Summary
这种动物模型使研究人员能够诱导具有统计学意义的继发性淋巴水肿在小鼠的后肢,持续至少8周。该模型可用于研究淋巴水肿的病理生理学,并研究新的治疗方案。
Abstract
动物模型在淋巴水肿研究中至关重要,以便了解疾病的病理生理学,同时探索潜在的治疗方案。这种小鼠模型允许研究人员诱导持续至少8周的显著淋巴水肿。淋巴水肿是诱导使用分段放射治疗和手术消融淋巴。该模型要求小鼠在手术前后获得10格雷(Gy)辐射。模型的手术部分包括三个淋巴血管的结扎和从小鼠后肢提取两个淋巴结。由于小鼠的解剖结构很小,因此获得显微手术工具和显微镜至关重要。该模型的优点是,它导致统计显著淋巴水肿,这为评估不同的治疗方案提供了良好的基础。这也是一个伟大的和容易获得的显微外科培训的选择。此模型的局限性是该过程可能非常耗时,尤其是在未提前练习时。该模型在小鼠中产生客观可量化的淋巴水肿,不会引起严重的发病率,并已在三个单独的项目中进行了测试。
Introduction
淋巴水肿的特点是淋巴液的积累,导致局部组织肿胀,这主要是由于淋巴血管1淋巴液的流动受损或中断。淋巴流可能因感染、阻塞、损伤或淋巴系统2的先天性缺陷而受损或中断。这些病因导致淋巴液的积累,导致慢性炎症状态,导致随后的纤维化,以及脂肪组织的沉积3。淋巴水肿可分为原发性或继发性淋巴水肿。原发性淋巴水肿是由发育异常或基因突变2,4引起的。继发性淋巴水肿的发生是由于潜在的全身疾病,手术或创伤2,4。继发性淋巴水肿是世界上最常见的淋巴水肿形式2。在发达国家,继发性淋巴水肿最常见的病因是肿瘤治疗,如辅助放射治疗和淋巴结解剖5。淋巴水肿是乳腺癌患者中最常见的,但也可以在妇科、黑色素瘤、泌尿生殖素或颈部癌症患者中发展。有人建议,在所有被诊断患有乳腺癌的妇女中,21%会发展成淋巴水肿7。
淋巴水肿对患者在身体和心理上都有压力。淋巴水肿患者感染的风险增加5、8、9,生活质量差,可发展社会焦虑和抑郁症症状10。慢性淋巴水肿的并发症导致高昂的护理费用和增加的疾病负担9,11。研究结果还表明,淋巴水肿可能与乳腺癌治疗后死亡风险增加有关。保守管理,如压缩受影响的区域,手动淋巴排水和一般护肤仍然是第一线的方法。目前尚无治疗6。虽然在外科和医疗领域取得了进展,但仍有改进的余地。需要更多的研究,提供洞察的病理生理学和疾病的进展,是需要使临床医生提供更好的治疗选择的患者5。
动物模型正用于临床前研究,以了解疾病的病理生理学,并开发潜在的治疗方案。在13只、14只、兔子15只、绵羊16只、猪17只、18只和啮齿动物19只、20只,建立了几种不同的淋巴水肿动物模型。 21,22,23,24.啮齿动物模型似乎是最具成本效益的模型,当研究淋巴功能的重建,由于啮齿动物容易获得和相对低廉25。大多数小鼠模型都集中在诱导淋巴水肿在小鼠的尾巴21,22,23。尾部模型是非常可靠的,但诱导淋巴水肿的确切手术技术在以前的公开材料中变化很大。这导致在已知的淋巴水肿25中呈现的发达淋巴水肿的持续时间和鲁棒性的波动。在后肢模型中也使用不同的技术诱导淋巴水肿,它们也产生不同的结果,但从翻译的角度来看,后肢模型可能更容易理解。以前的淋巴水肿模型一直受到自发淋巴水肿分辨率的阻碍,因此需要一个可重复的和永久淋巴水肿模型25。研究人员此前曾试图增加辐射剂量,以防止自发淋巴水肿的分辨率,但这往往导致随后的严重发病率。
该模型通过将显微手术与辐射相结合,在不引起严重发病率的情况下,产生具有统计学意义的淋巴水肿。该模型已由以前的手术模型修改,增加了一剂引淋巴水肿的辐照,而不会引起严重的发病率26。它还为显微外科培训提供了绝佳的机会。由于小鼠的解剖结构较小,因此有必要使用显微外科设备和显微镜。当使用者被教导了基本的显微外科技术,如用显微手术器械缝合时,可以进行外科手术。执行此程序的操作员都观看了 Acland 关于显微外科技能(1981 年)和基本显微技术(1985 年)的先决条件的教程视频。我们建议在研究中使用之前,先进行8~10次的外科手术。实施该过程可确保减少错误,并更有效地执行该过程。掌握了后,手术可在45分钟内完成。
