Summary
Her præsenterer vi en detaljeret procedure til at køre et eksperimentdesign i en automatiseret mikrobioreaktor efterfulgt af cellehøst og proteinkvantificering ved hjælp af en Protein A kolonne.
Abstract
Optimering af bioprocesser for at øge udbyttet af ønskede produkter er af betydning i den biofarmaceutiske industri. Dette kan opnås ved at udvælge stammen og ved at udvikle bioprocesparametre. Der er anvendt rystekolber til dette formål. De mangler dog evnen til at styre procesparametre som pH og opløst ilt (DO). Denne begrænsning kan overvindes ved hjælp af en automatiseret mikrobioreaktor. Disse bioreaktorer efterligner dyrkning i større skala. En af de største fordele ved dette system er integrationen af Design of Experiment (DOE) i softwaren. Denne integration gør det muligt at etablere et design, hvor flere procesparametre kan varieres samtidigt. De kritiske procesparametre og optimale bioprocesbetingelser kan analyseres i softwaren. Fokus for det arbejde, der præsenteres her, er at introducere brugeren til de trin, der er involveret i processen design i softwaren og indarbejdelse af DOE inden for dyrkning køre.
Introduction
Det globale biofarmaceutiske marked var mere værd end 250 milliarder dollar i 2018 og har løbende ekspanderet1. Medicinalvirksomheder bevæger sig væk fra at producere små molekylære lægemidler til bioteknologisk fremstillede terapeutiske såsom rekombinant proteiner. Disse alene er ansvarlige for en omsætning på mere end $ 150 milliarder1. Pattedyrceller anvendes nu i udstrakt grad til fremstilling af disse farmaceutiske rekombinantproteiner. I den nuværende periode, blandt de 68 godkendte produkter produceret af pattedyrceller, 57 er produceret af kinesiske Hamster æggestok celler (CHO)2. CHO celler anvendes specielt til produktion af rekombinant proteiner, der kræver post-translationelle ændringer. Disse celler foretrækkes , efterhånden som de vokser i en suspension og derved muliggør reproducerbare resultater i et serumfrit kemisk defineret medium3,4. Den anden fordel ved at bruge CHO-celler er, at produktets glykoliske struktur ligner det humane monoklonale antistof (mAb) og resulterer i højere rekombinant proteinudbytte og specifik produktivitet på grund af genforstærkning5.
Udbyttet af rekombinant CHO (rCHO) cellekultur er steget med hundrede gange i de seneste to årtier. Denne forbedring tilskrives optimering af procesparametre, fodringsstrategi og udvikling af serumfrit kemisk defineret medium6. Med stigningen i kravene til de farmaceutiske produkter, presset stiger på omkostninger og tid effektivitet for udviklingen af produktionsprocessen7. For at reducere presset og samtidig sikre produktkvaliteten har omdirigeret fokus for den farmaceutiske industri på Quality by Design (QbD). QbD bruges til at forstå produktproduktionen såvel som processen. Et vigtigt værktøj, der anvendes i OBD er Design of Experiment (DOE). Det hjælper med at øge forståelsen af processen ved at afsløre forholdet mellem forskellige input variabler og resulterende output data. Anvendelse af DOE-metoden til optimering af bioprocessen er gavnligt i de tidlige faser af projektet ved at sidestilles procesbetingelserne og øge titerket og -kvaliteten. Denne tilgang er gavnlig i forhold til den gammeldags strategi: one-factor-at-a-time (OFAT). De statistiske tilgange til DOE ved hjælp af klassisk, Shainin eller Taguchi er langt bedre end OFAT8.
Processen og medieoptimeringen kan udføres i rystekolber. Kolberne er relativt billige. Det er dog ikke muligt at styre parametre som temperatur, pH og opløst ilt (DO). For at overvinde disse ulemper kan multiuse bench-top bioreaktorer lige fra arbejdsvolumen på 0,5 L til 5 L anvendes. Reaktorerne giver en omfattende on-line overvågning og proceskontrol. Men brugen af multiuse bioreaktor er tid og arbejdskrævende. For at overvinde disse ulemper anvendes en ny engangsbioreaktor, der kombinerer den omfattende proces med overvågning af bioreaktoren på bænken og nem håndtering af rystekolben. Det høje gennemløbsscreeningssystem og engangsteknologi har bidraget til at øge effektiviteten af procesydeevne og -udvikling9.
