Summary
Hier presenteren we een gedetailleerde procedure om een ontwerp van experiment uit te voeren in een geautomatiseerde micro-bioreactor gevolgd door celoogst en eiwitkwantificering met behulp van een Protein A-kolom.
Abstract
Optimalisatie van bioprocessen om de opbrengst van gewenste producten te verhogen is van belang in de biofarmaceutische industrie. Dit kan worden bereikt door stamselectie en door bioprocesparameters te ontwikkelen. Hiervoor zijn schudkolven gebruikt. Ze missen echter de mogelijkheid om de procesparameters zoals pH en opgeloste zuurstof (DO) te controleren. Deze beperking kan worden overwonnen met behulp van een geautomatiseerde micro-bioreactor. Deze bioreactoren bootsen de teelt op grotere schaal na. Een van de grote voordelen van dit systeem is de integratie van het Design of Experiment (DOE) in de software. Deze integratie maakt het mogelijk om een ontwerp te maken waarbij meerdere procesparameters tegelijkertijd kunnen worden gevarieerd. De kritische procesparameters en optimale bioprocesomstandigheden kunnen binnen de software worden geanalyseerd. De focus van het werk hier gepresenteerd is om de gebruiker kennis te laten maken met de stappen die betrokken zijn bij procesontwerp in de software en integratie van de DOE binnen de teelt run.
Introduction
De wereldwijde biofarmaceutische markt was in 2018 meer dan US $250 miljard waard en is voortdurend gegroeid1. Farmaceutische bedrijven gaan af van de productie van kleine moleculaire geneesmiddelen naar biotechnologisch geproduceerde therapieën zoals recombinante eiwitten. Deze alleen al zijn verantwoordelijk voor een omzet van meer dan $ 150 miljard1. Zoogdiercellen worden nu op grote schaal gebruikt voor de productie van deze farmaceutische recombinante eiwitten. In de huidige periode worden onder de 68 goedgekeurde producten die door zoogdiercellen worden geproduceerd, 57 geproduceerd door Chinese hamstereierstokcellen (CHO)2. CHO cellen worden specifiek gebruikt voor de productie van recombinante eiwitten die post-translationele wijzigingen vereisen. Deze cellen hebben de voorkeur omdat ze in een suspensie groeien en daardoor reproduceerbare resultaten mogelijk maken in een serumvrij chemisch gedefinieerd medium3,4. Het andere voordeel van het gebruik van CHO-cellen is dat de glycanstructuur van het product lijkt op die van het menselijke monoklonale antilichaam (mAb) en resulteert in een hogere recombinante eiwitopbrengst en specifieke productiviteit als gevolg van genversterking5.
De opbrengst van recombinant CHO (rCHO) celcultuur is de afgelopen twee decennia met honderd keer toegenomen. Deze verbetering wordt toegeschreven aan de optimalisatie van de procesparameters, voedingsstrategie en ontwikkeling van serumvrij chemisch gedefinieerd medium6. Met de toename van de eisen van de farmaceutische producten neemt de druk toe op kosten- en tijdefficiëntie voor de ontwikkeling van het productieproces7. Om de druk te verminderen en tegelijkertijd de productkwaliteit te waarborgen, heeft de focus van de farmaceutische industrie op Quality by Design (QbD) verschoven. QbD wordt gebruikt om de productproductie en het proces te begrijpen. Een essentieel hulpmiddel dat in obd wordt gebruikt is het Ontwerp van Experiment (DOE). Het helpt het begrip van het proces te vergroten door de relatie tussen verschillende invoervariabelen en resulterende uitvoergegevens te onthullen. Het toepassen van de DOE-aanpak om het bioproces te optimaliseren is nuttig in de vroege stadia van het project bij het assimileren van de procesomstandigheden en het verhogen van de titer kwantiteit en kwaliteit. Deze aanpak is gunstig in vergelijking met de ouderwetse strategie: one-factor-at-a-time (OFAT). De statistische benaderingen van DOE met behulp van Klassieke, Shainin of Taguchi zijn veel beter dan de OFAT8.
Het proces en de media optimalisatie kan worden uitgevoerd in shake kolven. De kolven zijn relatief goedkoop. Het is echter niet mogelijk om parameters zoals temperatuur, pH en opgeloste zuurstof (DO) te regelen. Om deze nadelen te overwinnen, kunnen multifunctionele bench-top bioreactoren, variërend van werkvolume van 0,5 L tot 5 L, worden gebruikt. De reactoren zorgen voor een uitgebreide on-line monitoring en procescontrole. Het gebruik van de multifunctionele bioreactor is echter tijd- en arbeidsintensief. Om deze nadelen te overwinnen, wordt een nieuwe bioreactor voor eenmalig gebruik gebruikt die het uitgebreide proces van het monitoren van de bench-top bioreactor en het eenvoudig hanteren van de schudkolf combineert. Het screeningsysteem met een hoge doorvoer en de technologie voor eenmalig gebruik hebben bijgedragen tot een verbetering van de efficiëntie van procesprestaties en -ontwikkeling9.
