضافة. لهذه الزراعة، يتم تغذية المفاعل بعد 72 ساعة لكل 24 ساعة.
- إضافة يدويا تأخير الوقت بين التغذية عن طريق إدخال البيانات في تأخير من الخلايا المضافة. اليوم الأول من التغذية هو بعد 72 ساعة من التطعيم والتالي هو بعد 96 ساعة وهلم جرا.
ملاحظة: يتم برمجة إضافة مضاد للرغوة ليتم إضافته ايضًا كل يوم لتجنب الرغوة أثناء الزراعة.
- تعيين أخذ العينات أثناء الزراعة.
- قم بتنشيط لوحة إضافة عينة وحدد نوع اللوحة واسمها وموقعها.
- تحقق من أخذ عينة من السفن وأدخل حجم العينة التي سيتم إزالتها من السفن. تحديد رسم خرائط نقل العينة من السفن إلى اللوحة. تأكد من أن حجم لا يقل عن 10 مل خلال كامل مسار الزراعة.
- إضافة عدد العينات التي يجب أخذها أثناء الزراعة. على غرار التغذية، أضف وقت العينة التي تتم إزالتها من السفينة لكل نقطة عينة إدخال.
- حفظ العملية. وهي الآن جاهزة للتنفيذ.
ملاحظة: لضمان التشغيل السلس للبروتوكول، قم بالتبديل إلى علامة التبويب "خطوات العملية" في برنامج ثقافة الخلية AMBR وحدد طريقة عرض "خطوة العملية" لتصور تدفق الوصفة.
- في علامة التبويب التجربة الجديدة، أدخل اسم التجربة مع التاريخ الذي سيتم إجراؤه اجرانه فيه.
- تصميم التجربة في المفاعل الحيوي الصغير الآلي
- من أجل تشغيل برنامج DOE للمفاعل الحيوي ، تأكد من أن يتم حفظ الوصفة في البرنامج الرئيسي وجاهزة للاستخدام.
- فتح AMBR 15 DOE البرمجيات وانقر على التحقيق وحدد جديد.
- أدخل اسم تحقيق DOE الجديد في مربع حوار إنشاء التحقيق.
- من أجل تعيين تجربة لتحقيق DOE ، افتح الوصفة التي تم إنشاؤها لدراسة المعلمات المختلفة. انقر على استعراض وتحديد التجربة المعنية.
- تحديد عامل DOE.
- يتم بالفعل إدراج علامات الوعاء في العمود. لتحديد عامل DOE المطلوب، حدد المعلمة وانقر على العمود المسمى عامل DOE. حدد جديد وإضافة وحدات، اختصار، الحد الأدنى والعلوي من العوامل (على سبيل المثال، درجة الحرارة، DO، درجة الحموضة).
- تحديد عامل الاستجابة.
- بمجرد تحديد عوامل الـ DOE، حدد الاستجابة التي سيتم على أساسها هيكلة التحليل التجريبي.
- في علامة التبويب الاستجابات، حدد القيم التي يجب مراعاتها لتحليل البيانات.
- انقر على تحرير استجابات DOE وحدد اسم الاستجابة والاختصار والوحدات والحدود الدنيا والقصوى (على سبيل المثال، titer، تركيز الخلية قابلة للحياة).
- بمجرد تعريف الاستجابات، حدد متغير AMBR لكل استجابة وحدد المتغير. يمكن ربط الاستجابة تلقائيًا بمتغير مفاعل حيوي صغير، اختر المتغير المطلوب من القائمة المنسدلة.
- تغيير المعادلة لكل استجابة اعتماداً على المطلب. الخيار هو بين الحد الأدنى والحد الأقصى والأول والأخير ومتوسط البيانات.
- إنشاء تصميم.
- استخدم معالج تصميم البدء لتحديد نوع التصميم التجريبي، لإضافة أو إزالة عدد النسخ المتماثلة ونقاط الوسط.
- حدد الهدف، الذي يحدد اختيار التصاميم والنماذج:
الفحص: يستخدم نماذج خطية وتفاعلية للعثور على العوامل الهامة
الأمثل (RSM)، ويستخدم نماذج التربيعية ومكعبة للنمذجة التفصيلية والتحسين
تقسيم الهدف: يمكن اختيار نماذج لعوامل الصياغة والعملية بشكل منفصل - بمجرد تحديد الهدف ، حدد النموذج والتصميم مع عدد نقاط المركز والنسخ المتماثل.