I denne artikel er retningslinjerne for at indlæse opskriften i den automatiserede mikrobioreaktorsoftware (AMBR) listet. Indflydelsen af forskellige omrørerhastigheder og pH på den levedygtige cellekoncentration (VCC) og titer undersøges i løbet af dette forsøg. Det eksperimentelle resultat og analysen udføres med design af eksperimentsoftware MODDE 12. Produktanalyserne udføres i et højtryksvæskekromatografisystem (HPLC) med en Protein A-kolonne. Den er baseret på princippet om , at fc-regionen af mAb binder sig til protein A med høj affinitet10,11. Med denne metode er det muligt at identificere og kvantificere mAb. Kvantificeringen foretages over de målte elueringsområder ved 280 nm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forkulturprocedure
BEMÆRK: Rekombinant CHO DG44 celler med en levedygtig cellekoncentration på 1 x 107 celler/ml anvendes til denne protokol.
- Tø hætteglasset med 1,2 ml celler op til stuetemperatur, og overfør straks cellesuspensionen til et konisk centrifugerør på 15 ml, der indeholder 10 ml koldtfrømedium.
- Det koniske centrifugerør centrifugeres i 5 minutter ved 190 x g og stuetemperatur, og supernatanten kasseres.
- 150 ml frømedium i en 500 ml rystekolbe opvarmes til 36,8 °C.
- Resuspender forsigtigt cellepelletsen i 10 ml forvarmet frømedium og cellerne overføres til rystekolben.
- 1 ml af prøven fra kolben anvendes til at måle den oprindelige VCC og levedygtigheden ved hjælp af en celletæller.
BEMÆRK: Rentabiliteten bør være over 70% efter optøning for vellykket dyrkning. - Rystkolben inkuberes i en orbitalshaker (shakerdiameter på 19 mm) ved 36,8 °C og 7,5 % CO2 med en rystehastighed på 120 omdrejninger i minuttet.
BEMÆRK: Disse forhold varierer afhængigt af cellestammen og mediet. - Tre dage efter at have passeret cellerne fjernes rystekolben fra rysteren, og den placeres under laminarflowskabet. Der udtages 1 ml prøve for at måle den endelige cellekoncentration. Den mængde, der skal overføres til frisk forvarmet frømedium, beregnes således, at den oprindelige cellekoncentration i den nye passage er 2 x 105 celler/ml.
- Passage cellerne 5 gange i alt, før de overføres til bioreaktoren til hoveddyrkningen.
2. Hoveddyrkning
- Den endelige cellekoncentration i forkulturen måles. Den mængde, der skal overføres til bioreaktoren, beregnes således, at den oprindelige cellekoncentration i reaktoren er 3 x 105 celler/ml.
- Fyld reaktoren med produktionsmedium en dag før inokuleringen for at ligevægte reaktoren og indstille procesparametre som temperatur, pH og DO.
BEMÆRK: Dyrkningsbetingelserne er 36,8 °C og 60 % koncentration af opløst ilt (DO). Vi testede omrørerhastigheder på 1050 rpm og 1300 rpm sammen med pHs på 6,9, 7,1 og 7,3. Dyrkningens samlede varighed er 12 dage, indtil cellerne høstes. Batchprocessen kører i 72 timer, hvorefter tilføringsmediet tilsættes hver 24 timer. Den protokol, der skal anvendes til dyrkning, er angivet i detaljer i det næste segment.
3. Skrivning opskriften i den automatiserede Mikro-bioreaktor Software
BEMÆRK: Der er to måder at skrive en opskrift i AMBR celle kultur software: det er skabt enten ved hjælp af en guide eller ved at tilføje hvert trin manuelt. I forbindelse med denne protokol vises trin, der bruger guiden.
- Oprette et nyt eksperiment
- Åbn AMBR-cellekultursoftwaren, og klik på Opret nyt eksperimentunder fanen Introduktion .
- Indlæser opskriften
- Angiv navnet på eksperimentet sammen med den dato, hvor det skal udføres, under fanen Nyt eksperiment.
- Kontrolpunktet for dyrkningsstationen og de fartøjer, der skal anvendes under dyrkningen, aktiveres. Den automatiske Tilføj DOE Tags vil også blive aktiveret for en nem overgang under programmeringen af DOE eksperiment. Klik på Næste for at skifte til den næste fane.
- Indstil oplysninger om tilsætning af medier i beholderen sammen med antiskum, inokulum, foder og glukose.
- Aktiver kontrolpunktet Tilføj medieplade. Angiv pladetype, navn og placering på den plade, der indeholder mediet.
FORSIGTIG: Afhængigt af pladetypen, og hvis pladen indeholder et låg, skal du aktivere kontrollen på Er låg for at sikre, at væskehåndteringen fungerer korrekt - Klik på Tilføj medier til fartøjer. Indtast mængden af medier, der skal tilføjes i fartøjerne. Definer kortlægningen af overførslen af mediet fra pladen til karrene. Klik på Næste for at skifte til den næste fane.