In dit artikel worden de richtlijnen voor het laden van het recept in de geautomatiseerde microbioreactor (AMBR) software vermeld. De invloed van verschillende roerdersnelheden en pH op de levensvatbare celconcentratie (VCC) en titer wordt in de loop van dit experiment bestudeerd. Het experimentele resultaat en de analyse worden uitgevoerd met ontwerp van experimentsoftware MODDE 12. De productanalyses worden uitgevoerd in een hplc-systeem (hoge druk vloeistofchromatografie) met een Protein A-kolom. Het is gebaseerd op het principe dat het Fc-gebied van de mAb bindt aan eiwit A met hoge affiniteit10,11. Met deze methode is het mogelijk om de mAb te identificeren en te kwantificeren. De kwantificering vindt plaats boven de gemeten elutiepiekgebieden met 280 nm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Precultuurprocedure
LET OP: Voor dit protocol worden recombinante CHO DG44-cellen met een levensvatbare celconcentratie van 1 x 107 cellen/mL gebruikt.
- Ontdooi de flacon met 1,2 mL cellen op kamertemperatuur en breng de celsuspensie onmiddellijk over op een conische centrifugebuis van 15 mL met 10 mL koudzaadmedium.
- Centrifugeer de conische centrifugebuis 5 minuten op 190 x g en kamertemperatuur en gooi de supernatant weg.
- Verwarm 150 ml van het zaadmedium voor in een schudkolf van 500 ml tot 36,8 °C.
- Hang de celpellet voorzichtig op in 10 mL voorverwarmd zaadmedium en breng de cellen over in de schudkolf.
- Gebruik 1 mL van het monster uit de kolf om de initiële VCC en levensvatbaarheid te meten met behulp van een celteller.
LET OP: De levensvatbaarheid moet boven de 70% liggen na ontdooiing voor een succesvolle teelt. - Incubeer de schudkolf in een orbitale shaker (shakerdiameter van 19 mm) bij 36,8 °C en 7,5% CO2 met een schudsnelheid van 120 rpm.
LET OP: Deze omstandigheden variëren afhankelijk van de celstam en het medium. - Drie dagen na het passeren van de cellen, verwijder de schudkolf uit de shaker en plaats deze onder de laminaire stroomkast. Neem 1 mL monster om de uiteindelijke celconcentratie te meten. Bereken het volume dat moet worden overgebracht naar vers voorverwarmd zaadmedium zodanig dat de initiële celconcentratie in de nieuwe passage 2 x 105 cellen/mL bedraagt.
- Passage van de cellen 5 keer in totaal alvorens over te dragen aan de bioreactor voor de belangrijkste teelt.
2. Hoofdteelt
- Meet de uiteindelijke celconcentratie van de voorcultuur. Bereken het volume dat naar de bioreactor moet worden overgebracht, zodat de initiële celconcentratie in de reactor 3 x 105 cellen/mL bedraagt.
- Vul de reactor met productiemedium een dag voor de inenting om de reactor te equilibrate en stel de procesparameters zoals temperatuur, pH en DO in.
LET OP: De teeltcondities zijn 36,8 °C en 60% opgeloste zuurstofconcentratie (DO). We testten roerstaafsnelheden van 1050 tpm en 1300 rpm samen met pH's van 6,9, 7,1 en 7,3. De totale duur van de teelt is 12 dagen tot de cellen worden geoogst. Het batchproces duurt 72 uur waarna het voermedium om de 24 uur wordt toegevoegd. Het protocol dat voor de teelt moet worden gebruikt, wordt in detail vermeld in het volgende segment.
3. Het schrijven van het recept in de geautomatiseerde Micro-bioreactor Software
LET OP: Er zijn twee manieren om een recept te schrijven in de AMBR-celkweeksoftware: het wordt gemaakt met behulp van een wizard of door elke stap handmatig toe te voegen. Voor de toepassing van dit protocol worden stappen met de wizard weergegeven.
- Een nieuw experiment maken
- Open de AMBR-celkweeksoftware en klik op het tabblad Inleiding op Nieuw experiment maken.
- Het laden van het recept
- Voer op het tabblad Nieuw experiment de naam van het experiment in, samen met de datum waarop het moet worden uitgevoerd.
- Activeer het controlepunt voor het kweekstation en de vaten die tijdens de teelt moeten worden gebruikt. De Auto Add DOE Tags worden ook geactiveerd voor een eenvoudige overgang tijdens de programmering van het DOE-experiment. Klik op Volgende om naar het volgende tabblad te gaan.
- Stel informatie in over de toevoeging van media in het vat samen met antischuim, entmateriaal, voer en glucose.
- Activeer het controlepunt Mediaplaat toevoegen. Definieer het type plaat, de naam en de locatie van de plaat die het medium bevat.