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Protocol
根据机构准则,动物被安置在南丹麦大学动物照料设施中。涉及动物主体的所有程序都已获得丹麦环境和食品部动物实验监察局的批准。
1. 手术前辐照
注:手术前照射发生在手术前7天。
- 诱导麻醉。
- 将鼠标放入感应箱中,将蒸发器设置为 3% 的无氧,氧气流量为 0.8±1.2 L/min,以诱导吸入麻醉。
注:或者,可以使用注射麻醉剂,但在照射的短时间诱导吸入麻醉就足够了。为了获得本文中介绍的结果,使用了9周大的雌性C57BL6小鼠。 - 确保鼠标完全麻醉通过尾巴或爪子捏测试。
- 将鼠标放入感应箱中,将蒸发器设置为 3% 的无氧,氧气流量为 0.8±1.2 L/min,以诱导吸入麻醉。
- 放置鼠标进行辐照。
- 如果完全镇静,将鼠标从感应盒中移入,并将其置于辐射源下,置于苏西位置,用胶带轻轻固定后肢。
注:小鼠在辐射的短时间内将保持镇静状态。 - 放置一个 1.5 mm 厚的铅垫,以确保只有接受手术的区域(即膝盖周围直径为 25 mm 的圆形区域)得到辐照。
- 如果完全镇静,将鼠标从感应盒中移入,并将其置于辐射源下,置于苏西位置,用胶带轻轻固定后肢。
- 以 5.11 Gy/min (100 kVp, 10 mA) 的剂量管理 10 Gy 辐射。
注意:处理辐射时必须采取安全预防措施。在这次实验中,所有辐照都发生在辐射绝缘室,辐射源只有在所有人员离开并密封房间后才打开。 - 将鼠标放回笼子。
2. 设备设置
注:手术应在专门进行外科手术的房间里进行。操作表面必须无菌。
- 用 70% 乙醇彻底清洁所有操作表面。戴发网和护套。使用无菌手术器械和无菌手套。
- 准备麻醉。
- 绘制 1 mL 的芬太尼 (0.315 mg/mL),1 mL 的中子兰 (5 毫克/mL), 和 2 mL 的无菌水。对不同的成分使用不同的注射器和针头。
- 将芬太尼和无菌水混合,将注射器慢慢倒入无菌玻璃管中。混合时,添加中子兰以完成工作溶液。
- 准备麻醉。
- 绘制 0.2 mL 的丁丙诺啡 (0.3 mg/mL) 和 2 mL 的盐水。
- 将注射器慢慢倒入无菌玻璃管中,以完成工作溶液,从而混合体积。
- 打开显微镜,确保照明充足,并且显微镜对操作员的眼睛进行了良好调整。
注:所有外科手术应在手术显微镜下进行。放大范围从 4x-25x 就足够了。
3. 准备
- 将鼠标放在一个空容器中,以清除的刻度对小鼠进行手术前称重。
- 施用麻醉剂。
- 每10克小鼠体重提取0.1 mL的麻醉剂。注射麻醉下皮,作为博鲁斯注射。
- 让老鼠在笼子里休息,笼子里有很多床上用品和遮蔽物,大约10分钟,直到完全镇静。通过评估肌肉松弛和进行爪子或尾部捏合测试来检查麻醉深度。
- 完全镇静后,使用电动剪子切割为手术选择的后肢。确保擦掉多余的头发。
- 打开加热装置(如加热垫),用手术布盖住。
- 将氧气流量设置为 0.8 L/min,并将其与鼻塞连接。使用100%氧气。
注:诺塞内仅用于送氧,不麻醉。 - 应用眼部涂膏,注射0.5 mL的盐水皮下,最好是在小鼠的刮毛中,以防止手术期间的低血症。
- 放置鼠标进行手术。
- 将鼠标放在手术布上,以上等位置。将鼻塞放在鼻塞上。
- 用胶带轻轻固定后肢末端,以防止小鼠在手术过程中移动。
- 使用酒精/氯西丁或酒精/波维多碘对皮肤进行消毒。
4. 外科
注: 在此示例中,为该过程选择了左后肢(当鼠标以上视位置查看时)。
- 做一个圆形切口。
- 用光滑的钳子抬起皮肤,并夹一个小开口约5毫米接近popliteal fossa。
- 将锋利的剪刀滑入开口,夹向膝盖,使切口在膝盖正上方结束。在剪贴时用钳子抬起皮肤,确保不要刺穿底层血管。
- 将鼠标移到倾斜位置,并继续从膝盖夹向弹出的 fossa,直到圆周切口完成。