- Aktiver kontrolpunktet Tilføj medieplade. Angiv pladetype, navn og placering på den plade, der indeholder mediet.
- Indstil dyrkningsbetingelserne i reaktoren.
- Når medieoplysningerne er blevet ført ind i softwaren, skal du tildele dyrkningsbetingelserne. Klik på Condition Media og udfylde temperaturen, mål DO, øvre pH-grænse og omrøring RPM (Op omrøring eller Ned omrøring).
- Sæt tilsætning af inokulumer i beholderne.
- Aktivér Tilføj celleplade. Kimen ser ud til at have type, navn og placering på den plade, der indeholder mediet.
- Klik på Tilføj celler til fartøjer. Angiv tidspunktet for podning og mængden af medier, der skal føjes til fartøjerne.
- Definer den sti, som væskebehandleren har tilbagelagt, til overførslen af cellen fra pladen til karrene. Klik på Næste for at skifte til den næste fane.
BEMÆRK: Sørg for, at Genbrug pipettespidserne er deaktiveret for at undgå krydskontaminering og forkert indledende levedygtig cellekoncentration.
- Sæt tilsætning af foder, glukose og antifoam.
BEMÆRK: Proceduren for tilsætning af foder, glukose og antifoam ligner hinanden. Af hensyn til denne protokol er proceduren opført for "Foder". Dette kan replikeres for glukose og antifoam.- Aktiver tilføj fremføringsplade og definer pladetype, navn og placering. Klik på Tilføj foder til fartøjer og indtast mængden af foder, der skal føjes til fartøjerne. Definer kortlægningen af overførslen af foderet fra pladen til beholderne.
- Afhængigt af dyrkningen skal du tilføje antallet af fodertilsætningstilsætning. Til denne dyrkning fodres reaktoren efter 72 timer for hver 24 timer.
- Tilføj manuelt tidsforsinkelsen mellem fremføringen ved at indtaste dataene i Delay from cells added. Den første dag i fodring er efter 72 timers vaccination og den næste er efter 96 timer og så videre.
BEMÆRK: Antifoam tilsætning er programmeret til at blive tilføjet hver dag for at undgå skumdannelse under dyrkningen.
- Sæt prøveudtagning under dyrkningen.
- Tilføj prøveplade en deskaleres, og definer pladetype, navn og placering.
- Kontroller udtag prøven fra fartøjerne, og ind i den mængde prøve, der skal fjernes fra beholderne. Definer kortlægningen af overførslen af prøven fra beholderne til pladen. Sørg for, at volumenet ikke falder til under 10 ml under hele dyrkningen.
- Der tilsættes det antal prøver, der skal udtages under dyrkningen. I lighed med fodringen tilsættes tidspunktet for den prøve, der fjernes fra beholderen, for hvert inputprøvepunkt.
- Gem processen. Den er nu klar til henrettelse.
BEMÆRK: Hvis du vil sikre, at protokollen kører problemfrit, skal du skifte til fanen Procestrin i AMBR-cellekultursoftwaren og vælge Procestrinvisning for at visualisere opskriftens flow.
- Angiv navnet på eksperimentet sammen med den dato, hvor det skal udføres, under fanen Nyt eksperiment.
- Design af eksperiment i den automatiserede mikrobioreaktor
- For at køre DOE software af bioreaktoren, sikre, at opskriften i de vigtigste software er gemt og klar til brug.
- Åbn AMBR 15 DOE-softwaren, og klik på Undersøgelse, og vælg Ny.
- Angiv navnet på den nye doe-undersøgelse i dialogboksen Opret undersøgelse.
- For at tildele et eksperiment til DOE undersøgelsen, åbne opskriften skabt til at studere de forskellige parametre. Klik på Gennemse og vælg det respektive eksperiment.
- Definer DOE-faktoren.
- Fartøjsmærkerne er allerede registreret i kolonnen. Hvis du vil definere den ønskede DOE-faktor, skal du vælge parameteren og klikke på kolonnen med navnet DOE-faktor. Vælg Ny, og tilføj enhederne, forkortelsen, den nedre og øvre grænse for faktorerne (f.eks. temperatur, DO, pH).
- Definer svarfaktoren.
- Når doe-faktorerne er defineret, skal man definere det respons, som forsøgsanalysen skal struktureres på.
- Definer de værdier, der skal tages i betragtning til analyse af dataene, under fanen Svar.
- Klik på Rediger DOE Responses og definer navnet på svaret, forkortelsen, enheder, minimum- og maksimumgrænser (f.eks. titer, levedygtig cellekoncentration).