LET OP: Afhankelijk van het type plaat en als de plaat een deksel bevat, activeert u de controle op Is Lidded om een goede werking van de vloeistofhandler te garanderen - Klik op Media toevoegen aan schepen. Voer het volume van de media in die in de vaten moeten worden toegevoegd. Definieer de toewijzing van de overdracht van de media van de plaat naar de vaten. Klik op Volgende om naar het volgende tabblad te gaan.
- Activeer het controlepunt Mediaplaat toevoegen. Definieer het type plaat, de naam en de locatie van de plaat die het medium bevat.
- Stel de teeltomstandigheden in de reactor in.
- Nadat de media-informatie in de software is ingevoerd, wijst u de teeltvoorwaarden toe. Klik op Condition Media en vul de temperatuur, doel DO, bovenste pH-limiet en roeren RPM (Omhoog roeren of Omlaag roeren).
- Zet toevoeging van inoculumen in de vaten.
- Celplaat toevoegenactiveren . Definieer het plaattype, de naam en de locatie van de plaat die het medium bevat.
- Klik op Cellen toevoegen aan bloedvaten. Voer het tijdstip van inenting en het volume van de media toe te voegen aan de vaten.
- Definieer het pad dat door de vloeistofhandler naar de overdracht van de cel van de plaat naar de vaten wordt afgelegd. Klik op Volgende om naar het volgende tabblad te gaan.
LET OP: Zorg ervoor dat PipetteTips voor hergebruik worden gedeactiveerd om kruisbesmetting en onjuiste initiële levensvatbare celconcentratie te voorkomen.
- Stel toevoeging van voer, glucose en antischuim in.
LET OP: De procedure voor de toevoeging van diervoeders, glucose en antischuim is op elkaar vergelijkbaar. Omwille van dit protocol wordt de procedure vermeld voor "Feed". Dit kan worden gerepliceerd voor glucose en antischuim.- Activeer de feedplaat toevoegen en definieer het type, de naam en de locatie van de plaat. Klik op Feed toevoegen aan schepen en voer het volume in van de feed die aan de vaten moet worden toegevoegd. Definieer de toewijzing van de overdracht van het voer van de plaat naar de vaten.
- Voeg afhankelijk van de teelt het aantal voertoevoegingen toe. Voor deze teelt wordt de reactor na 72 uur voor elke 24 uur gevoed.
- Voeg handmatig de vertraging tussen de voeding toe door de gegevens in te voeren in Vertraging van cellen die zijn toegevoegd. De eerste dag van het voeden is na 72 uur inenting en de volgende is na 96 uur en ga zo maar door.
LET OP: Antischuim toevoeging is geprogrammeerd om elke dag worden toegevoegd om schuimvorming tijdens de teelt te voorkomen.
- Stel bemonstering tijdens de teelt.
- Activeer de voorbeeldplaat toevoegen en definieer het type, de naam en de locatie van de plaat.
- Controleer Take Sample van vaartuigen en voer het volume in van het monster dat uit de vaten moet worden verwijderd. Definieer de toewijzing van de overdracht van het monster van de vaten naar de plaat. Zorg ervoor dat het volume gedurende de gehele teeltgang niet onder de 10 mL daalt.
- Voeg het aantal monsters toe dat tijdens de teelt moet worden genomen. Voeg, net als bij het voeren, de tijd toe waarop het monster voor elk invoermonsterpunt uit het vat wordt verwijderd.
- Sla het proces op. Het is nu klaar voor uitvoering.
LET OP: Als u de goede werking van het protocol wilt garanderen, schakelt u over naar het tabblad Processtappen in de AMBR-celkweeksoftware en selecteert u de weergave Processtap om de stroom van het recept te visualiseren.
- Voer op het tabblad Nieuw experiment de naam van het experiment in, samen met de datum waarop het moet worden uitgevoerd.
- Ontwerp van experiment in de geautomatiseerde microbioreactor
- Om de DOE-software van de bioreactor uit te voeren, moet u ervoor zorgen dat het recept in de hoofdsoftware wordt opgeslagen en klaar voor gebruik.
- Open de AMBR 15 DOE-software en klik op Onderzoek en selecteer Nieuw.
- Voer de naam van het nieuwe DOE-onderzoek in het dialoogvenster Onderzoek maken in.
- Om een experiment toe te wijzen aan het DOE-onderzoek, opent u het recept dat is gemaakt om de verschillende parameters te bestuderen. Klik op Bladeren en selecteer het betreffende experiment.
- Definieer de DOE-factor.
- De tags van het schip zijn al ingeschakeld in de kolom. Als u de gewenste DOE-factor wilt definiëren, selecteert u de parameter en klikt u op de kolom met het label DOE-factor. Selecteer Nieuw en voeg de eenheden, afkorting, onder- en bovengrens van de factoren toe (bijvoorbeeld temperatuur, DO, pH).
- Definieer de reactiefactor.
- Zodra de DOE-factoren zijn gedefinieerd, definieert u de respons op basis waarvan de experimentele analyse zou worden gestructureerd.