- انقر على إنهاء والتبديل إلى علامة التبويب التالية.
- تعريف التجربة.
ملاحظة: يتم سرد عوامل وزارة البيئة في العمود الأيمن من البرنامج. عند اختيار العوامل المطلوبة ، سيتم تسليط الضوء على السفن التي تعمل بتلك التجربة مع المعلمة المطلوبة. يمكن نقل السفن داخل محطة الثقافة عن طريق النقر على السفينة ونقلها إلى الموقع المطلوب.- إنشاء حزم العمل التي يمكن استيرادها في برنامج ثقافة الخلية AMBR. اعتمادا على عدد من التجارب يتم إنشاء حزم العمل المختلفة وتخزينها لمزيد من التنفيذ
- تنفيذ التجربة في حزم العمل التي تم إنشاؤها على كمبيوتر التحكم AMBR
- في علامة التبويب التجربة، انقر على إنشاء تجربة DOE وتصفح حزمة العمل التي تم إنشاؤها باستخدام برنامج DOE.
- تهيئة العملية بالنقر فوق ابدأ.
- تحليل النتائج التجريبية
- بمجرد تنفيذ التجربة، قم بتصدير البيانات باستخدام نتائج تصدير DOE. يتم فتح إطار "نتائج DOE Export" ويتم سرد الصفوف التي تشير إلى وعاء الثقافة والمحطة في الجدول.
- حدد الصفوف المطلوبة وانقر على الصفوف المحددة المصدرة أو تصدير البيانات التجريبية لتخزين جميع النتائج وحفظ الملف لمزيد من التحليل.
- استيراد البيانات إلى وحدة DoE AMBR عن طريق التبديل إلى علامة التبويب النتائج وتحديد نتائج الاستيراد.
- تصفح ملف البيانات المطلوب وانقر فوق نتائج التحليل.
- تحليل النتائج بشكل أكبر في MODDE.
4- تنفيذ الزراعة في المفاعل الحيوي الصغير الآلي
ملاحظة: يتم تنفيذ الخطوات التالية من قبل المستخدم بمساعدة البروتوكول المكتوب في البرنامج المذكور أعلاه. يتم تنفيذ الخطوات من قبل المستخدم ما لم يذكر خلاف ذلك.
- تحميل السفن
- فتح غاما تعقيم الأوعية الثقافة تحت مجلس الوزراء تدفق laminar والمشرق في محطة الثقافة كما هو مبين في الشكل 2.
- تنظيف لوحة المشبك مع الإيثانول 70٪ والمياه المقطرة مزدوجة. ثم، أوتوكلاف لوحة ومكان على رأس السفينة.
- قم بتركيب لوحة المشبك مع لوحة التحريك ، مما يضمن تثبيت كل دبوس بحزم.
- تشديد كل من لوحة التحريك ولوحة المشبك على الجمعية اثارة.
- تشغيل برنامج المفاعلات الحيوية الدقيقة
- استخدم البرنامج المكتوب في القسم 3 لتشغيل الزراعة.
- تصور خطوات العملية المجدولة أو المكتملة في علامة التبويب العملية. قم بتغيير خطوات الزراعة أثناء تشغيل العملية حسب الحاجة عن طريق إيقاف معالج السائل أولاً عن العمل المؤقت ثم تحرير وصفة العملية.
- إضافة الرغوة إلى الأوعية قبل أن يبدأ التحريك لضمان عدم وجود رغوة مفرطة أثناء الزراعة. سيتم إضافة الرغوة بانتظام ، ويتم الكشف عن الرغوة بصريًا.
- إضافة وسائل الإعلام إلى السفينة
- ملء لوحة بئر 24 مزودة المفاعلات الحيوية الدقيقة يدويا مع وسائل الإعلام العقيمة ومكان في سطح السفينة المعينة من النظام. تأكد من وضع اللوحة في سطح السفينة المعينة من قبل البرنامج المكتوب (القسم 3). وسيتم ملء السفينة على النحو المصممة في الفرع 3-2-2.