- Når svarene er defineret, skal du vælge AMBR-variablen for hvert svar og definere variablen. Et svar kan automatisk forbindes med en mikro-bioreaktor variabel, Vælg den nødvendige variabel fra rullelisten.
- Ændre ligningen for hvert af svarene afhængigt af kravet. Valget er mellem minimum-, maksimum-, første-, last- og gennemsnitsdata.
- Opret et design.
- Brug guiden Start design til at vælge typen af eksperimentelt design, så du kan tilføje eller fjerne antallet af replikater og midterpunkter.
- Vælg det mål, som bestemmer valget af design og modeller:
Screening: Bruger lineære modeller og interaktionsmodeller til at finde de vigtige faktorer
Optimering (RSM), Bruger kvadratiske og kubiske modeller til detaljeret modellering og optimering
Split mål: Modeller for formulering og procesfaktorer kan vælges separat - Når målet er besluttet, skal du vælge modellen og designet sammen med antallet af centerpunkter og replikeringer.
- Klik på Udfør og skifte til den næste fane.
- Definer eksperimentet.
BEMÆRK: Doe faktorer er opført i højre kolonne af softwaren. Ved valg af de ønskede faktorer vil de fartøjer, der kører det pågældende forsøg med den ønskede parameter, blive fremhævet. Fartøjerne på kulturstationen kan flyttes rundt ved at højreklikke på fartøjet og flytte det til det ønskede sted.- Opret arbejdspakker, der kan importeres i AMBR-cellekultursoftwaren. Afhængigt af antallet af eksperimenter oprettes og opbevares de forskellige arbejdspakker med henblik på yderligere implementering
- Udførelse af eksperimentet i arbejdspakkerne, der er oprettet på ambr-styringslaptopen
- Klik på Opret DOE-eksperiment under fanen Eksperiment, og søg efter den arbejdspakke, der er oprettet ved hjælp af DOE-softwaren.
- Initialiser processen ved at klikke på Start.
- Analyse af forsøgsresultater
- Når eksperimentet er udført, skal du eksportere dataene ved hjælp af EksportdoE-resultater. Vinduet Eksporter DOE-resultater åbnes, og de rækker, der angiver kulturbeholderen og -stationen, vises i tabellen.
- Vælg de ønskede rækker, og klik på Eksporterede markerede rækker eller Eksporter eksperimentelle data for at gemme alle resultaterne og gemme filen til yderligere analyse.
- Importer dataene til AMBR DOE-modulet ved at skifte til fanen Resultater og vælge Importér resultater.
- Søg efter den ønskede datafil, og klik på Analyseresultaterne.
- Analysér resultaterne yderligere i MODDE.
4. Gennemførelse af dyrkning i den automatiserede mikrobioreaktor
BEMÆRK: Følgende trin udføres af brugeren ved hjælp af protokollen skrevet i ovennævnte software. Trinene udføres af brugeren, medmindre andet er nævnt.
- Indlæsning af fartøjerne
- Åbn gammasteriliserede dyrkningsfartøjer under et laminarflowskab og orientering på kulturstationen som vist i figur 2.
- Rengør klemmepladen med 70 % ethanol og dobbelt destilleret vand. Derefter autoklave pladen og placere oven på fartøjet.
- Monter klemmepladen med en omrørerplade, der sikrer, at hver stift er fastspændt.
- Stram både omrørerpladen og klemmepladen på omrøringsenheden.
- Drift af mikrobioreaktorsoftwaren
- Brug det program, der er skrevet i afsnit 3, til at køre dyrkningen.
- Visualiser de procestrin, der er planlagt eller fuldført under fanen Proces. Rediger dyrkningstrinnene under proceskørslen efter behov ved først at sætte væskebehandleren på pause og derefter redigere procesopskriften.
- Tilsæt antiskum til beholderne, før omrøreren påbegyndes for at sikre, at der ikke er overdreven skumdannelse under dyrkningen. Antifoam vil blive tilføjet regelmæssigt, og skummet detekteres visuelt.
- Tilføjelse af medier til fartøjet
- Fyld den 24 brøndplade, der er forsynet med mikrobioreaktorerne, manuelt med sterile medier og anbringes i systemets angivne dæk. Sørg for, at pladen er placeret i det dæk, der er angivet i det skriftlige program (punkt 3). Påfyldningen af fartøjet vil finde sted som udformet i punkt 3.2.2.
BEMÆRK: Temperaturen og omrøreren starter umiddelbart efter tilsætning af mediet og antiskummet. Sensorlæseren aktiveres 1 time efter, at beholderen er fyldt (Start monitortrin). Gasningen til hvert fartøj påbegyndes, når læseren er aktiveret. Mediet skal i ligevægt i mindst 6 timer før pH-rekalibrering og inokulering. Procesparametrene kan ændres i softwaren som nævnt i afsnit 3.2.3.