- Definieer op het tabblad Antwoorden de waarden die in aanmerking moeten worden genomen voor de analyse van de gegevens.
- Klik op Doe-antwoorden bewerken en definieer de naam van de respons, afkorting, eenheden, minimum- en maximumlimieten (bijvoorbeeld titer, levensvatbare celconcentratie).
- Zodra de antwoorden zijn gedefinieerd, selecteert u de AMBR-variabele voor elke respons en definieert u de variabele. Een reactie kan automatisch worden gekoppeld aan een micro-bioreactor variabele, Kies de vereiste variabele uit de vervolgkeuzelijst.
- Wijzig de vergelijking voor elk van de antwoorden, afhankelijk van de vereiste. De keuze is tussen de minimale, maximale, eerste, laatste en gemiddelde gegevens.
- Maak een ontwerp.
- Gebruik de wizard Ontwerp starten om het type experimenteel ontwerp te selecteren om het aantal replicaties en middelpunten toe te voegen of te verwijderen.
- Selecteer de doelstelling, die de keuze van ontwerpen en modellen bepaalt:
Screening: Gebruikt lineaire en interactiemodellen om de belangrijke factoren te vinden
Optimalisatie (RSM), Maakt gebruik van kwadratische en kubieke modellen voor gedetailleerde modellering en optimalisatie
Gespleten doelstelling: Modellen voor formulerings- en procesfactoren kunnen afzonderlijk worden gekozen - Zodra het doel is bepaald, selecteert u het model en het ontwerp samen met het aantal middelpunten en repliceert.
- Klik op Voltooien en ga naar het volgende tabblad.
- Definieer het experiment.
LET OP: De DOE-factoren staan vermeld in de rechterkolom van de software. Bij het selecteren van de gewenste factoren worden de vaartuigen die met de gewenste parameter experimenteren gemarkeerd. De schepen binnen het cultuurstation kunnen worden verplaatst door met de rechtermuisknop op het schip te klikken en het naar de gewenste locatie te verplaatsen.- Werkpakketten maken die kunnen worden geïmporteerd in de AMBR-celkweeksoftware. Afhankelijk van het aantal experimenten worden de verschillende werkpakketten gemaakt en opgeslagen voor verdere implementatie
- Uitvoering van het experiment in de werkpakketten die op de AMBR-besturingslaptop zijn gemaakt
- Klik op het tabblad Experiment op Doe-experiment maken en blader naar het werkpakket dat is gemaakt met de DOE-software.
- Initialiseer het proces door op Startte klikken.
- Analyse van experimentele resultaten
- Zodra het experiment is uitgevoerd, exporteert u de gegevens met Export DOE-resultaten. Het venster DOE-resultaten exporteren wordt geopend en de rijen die het kweekschip en station aangeven, worden in de tabel weergegeven.
- Selecteer de gewenste rijen en klik op Geselecteerde rijen exporteren of Experimentele gegevens exporteren om alle resultaten op te slaan en het bestand op te slaan voor verdere analyse.
- Importeer de gegevens in de AMBR DOE-module door over te schakelen naar het tabblad Resultaten en Importresultaten teselecteren .
- Blader naar het gewenste gegevensbestand en klik op de analyseresultaten.
- Analyseer de resultaten verder in MODDE.
4. Uitvoering van de teelt in de geautomatiseerde microbioreactor
LET OP: De volgende stappen worden uitgevoerd door de gebruiker met behulp van het protocol geschreven in de bovengenoemde software. De stappen worden uitgevoerd door de gebruiker, tenzij anders vermeld.
- Laden van de schepen
- Open de gamma gesteriliseerde kweekvaten onder een laminaire stroomkast en oriënt in het cultuurstation zoals afgebeeld in figuur 2.
- Reinig de klemplaat met 70% ethanol en dubbel gedestilleerd water. Dan, autoclave de plaat en plaats op de top van het schip.
- Monteer de klemplaat met een roerrplaat, zodat elke pin stevig wordt bevestigd.
- Draai zowel de roergangerplaat als de klemplaat op de roerbak.
- Het uitvoeren van de microbioreactorsoftware
- Gebruik het programma geschreven in sectie 3 om de teelt uit te voeren.
- Visualiseer de geplande of voltooide processtappen in het tabblad Proces. Wijzig de teeltstappen tijdens het proces dat wordt uitgevoerd als dat nodig is door eerst de vloeistofhandler te pauzeren en vervolgens het procesrecept te bewerken.
- Voeg antischuim toe aan de vaten voordat de roerganger wordt gestart om ervoor te zorgen dat er geen overmatig schuimen is tijdens de teelt. Het antischuim zal regelmatig worden toegevoegd, en het schuim visueel gedetecteerd.
- Toevoeging van media aan het schip
- Vul de 24 putplaat die bij de microbioreactoren is voorzien handmatig met steriele media en plaats in het aangewezen dek van het systeem. Zorg ervoor dat de plaat in het dek wordt geplaatst dat door het geschreven programma is aangewezen (punt 3). De vulling van het vaartuig vindt plaats zoals ontworpen in punt 3.2.2.