- 解剖膝盖以下的皮肤。
- 轻轻钝化解剖膝盖以下的区域,到脚踝上方几毫米,通过缓慢打开和关闭微剪刀,同时用钳子抬起皮肤。
- 使用微剪刀小心地剪下剩余的可见粘附。在整个过程中,定期使用无菌盐水保持组织湿润。
- 解剖圆周切口近端边缘的皮肤,以便用弹性伸缩器缩回。
注: 缩回器使操作员能够更好地了解近端淋巴血管,并防止近端边缘在手术过程中移动。 - 当仍然处于易发位置时,轻轻旋转后肢,用胶带固定它,以便从暴露区域的最近点到最远端的异形静脉可见。
- 使用带 30 G 针头的 0.5 mL 注射器在第二和第三个脚趾之间分皮注射约 0.01 mL 的专利蓝 V。轻轻按爪子几次,以分发专利蓝色V。
注:如果淋巴血管的蓝色在手术过程中褪色,轻轻按摩爪子,以促进吸收,而不是注入更多的专利蓝色V。 过度使用专利蓝V可能导致淋巴血管周围的组织泄漏和着色,这可能妥协的程序。 - 找到重要结构:淋巴淋巴结(PLN),两个淋巴器血管远至淋巴结(DLV1和DLV2),以及一个淋巴血管接近淋巴结(PLV)。
注: 所有淋巴血管都可以在异血静脉附近找到。近端淋巴血管通常发现内向静脉,两个远端淋巴血管被发现内向和侧向静脉。在随附的视频中使用了结构的缩写。 - 放大以清晰地可视化 PLV,并使用微针支架和微钳用 10-0 尼龙缝合。按爪子几次,以确保没有专利蓝色V通过近缝合。
注:可能需要修剪淋巴血管周围的脂肪。 - 重复步骤 4.7,使两个远端淋巴血管停止。按爪子几次,以确保没有专利蓝色V通过近连字。如果淋巴血管靠近异血静脉,请尝试进一步解剖。
注:在此示例中,可以看到其中一个淋巴血管爆裂,原因是结扎阻碍淋巴流动。淋巴血管通常会从静脉进一步向下分裂。 - 取出爆裂淋巴结。
- 找到爆裂淋巴节点,用微剪刀夹住一个小孔,用微钳和微剪刀将其取出。
注:淋巴结具有光滑的珍珠状表面,与周围的脂肪组织相反。 - 要测试被切除的组织是否为淋巴结,将其放入装满水的试管中。
注:如果组织由脂肪组成,组织将漂浮。如果组织是淋巴结,它将沉入底部。
- 找到爆裂淋巴节点,用微剪刀夹住一个小孔,用微钳和微剪刀将其取出。
- 取出脂肪垫和淋巴结。
- 在去除内脏脂肪垫之前,使用双极凝固剂烧灼穿过脂肪的血管。
- 使用微钳和微剪刀切除内脏脂肪垫。轻轻夹住穿过脂肪的烧焦容器。然后轻轻地切除内脏区域的脂肪组织。
注:位于脂肪中的淋巴结很少被专利蓝V着色,很难与脂肪区分开来。在一块中取出脂肪垫是确保淋巴结已移除的最佳方式。
- 用无菌盐水彻底冲洗腿部,并通过显微镜确认任何小毛发和颗粒已被彻底从手术区域去除,以避免伤口污染和感染。确保没有活动性出血。
- 用钳子和针架缝合6-0尼龙缝合,将皮肤边缘缝合到肌肉筋膜,留下2⁄3毫米的间隙,以限制表面淋巴流。
注: 随附的视频显示了已完成缝合的示例。 - 管理麻醉。每30克小鼠体重提取0.1 mL的麻醉剂。注射麻醉剂皮下注射作为博鲁斯注射。
- 称量鼠标进行手术后进行比较。
- 将鼠标放在加热的柜子里,以便恢复。
5. 术后护理
- 给小鼠单独的笼子恢复手术后与水和食物的libitum。
- 每天为麻醉症服用0.02 mL的丁丙诺啡3x3x。
- 每天监测动物伤口愈合、疼痛和感染的迹象。如果存在感染迹象,请使用抗生素膏。
6. 术后辐照
- 手术后三天,重复手术前照射程序(步骤1.1+1.4)。
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Representative Results
此过程以前已在三个单独的实验中使用。所有的实验都是由不同的首席研究员进行的,他们都是本文的合著者。在所有三个实验中,都非常小心地遵循与本协议中描述的相同的程序。在所有三个实验中,继发性淋巴水肿在一个后肢诱导,而另一个后肢作为控制。后肢的体积是所有三个实验的主要结果。图 1说明了研究设计。