- Fyld den 24 brøndplade, der er forsynet med mikrobioreaktorerne, manuelt med sterile medier og anbringes i systemets angivne dæk. Sørg for, at pladen er placeret i det dæk, der er angivet i det skriftlige program (punkt 3). Påfyldningen af fartøjet vil finde sted som udformet i punkt 3.2.2.
- Podning
- Den levedygtige cellekoncentration måles efter5. Antallet af celler, der skal overføres til beholderne, beregnes for at sikre, at den oprindelige cellekoncentration i alle beholderne er 3 x 105 celler/ml.
- Cellerne overføres til en 24 dyb brøndplade, således at ophængets volumen er mindst 1,6 gange det krævede volumen. For et nødvendigt volumen på 2 ml i inokulum overføres 3,2 ml cellesuspension til hver brønd i pladen.
- Placer 24 brøndpladen i det angivne dæk. Fartøjerne podes som i punkt 3.2.4.
- Daglig prøveudtagning og analyse
- Der fjernes hver dag en 460 μL prøve fra beholderne ved hjælp af væskebehandleren. 200 μL af prøven fortyndes med 800 μL filtreret 1x PBS-buffer (5 x fortynding), og derefter anbringes i celletælleren.
- Den resterende prøve centrifugeres i 5 min ved 190 x g og stuetemperatur, og supernatanten opbevares til yderligere analyse (glukose, laktat, glutamin og glutamat).
- 100 μL af supernatanten fryses ved -20 °C indtil afslutningen af dyrkningen til proteinkvantificering.
- Ophør af dyrkning
- Når procesparameterstyringen (dvs. temperatur, omrøring, pH og DO) er afsluttet, skal overvågningen af processen stoppes.
- Skru omrørerpladen og klemmepladen af.
- Fjern kulturfartøjerne og rengør kulturstationerne. Anbring tørrepladerne på dyrkningsstationerne, og skru dem ind.
- I mellemtiden rengøres klemmepladerne grundigt med 70 % ethanol og dobbelt destilleret vand.
- Klik på Stop i bioreaktorsoftwaren, når tørrecyklussen er afsluttet.
- Cellekultur høst
- Høst celler på dag 12 af dyrkningen ved manuelt at fjerne indholdet af fartøjerne i 50 ml centrifugerør. Cellebouillonen centrifugeres ved 190 x g i 30 min.
- Cellen kasseres, og supernatanten opbevares ved -20 °C.
5. Måling af mAb-koncentration
- Brug en 1,7 ml protein A kolonne til kvantificering af proteinet under dyrkningsen.
-
Ligevægts- og elueringsbufferen klartilser før optøning af prøverne.
- Der anvendes en opløsning på 0,5 M Na2HPO4 indeholdende 0,5 M NaCl med en pH-pH-ækvivalent på 7,9 som ligevægtsbuffer og en opløsning på 100 mM glycin indeholdende 0,5 M NaCl med en pH-pH på 2 som elueringsbuffer.
- Der filtreres begge buffere gennem en 0,2 μm membran og degas, før de placeres til analysen.
- Renluft det højtydende væskekromatografisystem (HPLC) med friskfremstillet equilibrationbuffer.
- Læg proteinet En kolonne på HPLC-systemet.
- Kromatografi med en strømningshastighed på 1 ml/min. Sæt kolonneovnstemperaturen ved 30 °C og autosamplertemperatur ved 10 °C
- Optø de frosne prøver ved stuetemperatur og filtrere 225 μL af hver prøve gennem en 0,22 μm PVDF-membran. Prøverne fortyndes med højere koncentration af det ønskede protein i forholdet 1:20 med ligevægtsbuffer, og der filtreres gennem membranen, før autosampleren anbringes.
- Prøverne anbringes i autoprovianten. Indlæs metoden og sekvensen i softwaren, og start sekvensen.
BEMÆRK: Metoden består af tre faser (se figur 1): injektion af prøven i kolonnen i de første to minutter efterfulgt af elueringsbuffer i 8 min og kolonneregenerering med ligevægtsbuffer i 10 min.
Figur 1: Protein Et kromatogram, der repræsenterer de forskellige faser under en enkelt kørsel. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En oversigt over den dyrkning, der udføres i denne undersøgelse, findes i figur 2.
Figur 2: Skematisk repræsentation af forsøgsbetingelserne for afprøvning af pH- og omrørerhastighedsprofiler på dyrkningsstationerne. Figuren repræsenterer også det korrekte layout til at placere fartøjerne. Klik her for at se en større version af dette tal.