LET OP: De temperatuur en roerstaaf beginnen onmiddellijk na de toevoeging van de media en het antischuim. De sensorlezer wordt 1 uur na het vullen van het vat geactiveerd (Start Monitor stap). Het vergassen naar elk schip begint zodra de lezer is geactiveerd. Media wordt overgelaten aan evenwicht voor een minimum van 6 uur voor pH herijking en inenting. De procesparameters kunnen worden gewijzigd in de software zoals vermeld in punt 3.2.3.
- Vul de 24 putplaat die bij de microbioreactoren is voorzien handmatig met steriele media en plaats in het aangewezen dek van het systeem. Zorg ervoor dat de plaat in het dek wordt geplaatst dat door het geschreven programma is aangewezen (punt 3). De vulling van het vaartuig vindt plaats zoals ontworpen in punt 3.2.2.
- Inenting
- Meet de levensvatbare celconcentratie na de5e passage. Bereken het aantal cellen dat naar de vaten moet worden overgebracht om ervoor te zorgen dat de initiële celconcentratie in alle vaten 3 x 105 cellen/mL bedraagt.
- Breng de cellen over op een 24 diepe putplaat, zodat het volume van de suspensie ten minste 1,6 keer het vereiste volume is. Voor een vereiste volume van 2 mL van het entmateriaal, breng 3,2 mL celsuspensie in elke put in de plaat.
- Plaats de 24 putplaat in het aangewezen dek. De schepen worden ingeënt als in punt 3.2.4.
- Dagelijkse bemonstering en analyse
- Verwijder elke dag een monster van 460 μL uit de vaten met behulp van de vloeistofhandler. Verdun 200 μL van het monster met 800 μL gefilterde 1x PBS-buffer (5x verduning) en plaats deze vervolgens in het celteller.
- Centrifugeer het resterende monster gedurende 5 minuten bij 190 x g en kamertemperatuur en bewaar het supernatant voor verdere analyse (glucose, lactaat, glutamine en glutamaat).
- Vries 100 μL van de supernatant in bij -20 °C tot het einde van de teelt voor eiwitkwantificering.
- Einde van de teelt
- Wanneer de procesparametercontrole (d.w.z. temperatuur, agitatie, pH en DO) is beëindigd, stopt u de controle van het proces.
- Schroef de roerrplaat en klemplaat los.
- Verwijder de kweekvaten en maak de cultuurstations schoon. Leg de droogplaten op de kweekstations en schroef ze erin.
- Reinig ondertussen de klemplaten grondig met 70% ethanol en dubbel gedestilleerd water.
- Klik op Stop in de bioreactorsoftware zodra de droogcyclus is voltooid.
- De cultuuroogst van de cel
- Oogst cellen op dag 12 van de teelt door de inhoud van de vaten handmatig te verwijderen in centrifugebuizen van 50 mL. Centrifugeer de celbouillon op 190 x g gedurende 30 min.
- Gooi de celpellet weg en bewaar de supernatant op -20 °C.
5.
- Gebruik een 1,7 mL Eiwit A kolom voor de kwantificering van het eiwit tijdens de teelt run.
-
Bereid de evenwichts- en elutiebuffer voor voordat u de monsters ontdooit.
- Gebruik een oplossing van 0,5 M Na2HPO4 met 0,5 M NaCl met een pH van 7,9 als evenwichtsbuffer en een oplossing van 100 mM glycine met 0,5 M NaCl met een pH van 2 als elutiebuffer.
- Filtreer beide buffers door een membraan van 0,2 μm en ontgas voordat ze voor de analyse worden geplaatst.
- Zuiver het hoogwaardige vloeistofchromatografiesysteem (HPLC) met vers bereide evenwichtsbuffer.
- Laad het eiwit Een kolom op het HPLC-systeem.
- Chromatografie uitvoeren met een stroomsnelheid van 1 mL/min. Stel de temperatuur van de kolomoven in op 30 °C en de temperatuur van de autosampler op 10 °C
- Ontdooi de bevroren monsters bij kamertemperatuur en filter 225 μL van elk monster door een 0,22 μm PVDF-membraan. Verdun de monsters met een hogere concentratie van het gewenste eiwit zijn in een 1:20 verhouding met evenwichtbuffer en filter door het membraan voordat u in de autosampler plaatst.
- Plaats de monsters in de autosampler. Laad de methode en volgorde in de software en start de reeks.
LET OP: De methode bestaat uit drie fasen (zie figuur 1):injectie van het monster in de kolom gedurende de eerste twee minuten; gevolgd door elutiebuffer voor 8 min en kolomregeneratie met evenwichtsbuffer gedurende 10 min.
Figuur 1: Eiwit Een chromatogram, dat de verschillende fasen tijdens één keer weergeeft. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een overzicht van de teelt die in deze studie wordt uitgevoerd, wordt gepresenteerd in figuur 2.