所有小鼠在手术后的几周内都进行了微计算机断层扫描(+CT)扫描,以测量后肢的体积。_CT 扫描在多模态临床前扫描仪(材料表)上执行,后肢的体积通过相关软件中的感兴趣区域 (ROI) 功能进行测量,如前面所述26。远端骨状关节位于三维(3D)等向图像中,使用前面描述的方法27。ROI 开始于远端牙周关节,包括所有组织远端到该点。用于分析的 Hounsfield 范围设置为 -500 到 4000。
使用统计软件分析所有数据 (材料表).西达克的多重比较测试用于比较诱导淋巴水肿后肢的体积,与对照后肢。控制后肢和淋巴水肿后肢之间的显著差异定义为 P 值 <0.05。
图1:研究结果测量的设计和时间点。请点击此处查看此图的较大版本。
实验126包括32只老鼠,分成四组。其中一个目标是研究几种不同的剂量的辐射,并找到最可取的剂量,诱导持久的淋巴水肿,而不会引起严重的发病率。接受两剂10Gy照射的组包括四只小鼠。图2显示,淋巴水肿在所有8周内均达到一致状态。表1显示,第1周、第7周和第8周淋巴水肿后肢和控制后肢的体积有显著差异。虽然诱导淋巴水肿的一致状态得到实现,但所有8周内后肢之间没有统计学显著性差异。这一结果不同于其他两个实验,可以解释为四只小鼠的样本量相对较小。增加测量数量将增加研究的力量,并在此发现差异的可能性,如果存在差异28。
图2:平均后肢体积:实验1。这一图中包括对两剂10Gy照射的组4只小鼠的测量。此图显示手术后 8 周内以 mm3为单位的平均后肢体积。所有小鼠在手术前和术后都接受10Gy照射。误差条表示标准差 (SD)。请点击此处查看此图的较大版本。
周 | 淋巴水肿体积(毫米3 (n = 4) | 控制音量(mm3 (n = 4) | P 值 | 95% 置信区间 |
1 | 218.53 × 9.3 | 136.78 × 2.48 | 0.002 | 53.77~109.73 |
2 | 202.25 × 10.24 | 141.88 × 8.02 | 0.066 | (-6.53)~127.28 |
3 | 193.28 × 10.80 | 141.20 × 6.80 | 0.060 | (-3.7)~107.85 |
4 | 194.95 × 21.05 | 141.50 × 8.03 | 0.224 | (-41.85)~148.75 |
5 | 193.75 × 7.07 | 141.70 × 8.60 | 0.051 | (-0.27)~104.37 |
6 | 193.23 × 3.42 | 141.78 × 10.29 | 0.054 | (-1.56)~104.46 |
7 | 194.95 × 7.26 | 143.23 × 8.90 | 0.050 | 0.17~103.28 |
8 | 195.8 × 9.65 | 152.18 × 5.81 | 0.009 | 19.88~67.38 |
表1:西达克的多重比较测试:实验1。此表显示了术后 8 周内诱导淋巴水肿后肢平均体积和控制后肢之间的统计比较。所有小鼠在手术前和术后都接受10Gy照射。值以:均值 = SD 表示,以 mm3为单位。P值<0.05被认为是控制后肢和淋巴水肿后肢之间的显著差异。n(观测值数) = 4。
实验2包括45只小鼠。15只小鼠作为对照,并注射盐水。这些控制用作代表性的结果,因为我们假设盐水注射对诱导淋巴水肿的体积没有影响。图3显示淋巴水肿较实验1稳定。此外,在8周内,控制后肢的体积增加。这降低了表2中显示的相对差异。据推测,在手术后的几周内,小鼠更多地使用非手术的后肢,这导致非手术后肢的肥大和肢体体积增加。最重要的是,表3显示,在手术后所有8周内,淋巴水肿后肢和控制后肢之间存在统计学显著性差异。小鼠数量较多证明,此程序可诱发统计显著淋巴水肿至少 8 周。
图3:平均后肢体积:实验2。对照组的15只小鼠的测量结果包括此图。此图显示手术后 8 周内以 mm3为单位的平均后肢体积。所有小鼠在手术前和术后都接受10Gy照射。误差栏代表SD。请点击这里查看此图的较大版本。