Cellevæksten i de automatiserede mikrobioreaktorer kan sammenlignes med multireaktorerne. Dette er afbildet i figur 3. Cellekoncentrationen fra de tre forskellige skalaer sammenlignes, og det bemærkes, at den 15 ml automatiserede mikrobioreaktor efterligner 2 L glasbioreaktoren. Resultaterne fra rystekolben sammenlignes også for at udstille fordelen ved AMBR.
Figur 3: Sammenligning af den levedygtige cellekoncentration i forskellige skalaer. 15 ml mikrobioreaktor, 150 ml rystekolbe og 2 L multi-use glas bioreaktor. Klik her for at se en større version af dette tal.
Indflydelsen af forskellige omrørerhastighed og pH studeres i de automatiserede mikrobioreaktorer. Levedygtig cellekoncentration (VCC) er en af de vitale parametre for at sammenligne dyrkningen. Figur 4 repræsenterer sammenligningen af VCC- og monoklonal antistofkoncentration i de forskellige mikrobioreaktorer. Figur 5 repræsenterer svarkonturplottet for de to besvarelser, der blev taget i betragtning til sammenligningen, nemlig VCC- og mAb-koncentrationen. Værdierne er sammenlignelige i fartøjer med samme pH-hastighed og forskellig omrørerhastighed, hvilket indikerer, at den omrørerhastighed, der er valgt til denne proces, ikke har nogen væsentlig indflydelse på procesoutputtet. Til fremtidig dyrkning vil omrørerhastigheden på 1050 omdrejninger i minuttet blive anvendt for at undgå skumdannelse.
PH'en har imidlertid en iøjnefaldende indvirkning på procesoutputdataene. PH 6.9's negative indflydelse på VCC kan observeres i figur 4A. Cellernes vækst forbedredes betydeligt under dyrkningen ved pH 7,3 sammenlignet med pH 7.1. I figur 5Bsammenlignes den monoklonale antistofkoncentration i de forskellige dyrkninger. Produktionen af mAb er langsommere i de fartøjer, der holdes på pH 7.3; koncentrationen af slutproduktet kan dog sammenlignes med det fartøj, der holdes på pH 7.1.
Figur 4: Resultatet af DOE-eksperimentet. (A) Dyrkningsens levedygtige cellekoncentrationsprofil for at undersøge indflydelsen af pH- og omrørerhastigheden (B) Monoklonal antistofkoncentrationsprofil på den fodrede batchproces i de respektive dyrkningsbetingelser. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Responskonturplot, der angiver pH- og omrørerhastighedens indflydelse på den maksimale levedygtige cellekoncentration og monoklonale antistof. Klik her for at se en større version af dette tal.
En af fordelene ved at bruge AMBR er den løbende overvågning og kontrol af dyrkningen. Overvågningen af pH-værdien kan observeres i figur 6. PH-værdien styres ved det indstillede punkt ved hjælp af CO2. Bolusfodringen fra dag 3 er ansvarlig for stigningen i værdierne.
Figur 6: pH-monitorering i de automatiserede mikrobioreaktorer til dyrkning med faste punkter pH 6.9, 7.1 og 7.3 og en omrørerhastighed på 1050 omdrejninger i minuttet. Klik her for at se en større version af dette tal.
De procesparametre, der blev anvendt til de fremtidige test, blev indsnævret til en omrørerhastighed på 1050 omdrejninger i minuttet og pH-værdien på 7,1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Optimering af processen for at øge udbyttet er af afgørende betydning i den biofarmaceutiske industri. Rystekolber kan potentielt anvendes til screening af stammen; Overvågningen af procesparametresom pH og DO er dog ikke tilgængelig i kolberne. Mikrobioreaktorerne har en fordel, da de giver mulighed for løbende overvågning og kontrol af processen. Disse kontrolsløjfer i mikrobioreaktoren giver også en tilstand svarende til dem i større skala og giver således resultater, der kan sammenlignes med de større bioreaktorer. En anden fordel ved mikrobioreaktoren er den brede vifte af betingelser , der kan testes inden for samme tidsramme og til en lavere pris sammenlignet med bænketopbioreaktorer med hensyn til tid og arbejdskraft12,13 . Den mindre størrelse er også fordelagtig i form af lavere driftsomkostninger på grund af den reducerede mængde substrat og reduceret pladsbehov for parallelle operationer; omkostningerne ved fartøjerne skal dog tages i betragtning, da det kan være dyrere at dyrke en dyrkning i enkeltanvendelsesmikrobioreaktorer sammenlignet med multireaktoren i toptil.