ملاحظة: درجة الحرارة والتحريك تبدأ مباشرة بعد إضافة وسائل الإعلام ومضاد الرغوة. يتم تنشيط قارئ المستشعر بعد ساعة واحدة من تعبئة السفينة (خطوة مراقبة البدء). يبدأ الغاز لكل سفينة بمجرد تنشيط القارئ. يتم ترك وسائل الإعلام للتوازن لمدة لا تقل عن 6 ساعات قبل إعادة معايرة درجة الحموضة والتطعيم. يمكن تغيير معلمات العملية في البرنامج كما هو مذكور في القسم 3.2.3.
- ملء لوحة بئر 24 مزودة المفاعلات الحيوية الدقيقة يدويا مع وسائل الإعلام العقيمة ومكان في سطح السفينة المعينة من النظام. تأكد من وضع اللوحة في سطح السفينة المعينة من قبل البرنامج المكتوب (القسم 3). وسيتم ملء السفينة على النحو المصممة في الفرع 3-2-2.
- تلقيح
- قياس تركيز الخلية قابلة للحياة بعدمرور 5. حساب عدد الخلايا التي سيتم نقلها إلى الأوعية للتأكد من أن تركيز الخلية الأولية في جميع الأوعية هو 3 × 105 خلايا / مل.
- نقل الخلايا إلى لوحة بئر عميقة 24 بحيث حجم التعليق هو ما لا يقل عن 1.6 أضعاف الحجم المطلوب. لحجم مطلوب من 2 مل من اللاوكولم، نقل 3.2 مل من تعليق الخلية إلى كل بئر في لوحة.
- ضع لوحة البئر 24 في سطح السفينة المعين. وسيتم تلقيح السفن كما هو الحال في الفرع 3-2-4.
- أخذ العينات والتحليلات اليومية
- قم بإزالة عينة 460 ميكرولتر من الأوعية كل يوم باستخدام معالج السائل. تمييع 200 ميكرولتر من العينة مع 800 ميكرولتر من المخزن المؤقت 1x PBS المصفاة (5x تخفيف)، ومن ثم وضع في عداد الخلية.
- طرد يُبقي من العينة لمدة 5 دقائق عند 190 x g ودرجة حرارة الغرفة وخزن المنتقّة لمزيد من التحليل (الجلوكوز واللاكتات والغلوتامين والغلوتامات).
- تجميد 100 ميكرولتر من supernatant في -20 درجة مئوية حتى نهاية زراعة للكم الكمي البروتين.
- نهاية الزراعة
- عندما يتم إنهاء التحكم في معلمة العملية (أي درجة الحرارة والهياج ودرجة الحموضة وDO) ، توقف عن مراقبة العملية.
- فك لوحة التحريك ولوحة المشبك.
- إزالة الأوعية الثقافة وتنظيف محطات الثقافة. وضع لوحات التجفيف على محطات الثقافة والمسمار لهم في.
- وفي الوقت نفسه، تنظيف لوحات المشبك جيدا مع الإيثانول 70٪ والمياه المقطرة مزدوجة.
- انقر على إيقاف في برنامج المفاعل الحيوي بمجرد الانتهاء من دورة التجفيف.
- حصاد استزراع الخلايا
- حصاد الخلايا في اليوم 12 من الزراعة عن طريق إزالة محتوى السفن يدويا إلى 50 مل أنابيب الطرد المركزي. طرد مركزي مرق الخلية في 190 × ز لمدة 30 دقيقة.
- تجاهل بيليه الخلية وتخزين supernatant في -20 درجة مئوية.
5. قياس تركيز mAb
- استخدام 1.7 مل بروتين عمود لتحديد كمية البروتين أثناء تشغيل الزراعة.
-
إعداد الحاجز المعادلة واللاوطي قبل إذابة العينات.
- استخدم محلول 0.5 M Na2HPO4 يحتوي على 0.5 M NaCl مع درجة الحموضة من 7.9 كحاجز توازن ومحلول من الجليسين 100 mM يحتوي على 0.5 M NaCl مع درجة الحموضة من 2 كعازل الإلوطي.
- تصفية كل من المخازن المؤقتة من خلال غشاء 0.2 ميكرون وديغا قبل وضعها للتحليل.
- قم بتطهير نظام الكروماتوغرافيا السائل عالي الأداء (HPLC) مع عازل توازني معد حديثًا.
- تحميل البروتين عمود على نظام HPLC.