实验1 | 实验2 | 实验 3 | 实验 1、2 和 3 组合 | |||||
周 | 绝对差 (mm3) | 相对差异(%) | 绝对差 (mm3) | 相对差异(%) | 绝对差 (mm3) | 相对差异(%) | 绝对差 (mm3) | 相对差异(%) |
1 | 81.75 × 7.20 | 0.60 ± 0.04 | 104.34 × 25.96 | 0.76 × 0.23 | 85.20 × 35.05 | 0.64 × 0.27 | 94.02 × 29.57 | 0.69 × 0.24 |
2 | 60.38 × 17.21 | 0.43 × 0.14 | 107.12 × 44.33 | 0.79 × 0.33 | 85.63 × 37.94 | 0.63 ± 0.29 | 92.77 × 41.68 | 0.68 ± 0.31 |
3 | 52.08 × 14.35 | 0.37 × 0.11 | 78.77 × 39.45 | 0.57 × 0.28 | 74.67 × 49.57 | 0.54 ± 0.38 | 73.74 × 41.51 | 0.53 ± 0.31 |
4 | 53.45 × 24.51 | 0.38 ± 0.19 | 50.67 × 29.94 | 0.36 × 0.21 | 50.62 × 16.35 | 0.37 × 0.11 | 51.01 × 24.03 | 0.37 × 0.17 |
5 | 52.05 × 13.46 | 0.37 × 0.11 | 32.74 × 24.66 | 0.22 ± 0.17 | 42.67 × 11.81 | 0.31 ± 0.07 | 39.08 × 20.02 | 0.27 × 0.14 |
6 | 51.45 × 13.63 | 0.36 × 0.11 | 26.80 × 22.35 | 0.18 × 0.14 | 32.86 × 10.90 | 0.22 ± 0.08 | 32.32 × 18.96 | 0.21 × 0.13 |
7 | 51.73 × 13.26 | 0.36 × 0.11 | 19.04 × 17.22 | 0.12 × 0.11 | - | - | 25.92 × 21.15 | 0.17 × 0.15 |
8 | 43.63 × 6.11 | 0.29 ± 0.04 | 15.15 × 11.70 | 0.10 ± 0.08 | - | - | 21.15 × 15.96 | 0.14 ± 0.10 |
表2:绝对差异和相对差异。此表显示了淋巴水肿和控制后肢之间的绝对体积差异 = Mm3的 SD 和相对差异 = SD 百分比。
周 | 淋巴水肿体积(毫米3 (n = 15) | 控制音量(毫米3) (n = 15) |
P 值 | 95% 置信区间 |
1 | 241.82 × 35.69 | 137.48 × 21.54 | <0.001 | 82.21~126.47 |
2 | 242.41 × 45.13 | 135.29 × 5.81 | <0.001 | 69.33~144.89 |
3 | 216.85 × 41.47 | 138.08 × 5.31 | <0.001 | 45.15~112.39 |
4 | 193.10 × 31.27 | 142.43 × 5.29 | <0.001 | 25.15~76.18 |
5 | 180.03 × 26.03 | 147.29 × 6.45 | 0.002 | 11.72~53.76 |
6 | 179.89 × 25.00 | 153.09 × 6.56 | 0.004 | 7.74~45.85 |
7 | 176.45 × 19.77 | 157.41 × 7.49 | 0.008 | 4.35~33.71 |
8 | 166.97 × 11.8 | 151.82 × 10.07 | 0.002 | 5.18~25.12 |