Mens der er flere fordele ved systemet, er der et par betydelige ulemper ved at bruge mikrobioreaktorer. Det er muligt at ændre pH og DO for hvert fartøj på én dyrkningsstation. omrørerhastigheden og temperaturen kan dog ikke ændres for et enkelt fartøj. Dette øger antallet af forsøg, der udføres for at fastslå den optimale omrørerhastighed og temperatur. Onlinemålingerne er begrænset til pH og DO. Overvågning af de kritiske procesparametre (CPP), såsom temperatur, pH, DO, vil være gavnlig timellem prøveudtagningen og analysen. Det har potentiale til at være et nyttigt værktøj til optimering afproduktiviteten 14. Udvikling inden for spektroskopiske målinger i mikrobioreaktorer kan vise sig at være gavnlig i fremtidige modeller.
Fordelene opvejer ulemperne ved at bruge den automatiserede mikrobioreaktor. Der er dog nogle få kriterier, der skal tages i betragtning, når disse systemer anvendes. Først og fremmest er udformningen af scriptet til at køre dyrkning. Det er af afgørende betydning, at scriptet skrevet er inklusive alle de afgørende skridt såsom definition af pladerne sammen med den korrekte kortlægning af pladen og fartøjer. Alle parametre skal kontrolleres, før forsøget startes. Sørg for, at der ikke er planlagt nogen procestrin på samme tid. Dette vil resultere i, at arbejdsstationen vælger det ene trin frem for det andet.
Et andet vigtigt kriterium, der skal fokuseres på, er brugen af klemmerpladerne. Pladerne er autoclaved før hver dyrkning; dette kan føre til beskadigelse af O-ringene. Kontroller visuelt O-ringene før autoklavering. Defekte O-ringe kan resultere i uventede variationer i DO- og pH-kontrollen. Den anden faktor for defekte aflæsninger kan være en løs forbindelse mellem klemmepladen og karrene. Sørg for, at klemmepladen og omrørerpladerne sidder tæt fast på omrøringsenheden. Brug det tilspændingsværktøj, der følger med systemet.
Under dyrkningen er det afgørende at visuelt overvåge skummet. Der kræves mindst 20 μL antiskum ved dyrkningens begyndelse. Skumdannelse vil resultere i væske, der er til stede i klemmepladens trug. Overskydende skum i klemmepladen vil føre til overløb, hvilket fører til, at skummet indsamles i bunden af kulturstationen, hvilket tilslører pH- og DO-pletterne, der skal aflæses af sensoren.
En anden vigtig faktor at fokusere på, er brugen af DOE software. Den integrerede DOE-software muliggør hurtig design af processen, der omfatter de relevante betingelser. Visualiseringen af de anvendte fartøjer sikrer, at ingen faktor er blevet overset. En af fordelene ved DOE-analyse er, at forsøgene kan konfigureres via arbejdspakker, der konfigurerer hver bioreaktor med definerede biobehandlingsparametre. Alle de genererede data analyseres ved hjælp af MODDE. Softwaren administrerer den store mængde data, der genereres i løbet af eksperimentet. En generaliseret delmængde design setup genererer en sekvens af reduceret design sæt, og dermed løse problemet med multivariat kalibrering.
En detaljeret procedure til at køre et design af eksperiment i en automatiseret mikro-bioreaktor er påvist i denne artikel. Protokollen er designet til at fokusere på foderbatchprocessen. DOE-softwaren hjalp med at etablere de optimale procesparametre for at øge biomassen og titerkoncentrationen. Dyrkningsdataene blev også sammenlignet med et forsøg udført i en rystekolbe og en 2 L bench-top bioreaktor. Resultaterne viser, at processen er reproducerbarhed og skalerbarhed. Formålet med protokollen var at demonstrere brugen af automatiserede mikrobioreaktorer i en foderbatchproces og at analysere biobehandlingsparametrene ved hjælp af DOE-softwaren. Det kan konkluderes , at de automatiserede mikrobioreaktorer er nyttige for procesudviklingen , og disse kan udvides til et semiperfusionssystem15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF), forbundsministeriet for uddannelse og forskning, Tyskland, og BioProcessing-teamet under Sartorius Stedim Biotech GmbH, Tyskland, for deres støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL disposable pipette tips, sterilized | Sartorius Stedim Biotech GmbH | A-0040 | |
| 200 mM L-glutamine | Corning, Merck | 25-005-CV | |
| 24 Well deep well plates | Sartorius Stedim Biotech GmbH | A-0038 | |
| 5 mL disposable pipette tips, sterilized | Sartorius Stedim Biotech GmbH | A-0039 | |