- تنفيذ الكروماتوغرافيا بمعدل تدفق 1 مل / دقيقة. تعيين درجة حرارة الفرن العمود في 30 درجة مئوية ودرجة حرارة autosampler في 10 درجة مئوية
- إذابة العينات المجمدة في درجة حرارة الغرفة وتصفية 225 ميكرولتر من كل عينة من خلال غشاء PVDF 0.22 ميكرون. تمييع العينات مع تركيز أعلى من البروتين المطلوب في نسبة 1:20 مع عازل التوازن والتصفية من خلال الغشاء قبل وضع في autosampler.
- ضع العينات في العينات الذاتية. تحميل الأسلوب والتسلسل في البرنامج وبدء التسلسل.
ملاحظة: وتتألف الطريقة من ثلاث مراحل (انظر الشكل 1):حقن العينة في العمود لأول دقيقتين؛ تليها العازلة elution لمدة 8 دقيقة وتجديد العمود مع الحاجز التوازنلمدة 10 دقيقة.
الشكل 1: البروتين الكروماتوغرام، الذي يمثل المراحل المختلفة خلال تشغيل واحد. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويرد في الشكل 2لمحة عامة عن الزراعة التي أجريت في هذه الدراسة.
الشكل 2: التمثيل التخطيطي للظروف التجريبية لاختبار pH وملامح سرعة التحريك في محطات الثقافة. يمثل الشكل أيضًا التخطيط الصحيح لوضع الأوعية. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
ويماثل نمو الخلايا في المفاعلات الحيوية الدقيقة الآلية المفاعلات الحيوية المتعددة الإستخدامات. وهذا مبين في الشكل 3. تتم مقارنة تركيز الخلية من المقاييس الثلاثة المختلفة ويلاحظ أن المفاعل الحيوي الصغير الآلي 15 مل يحاكي المفاعل الحيوي الزجاجي 2 L. كما تقارن نتائج قارورة الهزة لإظهار فائدة AMBR.
الشكل 3: مقارنة تركيز الخلية القابلة للحياة على نطاقات مختلفة. 15 مل ميكرو بيومفاعلات، 150 مل يهز قارورة، و 2 L متعددة التطبيقات مفاعل حيوي زجاجي متعدد الإستخدام. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
يتم دراسة تأثير سرعة التحريك المختلفة والحموضة في المفاعلات الحيوية الدقيقة الآلية. تركيز الخلية قابلة للحياة (VCC) هي واحدة من المعلمات الحيوية لمقارنة الزراعة. يمثل الشكل 4 مقارنة تركيز VCC والأجسام المضادة أحادية النسيلة في المفاعلات الحيوية الدقيقة المختلفة. ويمثل الشكل 5 مخطط الاستجابة للردين اللذين تم النظر فيهما للمقارنة، وهما تركيز VCC وMAb. القيم قابلة للمقارنة في الأوعية بنفس درجة الحموضة وسرعة التحريك المختلفة ، مما يشير إلى أن سرعة التحريك المحددة لهذه العملية ليس لها تأثير كبير على إخراج العملية. بالنسبة للزراعة المستقبلية ، سيتم استخدام سرعة التحريك البالغة 1050 دورة في الدقيقة من أجل تجنب الرغوة.
ومع ذلك، فإن درجة الحموضة لها تأثير واضح على بيانات مخرجات العملية. يمكن ملاحظة التأثير السلبي لـ pH 6.9 على VCC في الشكل 4A. تحسن نمو الخلايا بشكل ملحوظ في ظل الثقافة عند درجة الحموضة 7.3 مقارنة بالهيدروجين 7.1. في الشكل 5B، يتم مقارنة تركيز الأجسام المضادة أحادية النسيلة للزراعة المختلفة. إنتاج mAb أبطأ في السفن التي يتم صيانتها عند درجة الحموضة 7.3. ومع ذلك ، فإن تركيز المنتج النهائي مشابه للسفينة التي يتم الحفاظ عليها عند درجة الحموضة 7.1.
الشكل 4: نتيجة تجربة وزارة النُهُوَة. (أ)صورة تركيز الخلية القابلة للحياة من تشغيل الزراعة لدراسة تأثير درجة الحموضة وسرعة التحريك(B)التشكيل الجانبي لتركيز الأجسام المضادة أحادية النسيلة على عملية دفعة تغذية في ظروف الزراعة المعنية. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: مؤامرة كفاف الاستجابة تشير إلى تأثير درجة الحموضة وسرعة التحريك على أقصى تركيز الخلية قابلة للحياة والأجسام المضادة أحادية النسيلة، على التوالي. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
واحدة من مزايا استخدام AMBR هو الرصد المستمر ومراقبة الزراعة. ويمكن ملاحظة رصد درجة الحموضة في الشكل 6. يتم التحكم في درجة الحموضة في النقطة المحددة باستخدام CO2. تغذية بولس من اليوم 3 هي المسؤولة عن ارتفاع في القيم.