表3:西达克的多重比较测试:实验2。此表显示了术后 8 周内诱导淋巴水肿后肢平均体积和控制后肢之间的统计比较。所有小鼠在手术前和术后都接受10Gy照射。值以:均值 = SD 表示,以 mm3为单位。P值<0.05被认为是控制后肢和淋巴水肿后肢之间的显著差异。n(观测值数) = 15。
实验3包括36只小鼠。12只小鼠作为对照,并给予盐水注射。这些控制用作代表性的结果,因为我们假设盐水注射对诱导淋巴水肿的体积没有影响。在这个实验中,小鼠的后肢体积被测量了6周,而不是8周。实验进行时,由于后勤困难,实验只持续了6周。图 4显示了比实验 2 更一致的淋巴水肿。表4显示,术后6周内淋巴水肿有统计学意义。
图 4:平均后肢体积:实验3。对照组的12只小鼠的测量结果包括此图。此图显示手术后 6 周内以 mm3为单位的平均后肢体积。所有小鼠在手术前和术后都接受10Gy照射。误差栏代表SD。请点击这里查看此图的较大版本。
周 | 淋巴水肿体积(毫米3 (n = 12) | 控制音量(mm3(n = 12) | P 值 | 95% 置信区间 |
1 | 219.06 × 35.00 | 133.86 × 10.02 | <0.001 | 51.66~118.74 |
2 | 220.90 × 36.98 | 135.27 × 5.89 | <0.001 | 49.33~121.94 |
3 | 211.74 × 47.30 | 137.07 × 7.56 | 0.002 | 27.24~122.11 |
4 | 186.09 × 20.36 | 135.47 × 5.70 | <0.001 | 34.98~66.27 |
5 | 182.35 × 18.25 | 139.68 × 7.45 | <0.001 | 31.37~53.98 |
6 | 183.44 × 12.11 | 150.58 × 8.37 | <0.001 | 22.42~43.29 |
表4:西达克的多重比较测试:实验3。此表显示了术后 6 周内诱导淋巴水肿后肢平均体积和控制后肢之间的统计比较。所有小鼠在手术前和术后都接受10Gy照射。值以:均值 = SD 表示,以 mm3为单位。P值<0.05被认为是控制后肢和淋巴水肿后肢之间的显著差异。n(观测值数) = 12。
图 5和表 5显示了所有三个实验的总和的平均后肢体积。表5显示,使用这个程序会导致统计显著淋巴水肿持续至少8周。前6周的数据是实验1、2和3对31只小鼠的综合测量。在第7-8周,我们只得到了实验1和2的数据,结果对19只小鼠进行了联合测量。
图 5:组合平均后肢体积:实验 1、2 和 3。手术后前6周包括31只小鼠,后2周内包括19只小鼠。此图显示手术后 8 周内以 mm3为单位的平均后肢体积。所有小鼠在手术前和术后都接受10Gy照射。误差栏代表SD。请点击这里查看此图的较大版本。
周 | 淋巴水肿体积(mm3(周 1⁄6 n = 31) (第 7-8 周 n = 19) |
控制音量(mm3(周 1⁄6 n = 31) (第 7-8 周 n = 19) |
P 值 | 95% 置信区间 |
1 | 230.00 × 34.46 | 135.99 × 16.03 | <0.001 | 78.19~109.84 |
2 | 228.90 × 40.91 | 136.13 × 6.32 | <0.001 | 70.47~115.07 |
3 | 211.83 × 41.15 | 138.09 × 6.36 | <0.001 | 51.53~95.95 |
4 | 190.63 × 25.81 | 139.62 × 6.54 | <0.001 | 38.15~63.87 |
5 | 182.70 × 21.52 | 143.62 × 7.79 | <0.001 | 28.36~49.79 |
6 | 182.98 × 19.11 | 150.66 × 8.36 | <0.001 | 22.18~42.47 |