Figuur 2: Schematische weergave van de experimentele omstandigheden om pH- en roerstaafsnelheidsprofielen in de cultuurstations te testen. De figuur vertegenwoordigt ook de juiste lay-out om de schepen te plaatsen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
De celgroei in de geautomatiseerde microbioreactoren is vergelijkbaar met de multifunctionele bioreactoren. Dit is afgebeeld in figuur 3. De celconcentratie van de drie verschillende schalen wordt vergeleken en er wordt geconstateerd dat de 15 mL geautomatiseerde microbioreactor de bioreactor van 2 L glas nabootst. De resultaten van de schudkolf worden ook vergeleken met het voordeel van de AMBR.
Figuur 3: Vergelijking van de levensvatbare celconcentratie op verschillende schalen. 15 mL microbioreactor, 150 mL shake kolf, en 2 L multi-use glas bioreactor. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
De invloed van verschillende roerrsnelheid en pH wordt bestudeerd in de geautomatiseerde microbioreactoren. Levensvatbare celconcentratie (VCC) is een van de essentiële parameters om de teelt te vergelijken. Figuur 4 vertegenwoordigt de vergelijking van de VCC en monoklonale antilichaamconcentratie in de verschillende microbioreactoren. Figuur 5 vertegenwoordigt de responscontourplot van de twee antwoorden die voor de vergelijking in aanmerking worden genomen, namelijk vcc- en mAb-concentratie. De waarden zijn vergelijkbaar in de vaten met dezelfde pH en verschillende roerrsnelheid, wat aangeeft dat de stijgbeugelsnelheid die voor dit proces is geselecteerd, geen significante invloed heeft op de procesoutput. Voor toekomstige teelten zou de roerrsnelheid van 1050 tpm worden gebruikt om schuimvorming te voorkomen.
De pH heeft echter een opvallende invloed op de procesoutputgegevens. De negatieve invloed van pH 6.9 op de VCC kan worden waargenomen in figuur 4A. De groei van de cellen verbeterde aanzienlijk onder de kweek met pH 7,3 ten opzichte van pH 7,1. In figuur 5Bwordt de monoklonale antilichaamconcentratie van de verschillende teelten vergeleken. De productie van de mAb verloopt trager in de vaartuigen met een pH-stand van 7,3; de uiteindelijke productconcentratie is echter vergelijkbaar met het vaartuig dat op pH 7.1 wordt gehouden.
Figuur 4: Resultaat van het DOE-experiment. aA) Het levensvatbare celconcentratieprofiel van de teeltrun om de invloed van pH- en roerdersnelheid (B) Monoklonale antilichaamconcentratieprofiel over het fed-batchproces in de respectieve teeltomstandigheden te bestuderen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Responscontourplot die de invloed van pH en roerdersnelheid op respectievelijk de maximaal levensvatbare celconcentratie en monoklonale antilichaam aangeeft. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Een van de voordelen van het gebruik van de AMBR is de continue monitoring en controle van de teelt. De controle van de pH kan worden waargenomen in figuur 6. De pH wordt op het ingestelde punt geregeld met CO2. De bolus voeding van dag 3 is verantwoordelijk voor de piek in de waarden.
Figuur 6: pH-monitoring in de geautomatiseerde microbioreactoren voor de teelt, met ingestelde punten van pH 6.9, 7.1 en 7.3 en een roerstaafsnelheid van 1050 tpm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
De procesparameters die voor de toekomstige tests werden gebruikt, werden teruggebracht tot een roerrsnelheid van 1050 tpm en een pH van 7,1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Optimalisatie van het proces om de opbrengst te verhogen is van cruciaal belang in de biofarmaceutische industrie. Schudkolven kunnen mogelijk worden gebruikt voor het screenen van de stam; De bewaking van de procesparameters zoals pH en DO zijn echter niet beschikbaar in de kolven. De microbioreactoren hebben een voordeel omdat ze continue monitoring en controle van het proces mogelijk maken. Deze controlelussen in de microbioreactor bieden ook een toestand die vergelijkbaar is met die op grotere schaal en leveren dus resultaten op die vergelijkbaar zijn met de grotere bioreactoren. Een ander voordeel van de microbioreactor is het brede scala aan omstandigheden die binnen hetzelfde tijdsbestek en tegen lagere kosten kunnen worden getest in vergelijking met bench top bioreactoren in termen van tijd en arbeid12,13 . De kleinere omvang is ook voordelig in termen van lagere bedrijfskosten als gevolg van de verminderde hoeveelheid substraat en de verminderde ruimtevereiste voor parallelle bewerkingen; de kosten van de vaten moeten echter in aanmerking worden genomen, aangezien het duurder kan zijn om een teelt in de microbioreactorvoor eenmalig gebruik te laten uitvoeren in vergelijking met de multiuse bioreactor voor bench top.