الشكل 6: رصد درجة الحموضة في المفاعلات الحيوية الدقيقة الآلية للزراعة، مع نقاط محددة من الرقم الهيدروجيني 6.9 و 7.1 و 7.3 وسرعة التحريك 1050 دورة في الدقيقة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
تم تضييق معلمات العملية المستخدمة للاختبارات المستقبلية إلى سرعة تحريك 1050 دورة في الدقيقة ودرجة الحموضة 7.1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
إن تحسين عملية زيادة العائد أمر بالغ الأهمية في صناعة الأدوية الحيوية. يمكن استخدام قوارير الهز لفحص السلالة. ومع ذلك، مراقبة معلمات العملية مثل درجة الحموضة وDO غير متوفرة في القوارير. وللمفاعلات الحيوية الدقيقة ميزة لأنها تسمح بالرصد المستمر والسيطرة على العملية. هذه الحلقات التحكم في المفاعل الحيوي الدقيق توفر أيضا حالة مماثلة لتلك التي على نطاق أوسع، وبالتالي، تقديم النتائج التي هي مماثلة للمفاعلات الحيوية على نطاق أوسع. ميزة أخرى للمفاعل الحيوي الصغير هي مجموعة واسعة من الشروط التي يمكن اختبارها في نفس الإطار الزمني وبتكلفة أقل بالمقارنة مع المفاعلات الحيوية العليا مقاعد البدلاء من حيث الوقت والعمل12،13. كما أن الحجم الأصغر مفيد من حيث انخفاض تكاليف التشغيل بسبب انخفاض كمية الركيزة وانخفاض الاحتياجات من المساحة للعمليات الموازية؛ ومع ذلك ، يجب النظر في تكلفة السفن لأنه قد يكون أكثر تكلفة لتشغيل زراعة في المفاعلات الحيوية الدقيقة ذات الاستخدام الواحد بالمقارنة مع المفاعل الحيوي متعدد الإستخدامات على مقاعد البدلاء.
في حين أن هناك العديد من المزايا للنظام ، هناك بعض العيوب الكبيرة لاستخدام المفاعلات الحيوية الدقيقة. تغيير درجة الحموضة وDO لكل سفينة داخل محطة ثقافة واحدة ممكن؛ ومع ذلك ، لا يمكن تغيير سرعة التحريك ودرجة الحرارة لسفينة فردية. وهذا يزيد من عدد التجارب التي أجريت لتحديد السرعة المثلى للتحريك ودرجة الحرارة. تقتصر القياسات عبر الإنترنت على درجة الحموضة وDO. في الوقت الحقيقي رصد العملية من معلمات العملية الحرجة (CPP)، مثل درجة الحرارة، ودرجة الحموضة، DO، سيكون من المفيد لتجنب التأخير بين أخذ العينات والتحليل. لديها القدرة على أن تكون أداة مفيدة لتحسين الإنتاجية14. وقد يثبت أن التنمية في مجال القياسات الطيفية في المفاعلات الحيوية الدقيقة مفيدة في النماذج المقبلة.
مزايا تفوق مساوئ استخدام المفاعل الحيوي الصغير الآلي. ومع ذلك، هناك عدد قليل من المعايير التي يجب مراعاتها عند تشغيل هذه الأنظمة. أولا وقبل كل شيء هو تصميم السيناريو لتشغيل بنجاح زراعة. ومن الأهمية بمكان أن يكون النص المكتوب شاملا لجميع الخطوات الحاسمة مثل تعريف اللوحات جنبا إلى جنب مع رسم الخرائط الصحيحة للصفيحة والسفن. يجب التحقق من كافة المعلمات قبل بدء التجربة. تأكد من عدم جدولة أية خطوات عملية تحدث في نفس الوقت. سيؤدي هذا إلى اختيار محطة العمل خطوة واحدة على الأخرى.