7 | 180.34 × 19.31 | 154.43 × 9.60 | <0.001 | 11.61~40.22 |
8 | 173.04 × 16.42 | 151.89 × 9.19 | <0.001 | 10.35~31.94 |
表5:西达克的多重比较测试:实验1、2和3相结合。此表显示了手术后前 6 周内 31 只小鼠和随后 2 周内 19 只小鼠的诱导淋巴水肿后肢平均体积和控制后肢之间的统计比较。所有小鼠在手术前和术后都接受10Gy照射。值以:均值 = SD 表示,以 mm3为单位。P值<0.05被认为是控制后肢和淋巴水肿后肢之间的显著差异。n(观测值数) = 31。
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Discussion
此协议中有几个关键步骤。首先,研究人员在处理放射性时必须采取安全预防措施。其次,在该协议的手术部分,重要的是开始程序,一旦鼠标已被麻醉,并完成它,没有不必要的休息。这一点很重要,以避免动物的手术时间过长,并防止麻醉在手术过程中失去效果。建议只注射一次麻醉剂,一次完成手术。这也是一个关键步骤, 不要管理太多的专利蓝色 V, 因为过量的专利蓝色 V 将变色周围的淋巴血管.如果周围的组织变色,几乎不可能可视化淋巴血管,这损害了程序。即使一个人设法可视化淋巴血管,变色的组织将很难评估专利蓝色V是否通过近度到结扎。这是有问题的,因为操作员必须确保放置的连字收缩淋巴流,以确保该过程将成功。关闭伤口时,留下 2⁄3 mm 的间隙也很重要。作为一个临时的皮肤间隙往往需要模仿人类伤口愈合过程29。
这种方法的局限性是,这是一个耗时的程序,需要访问显微镜和以前的显微外科培训。执行本协议的外科部分时,计划外科手术之间的时间非常重要。大量的时间进入等待动物被麻醉,剃下后肢,一般准备每个外科手术。因此,建议提前准备外壳和麻醉剂。需要注意的是,要确定慢性淋巴水肿已经诱发,必须分析组织病理学。我们在本文中没有包括组织病理学,这是一个限制。没有组织病理学支持的事实,组织学的变化已经发生在淋巴血管,在后肢的体积的变化只能被描述为水肿。该文章包括实验126中四只小鼠的所有数据,包括组织病理学,并表明使用这种技术对组织病理学有显著的变化。这篇文章还包括淋巴成像。在实验2和3中,对小鼠也采用了同样的程序,但组织病理学显示,在这些实验中,淋巴水肿后肢和控制后肢之间没有显著差异。进一步的研究,包括组织病理学需要这个模型,以澄清淋巴水肿是否诱发组织学水平。实验2和3尚未发表,因此我们不能参考它们。
虽然使用μCT扫描测量后肢体积可以认为比使用水位移方法或圆周测量更客观,但它仍然有其局限性。测量技术昂贵、耗时,需要访问 _CT 扫描器和分析软件。
一般来说,啮齿动物淋巴水肿模型面临的最大挑战之一是自发淋巴水肿的解析,除非25日进行过度辐射。在开发这个模型时,我们测试了几种不同的辐射剂量,以找到一种剂量,诱导持久的淋巴水肿,而不会引起严重的发病率26。以前,淋巴水肿模型尚未在淋巴水肿诱导或结果评估方法中标准化。Oashi等人20使用单剂量30Gy照射,并在三个单独的点连接每个淋巴血管。在这项研究中,外科手术花了90分钟。虽然本文介绍的方法可以被认为是耗时的,手术部分的手术部分仍然可以执行大约两倍于Oashi等人提出的方法。他们还有6个月的随访期,这比本文中提出的任何研究都长得多。然而,他们只包括一只小鼠,他们手动测量肢体周长以评估肿胀,而本文中介绍的体积使用μCT扫描和3D分析软件在31只小鼠身上测量。小松等人30日用电动刀切除了淋巴结及相关的外周淋巴血管和脂肪组织。使用电动刀可能是一种更简单的方法,不需要显微外科训练,但诱导水肿在第4天后解决,而本文介绍的方法提供持续至少8周的一致淋巴水肿。