Hoewel er verschillende voordelen aan het systeem, zijn er een paar aanzienlijke nadelen aan het gebruik van de micro-bioreactoren. Het wijzigen van de pH en de DO voor elk van het schip binnen één cultuurstation is mogelijk; de roerdersnelheid en de temperatuur kunnen echter niet voor een individueel vaartuig worden gewijzigd. Dit verhoogt het aantal experimenten dat wordt uitgevoerd om de optimale roerrsnelheid en -temperatuur vast te stellen. De online metingen zijn beperkt tot pH en DO. Real-time procesbewaking van de kritische procesparameters (CPP), zoals temperatuur, pH, DO, zou nuttig zijn om de vertraging tussen bemonstering en analyse te voorkomen. Het heeft het potentieel om een nuttig hulpmiddel voor het optimaliseren van de productiviteit14. Ontwikkeling op het gebied van spectroscopische metingen in microbioreactoren kan in de toekomstige modellen nuttig blijken te zijn.
De voordelen wegen op tegen de nadelen van het gebruik van de geautomatiseerde microbioreactor. Er zijn echter een paar criteria die in aanmerking moeten worden genomen bij het bedienen van deze systemen. Eerst en vooral is het ontwerpen van het script om de teelt succesvol uit te voeren. Het is van vitaal belang dat het geschreven script alle cruciale stappen bevat, zoals de definitie van de platen, samen met de juiste mapping van de plaat en schepen. Alle parameters moeten worden gecontroleerd voordat het experiment wordt gestart. Zorg ervoor dat er geen processtappen tegelijkertijd worden gepland. Dit zal resulteren in het werkstation te kiezen een stap over de andere.
Een ander belangrijk criterium om op te richten is het gebruik van de klemplaten. De platen zijn autoclaved vóór elke cultuur; dit kan leiden tot schade aan de O-ringen. Controleer visueel de O-ringen voor autoclaven. Defecte O-ringen kunnen leiden tot onverwachte variatie in de DO en pH-regeling. De andere factor voor defecte metingen kan een losse verbinding tussen de klemplaat en de vaten zijn. Zorg ervoor dat de klemplaat en de roerstaafplaten goed aan de roerbak zijn bevestigd. Gebruik het aanhaalgereedschap dat bij het systeem is meegeleverd.
Tijdens de teelt is het cruciaal om het schuim visueel te monitoren. Bij het begin van de teelt is minimaal 20 μL antischuim nodig. Schuimvorming zal resulteren in vloeistof aanwezig zijn in de trog van de klemplaat. Overmaat van het schuim in de klemplaat zal leiden tot overloop, wat leidt tot het schuim wordt verzameld aan de onderkant van het kweekstation, verduisteren de pH en DO vlekken te lezen door de sensor.
Een andere belangrijke factor om op te focussen is het gebruik van de DOE-software. De geïntegreerde DOE-software maakt het mogelijk om het proces snel te ontwerpen waarin de relevante voorwaarden zijn opgenomen. De visualisatie van de gebruikte vaten zorgt ervoor dat er geen factor over het hoofd is gezien. Een van de voordelen van DOE-analyse is dat de experimenten kunnen worden geconfigureerd via werkpakketten, het configureren van elke bioreactor met gedefinieerde bioprocessing parameters. Alle gegenereerde gegevens worden geanalyseerd met MODDE. De software beheert de grote hoeveelheid gegevens die in de loop van het experiment wordt gegenereerd. Een gegeneraliseerde subset ontwerp setup genereert een reeks van verminderde ontwerpset, waardoor het probleem met multivariate kalibratie.