معيار آخر مهم يجب التركيز عليه هو استخدام لوحات المشبك. يتم الأوتوكلاف لوحات قبل كل زراعة; هذا يمكن أن يؤدي إلى تلف حلقات O. تحقق بصريًا من حلقات O قبل الأوتوكلاف. يمكن أن يؤدي خلل O-حلقات في تباين غير متوقع في التحكم DO وpH. العامل الآخر للقراءات الخاطئة يمكن أن يكون اتصال فضفاض بين لوحة المشبك والأوعية. تأكد من أن لوحة المشبك ولوحات التحريك مؤمنة بإحكام إلى التجمع التحريك. استخدام أداة تشديد المقدمة مع النظام.
أثناء الزراعة ، من الأهمية بمكان مراقبة الرغوة بصريًا. مطلوب ما لا يقل عن 20 ميكرولتر من الرغوة المضادة في بداية الزراعة. الرغوة سوف يؤدي إلى السائل يجري موجودة في الحوض الصغير من لوحة المشبك. الزائدة من الرغوة في لوحة المشبك سيؤدي إلى تجاوز، مما يؤدي إلى الرغوة التي يتم جمعها في الجزء السفلي من محطة الثقافة، وحجب درجة الحموضة والبقع DO أن تقرأ من قبل أجهزة الاستشعار.
وثمة عامل هام آخر ينبغي التركيز عليه وهو استخدام برنامج وزارة البيئة. ويتيح برنامج وزارة الحماية المتكامل التصميم السريع للعملية التي تتضمن الشروط ذات الصلة. ويضمن تصور السفن المستخدمة عدم إغفال أي عامل. واحدة من مزايا تحليل وزارة الطاقة هو أنه يمكن تكوين التجارب عبر حزم العمل ، وتكوين كل مفاعل حيوي مع معلمات المعالجة الحيوية المحددة. يتم تحليل كافة البيانات التي تم إنشاؤها باستخدام MODDE. البرنامج يدير كمية كبيرة من البيانات التي تم إنشاؤها أثناء التجربة. يقوم إعداد تصميم المجموعة الفرعية المعمم ة بإنشاء سلسلة من مجموعة التصميم المخفضة ، وبالتالي حل المشكلة بمعايرة متعددة المتغيرات.
يتم عرض إجراء مفصل لتشغيل تصميم التجربة في مفاعل حيوي صغير آلي في هذه المقالة. تم تصميم البروتوكول للتركيز على عملية دفعة التغذية. ساعد برنامج DOE في وضع معلمات العملية المثلى لزيادة الكتلة الحيوية وتركيز التتر. كما تمت مقارنة بيانات الزراعة بتجربة أجريت في قارورة اهتزازية ومفاعل حيوي من أعلى مقاعد البدلاء 2 لتر. وتبين النتائج قابلية العملية للاستنساخ وقابلية التوسع. وكان الهدف من البروتوكول هو إثبات استخدام المفاعلات الحيوية الدقيقة الآلية في عملية دفعة تغذية وتحليل بارامترات المعالجة البيولوجية باستخدام برنامج وزارة الطاقة. ويمكن استنتاج أن المفاعلات الحيوية الدقيقة الآلية مفيدة لتطوير العملية ويمكن توسيع هاتإلى نظام شبه البُخل15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
يود المؤلفان أن يشكرا البوندسوزيريوم فور بيلديونغ أوند فورشونج (BMBF)، والوزارة الاتحادية للتعليم والبحوث، ألمانيا، وفريق المعالجة الحيوية في سارتوريوس ستيديم للتكنولوجيا الحيوية GmbH، ألمانيا، على دعمهم.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL disposable pipette tips, sterilized | Sartorius Stedim Biotech GmbH | A-0040 | |
| 200 mM L-glutamine | Corning, Merck | 25-005-CV | |
| 24 Well deep well plates | Sartorius Stedim Biotech GmbH | A-0038 | |
| 5 mL disposable pipette tips, sterilized | Sartorius Stedim Biotech GmbH | A-0039 | |
| ambr 15 automated microbioreactor system | Sartorius Stedim Biotech GmbH | 001-2804 | |
| ambr 15 Cell Culture 24 Disposable Bioreactors - Sparged | Sartorius Stedim Biotech GmbH | 001-1B86 | |
| Antifoam C Emulsion | Sigma-Aldrich, Merck | A8011 | |
| Bottle Top Sterile filter | Corning, Merck | CLS431474 | 0.1 μm pore size |
| CEDEX Detergent (3% Mucosol) | Roche Innovatis AG | 05-650-658-001 | |
| Cell counter | Roche Innovatis AG | 05-650-216-001 | CEDEX HiRes |
| CHO DG44 cell line | Cellca, Sartorius Stedim Biotech GmbH | ||
| CHOKO Feed Media A (FMA) | Sigma-Aldrich, Merck | CR80025 | |
| CHOKO Feed Media B (FMB) | Sigma-Aldrich, Merck | CR80026 | |
| CHOKO Production Medium | Sigma-Aldrich, Merck | CR80027 | |
| CHOKO Stock Culture Meium | Sigma-Aldrich, Merck | CR80028 | |