该协议有望使研究人员考虑修订后的淋巴水肿模型的局限性和优点。该协议还应帮助研究人员成功复制模型。该方法可用于今后的观察和介入研究,以了解淋巴水肿的病理生理学和研究新的治疗方案。在未来的研究中,进行超过8周的随访观察诱发淋巴水肿持续多长时间也是很有趣的。观察手术前和手术后对小鼠进行更有针对性的照射的效果也很有趣。这可以通过执行 CT 扫描和规划目标卷来实现。在未来的研究中,该模型还可以得到荧光引导淋巴成像、测光仪或生物阻抗研究的支持。该方法提供持续至少8周的具有统计学意义的淋巴水肿,由不同的铅研究人员在三个单独的实验中直接通过CT体积测量。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢生物医学实验室主任彼得·博伦提供了记录通过显微镜看到的画面所需的设备。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
10-0 Nylon suture | S&T | 12051-10 | |
6-0 Nylon suture - Dafilon | B Braun | C0933112 | |
Coagulator - ICC 50 | ERBE | ||
Cotton tipped applicators | Yibon medical co | ||
Dissecting forceps | Lawton | 09-0190 | |
Elastic retractors | Odense University Hospital | ||
Electrical clipper | Aesculap | GT420 | |
Fentanyl 0,315 mg/ml | Matrix | ||
Heating pad - PhysioSuite | Kent Scientific Corp. | ||
Isoflurane 1000mg Attane | Scan Vet | ||
Isoflurane vaporizer - PPV | Penlon | ||
Micro jewler forceps | Lawton | 1405-05 | |
Micro Needle holder | Lawton | 25679-14 | |
Micro scissors | Lawton | 10128-15 | |
Micro tying forceps | Lawton | 43953-10 | |
Microfine U-40 syringe 0,5ml | BD | 328821 | |
Microlance syringe 25g | BD | ||
Microlance syringe 27g | BD | ||
Midazolam 5 mg/ml (hameln) | Matrix | ||
Needle holder - Circle wood | Lawton | 08-0065 | |
Non woven swabs | Selefa | ||
Opmi pico microscope F170 | Zeiss | ||
Patent blue V - 25 mg/ml | Guerbet | ||
Scissors - Joseph | BD | RH1630 | |
Siemens INVEON multimodality pre-clinical scanner | Siemens pre-clinical solutions | ||
Source of radiation - D3100 | Gulmay | ||
Stata Statistical Software: Release 15 | StataCorp LLC | ||
Temgesic - 0,2 mg | Indivior | ||
Vet eye ointment - viscotears | Bausch & Lomb |
References
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