Een gedetailleerde procedure voor het uitvoeren van een ontwerp van experiment in een geautomatiseerde micro-bioreactor wordt aangetoond in dit artikel. Het protocol is ontworpen om zich te concentreren op het feed batch proces. De DOE-software hielp bij het vaststellen van de optimale procesparameters om de biomassa en de titerconcentratie te verhogen. De teeltgegevens werden ook vergeleken met een experiment uitgevoerd in een schudkolf en een 2 L bench-top bioreactor. De resultaten tonen de reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van het proces aan. Het doel van het protocol was om het gebruik van geautomatiseerde micro-bioreactoren in een feed batch proces aan te tonen en om de bioprocessing parameters te analyseren met behulp van de DOE software. Geconcludeerd kan worden dat de geautomatiseerde microbioreactoren nuttig zijn voor de procesontwikkeling en deze kunnen worden uitgebreid tot een semiperfusiesysteem15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen het Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF), het Federale Ministerie van Onderwijs en Onderzoek, Duitsland, en het BioProcessing-team van Sartorius Stedim Biotech GmbH, Duitsland, bedanken voor hun steun.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL disposable pipette tips, sterilized | Sartorius Stedim Biotech GmbH | A-0040 | |
| 200 mM L-glutamine | Corning, Merck | 25-005-CV | |
| 24 Well deep well plates | Sartorius Stedim Biotech GmbH | A-0038 | |
| 5 mL disposable pipette tips, sterilized | Sartorius Stedim Biotech GmbH | A-0039 | |
| ambr 15 automated microbioreactor system | Sartorius Stedim Biotech GmbH | 001-2804 | |
| ambr 15 Cell Culture 24 Disposable Bioreactors - Sparged | Sartorius Stedim Biotech GmbH | 001-1B86 | |
| Antifoam C Emulsion | Sigma-Aldrich, Merck | A8011 | |
| Bottle Top Sterile filter | Corning, Merck | CLS431474 | 0.1 μm pore size |
| CEDEX Detergent (3% Mucosol) | Roche Innovatis AG | 05-650-658-001 | |
| Cell counter | Roche Innovatis AG | 05-650-216-001 | CEDEX HiRes |
| CHO DG44 cell line | Cellca, Sartorius Stedim Biotech GmbH | ||
| CHOKO Feed Media A (FMA) | Sigma-Aldrich, Merck | CR80025 | |
| CHOKO Feed Media B (FMB) | Sigma-Aldrich, Merck | CR80026 | |
| CHOKO Production Medium | Sigma-Aldrich, Merck | CR80027 | |
| CHOKO Stock Culture Meium | Sigma-Aldrich, Merck | CR80028 | |
| Chromaster high pressure liquid chromatography system | VWR International | ||
| Conical Centrifuge tube | Corning, Merck | SIAL0790 | |
| Ethanol | Merck | 1070179026 | |
| Glycine | Carl Roth | 56-40-6 | |
| HPLC Vials | VWR International | SUPLSU860181 | |
| PBS | Sigma-Aldrich,Merck | P4417 | |
| Protein A Column | Thermo Fisher Scientific | 1502226 | POROS™ A 1.7 mL |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich,Merck | 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Sigma-Aldrich,Merck | 7558-79-4 | |
| Trypan Blue | VWR International | VWRVK940 | |
| YSI | YSI Inc | 2900D | YSI 2900 Select |
References
- Langer, E. S. 15th Annual report and survey of Biopharmaceutical Manufacturing Capacity and Production: A study of Biotherapeutical Developers and Contract Manufacturing Organizations. Bioplan Associates. , Available from: http://bioplanassociates.com/wp-content/uploads/2018/07/15thAnnualBiomfgReport_TABLEOFCONTENTS-LR.pdf (2019).
- Walsh, G. Biopharmaceutical benchmarks 2018. Nature Biotechnology. 36, 1136 (2018).
- Kim, J. Y., Kim, Y., Lee, G. M. CHO cells in biotechnology for production of recombinant proteins: current state and further potential. Applied Microbiology and Biotechnology. 93 (3), 917-930 (2012).
- Lai, T., Yang, Y., Ng, S. K. Advances in Mammalian cell line development technologies for recombinant protein production. Pharmaceuticals (Basel). 6 (5), 579-603 (2013).
- Carlage, T., et al. Analysis of dynamic changes in the proteome of a Bcl-XL overexpressing Chinese hamster ovary cell culture during exponential and stationary phases. Biotechnology Progress. 28 (3), 814-823 (2012).
- Hacker, D. L., de Jesus, M., Wurm, F. M. 25 years of recombinant proteins from reactor-grown cells - where do we go from here. Biotechnology Advances. 27 (6), 1023-1027 (2009).
- Shukla, A. A., Gottschalk, U. Single-use disposable technologies for biopharmaceutical manufacturing. Trends in Biotechnology. 31 (3), 147-154 (2013).
- Ao, S., Gelman, L. Advances in electrical engineering and computational science. Lecture notes in electrical engineering. 39, Springer. New York. (2009).
- Bareither, R., et al. Automated disposable small scale reactor for high throughput bioprocess development: a proof of concept study. Biotechnology and Bioengineering. 110 (12), 3126-3138 (2013).
- Kang, Y., Ludwig, D. L., Balderes, P. What can cell culture flocculation offer for antibody purification processes. Pharmaceutical Bioprocessing. 2 (6), 483-485 (2014).
- Choe, W., Durgannavar, T. A., Chung, S. J. Fc-Binding Ligands of Immunoglobulin G: An Overview of High Affinity Proteins and Peptides. Materials (Basel). 9 (12), (2016).
- Schäpper, D., et al. Application of microbioreactors in fermentation process development: a review. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 395 (3), 679-695 (2009).
- Zhang, Z., et al. Microbioreactors for Bioprocess Development. Journal of the Association for Laboratory Automation. 12 (3), 143-151 (2007).
- Claßen, J., et al. Spectroscopic sensors for in-line bioprocess monitoring in research and pharmaceutical industrial application. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (3), 651-666 (2017).
- Janoschek, S., et al. A protocol to transfer a fed-batch platform process into semi-perfusion mode: The benefit of automated small-scale bioreactors compared to shake flasks as scale-down model. Biotechnology Progress. 35 (2), 2757 (2019).