| Chromaster high pressure liquid chromatography system | VWR International | ||
| Conical Centrifuge tube | Corning, Merck | SIAL0790 | |
| Ethanol | Merck | 1070179026 | |
| Glycine | Carl Roth | 56-40-6 | |
| HPLC Vials | VWR International | SUPLSU860181 | |
| PBS | Sigma-Aldrich,Merck | P4417 | |
| Protein A Column | Thermo Fisher Scientific | 1502226 | POROS™ A 1.7 mL |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich,Merck | 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Sigma-Aldrich,Merck | 7558-79-4 | |
| Trypan Blue | VWR International | VWRVK940 | |
| YSI | YSI Inc | 2900D | YSI 2900 Select |
References
- Langer, E. S. 15th Annual report and survey of Biopharmaceutical Manufacturing Capacity and Production: A study of Biotherapeutical Developers and Contract Manufacturing Organizations. Bioplan Associates. , Available from: http://bioplanassociates.com/wp-content/uploads/2018/07/15thAnnualBiomfgReport_TABLEOFCONTENTS-LR.pdf (2019).
- Walsh, G. Biopharmaceutical benchmarks 2018. Nature Biotechnology. 36, 1136 (2018).
- Kim, J. Y., Kim, Y., Lee, G. M. CHO cells in biotechnology for production of recombinant proteins: current state and further potential. Applied Microbiology and Biotechnology. 93 (3), 917-930 (2012).
- Lai, T., Yang, Y., Ng, S. K. Advances in Mammalian cell line development technologies for recombinant protein production. Pharmaceuticals (Basel). 6 (5), 579-603 (2013).
- Carlage, T., et al. Analysis of dynamic changes in the proteome of a Bcl-XL overexpressing Chinese hamster ovary cell culture during exponential and stationary phases. Biotechnology Progress. 28 (3), 814-823 (2012).
- Hacker, D. L., de Jesus, M., Wurm, F. M. 25 years of recombinant proteins from reactor-grown cells - where do we go from here. Biotechnology Advances. 27 (6), 1023-1027 (2009).
- Shukla, A. A., Gottschalk, U. Single-use disposable technologies for biopharmaceutical manufacturing. Trends in Biotechnology. 31 (3), 147-154 (2013).
- Ao, S., Gelman, L. Advances in electrical engineering and computational science. Lecture notes in electrical engineering. 39, Springer. New York. (2009).
- Bareither, R., et al. Automated disposable small scale reactor for high throughput bioprocess development: a proof of concept study. Biotechnology and Bioengineering. 110 (12), 3126-3138 (2013).
- Kang, Y., Ludwig, D. L., Balderes, P. What can cell culture flocculation offer for antibody purification processes. Pharmaceutical Bioprocessing. 2 (6), 483-485 (2014).
- Choe, W., Durgannavar, T. A., Chung, S. J. Fc-Binding Ligands of Immunoglobulin G: An Overview of High Affinity Proteins and Peptides. Materials (Basel). 9 (12), (2016).
- Schäpper, D., et al. Application of microbioreactors in fermentation process development: a review. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 395 (3), 679-695 (2009).
- Zhang, Z., et al. Microbioreactors for Bioprocess Development. Journal of the Association for Laboratory Automation. 12 (3), 143-151 (2007).
- Claßen, J., et al. Spectroscopic sensors for in-line bioprocess monitoring in research and pharmaceutical industrial application. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (3), 651-666 (2017).
- Janoschek, S., et al. A protocol to transfer a fed-batch platform process into semi-perfusion mode: The benefit of automated small-scale bioreactors compared to shake flasks as scale-down model. Biotechnology Progress. 35 (2), 2757 (2019).