| ambr 15 automated microbioreactor system | Sartorius Stedim Biotech GmbH | 001-2804 | |
| ambr 15 Cell Culture 24 Disposable Bioreactors - Sparged | Sartorius Stedim Biotech GmbH | 001-1B86 | |
| Antifoam C Emulsion | Sigma-Aldrich, Merck | A8011 | |
| Bottle Top Sterile filter | Corning, Merck | CLS431474 | 0.1 μm pore size |
| CEDEX Detergent (3% Mucosol) | Roche Innovatis AG | 05-650-658-001 | |
| Cell counter | Roche Innovatis AG | 05-650-216-001 | CEDEX HiRes |
| CHO DG44 cell line | Cellca, Sartorius Stedim Biotech GmbH | ||
| CHOKO Feed Media A (FMA) | Sigma-Aldrich, Merck | CR80025 | |
| CHOKO Feed Media B (FMB) | Sigma-Aldrich, Merck | CR80026 | |
| CHOKO Production Medium | Sigma-Aldrich, Merck | CR80027 | |
| CHOKO Stock Culture Meium | Sigma-Aldrich, Merck | CR80028 | |
| Chromaster high pressure liquid chromatography system | VWR International | ||
| Conical Centrifuge tube | Corning, Merck | SIAL0790 | |
| Ethanol | Merck | 1070179026 | |
| Glycine | Carl Roth | 56-40-6 | |
| HPLC Vials | VWR International | SUPLSU860181 | |
| PBS | Sigma-Aldrich,Merck | P4417 | |
| Protein A Column | Thermo Fisher Scientific | 1502226 | POROS™ A 1.7 mL |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich,Merck | 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Sigma-Aldrich,Merck | 7558-79-4 | |
| Trypan Blue | VWR International | VWRVK940 | |
| YSI | YSI Inc | 2900D | YSI 2900 Select |
References
- Langer, E. S. 15th Annual report and survey of Biopharmaceutical Manufacturing Capacity and Production: A study of Biotherapeutical Developers and Contract Manufacturing Organizations. Bioplan Associates. , Available from: http://bioplanassociates.com/wp-content/uploads/2018/07/15thAnnualBiomfgReport_TABLEOFCONTENTS-LR.pdf (2019).
- Walsh, G. Biopharmaceutical benchmarks 2018. Nature Biotechnology. 36, 1136 (2018).
- Kim, J. Y., Kim, Y., Lee, G. M. CHO cells in biotechnology for production of recombinant proteins: current state and further potential. Applied Microbiology and Biotechnology. 93 (3), 917-930 (2012).
- Lai, T., Yang, Y., Ng, S. K. Advances in Mammalian cell line development technologies for recombinant protein production. Pharmaceuticals (Basel). 6 (5), 579-603 (2013).
- Carlage, T., et al. Analysis of dynamic changes in the proteome of a Bcl-XL overexpressing Chinese hamster ovary cell culture during exponential and stationary phases. Biotechnology Progress. 28 (3), 814-823 (2012).
- Hacker, D. L., de Jesus, M., Wurm, F. M. 25 years of recombinant proteins from reactor-grown cells - where do we go from here. Biotechnology Advances. 27 (6), 1023-1027 (2009).
- Shukla, A. A., Gottschalk, U. Single-use disposable technologies for biopharmaceutical manufacturing. Trends in Biotechnology. 31 (3), 147-154 (2013).
- Ao, S., Gelman, L. Advances in electrical engineering and computational science. Lecture notes in electrical engineering. 39, Springer. New York. (2009).
- Bareither, R., et al. Automated disposable small scale reactor for high throughput bioprocess development: a proof of concept study. Biotechnology and Bioengineering. 110 (12), 3126-3138 (2013).
- Kang, Y., Ludwig, D. L., Balderes, P. What can cell culture flocculation offer for antibody purification processes. Pharmaceutical Bioprocessing. 2 (6), 483-485 (2014).
- Choe, W., Durgannavar, T. A., Chung, S. J. Fc-Binding Ligands of Immunoglobulin G: An Overview of High Affinity Proteins and Peptides. Materials (Basel). 9 (12), (2016).
- Schäpper, D., et al. Application of microbioreactors in fermentation process development: a review. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 395 (3), 679-695 (2009).
- Zhang, Z., et al. Microbioreactors for Bioprocess Development. Journal of the Association for Laboratory Automation. 12 (3), 143-151 (2007).
- Claßen, J., et al. Spectroscopic sensors for in-line bioprocess monitoring in research and pharmaceutical industrial application. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (3), 651-666 (2017).
- Janoschek, S., et al. A protocol to transfer a fed-batch platform process into semi-perfusion mode: The benefit of automated small-scale bioreactors compared to shake flasks as scale-down model. Biotechnology Progress. 35 (2), 2757 (2019).
